CN102503857B - 蓓萨罗丁羟肟酸及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属医药技术领域，公开了蓓萨罗丁羟肟酸及其制备方法和用途。化合物的结构如图所示，其制备主要以1,1,4,4,6-五甲基-1,2,3,4-四氢化萘为起始原料，经傅-克酰基化、Wittig反应、缩合三步反应得到目标化合物，操作简单、后处理方便、收率较高。目标化合物通过与维甲酸类X受体结合和抑制组蛋白去乙酰化酶等多种作用机制对多种癌细胞具有良好的抑制作用，且其抗癌活性明显强于蓓萨罗丁，从而用于肿瘤的治疗。
Description
技术领域：
本发明属于医药技术领域，涉及到蓓萨罗丁羟肟酸及其制备方法和应用。
背景技术：
近些年，维甲酸受体与维甲酸类药物研究成为一个抗癌药物研究热点。维甲酸受体通过转录调节、翻译调节和磷酸化调节与其他多条信号通路相互联系、共同调节，对肿瘤细胞的增殖、分化和凋亡起着非常重要作用，维甲酸类似物在诱导多种肿瘤细胞分化、逆转肿瘤细胞的恶性表型方面效果显著。维甲酸受体属于核受体超家族中的一个子家族，维甲酸受体子家族包括两类受体RARs(retinoic acid receptors)和RXRs(retinoid X receptors)，RARs和RXRs分别有三种亚型α、β、γ共6种受体蛋白。在配体与维甲酸受体结合后，对脊椎动物的发育和分化产生重要影响，在体外实验发现可以诱导许多肿瘤细胞系分化。目前RARs和RXRs已成为控制细胞生长和分化及功能相当复杂的内分泌网络的焦点，这个受体网络中任何一个受体异常，均可以导致内分泌紊乱、肿瘤或畸形的发生。
蓓萨罗丁(Bexarotene，结构式见图)是由美国Ligand制药公司研制的新型抗癌药，其口服软胶囊和外用凝胶剂获FDA批准于2000年在美国上市，用于治疗皮肤T-细胞淋巴瘤。2001年在欧洲市场获准上市，蓓萨罗丁是一种新型的RXR受体选择性的合成维甲酸类似物，它可以选择性地与维甲酸类X受体(RXR)亚单位(RXRα，RXRβ，RXRγ)结合，因而可以选择性地发挥其功能并可降低临床用药的毒性；它可以抑制造血系统及鳞细胞恶性肿瘤细胞系的生长；它可以诱导一些恶性肿瘤细胞系的程序化死亡；它可以抑制人鳞细胞肿瘤的异种移植物；在鼠皮肤癌模型中，它可以明显地抑制乳突淋瘤的生长。目前蓓萨罗丁用于治疗皮肤T-细胞淋巴瘤。口服制剂国外现正在开展治疗乳腺癌、牛皮癣、卡波氏肉瘤、肺癌的Ⅲ期临床试验；凝胶剂现正开展治疗牛皮癣、顽固性手癣的Ⅲ期临床试验。
人们普遍认为癌症的发生与基因及基因组的突变有关,如癌基因或抑癌基因的扩增、易位、删除及点突变等。现有大量研究表明，癌症的发生与表观遗传学有着密切关系。表观遗传学是目前遗传学研究的热点，其主要包括组蛋白乙酰化、磷酸化、泛素化及DNA甲基化等，其在基因转录调节中起着重要作用。决定组蛋白乙酰化状态的酶有两类，组蛋白乙酰化酶(HAT)和组蛋白去乙酰化酶(HDAC)，其中HAT的作用使组蛋白末段乙酰化，舒展核小体结构、激活基因转录，而HDAC的功能为抑制基因转录。在正常生理状态下，这两类酶对组蛋白乙酰化作用的调控处于平衡状态。而细胞在发生转化的状态下,HDAC s的活性明显增强,使得原有的基因表达平衡状态被打破,导致一些影响细胞增殖和调控细胞周期的分子表达失衡,进而导致细胞恶变。HDAC抑制剂作为新一代靶向抗肿瘤药物，已成为抗癌药物研究的热点。羟肟酸类化合物是发现最早且迄今研究最为广泛的一类HDAC抑制剂，其抑酶作用强，其羟肟酸与锌离子结合是其产生HDAC抑制活性必须的，目前这类化合物上市的有SAHA(结构式见图)等。
目前维甲酸类化合物和HDAC抑制剂都是抗肿瘤药物研究的热点。鉴于维甲酸类似物蓓萨罗丁具有良好的抗肿瘤作用和羟肟酸类HDAC抑制剂结构特点，我们设计合成了蓓萨罗丁羟肟酸，活性测试发现，其抗癌活性明显强于蓓萨罗丁，在制备肿瘤、牛皮癣、顽固性手癣等治疗药物中具有极好的应用前景。
发明内容：
本发明提供了一种对肿瘤具有治疗作用的化合物，其结构式如下：
其合成流程如下：
其合成具体步骤如下：
(1)4-(3,5,5,8,8-五甲基-5,6,7,8-四氢化萘-2-羰基)苯甲酸甲酯(Ⅲ)的制备：
五甲基四氢化萘(Ⅰ)和对苯二甲酸单甲酯单酰氯(Ⅱ)在二氯甲烷或1,2-二氯乙烷中，在各种路易斯酸(如：无水三氯化铝、氯化锌、三氯化铁等等)催化下，在30-50℃下发生傅克酰基化反应，得到4-(3,5,5,8,8-五甲基-5,6,7,8-四氢化萘-2-羰基)苯甲酸甲酯；
(2)4-[1-(3,5,5,8,8-五甲基-5,6,7,8-四氢化萘-2-基)乙烯基]苯甲酸甲酯(Ⅳ)的制备：
