CN102516362B

CN102516362B - 一种胸腺五肽的制备方法

Info

Publication number: CN102516362B
Application number: CN201110442546.9A
Authority: CN
Inventors: 崔学云; 杨平
Original assignee: HAINAN ZHONGHE PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: Hainan Zhonghe Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority date: 2011-12-26
Filing date: 2011-12-26
Publication date: 2014-04-16
Anticipated expiration: 2031-12-26
Also published as: CN102516362A

Abstract

本发明涉及多肽类药物的制备，尤其涉及一种抗肿瘤辅助用药胸腺五肽的制备方法。本发明的制备方法，包括以下步骤：氨基酸树脂PEG-wang树脂-Tyr(tbu)-OH和高吸水性树脂混合；将Fmoc-Val-OH先溶解于DCM/DMF溶液中，连同HOBt/DMF/DIC混合溶液加入到上述混合树脂中；依次用DMF、乙醇、DCM洗涤，完成Fmoc-Val-OH的连接；同法依次连接Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg-OH，连接后经TFA∶EDT∶水＝95∶3∶2的裂解试剂裂解，滤除树脂，滤液加入到无水乙醚中，待沉降后吸出上清液，沉淀物加入等体积纯化水，震荡后静置分层，水层用无水乙醚萃取洗涤后浓缩，浓缩液冻干即得胸腺五肽。

Description

一种胸腺五肽的制备方法

技术领域

本发明涉及多肽类药物的制备，尤其涉及一种抗肿瘤辅助用药胸腺五肽的制备方法。

背景技术

胸腺五肽(Thymopentin)，也称之为TP-5、胸腺喷丁，其结构式及多肽序列为：

分子式：C₃₀H₄₉N₉O₉，分子量：679.77。

已有胸腺五肽制剂为注射用胸腺五肽，临床上主要用于治疗乙肝以及抗肿瘤辅助用药，是一个双向免疫调节药物。

已知的通过固相合成法制备胸腺五肽的制备方法较多，但大多在工业化时存在合成周期长、收率较低、粗品纯度差的问题。

早期工业化采用Boc保护氨基酸作为起始物料的工艺已经逐步被淘汰，原因是其反应过程中多次重复使用TFA(三氟乙酸)作为脱保护试剂，同时全部氨基酸偶联完成后在裂解制得多肽粗品时使用氟化氢作为脱保护的试剂，而氟化氢为强腐蚀性试剂，裂解反应剧烈，三氟乙酸和氟化氢对设备、管路、操作人员都有非常大的损害，存在安全生产和劳动保护问题。

Fmoc作为氨基保护基的合成策略的特点是避免了裂解时反复使用强酸和腐蚀性试剂。而且利用每次用温和的碱溶液脱保护时生成的易检测的化合物，直接监控反应的进程，并能使合成反应向自动化方向发展。Fmoc法合成时反应条件温和，可合成酸敏感型的氨基酸衍生物，因此，近年来学者们大多以Fmoc保护氨基酸作为合成胸腺五肽的起始物料，采用三氟乙酸作为主要的裂解试剂。

目前使用Fmoc保护氨基酸策略制备胸腺五肽的文献资料有：

天津大学化工学院张成刚的硕士论文《胸腺五肽和扶素康的固相合成及纯化》以Fmoc-Tyr(tBu)-OH和wang树脂为起始物料，DMF为反应溶剂，HATU为缩合剂，TFA∶p-甲基苯酚∶EDT∶水为97∶0.25∶0.25∶2.5(V/V)的切割条件，2倍过量进行缩合反应，反应时间为3h。反应结果胸腺五肽纯度达80.36％，收率达79.68％。该方法的缺点是HATU作为缩合剂要比HBTU价格高出四倍多，而且合成时间较长。

南京工业大学宋明媚的硕士学位论文《胸腺五肽固相合成的工艺优化与放大》采用工艺为：使用担载量为1毫摩尔/g的Wang树脂，DIC/HOBt/DMAP法连接Tyr与树脂，溶剂为45％DMF/THF，反应5h；肽链延长过程中每个氨基酸的连接均使用DIC/HOBt法，溶剂为45％DMF/THF，反应1h。切割试剂采用95％TFA/TIS/H20，反应3.5h，温度24℃，树脂洗涤液为95％TFA/DCM。胸腺五肽的产率为86.7％，纯度为88.9％。此方法虽然合成时间短，但裂解时间较长。

