CN102552431A

CN102552431A - 一种治疗造影剂肾病的组合药物

Info

Publication number: CN102552431A
Application number: CN2012100359091A
Authority: CN
Inventors: 龚学忠
Original assignee: Shanghai traditional chinese medicine hospital
Current assignee: Shanghai traditional chinese medicine hospital
Priority date: 2012-02-17
Filing date: 2012-02-17
Publication date: 2012-07-11

Abstract

本发明涉及一种治疗造影剂肾病（CIN）的中药组合药物，所述的中药组合药物由以下重量份的原料药制成：制大黄1-3份、川芎1份。本发明还提供这种中药组合药物的应用。本发明优点在于：本发明的中药组合药物，其配伍符合中药“君臣佐使”原则，经药效学实验验证，能有效保护CIN模型大鼠的肾功能，表现出较好的防治CIN的效应，机制研究发现能通过抑制Caspase3表达进而拮抗大鼠肾小管上皮细胞凋亡来保护大鼠肾功能。药味数较少，毒副作用小，成本较低，适于长期服用。本发明为治疗CIN提供了一种新的中药组合物，具有很好的应用前景。

Description

一种治疗造影剂肾病的组合药物

技术领域

本发明涉及一种中药组合药物，具体地说，是一种治疗造影剂肾病的中药组合药物。

背景技术

造影剂肾病 (contrast-induced nephropathy, CIN)是指由碘造影剂(contrast media，CM)的使用而引起的肾病，主要表现为急性肾功能衰竭(acute renal failure, ARF)。近年研究表明肾小管上皮细胞凋亡参与了CIN病理过程，并被认为是CM致肾损害和肾功能衰竭的主要原因。

CIN在祖国医学并无相应病名，但由于其主要表现为急性肾功能衰竭，因而可以归属为“关格”、“溺毒”的范畴。现在已经明确，在高危人群，比如70岁以上老年人或者慢性肾病、糖尿病、高血压患者，使用含碘造影剂后容易导致CIN发生，从病理学改变的角度，主要表现为造影剂使用后直接导致肾血管痉挛性收缩、血液流变性失常进而降低肾脏血流，导致肾脏血流“盗血”效应，即血流从相对缺血的髓质流向皮质，加重了肾髓质缺血。

中国专利文献CN1325094C公开了一种治疗尿毒症及肾阳虚、肾衰竭的药物及其制备方法，由黄芪、川芎、丹参和大黄构成，具有温补脾肾，活血化瘀，渗湿泄浊的功能。中国专利文献CN101181466B公开了一种治疗肾病的中药剂，由冬虫夏草、黄芪、甘草、大黄、五味子、海藻、生地、熟地、川芎、麝香、牛黄、何首乌、淮山药、西洋参和当归组成，具有补气阴不碍湿、清热解毒不伤正的功效，治疗效果显著。谭倩等公开了治疗造影剂肾病的中药处方，由生大黄、生牡蛎、丹参、蒲公英和六月雪组成，适用于湿热浊毒的关格患者，大黄、炮附子、牡蛎、丹参和蒲公英，适用于寒湿浊毒内结和有寒热错杂证候的关格患者（详见：谭倩等.造影剂肾病的中医药防治[J].家庭医学,2010:29.）这些药物往往药味数较多，不便于制备使用，目前临床上关于一种药味数较少且疗效显著的治疗造影剂肾病的组合药物还未见报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种治疗造影剂肾病的中药组合药物。

本发明的再一的目的是，提供一种治疗造影剂肾病的中药组合药物的应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：一种治疗造影剂肾病的中药组合药物，所述的中药组合药物由以下重量份的原料药制成：制大黄1-3份、川芎1份。

所述的中药组合药物由以下重量份的原料药制成：制大黄1份、川芎1份。

所述的中药组合药物由以下重量份的原料药制成：制大黄2份、川芎1份。

所述的中药组合药物由以下重量份的原料药制成：制大黄3份、川芎1份。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：所述的中药组合药物在制备治疗造影剂肾病的药物中的应用。

