CN102512507A - 藏边大黄提取物在制备防治糖尿病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了藏边大黄提取物的新应用，具体是其在制备预防治疗糖尿病药物中的应用。经动物试验证明从藏边大黄中制备的经乙醇渗漉浸提再经乙醇洗脱的提取物与3，5，3′，4′-四羟基二苯乙烯-4′-O-β-D-葡萄糖苷能够通过抑制肿瘤坏死因子-α、bax因子、转化生长因子-β或血清白介素-6表达水平，并提高bcl-2因子表达水平，对糖尿病，特别是糖尿病肾病或饮食引发的糖尿病起到防治作用，能够应用于治疗或预防糖尿病药物的制备。

Description

藏边大黄提取物在制备防治糖尿病药物中的应用

技术领域

本发明涉及藏边大黄提取物的应用，特别是涉及藏边大黄提取物在制备防治糖尿病药物中的应用，属于化合物或药物制剂的治疗活性领域。

背景技术

藏边大黄(Rheum emodi Wall.)系蓼科大黄属波叶组植物的根与根茎，主要分布在西藏、青海、四川及云南等地，均系野生。藏边大黄味酸、苦，性寒，藏医称曲扎(Quza)，是藏医的传统药材。申请号为201110124226.9名称为一种藏边大黄提取物及其制备方法的中国发明专利申请公开了一种藏边大黄经乙醇渗漉浸提再经乙醇洗脱的提取物。该提取物含有结构式如式(I)的单体化合物：

式(I)

其中R₁是或H。该提取物中含有30％～99％的结构式如式(II)的单体化合物：

式(II)

结构式如式(II)的单体化合物可以经上述藏边大黄提取物经进一步萃取、洗脱制备得到，并经NMR分析鉴定为3，5，3′，4′-四羟基二苯乙烯-4′-O-β-D-葡萄糖苷(PDG)(3，5，3′，4′-tetrahydroxystilbene 4′-O-β-D-glucopyranoside)。基于与现有化合物的比对分析，初步确定3，5，3′，4′-四羟基二苯乙烯-4′-O-β-D-葡萄糖苷具有与何首乌成份2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷类似的生物活性，包括抗肿瘤、降低胆固醇、抑制动脉粥样硬化、保护肝脏、舒张血管、防治老年痴呆、提高记忆力等，能够应用于相关药物的开发。

参考资料：

西藏金哈达药业有限公司.一种藏边大黄提取物及其制备方法[P]CN201110124226.9

吕丽爽.何首乌中二苯乙烯苷的制备及抗氧化机理研究[D].无锡：江南大学，2006.

发明内容

本发明的目的在于提供藏边大黄提取物用于制备预防治疗糖尿病药物的应用，以及含有藏边大黄提取物的药物组合物在制备治疗或预防糖尿病药物中的用途。

本发明的目的还在于提供3，5，3′，4′-四羟基二苯乙烯-4′-O-β-D-葡萄糖苷(PDG)用于制备预防治疗糖尿病药物的应用，以及含有PDG的药物组合物在制备治疗或预防糖尿病药物中的用途。

糖尿病(Diabetes mellitus，DM)是由遗传或环境因素相互作用而引起的常见病，常见症状有多饮、多尿，多食以及消瘦等，糖尿病若得不到有效的治疗，可引起身体多系统的损害。引起胰岛素绝对或相对分泌不足以及靶组织细胞对胰岛素敏感性降低，引起蛋白质、脂肪，水和电解质等一系列代谢紊乱综合征，其中以高血糖为主要标志

糖尿病肾病(Diabetic nephropathy，DN)是由糖尿病引起微血管病变而导致肾小球硬化出现肾小球排泄蛋白和滤过异常，迄今尚未完全阐明。DN是糖尿病常见且严重的并发症之一，是糖尿病患者的主要死亡原因之一。与DN发病关系较为肯定的有糖、脂代谢紊乱，肾脏血流动力学异常，肾小球滤过屏障改变及遗传易感等因素。近年来炎症学说备受关注，炎症假说认为糖尿病可能是细胞因子介导的炎症反应，是一种免疫性疾病，炎症在糖尿病及其血管井发症的发病机制中起媒介作用。即认为糖尿病是一种自然免疫和低度炎症性疾病。已有实验证明炎症参与了DN的进展，炎症因子在DN的发生发展中可能起着重要作用。