王卫国等人(《微波辅助固相合成胸腺五肽的研究》，有机化学，2006年第26卷第6期826-830)在胸腺五肽的固相合成中，以Fmoc-Tyr(tBu)-OH和wang树脂为起始物料，引入微波辅助技术，反应速率提高了15倍以上，氨基酸过量倍数也从传统的三倍降低到过量一倍。减少胸腺五肽的合成成本约40％；最终得到以吡啶/DMF为溶剂，HOBt为缩合试剂，反应物浓度为0.113毫摩尔/L，反应时间为4分钟，反应温度为20℃的最佳反应条件，此时胸腺五肽的产率最高，为88.7％。但是，受限于微波反应器在工业化生产中当前的应用不是十分普遍，而且其工艺为小试规模，距离工业化大生产尚需时日。

中国专利CN 1865279B《固相多肽合成胸腺五肽的制备方法》揭示胸腺五肽的固相合成方法为：(1)以CTC树脂或Wang树脂为起始原料，以Fmoc保护的氨基酸为单体，以TBTU/HOBt或HBTU/HOBt为缩合剂，逐个接上氨基酸，最后一个肽链采用Boc-Arg-OH；(2)将切肽试剂加入步骤(1)的产物中进行切肽，加入乙醚沉淀，收集粗品；(3)将步骤(2)的粗品采用C18或C8柱进行分离纯化，获得目标产物。每步接肽收率约为98％，最后一个肽链采用Boc-Arg-OH的方法，降低了生产成本，简化工艺，切肽后乙醚沉淀粗品，避免使用剧毒的氟化氢，三废污染少。采用C18柱进行分离纯化，避免使用三氟乙酸，减小三废，纯化收率≥50％，每步接肽收率均在98％以上；切肽后收率为88％，分离纯化收率为52％，总收率约为44％。

中国专利申请200510060558《胸腺五肽合成工艺方法》，其以Fmoc-Tyr(tBu)-OH和wang树脂为起始物料，然后用保护氨基酸Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH依次接二肽、三肽和四肽，其特征在于其后以保护氨基酸Boc-Arg-OH·HCl接五肽，接肽工作完成后充分洗涤，然后切肽、后处理即得胸腺五肽粗品。合成胸腺五肽路线基本与中国专利CN 1865279B相同。

中国专利CN200410002607《混合酸酐法合成胸腺五肽》在反应过程中引入了钯碳，这在目前工业化生产多肽中极为少用，主要是因为钯碳价格昂贵且钯碳易于在有机溶剂中自燃，带来安全隐患。

其他报道的合成胸腺五肽的方法还有：

中国专利200510011544.9《胸腺五肽合成方法》以羧基和羟基用叔丁基保护的酪氨酸为原料，通过四次缩合反应，依次连接由叔丁基或叔丁氧羰基保护的缴氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸，生成保护五肽，然后脱除保护基；其中在连接精氨酸合成五肽步骤中采用叔丁氧羰基对精氨酸进行保护。该方法为液相合成方法，每步需要精制纯化，操作繁琐的同时，收率在多次纯化后势必大大降低，工业化前景不乐观。

在上述的专利和文献报道中，我们不难发现，在使用Fmoc保护策略采用固相合成胸腺五肽的整个过程中未考虑树脂溶胀程度对于缩合反应的影响，未考虑其他偶联的氨基酸的溶解特性和反应生成的水分的控制，在整个反应过程中，大多以缩合的保护氨基酸过量2-5倍为解决缩合效率的手段。

我们惊喜的发现，新型氨基酸树脂PEG-wang树脂-Tyr(tbu)-OH，其结构式如下：

在制备胸腺五肽原料药时以PEG-wang树脂-Tyr(tbu)-OH作为起始物料，其优点在于PEG-wang树脂-Tyr(tbu)-OH的溶胀系数优于wang树脂-Tyr(tbu)-OH，促进缩合反应速率，而高吸水性树脂可以快速地在短时间内吸收反应溶剂中引入的水分和反应时产生的水分，加速正反应的进行，提高缩合效率，而使用DCM/DMF溶液对欲连接于树脂的保护氨基酸先一步溶解，提高了保护氨基酸的溶解度，减少保护氨基酸的投料量，提高了胸腺五肽的粗品的收率和纯度。