本发明优点在于：

本发明的中药组合药物，其配伍符合中药“君臣佐使”原则，经药效学实验验证，能有效保护CIN模型大鼠的肾功能，表现出较好的防治CIN的效应，机制研究发现能通过抑制Caspase3表达进而拮抗大鼠肾小管上皮细胞凋亡来保护大鼠肾功能。药味数较少，毒副作用小，成本较低，适于长期服用。本发明为治疗造影剂肾病提供了一种新的中药组合物，具有很好的应用前景。

附图说明

附图1是光镜下各组大鼠肾脏病理形态学改变（HE，×200）。

附图2是TUNEL法检测各组大鼠肾小管上皮细胞凋亡（×400），A：正常组TUNEL染色，B：模型组TUNEL染色，C：中药组合药物高剂量组TUNEL染色，D：中药组合药物低剂量组TUNEL染色，E：各组凋亡指数（AI）分析（**表示与A组相比p<0.01，##表示与B组相比p<0.01，+表示与C组相比p<0.05）。

附图3是western印迹法测定各组肾组织Caspase3蛋白表达，**表示与A组比较p<0.01，##表示与B组比较p<0.01。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

一种治疗造影剂肾病的中药组合药物，所述的中药组合药物由以下重量份的原料药制成：制大黄1-3份、川芎1份。

实施例1 中药组合药物的制备（一）

制大黄1份，川芎1份，常规方法煎煮。

实施例2 中药组合药物的制备（二）

制大黄2份，川芎1份，常规方法煎煮。

实施例3 中药组合药物的制备（三）

制大黄3份，川芎1份，常规方法煎煮。

实施例4 中药组合药物的制备（四）

制大黄1.2份，川芎1份，常规方法煎煮。

实施例5 中药组合药物的制备（五）

制大黄1.4份，川芎1份，常规方法煎煮。

实施例6 中药组合药物的制备（六）

制大黄1.6份，川芎1份，常规方法煎煮。

实施例7 中药组合药物的制备（七）

制大黄1.8份，川芎1份，常规方法煎煮。

实施例8 中药组合药物的制备（八）

制大黄2.2份，川芎1份，常规方法煎煮。

实施例9 中药组合药物的制备（九）

制大黄2.4份，川芎1份，常规方法煎煮。

实施例10 中药组合药物的制备（十）

制大黄2.6份，川芎1份，常规方法煎煮。

实施例11 中药组合药物的制备（十一）

制大黄2.8份，川芎1份，常规方法煎煮。

需要说明的是，实施例1-11所述的常规方法煎煮是中药汤剂常规的制作方法，即将所述的原料药加水煎煮成汤剂。

实施例12

一、材料和方法

1. 动物和试剂：雄性SD大鼠32只，体重200±20g，由中科院上海实验动物中心提供。消炎痛、L-NAME（L-NAME，即N _ω-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride，分子式为C₇H₁₅N₅O₄·HCl，是NOS (nitric oxide synthase)的非选择性抑制物）、NAC(N-acetylcysteine)均购自Sigma公司，造影剂Iohexol购自通用电气药业(上海)公司。TUNEL试剂盒为美国Roche产品，Caspase3多克隆抗体购自 Cell Signaling公司。

2. 动物模型的建立及分组：随机分为4组，每组8只：A组为正常组，B组为模型组，C组为中药组合药物高剂量组，D组为中药组合药物低剂量组。其中B-C-D三组均按照文献制备CIN模型，具体方法如下：尾静脉注射10 mg/kg消炎痛；15min后注射10 mg/kg L-NAME；15min后注射2 g iodine/kg 的iohexol (350 mg iodine/ml)；A组注射等量PBS液。本发明的中药组合物水煎液（参照实施例2所述的方法制备）浓缩成每毫升含生药2.25g，C、D组于造模前7天每日灌胃中药组合物水煎液，灌胃量分别为成人标准体重（60kg）常规用量50和20倍。

3. 肾功能和组织形态学检测：

3.1. 肾功能检测：造模后24h处死动物，尾静脉采血，分离血清，由全自动生化分析仪测定血清肌酐、尿素氮。

3.2. 肾组织形态学检测：大鼠乙醚麻醉，腹正中切开，取双肾，左肾分别戊二醛+锇酸固定及放入-80℃冰箱，用于western印迹检测；右肾经多聚甲醛固定后，乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片，用于HE染色及TUNEL检测。

