CN102559728A - 耐辐射异常球菌R1 dap基因培育耐盐植物的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明发现耐辐射异球菌Deinococcus radiodurans R1中的dap基因(DRB0118)具有提高原核生物及植物的抗逆能力。本发明构建了包含上述基因的重组载体，把它们分别导入原核及真核宿主细胞。实验证明，dap基因(DRB0118)在原核宿主细胞和烟草中表达后，均能提高其耐盐抗性。
Description
技术领域
本发明涉及耐辐射异常球菌R1(Deinococcus radiodurans R1)dap基因(DRB0118，GeneID：1799871)的新功能，具体涉及该基因在提高植物对盐胁迫抗性方面的应用。
背景技术
耐辐射异常球菌R1(D.radiodurans R1)因具有对电离辐射、UV辐射、DNA损伤试剂及渗透胁迫等极强抗性，而成为研究微生物非生物胁迫适应机制的理想菌株，也可作为一个研究高等植物耐盐的模式物种(Battista et al.，2001)。来源于D.radiodurans R1基因组中一个大质粒，其编码的蛋白与渗透胁迫抗性相关。
但目前未见耐辐射异球菌Deinococcus radiodurans R1中的dap基因(DRB0118，GeneID：1799871)在提高植物耐盐性方面的功能的研究报道。
发明内容
本发明的目的是从D.radiodurans R1基因组中发现能够提高植物对盐抗性的基因。并将该基因转入植物，使转入该基因的植物获得耐盐的能力。
本发明通过如下研究发现，Deinococcus radiodurans R1的dap基因(DRB0118)具有耐高渗和盐胁迫的功能，可用于培育耐盐性状的植物：
1、获得含有D.radiodurans R1dap基因(DRB0118)的重组工程菌株
1)通过PCR从D.radiodurans R1(DSM 20539)菌株基因组扩增出D.radioduransR1dap基因(DRB0118)，基因序列号为：GeneID：1799871。其大小为1014bp，该基因含337个氨基酸，将其克隆于载体pGEMT-easy上，构建了含有完整dap基因的重组质粒pGEMT-dap；
2)将dap基因(DRB0118)连接于pRADZ3穿梭质粒上，该质粒含有能在大肠杆菌和耐辐射异球菌中都起作用的groEL启动子，构建含有groEL启动子的完整dap基因(DRB0118)重组质粒pRADZ3-dap G；
3)将导入dap基因(DRB0118)的重组质粒pRADZ3-dap G转入受体大肠杆菌JM109中，获得工程菌株JM-dap(见实施例1)；
2、含有D.radiodurans R1 dap基因工程菌株的耐盐实验
实验证实，经4M NaCl盐溶液冲击后，含有D.radiodurans R1dap基因(DRB0118)的JM-dap重组菌株生长状况良好，菌落数高于只含空质粒的JM-Z3菌株(见实施例2及图4)。该工程菌株具有耐受4M NaCl冲击的能力；
此实验表明：D.radiodurans R1dap基因(DRB0118)具有提高原核生物耐盐的能力。
3、dap基因(DRB0118)在烟草中表达及转基因植株的耐盐性鉴定
1)将D.radiodurans R1dap基因(DRB0118)连接到植物表达载体pBI121中，构建具有dap基因(DRB0118)的重组质粒pBI121-dap；
2)将pBI121-dap重组质粒转化烟草中，获得了能够耐受盐胁迫的转基因烟草植株；
此实验表明：D.radiodurans R1dap基因(DRB0118)具有培育耐盐植物的用途(见实施例3)。
附图说明：
图1是含有D.radiodurans R1dap基因(DRB0118)序列的PCR产物的验证电泳图谱；
图2是含有D.radiodurans R1dap基因(DRB0118)及groEL启动子的原核表达载体的构建验证电泳图谱；
图3是在盐冲击试验前的含有空载体和含有D.radiodurans R1dap基因(DRB0118)序列的原核表达载体的大肠杆菌的生长状况的菌落照片，其中：