发明内容

本发明采用新型氨基酸树脂PEG-wang树脂-Tyr(tbu)-OH，混合适量的高吸水性树脂，将Fmoc-Val-OH先溶解于适量DCM/DMF溶液中，连同OBt/DMF/DIC混合溶液加入到上述树脂中搅拌反应1.5h后，依次用DMF、乙醇、DCM洗涤后，依次按照上述方法连接Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg-OH，经TFA∶EDT∶水＝95∶3∶2的裂解试剂裂解2h后，滤除树脂，滤液加入到无水乙醚中，待沉降后吸出上清液，沉淀物加入等体积纯化水，震荡后静置分层，水层用无水乙醚萃取洗涤后浓缩，浓缩液冻干即得胸腺五肽粗品，粗品通过反相液相色谱法纯化后冻干，得胸腺五肽原料药。

该方法可以应用于工业化大规模生产高纯度的胸腺五肽原料药，提高了胸腺五肽的生产效率和胸腺五肽原料药的纯度，其特征在于使用PEG-Wang树脂-Fmoc-Tyr(tBu)-OH为起始物料，高分子吸水树脂作为脱水剂，将后续将要偶联的fmoc保护的Val、Asp、Lys和Arg等四个保护氨基酸先用DCM/DMF溶液溶解后，再进行偶联，脱去保护基后，制得胸腺五肽粗品，粗品经色谱法纯化后冻干制得胸腺五肽原料药。

本发明的目的是提供一种高收率更高和节约保护氨基酸用量的合成胸腺五肽的方法。

本发明的胸腺五肽的制备方法步骤如下：

步骤1，氨基酸树脂PEG-wang树脂-Tyr(tbu)-OH和高吸水性树脂混合；

步骤2，将Fmoc-Val-OH先溶解于DCM/DMF溶液中，连同HOBt/DMF/DIC混合溶液加入到上述混合树脂中；

步骤3，依次用DMF、乙醇、DCM洗涤，完成Fmoc-Val-OH的连接；

步骤4，以同样方法依次连接Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg-OH，连接后经TFA∶EDT∶水＝95∶3∶2的裂解试剂裂解，滤除树脂，滤液加入到无水乙醚中，待沉降后吸出上清液，沉淀物加入等体积纯化水，震荡后静置分层，水层用无水乙醚萃取洗涤后浓缩，浓缩液冻干即得胸腺五肽。

本发明的胸腺五肽的制备方法，还包括将步骤4所得到的粗品胸腺五肽经过反相液相色谱法纯化得到胸腺五肽纯品的步骤。

本发明的胸腺五肽的制备方法，其中，步骤1的方法如下：取PEG-wang树脂-Tyr(tbu)-OH，加入到反应容器内，加入二甲基甲酰胺2000毫升洗涤1次，加入二甲基甲酰胺2000毫升浸泡60分钟，加入二氯甲烷2000毫升洗涤1次；加入2000毫升20％的六氢吡啶的二甲基甲酰胺溶液洗涤两次，每次5分钟，用1000毫升二甲基甲酰胺洗涤3次，1000毫升乙醇洗涤2次，1000毫升二氯甲烷洗涤2次，再加入1g-100g，优选50g的高吸水性树脂。

本发明的胸腺五肽的制备方法，其中，步骤2的方法如下：将240毫摩尔的Fmoc-Val-OH先溶解于1000毫升体积比为0.5～1∶0.125～1，优选1∶1的二氯甲烷/二甲基甲酰胺混合溶剂中搅拌溶解，加入1-羟基苯骈三氮唑600毫摩尔、1000毫升二甲基甲酰胺搅拌后，再加入360毫摩尔的二异丙基碳二亚胺，搅拌反应10分钟后加入到树脂中，搅拌反应1.5小时。