本发明所称的糖尿病包括1型糖尿病(T1DM)、2型糖尿病(T2DM)、其它特殊类型糖尿病及妊娠期糖尿病。尤其指高糖高脂饮食引发的糖尿病，以及糖尿病并发/继发的糖尿病肾病。

本发明将藏边大黄提取物，特别是3，5，3′，4′-四羟基二苯乙烯-4′-O-β-D-葡萄糖苷(PDG)应用于预防治疗糖尿病肾病药物制备的药效原理主要在于三方面：

(1)PDG水溶液能够显著抑制糖尿病肾病模型动物肾组织血清TNF-α因子的表达，从而发挥保护肾组织的作用。

肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是-个多效的炎症性细胞因子，是一种主要由由活化的巨噬细胞、单核细胞与T细胞产生的单核因子，不仅具有选择性地杀伤某些肿瘤细胞，而且有多种免疫调节作用。机体心、肺、肾是TNF-α的生物合成的主要场所，体内TNF-α的表达具有高度的组织特异性，在生理条件下，脾、肝、肺、胸腺及肾脏的组织均有TNF-αmRNA的表达。TNF-α可直接作用于多种效应细胞，具有广泛的生物学效应。TNF-α被认为是一种潜在的致纤维因子，作为炎症介质在炎症急性期和硬化过程中起重要作用。由于DN是在糖代谢异常情况下出现的以微血管损害为主的肾小球病变，结节性肾小球硬化则是特征性病理改变，因此目前研究认为两者有显著的相关性。临床DN组的TNF-α水平显著高于早期DN组，而早期DN组的TNF-α水平显著高于DM组，通过多因素相关回归分析，TNF-α与DN的病程和病情呈正相关。在DN时，作为高血糖及非酶糖基化终末产物生成物之一的TNF-α，通过其强大的生物学活性(如刺激系膜细胞产生氧自由基、促进系膜细胞产生前列腺素等、刺激脂肪细胞分泌瘦素、提高系膜细胞、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的分泌等机理)参与了DN发病，成为DN发病机理中较为重要的因素之一。在肾组织中，TNF-α促进炎症细胞固定于内皮，促进血小板在内皮表面聚集及血栓形成，引起系膜细胞收缩，细胞骨架改变及系膜细胞溶解，刺激肾小球细胞释放大量氧自由基，损伤基底膜，调动与胶原代谢有关的细胞因子，促进肾小球细胞释放胶原酶，损伤肾小球细胞及基底膜等作用可能与肾脏结构和功能的改变及蛋白尿的发生有关。目前拮抗TNF-α活性是DN防治的主要方向之一。

本发明动物试验采用切除单侧肾脏合并注射小剂量链脲佐菌素诱导大鼠发生T2DM，产生高浓度的炎症细胞因子，这些炎症细胞因子参与了DN的进展。但在PDG干预下，DN模型动物肾组织血清TNF-α表达水平下降，糖尿病肾病的病情得以改善，糖尿病肾病的发展得以延缓。

(2)PDG水溶液可以通过抑制DN肾组织中bax表达、激发bcl-2表达使DN肾脏细胞凋亡率减少从而达到保护肾组织的作用。

细胞凋亡(apoptosis)或程序性死亡(programmed cell death，PCD)是由基因控制的自主性的有序死亡，其突出特征是染色体DNA的有控降解和新蛋白质的合成。当细胞凋亡出现异常时，细胞增殖与细胞凋亡动态失衡，可导致肿瘤等多种疾病的发生。细胞凋亡与糖尿病肾病(DN)关系十分密切。DN的发生发展过程中，肾脏凋亡细胞数目增多被认为是导致DM大鼠肾脏受损的原因之一。DN早期机体通过细胞凋亡清除过度增生的多余细胞，这对肾脏有利，但晚期时肾脏损伤越重时，则细胞凋亡数越多，对糖尿病肾脏反而会产生损伤作用，最终肾小球发生硬化。bcl-2家族是目前最受重视的调控细胞凋亡的基因家族，它在细胞凋亡的调控中起着重要的作用。bcl-2家族可被分为凋亡抑制基因与凋亡诱导基因2个亚类。bcl-2与bax分别为凋亡抑制基因与凋亡诱导基因两个亚类中最具代表性的基因。bcl-2蛋白的生理功能主要是阻遏细胞凋亡，延长细胞寿命，而bax与bcl-2作用相反，具有促进细胞凋亡的作用。bax/bcl-2两蛋白之间的比例关系是决定对细胞凋亡抑制作用强弱的关键因素。