a是含有空表达载体的大肠杆菌JM 109菌株；
b是含有D.radiodurans R1dap基因(DRB0118)表达载体的大肠杆菌重组菌株；
图4是含有D.radiodurans R1dap基因(DRB0118)的原核表达载体及空载体的大肠杆菌(E.coli)在含4M NaCl培养基中的生长情况的菌落照片，图中的菌株如下：
a是含有空表达载体的大肠杆菌JM109菌株；
b是含有D.radiodurans R1dap基因(DRB0118)表达载体的大肠杆菌重组菌株。
图5是在250mmol.L-1的NaCl培养基上转D.radiodurans R1dap基因(DRB0118)烟草与非转基因烟草的耐盐试验结果比较。图中，左边是非转基因烟草，右边是转入D.radiodurans R1dap基因的烟草。
具体实施方式
以下实施例中所举的质粒、菌株只是用于对本发明作进一步详细说明，并不对本发明的实质内容加以限制。凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例中所举的质粒、菌株来源如下：
克隆载体pGEMT-easy：为Promrga公司市售产品；
穿梭质粒pRADZ3：为本实验室保存；
植物表达载体pBI121：为Clontech公司市售产品；
大肠杆菌JM 109：为北京全式金公司市售产品。农杆菌EHA 105由本实验室保存实施例1D.radiodurans R1dap基因(DRB0118)序列在大肠杆菌中的表达
根据已公布的D.radiodurans R1基因组中的dap基因(DRB0118)序列设计1对PCR特异性引物，从D.radioduransR1基因组DNA中扩增完整的核苷酸序列：
Up 5′ATTAACTAGT GAGACAGTTGTCCACGCCTG 3′；
Down 5′ACGCCATATG TTACAGGCTGAGAATACTGC 3′。
通过PCR方法从D.radioduransR1的基因组中扩增出目的基因序列，反应条件：94℃10min，[94℃60sec，55℃30sec，72℃60sec]30个循环，72℃10min，PCR产物经胶回收后，克隆于载体pGEMT-easy上，命名为pGEMT-dap，并测序验证；然后通过SpeI/NdeI双酶切获得含有粘性末端的及含有启动子groEL的pRADZ3载体，将dap基因(DRB0118)连接于pRADZ3载体上，构建大肠杆菌表达载体pRADZ3-dapG，将该表达载体转化大肠杆菌JM109，经PCR、酶切，测序验证插入序列正确(见图1，2)，将该重组菌株命名为JM-dap。
将含有pRADZ3空质粒的E.coli JM109命名为JM-Z3。
实施例2含D.radiodurans R1dap基因(DRB0118)重组菌株的耐盐实验
一、实验方法
1、将实施例1中获得的2个重组大肠杆菌分别接种于20mL LB液体培养基(含Amp抗生素)中，摇瓶过夜(37℃)培养后，再分别转接于100mL的LB液体培养基中，尽量保持接种量的一致，培养至OD600≈0.5即可。
2、取10mL的菌液离心后，在等体积的4M NaCl盐溶液里冲击2h，每个样品立即用无菌去离子水倍比稀释至10-4，取10μL点在LB固体培养基表面，经37℃培养16h，观察菌落形成情况并照相。
二、实验结果
图3显示，4M NaCl盐溶液冲击前含有D.radiodurans R1dap基因(DRB0118)的JM-dap菌株与含空质粒的JM-Z3菌株生长状态基本一致；4M NaCl盐溶液冲击后，含有D.radiodurans R1dap基因(DRB0118)的JM-dap重组菌株生长状况良好，菌落数高于只含空质粒的JM-Z3菌株(见图4)。
三、实验结论
D.radiodurans R1dap基因(DRB0118)提高了原核生物耐盐的能力。
实施例3dap基因(DRB0118)在烟草中表达及转基因植株的耐盐性鉴定
(一)含目的基因表达载体的构建