本发明的胸腺五肽的制备方法，其中，步骤3的方法如下：用2000毫升二甲基甲酰胺洗涤3次，2000毫升乙醇洗涤2次，2000毫升二氯甲烷洗涤2次，完成Fmoc-Val-OH的连接。

本发明的胸腺五肽的制备方法，其中，步骤4的方法如下：同法依次连接Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg-OH，再用2000毫升甲醇洗涤2次，取出烘干，烘干后的肽树脂按每克肽树脂用2000毫升裂解试剂计算需配制的裂解试剂的总量，按三氟乙酸∶乙二硫醇∶水＝95∶3∶2的比例配制裂解试剂，将树脂悬浮于配制好的裂解试剂中，搅拌反应2小时，滤除树脂，滤液加入到无水乙醚中，待沉降后吸出上清液，加入与剩余体积相等的纯化水，振荡后静置分层，水层用无水乙醚萃取洗涤两次，浓缩后冷冻干燥，得胸腺五肽。

本发明的胸腺五肽的制备方法，其中，步骤1的PEG-wang树脂-Tyr(tbu)-OH是由以下方法制备的：取PEG-wang树脂200毫摩尔，加入到反应容器内，加入二甲基甲酰胺2000毫升洗涤1次，加入二甲基甲酰胺2000毫升浸泡60分钟，加入二氯甲烷2000毫升洗涤1次，取Fmoc-Tyr(tBu)-OH600毫摩尔、1-羟基苯骈三氮唑600毫摩尔、DMAP 60毫摩尔，加入1000毫升二甲基甲酰胺搅拌溶解后，加入720毫摩尔的二异丙基碳二亚胺，搅拌反应10分钟后加入到树脂中，搅拌反应3小时，反应完毕后用2000毫升二甲基甲酰胺洗涤3次，2000毫升甲醇洗涤1次，2000毫升二氯甲烷洗涤2次，2000毫升甲醇洗涤2次，取出烘干即得PEG-wang树脂-Tyr(tbu)-OH。

本发明的胸腺五肽的制备方法，还包括将所得到的粗品胸腺五肽经过色谱柱纯化得到胸腺五肽纯品的步骤。优选的纯化步骤如下：将步骤4得到的胸腺五肽粗品用适量纯化水溶解后作为上样的样品，通过以下色谱条件纯化：

流动相A：0.3％HAC，流动相B：乙腈，波长：225nm

洗脱梯度表如下：

收集16-40分钟的洗脱液，将洗脱液用旋转蒸发仪浓缩后，用RCX-30阴离子交换柱填料转成无醋酸盐，转盐步骤：离子柱用0.3％HAC冲洗到酸性，上样，用纯化水冲到中性，用5％NH3.H2O洗脱，收集洗脱液，将上述洗脱液经过转盐后，装入冻干盘中，待所有灌装了胸腺五肽的冻干盘全部转移至冻干机后，开启冻干机，按设定冻干曲线进行冻干，-40℃预冻2小时，抽真空至20Pa以下，1小时升温至-5℃，保持30小时；1小时升温至5℃，保持5小时；1小时升温至30℃，保持3小时；释放真空、出箱，冻干过程中制品温度不得超过35℃，整个过程需40小时，得胸腺五肽纯品。

本发明的试剂和仪器的说明：

仪器	型号	生产厂商
			多肽固相合成仪	JBP-50	海南建帮科技
Waters 2695e	Waters 2695e	Waters公司
			色谱柱	Luna C18	菲罗门公司
质谱仪	ZQ-4000	Waters公司