本发明动物试验显示：DM状态下bcl-2和bax表达均有变化，bcl-2表达在DM组高于对照组，PDG治疗组高于糖尿病组；而bax表达在DM组低于对照组，PDG治疗组低于DM组。表明体内和体外的研究表明，bcl-2和bax参与了DM状态下细胞凋亡的发生，而PDG的干预能够抑制bax表达、激发bcl-2表达，降低bax/bcl-2的比例关系，由此通过抑制肾脏细胞的凋亡及凋亡相关基因的异常表达实现对DM模型动物肾组织的保护。

(3)藏边大黄提取物能够通过抑制肾组织中TGF-β1与IL-6的表达对糖尿病肾病的防治作用。

转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)是影响伤口愈合与瘢痕形成的重要生物因子，它能促进细胞增殖、迁移、分化和凋亡，同时刺激细胞外基质沉积和胶原过度产生。TGF-β1是TGF-β的5种异构体之一。TGF-β1参与糖尿病肾病发展过程，并涉及肾小球血液动力学改变、细胞外基质代谢、细胞增殖和细胞肥大等诸多方面。众多实验及临床研究表明糖尿病大鼠及糖尿病肾病活检组织TGF-β1 mRNA的表达及蛋白质含量均明显升高，同时伴肾脏肥大和细胞外基质增生。血清白介素-6(IL-6)是与肾小球疾病关系最为密切的炎症细胞因子，已知肾小球系膜细胞可自分泌IL-6。糖尿病患者体液和细胞免疫均明显异常，其IL-6有异常表达。一方面，IL-6具有多种功能的细胞因子，大量的IL-6则可对胰岛细胞产生直接的细胞毒作用，从而加快糖尿病的发生；另一方面，胰岛素抵抗以及胰岛素分泌不足引起的高血塘可促使胰岛细胞分泌IL-6，大量IL-6可促使β淋巴细胞分化，使之产生大最IgG，过量的IgG可促使杀伤性T琳巴细胞克隆的过度激活，该作用与其他的细胞因子和效应因子产生的细胞毒作用结合，可以引起胰岛β细胞死亡，加重胰岛素抵抗。本发明通过动物试验表明，DN时炎症因子TGF-β1和IL-6的表达增高，该两种炎症因子促进DN的持续进展，导致肾小球硬化和肾间质纤维化，但在藏边大黄提取物的药物干预下，模型大鼠肾组织中TGF-β1与IL-6的表达水平均降低，组织表现为大鼠肾间质炎细胞浸润程度及肾小球硬化、肾间质纤维化的程度均较糖尿病大鼠有所改善。提示藏边大黄提取物能够通过抑制了TGF-β1和IL-6的信号转导阻碍其发挥致炎作用，减轻DN肾组织的病理损伤，延缓肾功能的损害，。

基于PDG及藏边大黄提取物的药效原理，本发明提供以藏边大黄提取物为药效成分的药物组合物与以PDG为药效成分的药物组合物。此二者药物组合分别以藏边大黄提取物与PDG为药效成分，添加药学上可接受的药用辅料并依照本领域的常规方法制备而成。所制得的药物组合可进一步制备成为药物制剂。基于现有植物提取物的制药技术，特别是现有制药技术对2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的应用，本发明制备的药物制剂可以是：口服给药的剂型诸如片剂、胶囊(包括硬胶囊、软胶囊、肠溶胶囊、微囊)、粉剂、颗粒剂和糖浆剂；非口服给药的剂型诸如注射剂、栓剂、丸剂、凝胶剂和贴剂。此外，还可以将口服的速释固体制剂(例如片剂、颗粒剂等)和用于口服或非口服给药的缓释制剂(片剂、颗粒、精细颗粒、丸剂、胶囊、糖浆、乳剂、悬浮液、溶液)用于本发明。上述制剂可以是包衣或未包衣的形式，视需要而定。

本发明通过试验研究证明，藏边大黄提取物以及PDG对糖尿病，特别是糖尿病肾病有显著的保护作用，能够应用于治疗或预防糖尿病肾病药物的制备。原料药藏边大黄是传统藏医药材，安全可靠；PDG经动物毒性试验同样证明具有药用安全性。