3.3. 细胞凋亡检测：按照美国罗氏公司（Roche）产品说明书进行，步骤包括：肾组织常规固定，石蜡包埋后切片5μm，常规脱蜡、水合，Proteinase K工作液处理，加TUNEL反应液，加converter-POD，加底物DAB显色系统，光镜下观察，细胞核呈棕黄色的为凋亡细胞。在细胞凋亡区域，随机选取5个视野(x200)，以肾小管上皮细胞凋亡阳性细胞数占肾小管上皮细胞总数的百分比作为肾小管上皮细胞凋亡指数(AI)。同时设阴性对照。

3.4. western印迹检测caspase3蛋白表达：组织块称重、粉碎，裂解液裂解，考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。上样、电泳、转膜(100mA 40分钟)，放入到丽春红染色剂中染色5 min，观察蛋白转移效果，将转移成功的转移膜浸入5%脱脂奶粉封闭液中，37℃封闭2h；加一抗4℃过夜，加辣根过氧化酶标记的二抗室温反应1h，用ECL化学发光法检测，x线片显影成像，将显色条带扫描至计算机中，以beta-actin为内参，Gel-Pro凝胶分析软件半定量分析。

4. 统计学分析计量资料数据以 ±s表示，组间差异用单因素方差分析。用SPSS15.0统计软件进行统计学分析。

二、结果

1. 本发明的中药组合药物水煎液对CIN大鼠肾功能的影响：如表1所示：造模后24hB组大鼠出现了肾损伤，表现为Scr、BUN均较A组明显升高（p<0.01）；而C、D组虽都不能将Scr和BUN完全恢复正常，但均能有效防止造模导致的肾功能减退，其中在降低Scr方面C组较D组更强，与B组相比p分别<0.01和<0.05；在降低BUN方面，C、D组效果相近，与B组相比均p<0.01。

表1 肾功能检查(

±s)

组别	Scr(umol/L)	BUN(mmol/L)
			A组	31.42±4.84	6.24±1.12
B组	69.08±17.22**	30.45±6.02**
			C组	38.07±5.29*^##	15.80±2.91*^##
D组	40.77±6.42**^#	15.94±2.79*^##

注：*表示与A组相比p<0.05，**表示与A组相比p<0.01；^#表示与B组相比p<0.05，^##表示与B组相比p<0.01。

2. 肾脏病理形态学改变：请参照附图1A-D，附图1是光镜下各组大鼠肾脏病理形态学改变（HE，×200），与A组相比，B组大鼠镜下出现严重的肾小管-间质病变，表现为肾小管区胞浆内空泡样变和肾小管内明显蛋白管型，C组肾小管-间质病变明显减轻，D组肾小管-间质病变仍明显。附图1显示：光镜下模型组大鼠肾间质水肿，大片肾小管上皮细胞胞浆空泡样变，小管上皮细胞刷状缘脱落，并可见蛋白管型。C、D组均能有效减轻大鼠肾间质病变，但以C组作用更明显，D组仍可见到间质水肿及较多肾小管上皮细胞胞浆空泡样变及管型。

3. 本发明的中药组合药物水煎液对CIN大鼠肾小管上皮细胞凋亡指数的影响：请参照附图2，附图2是TUNEL法检测各组大鼠肾小管上皮细胞凋亡（×400），A：正常组TUNEL染色，B：模型组TUNEL染色，C：中药组合药物高剂量组TUNEL染色，D：中药组合药物低剂量组TUNEL染色，E：各组AI分析（**表示与A组相比p<0.01，##表示与B组相比p<0.01，+表示与C组相比p<0.05）。TUNEL法检测显示，正常组A组大鼠肾组织未见到凋亡细胞，模型组B组大鼠肾组织可见明显肾小管上皮细胞凋亡（图2 A-B）；与A组相比，C和D组肾组织凋亡细胞显著减少（图2 C-D）、AI值显著下降（p<0.01），并且C组在降低AI方面较D组更明显（p<0.05）（图2 E）。

4. 本发明的中药组合药物水煎液对CIN大鼠肾组织Caspase3蛋白表达的影响：请参照附图3，附图3是western印迹法测定各组Caspase3蛋白表达，**表示与A组比较p<0.01，##表示与B组比较p<0.01。Western 印迹结果显示，与A组相比，B组肾组织Capase3蛋白表达明显增多（p<0.01），C、D组均可显著抑制造模引起的Capase3蛋白表达的上调（p<0.01）。