具体实施方式

以下实施例是为了说明本发明而非限制本发明，任何符合本发明的实质的技术方案和工艺均属于本发明的保护范围。

实施例1：自制多肽固相合成反应器

按上述发明内容的步骤1制备PEG-wang树脂-Tyr(tbu)-OH后，按发明内容的步骤2制备胸腺五肽粗品：取制备好的PEG-wang树脂-Tyr(tbu)-OH，加入到反应容器内，加入DMF 2000毫升洗涤1次，加入DMF 2000毫升浸泡60分钟，加入DCM 2000毫升洗涤1次。加入2000毫升20％的六氢吡啶的DMF溶液洗涤两次，每次5分钟。用1000毫升DMF洗涤3次，1000毫升乙醇洗涤2次，1000毫升DCM洗涤2次。再加入5g高吸水性树脂(KL150-300A型，南通科力吸水树脂有限公司)，将240毫摩尔的Fmoc-Val-OH先溶解于1000毫升DCM/DMF(体积比为4∶1)中搅拌溶解，加入HOBt 600毫摩尔、1000毫升DMF搅拌后，再加入360毫摩尔的DIC，搅拌反应10分钟后加入到树脂中，搅拌反应1.5h。用2000毫升DMF洗涤3次，2000毫升乙醇洗涤2次，2000毫升DCM洗涤2次，完成Fmoc-Val-OH的连接。同法依次连接Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg-OH，再用2000毫升甲醇洗涤2次，取出烘干。烘干后的肽树脂按每克肽树脂用2000毫升裂解试剂计算需配制的裂解试剂的总量。按TFA∶EDT∶水＝95∶3∶2的比例配制裂解试剂，将树脂悬浮于配制好的裂解试剂中，搅拌反应2h。滤除树脂，滤液加入到无水乙醚中，待沉降后吸出上清液，加入与剩余体积相等的纯化水，振荡后静置分层。水层用无水乙醚萃取洗涤两次，浓缩后冷冻干燥，得胸腺五肽粗品。

按照上述发明内容的步骤3进行胸腺五肽粗品的纯化，按照发明内容的步骤4制备胸腺五肽原料药，粗肽纯度79.2％，纯品纯度95.9％，纯化收率84％，总收率为71％。

实施例2：

按上述发明内容的步骤1制备PEG-wang树脂-Tyr(tbu)-OH后，按发明内容的步骤2制备胸腺五肽粗品：取制备好的PEG-wang树脂-Tyr(tbu)-OH，加入到反应容器内，加入DMF 2000毫升洗涤1次，加入DMF 2000毫升浸泡60分钟，加入DCM 2000毫升洗涤1次。加入2000毫升20％的六氢吡啶的DMF溶液洗涤两次，每次5分钟。用1000毫升DMF洗涤3次，1000毫升乙醇洗涤2次，1000毫升DCM洗涤2次。再加入50g高吸水性树脂(KL150-300A型，南通科力吸水树脂有限公司)，将240毫摩尔的Fmoc-Val-OH先溶解于1000毫升DCM/DMF(体积比为1∶1)中搅拌溶解，加入HOBt 600毫摩尔、1000毫升DMF搅拌后，再加入360毫摩尔的DIC，搅拌反应10分钟后加入到树脂中，搅拌反应1.5h。用2000毫升DMF洗涤3次，2000毫升乙醇洗涤2次，2000毫升DCM洗涤2次，完成Fmoc-Val-OH的连接。同法依次连接Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg-OH，再用2000毫升甲醇洗涤2次，取出烘干。烘干后的肽树脂按每克肽树脂用2000毫升裂解试剂计算需配制的裂解试剂的总量。按TFA∶EDT∶水＝95∶3∶2的比例配制裂解试剂，将树脂悬浮于配制好的裂解试剂中，搅拌反应2h。滤除树脂，滤液加入到无水乙醚中，待沉降后吸出上清液，加入与剩余体积相等的纯化水，振荡后静置分层。水层用无水乙醚萃取洗涤两次，浓缩后冷冻干燥，得胸腺五肽粗品。

按照上述发明内容的步骤3进行胸腺五肽粗品的纯化，按照发明内容的步骤4制备胸腺五肽原料药，粗肽纯度95.3％，纯品纯度98.7％，纯化收率90％，总收率为80％。

实施例3：固相合成胸腺五肽的HPLC鉴定

RP-HPLC分析确定胸腺五肽：

实施例1的固相化学合成胸腺五肽粗品0.5g，以胸腺五肽标准品(海南中和药业有限公司)和合成粗品进行RP-HPLC分析，分析方法采用国家食品药品监督管理局颁布的国家药品标准WS1-(X-027)-2004Z的【鉴别】2项和检查项下的有关物质检测方法。

仪器：Waters 515(Waters公司)

在同一色谱分析条件下，合成胸腺五肽粗品在同一保留时间有一明显主峰，可以初步断定固相合成多肽中含有胸腺五肽。

Claims

1.一种胸腺五肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1，氨基酸树脂PEG-wang树脂-Tyr（tbu）-OH和高吸水性树脂混合；