具体实施方式

下面通过相关试验例对本发明的内容做进一步描述。

试验例一

此试验例用以说明3，5，3′，4′-四羟基二苯乙烯-4′-O-β-D-葡萄糖苷(PDG)通过显著抑制肾组织TNF-α表达起到防治糖尿病肾病的作用。

1材料与方法

1.1试剂链脲佐菌素(Streptozotocin STZ，美国sigma公司)；3，5，3′，4′-四羟基二苯乙烯-4′-O-β-D-葡萄糖苷(PDG)，依照CN2011101722069公开方法从藏边大黄药材中提取，纯度92.80％，加生理盐水配制成PDG溶液(以下简称PDG水溶液)。

1.2动物58只清洁级雄性wistar大鼠(哈尔滨医科大学提供)，200～230g。实验期间动物自由饮水，饲养环境为室温20～24℃，相对湿度70％～75％，12hr交替照明。

1.3仪器One Touch型强生血糖仪；HMAS-2000多媒体彩色病理图文分析系统；全自动生化分析仪；OLYMPUS显微镜等。

1.4方法

1.4.1糖尿病造模及分组将50只大鼠手术摘除右肾，1wk后大鼠背部伤口愈合后，连续5d按30mg/kg剂量空腹腹腔注射0.1％枸橼酸钠缓冲液(pH 4.2)配制的链脲佐菌素(STZ)，在造模同时喂高脂饲料(普通饲料+胆固醇+炼猪油+蔗糖)。末次STZ注射后72hr取尾静脉血测血糖，血糖≥16.7mmol/L且尿糖强阳性的大鼠判定为糖尿病鼠，纳入实验。糖尿病造模成功40只(原50只，死亡7只，3只未成模)，造模成功率为80％。按血糖值随机分为5组，模型组(M)，PDG高剂量组(T1)，PDG中剂量组(T2)，PDG低剂量组(T3)，西药对照组(X)，另纳入8只为正常对照组(N)。

1.4.2给药T 1组给予PDG 2.025g/kg·d灌胃；T2组给予PDG 1.350g/kg·d灌胃；T3组给予PDG 0.675g/kg·d灌胃；X组给予贝那普利1.5mg/kg·d+格列喹酮1.5mg/kg·d灌胃。N、M组均给予相当体积的灭菌蒸馏水灌胃。各组大鼠灌胃液体量为2.5ml/次，1次/d。

1.4.3检测指标实验第4、8wk末检测各组大鼠的体重、血糖。8wk末结束后，腹腔内注射10％的水合氯醛(3ml/kg)麻醉后，打开腹腔，由腹腔静脉采血5～6ml，用于检测BUN、FBG、HbAlc、FINS等。留取左肾，待作光镜和免疫组化检测。免疫组化显色结果利用HMAS-2000多媒体图像分析系统对各组肾组织细胞中TNF-α阳性细胞面密度值、阳性细胞平均灰度值进行分析。

1.4.4观察指标每d观察大鼠的精神状态，形态，毛色，饮食和饮水量。

1.5统计学处理所有数据以均数标准差表示，SPSS 13.0统计软件处理数据，组间差异采用方差分析，两两比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1一般情况观察整个实验期间，正常对照组大鼠表现反应较快，毛色白且致密，有光泽，进食、活动及生长情况无明显异常。各糖尿病组则精神不振，活动较少，多饮、多食、多尿、消瘦，营养不良，皮毛缺乏光泽，动作迟缓，蜷卧拱背，烂爪烂尾等现象，尤以模型组明显；PDG高、中、低剂量组及西药对照组大鼠治疗后多饮、多食、多尿，体重减轻等症状减轻，营养状态改善。

2.2PDG对糖尿病大鼠HbAlc、BUN、FBG、FINS含量的影响结果见表1。

表1  8wk末各组大鼠HbAlc，BUN，FBG，FINS变化情况(n＝8)

注：与N组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与M组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01；与T1组比较，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01。

2.3PDG对糖尿病大鼠组织细胞中TNF-α表达的影响结果见表2。

表2  8wk末各组大鼠肾组织细胞中TNF-α的表达

注：与N组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与M组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01；与T1组比较，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01。

上述动物试验例结果显示，模型组和各治疗组大鼠8wk末肾组织TNF-α较空白组均有不同程度升高，表明炎症反应参与DN进展。在PDG干预下，肾组织TNF-α的表达与糖尿病组比较表达显著降低，PDG能够减轻DN大鼠的肾组织TNF-α的表达，改善DN炎症状态，控制血糖，延缓糖尿病肾病的发生发展。