三、讨论

CIN目前是院内获得性急性肾衰第三位病因。对于该疾病，仍然缺乏较好的防治办法。除细胞凋亡外，另有三方面机制被认为可能与CIN发生有关，一是造影剂使用后导致血流从相对缺血的髓质流向皮质，加重了肾髓质缺血；二是造影剂对肾脏固有细胞的直接毒性，特别是对肾小管上皮细胞的分子毒性；三是过氧化损伤。其判定标准是使用造影剂48小时内出现血清肌酐升高超过基础值25%或者绝对值升高超过0.5mg/d（详见：Antoniol LB, Giancarlo M. Contrast-Induced Nephropathy. Journal of Interventional Cardiology 2008, 21(1):74-85.）。

本发明的研究复制了CIN大鼠模型，结实显示造影剂使用后24小时血清肌酐较正常大鼠翻倍，形态学提示肾组织发生广泛的肾间质水肿，大片肾小管上皮细胞胞浆空泡样变，肾小管上皮细胞刷状缘脱落，并可见蛋白管型，与国外文献报道一致（详见：Yukiyo Yokomaku, Toshiro Sugimoto, Shinji Kume,et al.Asialoerythropoietin Prevents Contrast-Induced Nephropathy. J Am Soc Nephrol 2008,19: 321–328.）。电镜和TUNEL检测等都进一步证实模型大鼠肾组织发生了肾小管上皮细胞凋亡，从而为细胞凋亡机制作为CIN的主要发病机制之一提供了进一步的体内研究依据。Caspase 3是凋亡过程中的关键酶，我们发现CIN模型大鼠肾组织Caspase3蛋白表达显著升高，提示模型大鼠肾小管上皮细胞凋亡的分子机制是Caspase3依赖。

除了对CIN发病机制还未完全弄清之外，迄今亦缺乏有效的防治CIN办法，除造影剂使用前后充分“水化”被CIN防治指南确认为能肯定防治CIN外，即使是NAC (N-acetylcysteine) 也需更多的临床证据进一步支持。因此进行有关中医药研究显得很为必要。

CIN在祖国医学并无相应病名，但由于其主要表现为急性肾功能衰竭，因而可以归属为“关格”、“溺毒”的范畴。本发明立足中医学理论，并结合“血瘀证”实质研究进展，将CIN中医病因病机关键归纳为“毒为先导、毒瘀互结”，并拟定了“解毒化瘀”的中医治法和制大黄－川芎组成的本发明的中药组合药物进行相关研究，取得了一定效果。本发明建立了CIN大鼠模型，发现制大黄－川芎组合药物确实能有效抑制造模导致的血清肌酐和尿素氮的升高，抑制模型大鼠肾小管上皮细胞凋亡，并且大剂量组在降低Scr方面较小剂量更好。形态学分析发现，本发明的中药组合药物预处理能有效减轻模型大鼠肾间质充血水肿，使得肾小管上皮细胞胞浆空泡样变显著减轻，TUNEL分析中本发明的中药组合药物处理组凋亡指数（AI）明显下降，提示制大黄－川芎对CIN大鼠的肾保护效应与抑制细胞凋亡有关。对Caspase3蛋白表达的研究发现，本发明的中药组合药物是能通过抑制Caspase3表达进而拮抗大鼠肾小管上皮细胞凋亡来保护大鼠肾功能。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种治疗造影剂肾病的中药组合药物，其特征在于，所述的中药组合药物由以下重量份的原料药制成：制大黄1-3份、川芎1份。

2.根据权利要求1所述的中药组合药物，其特征在于，所述的中药组合药物由以下重量份的原料药制成：制大黄1份、川芎1份。

3.根据权利要求1所述的中药组合药物，其特征在于，所述的中药组合药物由以下重量份的原料药制成：制大黄2份、川芎1份。

4.根据权利要求1所述的中药组合药物，其特征在于，所述的中药组合药物由以下重量份的原料药制成：制大黄3份、川芎1份。

5.根据权利要求1-4任一所述的中药组合药物在制备治疗造影剂肾病的药物中的应用。