步骤3，依次用DMF、乙醇、DCM洗涤，完成Fmoc-Val-OH的连接；

步骤4，同法依次连接Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg-OH，连接后经TFA：EDT：水=95:3:2的裂解试剂裂解，滤除树脂，滤液加入到无水乙醚中，待沉降后吸出上清液，沉淀物加入等体积纯化水，震荡后静置分层，水层用无水乙醚萃取洗涤后浓缩，浓缩液冻干即得胸腺五肽。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，还包括将步骤4所得到的粗品胸腺五肽经过反相液相色谱法纯化得到胸腺五肽纯品的步骤。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1的方法如下：取PEG-wang树脂-Tyr（tbu）-OH，加入到反应容器内，加入二甲基甲酰胺2000毫升洗涤1次，加入二甲基甲酰胺2000毫升浸泡60分钟，加入二氯甲烷2000毫升洗涤1次；加入2000毫升20%的六氢吡啶的二甲基甲酰胺溶液洗涤两次，每次5分钟，用1000毫升二甲基甲酰胺洗涤3次，1000毫升乙醇洗涤2次，1000毫升二氯甲烷洗涤2次，再加入1g-100g高吸水性树脂。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1的方法如下：取PEG-wang树脂-Tyr（tbu）-OH，加入到反应容器内，加入二甲基甲酰胺2000毫升洗涤1次，加入二甲基甲酰胺2000毫升浸泡60分钟，加入二氯甲烷2000毫升洗涤1次；加入2000毫升20%的六氢吡啶的二甲基甲酰胺溶液洗涤两次，每次5分钟，用1000毫升二甲基甲酰胺洗涤3次，1000毫升乙醇洗涤2次，1000毫升二氯甲烷洗涤2次，再加入50g高吸水性树脂。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2的方法如下：将240毫摩尔的Fmoc-Val-OH先溶解于1000毫升体积比为0.5～1：0.125～1的二氯甲烷/二甲基甲酰胺混合溶剂中搅拌溶解，加入1-羟基苯骈三氮唑600毫摩尔、1000毫升二甲基甲酰胺搅拌后，再加入360毫摩尔的二异丙基碳二亚胺，搅拌反应10分钟后加入到树脂中，搅拌反应1.5小时。

6.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤2中溶解Fmoc保护氨基酸的溶剂为体积比为1：1的二氯甲烷/二甲基甲酰胺。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3的方法如下：用2000毫升二甲基甲酰胺洗涤3次，2000毫升乙醇洗涤2次，2000毫升二氯甲烷洗涤2次，完成Fmoc-Val-OH的连接。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤4的方法如下：同法依次连接Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg-OH，再用2000毫升甲醇洗涤2次，取出烘干，烘干后的肽树脂按每克肽树脂用2000毫升裂解试剂计算需配制的裂解试剂的总量，按三氟乙酸：乙二硫醇：水=95:3:2的比例配制裂解试剂，将树脂悬浮于配制好的裂解试剂中，搅拌反应2小时，滤除树脂，滤液加入到无水乙醚中，待沉降后吸出上清液，加入与剩余体积相等的纯化水，振荡后静置分层，水层用无水乙醚萃取洗涤两次，浓缩后冷冻干燥，得胸腺五肽。

9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1的PEG-wang树脂-Tyr（tbu）-OH是由以下方法制备的：取PEG-wang树脂200毫摩尔，加入到反应容器内，加入二甲基甲酰胺2000毫升洗涤1次，加入二甲基甲酰胺2000毫升浸泡60分钟，加入二氯甲烷2000毫升洗涤1次，取Fmoc-Tyr(tBu)-OH600毫摩尔、1-羟基苯骈三氮唑600毫摩尔、DMAP60毫摩尔，加入1000毫升二甲基甲酰胺搅拌溶解后加入720毫摩尔的二异丙基碳二亚胺，搅拌反应10分钟后加入到树脂中，搅拌反应3小时，反应完毕后用2000毫升二甲基甲酰胺洗涤3次，2000毫升甲醇洗涤1次，2000毫升二氯甲烷洗涤2次，2000毫升甲醇洗涤2次，取出烘干即得PEG-wang树脂-Tyr（tbu）-OH。