试验例二

以下试验例说明PDG可以通过抑制bax表达、激发bcl-2表达使DN肾脏细胞凋亡率减少从而达到保护肾脏的作用。

1材料与方法

1.1试剂仪器PDG水溶液同试验例一；STZ(Sigma公司)；兔抗大鼠bcl-2、bax多克隆抗体(Santa Cruz公司)；SP试剂盒、DAB试剂盒(北京中杉金桥生物技术公司)；血糖仪及血糖试纸条(美国强生公司lifscan One Touch)；尿白蛋白放射免疫药盒、胰岛素放射免疫药盒(中国原子能研究所)；全自动生化分析仪(日立7170A)。

1.2大鼠模型的制备及分组清洁级近交系SD大鼠，体质量210～250g(来源同试验例一)。常规饲料中碳水化合物热卡62％，脂肪热卡22％，蛋白质热卡26％。高糖高脂饲料中高脂为熟猪油，高糖为蔗糖。其中碳水化合物热卡40％，脂肪热卡47％，蛋白质热卡13％。大鼠随机分为实验组与空白对照组，实验组(n＝30)喂以高糖高脂饲料6wk后，腹腔注射STZ 30mg/kg；空白对照组(n＝12)喂以常规饲料6wk后，腹腔注射pH为4.5的等体积枸橼酸缓冲液；注射2wk后行糖耐量试验，糖耐量异常者成模24只，成模率80％。成模大鼠再随机分为糖尿病组(n＝12)与糖尿病治疗组(n＝12)。治疗组给予PDG，用高压消毒水充分溶解，1mg/kg·d灌胃。对照组和糖尿病组于同时每d给予与治疗组相等体积的高压消毒水灌胃。给药8wk后从3组各随机选取6只大鼠处死，其余6只12wk后处死。

1.3标本收集及测定处死前1d将大鼠置于代谢笼，收集24hr尿液，测尿蛋白总量、尿肌酐。宰杀前称体质量，断尾测血糖(采用葡萄糖氧化酶法)。以2％戊巴比妥腹腔注射麻醉大鼠，经腹主静脉取血，分别测血浆胰岛素(Ins)(采用放射免疫法)，三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、肌酐清除率(Ccr)(采用日立7170A全自动生化分析仪)，24hr尿蛋白排泄率(Uaer)(采用放射免疫法)。处死动物，取出肾脏，去掉被膜，滤纸吸干血迹后称重；部分肾组织置于4％多聚甲醛固定，用于常规病理学及免疫组织化学观察，部分肾皮质用70％乙醇固定后用于流式细胞术检测。

1.4肾组织染色法HE和PA S染色法。

1.5免疫组织化学检测bax，bcl-2蛋白在肾组织中的表达链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法(SP)，4μm石蜡切片常规脱蜡至水；5％过氧化氢甲醇溶液中，室温震荡10min；抗原修复液(0.01mol/L柠檬酸2柠檬酸钠缓冲液，pH 6.0)，高压抗压热修复法进行抗原修复2min；正常山羊血清封闭，37℃，10min；滴加一抗(bax，bcl-2为兔抗大鼠抗体)，37℃，30min；二抗(生物素化羊抗兔抗体)，37℃，15min；DAB显色，苏木素复染，脱水，透明，封片。

1.6流式细胞术检测肾脏细胞凋亡率和bax，bcl-2蛋白表达将标本用网搓法制成单细胞悬液后，分别加入1∶100稀释兔抗大鼠bax，bcl-2多克隆抗体，37℃温浴30min；加入羊抗兔异硫氰酸荧光素-IgG，浴洗涤后进行检测。将测得的数据输入计算机，应用相应的程序进行资料处理，测定前以标准鸡红细胞调整仪器的变异系数(CV)值在5％以内。以荧光指数(FI)表示所测指标的相对含量，FI＞1.0为阳性表达，FI≤1.0为阴性表达。FI＝样品的平均荧光均道值/正常肾组织平均荧光均道值。

1.7统计学处理所有数值采用

表示，组间及组内比较分别采用F和t检验，由SPSS 10.0统计软件完成，P＜0.05为有统计学意义。

2结果

2.1症状和体征与对照组比较，实验组大鼠给予高脂饮食后，体质量增加明显，并出现脂肪的再分布，即腹型肥胖。注射STZ 2wk后体质量开始下降，到12wk时基本降到对照组水平，以后糖尿病组大鼠在整个病程中较对照组变化不大，注射STZ后1～2d即出现多尿，多饮，多食症状；8wk时糖尿病组症状已明显，随病程的延长，上述症状更加显著；12wk时出现毛发色泽黯淡，精神萎靡，活动减少。上述症状符合糖尿病的临床特点。