根据全长编码序列，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在正反引物上分别引入限制性内切酶位点(这可视选用的载体而定)，以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，将序列cDNA克隆至中间载体(如pBluescript)，进一步克隆到双元表达载体(如pBI121和pCAMBIA2200)，在保证阅读框架的前提下鉴定好的表达载体，再将其转入农杆菌中，利用叶盘法技术转化模式植物烟草。
(二)利用叶盘法转化烟草
用无菌牙签挑取YEB选择平板上的阳性菌落，接种于2ml YEB液体(Sm+，Kan+)，28℃，200rpm振荡培养24-36h；
室温下4,000g离心10min；
弃上清，菌体用1/2MS液体培养基悬浮，稀释到原体积的5-20倍，至菌液的OD600≈0.5；
取生长2周左右的烟草的无菌叶片，去掉其主叶脉，将其剪成约1平方厘米见方的小叶片；
将叶片放入制备好的菌液中，浸泡2-5min，在无菌滤纸上吸干菌液；
把经侵染的叶片放于MS培养基上，28℃暗培养48h；
将叶片转到愈伤培养基(MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+Kan 50mg/L+cb 250mg/L)上，25-28℃光照下培养，7-15d可见愈伤组织的形成；
约20d后可见分化芽长出，待芽长大后，切下，置于生根培养基(1/2MS+NAA0.5mg/L+Kan 25mg/L)上进行生根培养，2-7d左右生根；
等根系发达后，将植株取出，用无菌水洗净附着的固体培养基，移入土壤中，刚开始用玻璃罩罩几天，待植株健壮后再取下玻璃罩，温室中培养。
(三)含dap基因(DRB0118)序列转基因烟草的耐盐性鉴定实验
1、实验目的
鉴于该核苷酸序列已被证明在大肠杆菌中对盐胁迫具有抗性，进一步对转基因植株进行耐盐性鉴定。
2、实验方法
采用不同的NaCl浓度(0、50、100、150和250mmol.L-1NaCl)分别对转基因烟草植株和非转基因烟草植株进行生长情况的观察。
3、实验结果
在没有NaCl处理的情况下，转基因烟草和非转基因烟草的生长状况没有明显的差异；
在添加50mmol.L-1NaCl的情况下，非转基因烟草仍然能保持生长，但生长的速率比转基因烟草要缓慢一些，表明低盐条件下，野生型植株生长已明显受到抑制；
当NaCl的浓度增加到100和150mmol.L-1时，非转基因的烟草叶片最初变黄、接着叶片逐渐萎蔫，20d后全部死亡；
在250mmol.L-1的NaCl浓度下，非转基因烟草在2d内开始发黄，7-8d后几乎全部死亡；而转基因烟草能够存活5周以上。从图5可知转基因烟草可在250mmol.L-1的NaCl培养基上正常生长，非转基因烟草在250mmol.L-1的NaCl培养基上干枯死亡。结果证明，该基因对盐的胁迫确有抗性。
而在上述各种NaCl浓度下，转入dap基因(DRB0118)的烟草均能正常生长。
上述实验结果见表1：
表1转基因烟草和非转基因烟草对盐胁迫的比较
4、实验结论
上述结果表明，所克隆的dap基因(DRB0118)的功能与植物对盐的耐受性有关，而且在烟草中超表达，植株能最大耐受250mmol.L-1的NaCl。
Claims (9)
1.Deinococcus radiodurans R1dap基因(DRB0118，GeneID：1799871)培育耐盐植物的用途。
2.含Deinococcus radiodurans R1dap基因的重组质粒。
3.含有D.radiodurans R1dap基因的重组工程菌株。
4.含Deinococcus radiodurans R1dap基因的重组质粒培育耐盐植物的用途。
5.权利要求4所述的用途，所述重组质粒是能在大肠杆菌表达的质粒。
6.权利要求4所述的用途，所述重组质粒是能在植物中表达的质粒。
7.权利要求4所述的用途，所述重组质粒转化的宿主细胞培育耐盐植物的用途。
8.权利要求7所述的用途，所述宿主细胞包括原核细胞和真核细胞。
9.权利要求1或4所述的用途，所述植物是烟草。
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