10.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，纯化步骤如下：将胸腺五肽粗品用适量纯化水溶解后作为上样的样品，通过以下色谱条件纯化：

流动相A：0.3%HAC，流动相B：乙腈，波长：225nm

洗脱梯度表如下：

收集16-40分钟的洗脱液，将洗脱液用旋转蒸发仪浓缩后，用RCX-30阴离子交换柱填料转成无醋酸盐，转盐步骤：离子柱用0.3%HAC冲洗到酸性，上样，用纯化水冲到中性，用5%NH3﹒H2O洗脱，收集洗脱液，将上述洗脱液经过转盐后，装入冻干盘中，待所有灌装了胸腺五肽的冻干盘全部转移至冻干机后，开启冻干机，按设定冻干曲线进行冻干，-40℃预冻2小时，抽真空至20Pa以下，1小时升温至-5℃，保持30小时；1小时升温至5℃，保持5小时；1小时升温至30℃，保持3小时；释放真空、出箱，冻干过程中制品温度不得超过35℃，整个过程需40小时，得胸腺五肽纯品。

11.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤如下：

取PEG‐wang树脂‐Tyr（tbu）‐OH，加入到反应容器内，加入二甲基甲酰胺2000毫升洗涤1次，加入二甲基甲酰胺2000毫升浸泡60分钟，加入二氯甲烷2000毫升洗涤1次，加入2000毫升20%的六氢吡啶的二甲基甲酰胺溶液洗涤两次，每次5分钟，用1000毫升二甲基甲酰胺洗涤3次，1000毫升乙醇洗涤2次，1000毫升二氯甲烷洗涤2次，再加入1g‐100g高吸水性树脂，将240毫摩尔的Fmoc‐Val‐OH先溶解于1000毫升体积比为0.5～1：0.125～1的二氯甲烷/二甲基甲酰胺混合溶剂中搅拌溶解，加入1‐羟基苯骈三氮唑600毫摩尔、1000毫升二甲基甲酰胺搅拌后，再加入360毫摩尔的二异丙基碳二亚胺，搅拌反应10分钟后加入到树脂中，搅拌反应1.5小时，用2000毫升二甲基甲酰胺洗涤3次，2000毫升乙醇洗涤2次，2000毫升二氯甲烷洗涤2次，完成Fmoc‐Val‐OH的连接，同法依次连接Fmoc‐Asp(OtBu)‐OH、Fmoc‐Lys(Boc)‐OH、Fmoc‐Arg‐OH，再用2000毫升甲醇洗涤2次，取出烘干，烘干后的肽树脂按每克肽树脂用2000毫升裂解试剂计算需配制的裂解试剂的总量，按三氟乙酸：乙二硫醇：水=95:3:2的比例配制裂解试剂，将树脂悬浮于配制好的裂解试剂中，搅拌反应2小时，滤除树脂，滤液加入到无水乙醚中，待沉降后吸出上清液，加入与剩余体积相等的纯化水，振荡后静置分层，水层用无水乙醚萃取洗涤两次，浓缩后冷冻干燥，得胸腺五肽粗品；

其中，PEG‐wang树脂‐Tyr（tbu）‐OH是由以下方法制备的：取PEG‐wang树脂200毫摩尔，加入到反应容器内，加入二甲基甲酰胺2000毫升洗涤1次，加入二甲基甲酰胺2000毫升浸泡60分钟，加入二氯甲烷2000毫升洗涤1次，取Fmoc‐Tyr(tBu)‐OH600毫摩尔、1‐羟基苯骈三氮唑600毫摩尔、DMAP60毫摩尔，加入1000毫升二甲基甲酰胺搅拌溶解后，加入720毫摩尔的二异丙基碳二亚胺，搅拌反应10分钟后加入到树脂中，搅拌反应3小时，反应完毕后用2000毫升二甲基甲酰胺洗涤3次，2000毫升甲醇洗涤1次，2000毫升二氯甲烷洗涤2次，2000毫升甲醇洗涤2次，取出烘干即得PEG‐wang树脂‐Tyr（tbu）‐OH。