2.2生化指标8wk和12wk时糖尿病组大鼠空腹血糖(FBS)、Ins、TG、TC较同期对照组大鼠明显增加，Ccr下降，均有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)。糖尿病组12wk与8wk比较，TG、TC、Uaer均明显增加，Ccr减低(P＜0.01)。治疗组Ins、TC、Uaer较同期糖尿病组均好转，Ins下降程度较大，接近对照组水平；TC、Uaer则下降较小，与对照组仍有统计学意义(P＜0.01)。FBS、TG、Ccr有所下降，但无统计学意义。结果见表1，表2。

表1  8wk和12wk对照组和糖尿病组基础和临床指标比较(n＝6，

)

^*P＜0.05 vs 8 weeks  ^**P＜0.01 vs.control by t test

表2  12wk对照组、糖尿病组、治疗组基础和临床指标比较(n＝6，

)

^*P＜0.0l vs.control  ^**P＜0.01 vs diabetic by t test

2.3常规病理学观察光镜下观察，H E染色及PA S染色，糖尿病组大鼠较对照组肾小球体积增大，系膜基质增多，部分肾小管上皮细胞发生空泡变性。12wk时，还可见部分肾小管萎缩、部分扩张，透明管型形成，肾小球及肾小管基底膜增厚，基质增宽，纤维组织增生。

2.4流式细胞检测肾细胞凋亡及bax、bcl-2表达

2.4.13组细胞凋亡率比较8wk时，糖尿病组和治疗组的凋亡率较对照组明显升高，分别为(18.91±1.64)％，(16.15±0.92)％与(11.51±0.64)％，均有统计学意义(P＜0.05)，且治疗组低于糖尿病组(P＜0.05)。

2.4.23组bax、bcl-2基因表达8wk时，糖尿病组和治疗组bax表达为阳性，治疗组低于糖尿病组(P＜0.05)，12wk时这种趋势更明显(P＜0.05)。与之相反，bcl-2表达在8wk时糖尿病组和治疗组均为阳性，治疗组的表达较糖尿病组高，但无统计学意义(P＞0.05)，12wk时进一步增高，且有统计学意义(P＜0.05)。结果见表3。

表3流式细胞测定法bax和bcl-2基因表达(n＝6，

)

^*P＜0.05 vs.diabetic by t test

2.5免疫组织化学检测肾组织bax、bcl-2表达

2.5.1bax在肾组织中的表达对照组bax表达于肾小球的足细胞、近曲小管、远曲小管、集合管等上皮细胞胞浆中；糖尿病组和治疗组bax表达，在足细胞增加，远曲小管及小管间质细胞明显增加，8wk时治疗组较糖尿病组bax在近曲小管及远曲小管的表达减少，12wk时在远曲小管各段明显减少(P＜0.05)。

2.5.2bcl-2在肾组织中的表达对照组bcl-2主要表达于近曲小管各段和皮髓交界处，远曲小管、集合管有少许表达；糖尿病组和治疗组bcl-2表达在部分近曲小管明显减少，而部分近曲小管的表达未见明显变化。8wk时治疗组较糖尿病组bcl-2表达在近曲小管近端略有增加，在远端小管明显增加；12wk时在近曲小管表达呈明显强阳性，皮髓交界处表达较高。

上述动物试验例表明，DN状态下，PDG干预促进了bcl-2表达水平，同时抑制了bax表达水平，由此通过抑制肾脏细胞的凋亡及凋亡相关基因的异常表达来实现对DN的保护。

试验例三

此试验例用以说明藏边大黄提取物通过抑制肾组织中TGF-β1和IL-6的表达对糖尿病肾病的防治作用。

1、材料与方法

1.1实验材料健康雄性Wistar大鼠40只，体重(200±20)g，8周龄(来源同试验例一)；链脲佐菌素(STZ，美国Sigma公司)；兔抗大鼠TGF-β1、IL-6多克隆抗体(美国SantaCruz公司)；免疫组化试剂盒(北京博奥森生物技术有限公司)；藏边大黄提取物，具体是藏边大黄经乙醇渗漉浸提物再经乙醇洗脱的提取物，依照CN2011101722069公开方法从藏边大黄药材中提取。本品约含52％3，5，3′，4′-四羟基二苯乙烯-4′-O-β-D-葡萄糖苷(PDG)，为棕褐色粉末，实验时以蒸馏水配制成700mg·ml^-1水溶液，经过0.22μm孔径滤膜滤过除菌后使用，以下称藏边大黄提取物水溶液；氯沙坦钾片(美国默沙东公司，批号：H20000371)。

1.2实验分组及动物模型制备40只健康雄性Wistar大鼠随机分为正常对照组(N组)、DN模型组(DN组)、藏边大黄治疗组(DA组)、氯沙坦钾治疗组(DL组)，每组10只。除N组外其余各组均采用右肾切除加一次性腹腔注射50mg/kg STZ(将STZ溶于10mmol/L柠檬酸盐溶液，pH 4.3)造模，N组腹腔注射相同体积的不含STZ的柠檬酸盐溶液。72h后测血糖，以血糖≥16.7mmol/L稳定3d为造模成功。造模成功3d后，DA组每日给予藏边大黄溶剂3ml灌胃，DL组每日给予氯沙坦钾30mg/kg(3m1)灌胃，N组及DN组每日均给予等量蒸馏水灌胃，连续给药12wk。

1.3标本收集与肾脏病理组织学检查12wk末，收集大鼠24h尿液，检测尿蛋白定量，采血检测Scr及BUN。取肾组织饱和苦味酸溶液固定，石蜡包埋，常规切片，行HE、PAS染色，光镜下观察肾组织的病理学变化。

1.4免疫组化采用SP法检测DN大鼠肾组织中TGF-β1、IL-6的表达。常规切片2m；脱蜡至水；PBS液洗片2min×3次；EGTA(EDTA9.0)缓冲液中行抗原热修复2.5min，冰水中迅速冷却至常温；PBS液洗片2min×3次；加山羊血清封闭液15min；PBS液洗片2min3次；分别滴加兔抗大鼠TGF-β1、IL-6多克隆抗体，同时以PBS代替一抗作为阴性对照；滴加生物素标记山羊抗兔IgG，37恒温箱孵育15min；PBS液洗片2min×3次；滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37孵育15min；PBS液洗片2min×3次；避光，DAB显色，显微镜下观察显色3～5min，自来水终止显色；苏木素复染2min，盐酸酒精分化，氨水返蓝；脱水透明；中性树胶封片，镜下观察。

1.5统计学方法所有数据均以(

±s)表示，用SPSS 13.0软件包进行统计学处理。多组计量资料间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1大鼠的一般情况12wk时，DN组大鼠一般情况差，进食量减少，体重下降，皮毛色泽黯淡、粗糙，活动减少。DA组及DL组大鼠一般状况及活动状况均有所改善。

2.2各组大鼠24h尿蛋白定量、Scr、BUN的比较12wk末，DN组大鼠24h尿蛋白定量、Scr、BUN水平均高于N组(P＜0.05)；应用藏边大黄及氯沙坦钾治疗后大鼠24h尿蛋白定量、Scr、BUN水平降低，差异均有统计学意义(P＜0.05)。DA组与DL组比较各相关指标差异均无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

表1各组大鼠Scr、BUN、24h尿蛋白定量的比较

注：与正常对照组比较，^*P＜0.05；与模型组比较，ΔP＜0.05

2.3各组大鼠病理组织学改变N组肾小球大小一致，小球内细胞没有明显的增加，细胞外基质无明显增生；肾小管上皮细胞呈方形，大小一致，排列整齐，未见明显的炎细胞浸润PAS染色可见肾小球基底膜均匀完整；DN组肾小球体积明显增大，弥漫性系膜基质增生，系膜区增宽，可见少量慢性炎症细胞浸润，肾小囊腔闭塞，开始出现弥漫性肾小球硬化表现，肾小管上皮细胞水肿、脱落。PAS染色可见基底膜增厚、皱曲，甚至断裂。经治疗后，DA组及DL组肾组织病理改变有所减轻，但仍保留有DN的病理改变，系膜基质的增生减少，小管上皮细胞水肿减轻，PAS染色可见肾小球基底膜均匀变薄。

2.4各组大鼠肾组织TGF-β1和IL-6的表达采用同济千屏HPIAS 2000型图像分析软件进行半定量分析，用阳性面积与总面积的比值计算该成分在肾组织中的相对含量。免疫组化结果显示：N组大鼠肾组织中TGF-β1及IL-6有少量基础表达；DN组大鼠肾组织中TGF-β1及IL-6的表达明显上调；分别经藏边大黄和氯沙坦钾治疗后，该两组大鼠肾组织中的表达明显高于DN组，而TGF-β1及IL-6的表达明显降低，差异均有统计学意义(P＜0.05)。DA组与DL组比较各因子表达水平差异无统计学意义(P＞0.05)。见表2。

表2各组大鼠肾组织SOCSl、TGF-β1及IL-6的表达

注：与正常对照组比较，^*P＜0.05；与模型组比较，ΔP＜0.05

STZ诱导的糖尿病动物模型与人类I型糖尿病的发病经过，膜岛的病理改变及临床表现等方面有许多相似之处。上述动物试验例显示，藏边大黄干预治疗DN大鼠12周后，应用DA组及DL组大鼠肾间质炎细胞浸润程度及肾小球硬化、肾间质纤维化的程度均较DN组有所改善，DA组及DL组大鼠肾组织中TGF-β1和IL-6的表达水平均降低。结果表明藏边大黄具有免疫调节作用，能够减少DN患者24h尿蛋白，有一定的肾脏保护作用，并能抑制TGF-β1、IL-6的表达，减轻炎症反应对肾脏的损害作用。

试验例四

3，5，3′，4′-四羟基二苯乙烯-4′-O-β-D-葡萄糖苷的化合物毒性试验。

1、实验材料

ICR小鼠，雄性，体重18g～22g，由四川大学华西实验动物中心提供(合格证号：1037764)；PDG水溶液同试验例一。

2、试验方法和结果

将本发明化合物作为试验样品给小鼠灌服进行急性毒性试验。结果显示：小鼠灌服本发明化合物的最大耐受量为20g·kg^-1·24hr^-1，约为2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷药物的服用剂量标准(60kg体重成人口服日用量1.2g·kg^-1·24hr^-1)的1000倍；小鼠一次性灌服的LD50为15.2g·kg^-1·次^-1，95％置信限为22.60～34.23g·kg^-1。

长期毒性试验表明，大鼠灌服本发明化合物0.4、0.8、1.6g·kg^-1·d^-1(相当于2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷药物临床量的20、40、80倍)，24wk后血液学、血液生化学指标、脏器系数和对照组比较均无明显差异，病理检查结果亦未见保健食品引起的病理性改变。停用发明化合物2wk后，各给药组的各项指标与空白对照组比较，均无明显差异，提示该化合物无明显延迟性毒性。说明本发明化合物长期服用也是安全的。

Claims (10)

1.藏边大黄提取物在制备防治糖尿病疾病药物中的应用，所述藏边大黄提取物含有结构式如式(I)的单体化合物：

式(I)

其中R₁是

或H；所述R₁是

的单体化合物是3，5，3′，4′-四羟基二苯乙烯-4′-O-β-D-葡萄糖苷，其结构式如式(II)：

式(II)。

2.含有藏边大黄提取物的药物组合物用于制备防治糖尿病疾病药物的应用，所述藏边大黄提取物含有结构式如式(I)的单体化合物：

式(I)

其中R₁是

或H；所述R₁是

的单体化合物是3，5，3′，4′-四羟基二苯乙烯-4′-O-β-D-葡萄糖苷，其结构式如式(II)：

式(II)。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述药物组合物含有藏边大黄提取物与药学上可接受的药用辅料。

4.根据权利要求1、2、3任一所述的应用，其特征在于：所述药物是肿瘤坏死因子-α因子抑制药物。

5.根据权利要求1、2、3任一所述的应用，其特征在于：所述药物是抑制bax表达水平药物。

6.根据权利要求1、2、3任一所述的应用，其特征在于：所述药物是提高bcl-2表达水平药物。

7.根据权利要求1、2、3任一所述的应用，其特征在于：所述药物是转化生长因子-β1抑制药物。

8.根据权利要求1、2、3任一所述的应用，其特征在于：所述药物是血清白介素-6活性抑制药物。

9.根据权利要求1、2、3任一所述的应用，其特征在于：所述糖尿病疾病是指高糖高脂饮食引发的糖尿病，或者是糖尿病并发/继发的糖尿病肾病。

10.权利要求9任一所述的应用，其特征在于：所述药物是肿瘤坏死因子-α因子抑制药物，或者是抑制bax表达水平药物，或者是提高bcl-2表达水平药物，或者是转化生长因子-β1抑制药物，或者是血清白介素-6活性抑制药物。