4-(3,5,5,8,8-五甲基-5,6,7,8-四氢化萘-2-羰基)苯甲酸甲酯在合适的溶剂中(如N,N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、乙醇、甲苯等)，在各种无机碱如氢氧化钠(钾)、碳酸钠(钾)或有机碱如三乙胺、氢化钠、叔丁醇钠(钾)等作用下，与Wittig试剂如甲基三苯基溴化膦发生Wittig反应，得到4-[1-(3,5,5,8,8-五甲基-5,6,7,8-四氢化萘-2-基)乙烯基]苯甲酸甲酯；
(3)N-羟基-4-[1-(3,5,5,8,8-五甲基-5,6,7,8-四氢化萘-2-基)乙烯基]苯甲酰胺(蓓萨罗丁羟肟酸，Ⅶ)的制备：
4-[1-(3,5,5,8,8-五甲基-5,6,7,8-四氢化萘-2-基)乙烯基]苯甲酸甲酯在各种合适的溶剂中(如乙醇、甲醇、异丙醇、丙酮、乙酸乙酯、N,N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃等)，在各种无机碱如氢氧化钠(钾)、碳酸钠(钾)、碳酸氢钠(钾)或有机碱如三乙胺、吡啶、氢化钠、叔丁醇钠(钾)的作用下，与盐酸羟胺反应，得到N-羟基-4-[1-(3,5,5,8,8-五甲基-5,6,7,8-四氢化萘-2-基)乙烯基]苯甲酰胺(蓓萨罗丁羟肟酸)。
除以上方法外，还可以先将化合物Ⅳ在酸或碱催化下水解为蓓萨罗丁(Ⅴ)，然后将蓓萨罗丁(Ⅴ)与各种氯代试剂如二氯亚砜、三氯化磷、五氯化磷、三氯氧磷等反应得到酰氯(化合物Ⅵ)，化合物Ⅵ再在合适溶剂中，在各种合适的碱作用下，与盐酸羟胺反应得到N-羟基-4-[1-(3,5,5,8,8-五甲基-5,6,7,8-四氢化萘-2-基)乙烯基]苯甲酰胺(蓓萨罗丁羟肟酸)。
本发明制备方法简单，制备的化合物具有抗肿瘤作用。
具体实施方式：
实施例1.4-(3,5,5,8,8-五甲基-5,6,7,8-四氢化萘-2-羰基)苯甲酸甲酯(Ⅲ)的制备：
向2L三颈瓶中，加入100g对苯二甲酸单甲酯单酰氯(Ⅱ)和80g五甲基四氢化萘(Ⅰ)，再加入500mL二氯甲烷，搅拌溶解，分次加入200g三氯化铁，然后在30-35℃反应20小时，搅拌下将反应液缓慢倾入2L冰水混合物中，分层，分出二氯甲烷层，水层用二氯甲烷500ml×3萃取，合并有机层。合并的有机层用饱和NaHCO3水溶液300ml×3洗三遍，饱和NaCl水溶液300ml洗一遍，无水硫酸镁干燥1h，蒸去溶剂，得淡黄色固体产物，粗品收率95％。
实施例2.4-[1-(3,5,5,8,8-五甲基-5,6,7,8-四氢化萘-2-基)乙烯基]苯甲酸甲酯(Ⅳ)的制备：
向500mL三颈瓶中，置入50g甲基三苯基溴化膦、4.6g的氢氧化钠和22.4g4-(3,5,5,8,8-五甲基-5,6,7,8-四氢化萘-2-羰基)苯甲酸甲酯(Ⅲ)，然后加入230mL THF，缓缓升温回流10小时，减压蒸去THF，得4-[1-(3,5,5,8,8-五甲基-5,6,7,8-四氢化萘-2-基)乙烯基]苯甲酸甲酯，收率65％。
实施例3.蓓萨罗丁羟肟酸的制备：
向500mL茄形瓶中，加入20g4-[1-(3,5,5,8,8-五甲基-5,6,7,8-四氢化萘-2-基)乙烯基]苯甲酸甲酯、6g盐酸羟胺和9g氢氧化钠，然后，再加入200mL乙醇，室温搅拌反应20小时，过滤，滤液减压蒸去溶剂得到蓓萨罗丁羟肟酸粗品，乙醇重结晶，得到精品。ESI-MS：364.2[M+H]+，362.1[M-H]-1H-NMR(CDCl3)δ:1.28(s,6H),1.31(s,6H),1.70(s,4H),1.95(s,3H),5.35(d,1H),5.83(d,1H),7.08(s,1H),7.13(s,1H),7.38(d,2H),8.03(d,2H)
生物活性测试实验部分
2.1目标化合物蓓萨罗丁羟肟酸对U87细胞株增殖抑制活性实验
2.1.1实验目的
针对所提合成的蓓萨罗丁羟肟酸，应用人胶质瘤细胞株U87，采用经典的MTT法进行抗肿瘤活性筛选。
实验材料
A受试品
化合物蓓萨罗丁、蓓萨罗丁羟肟酸。
实验细胞株及来源
| 人肝癌细胞Hep3B等10种 | (购自ATCC) |
C实验试剂
| DMEM高糖培养基 | Gibco |
| 胎牛血清 | 天津市灏洋生物制品有限公司 |
| 四甲基偶氮唑盐(MTT) | 美国Sigma |
| 二甲基亚砜(DMSO) | 沈阳化学试剂厂 |
| NaCl | 沈阳化学试剂厂 |
| KCl | 沈阳化学试剂厂 |
| KH2PO3 | 沈阳化学试剂厂 |
| Na2HPO3 | 沈阳化学试剂厂 |
| NaHCO3 | 沈阳化学试剂厂 |
| 酶标仪 | 奥地利TECAN |
| 96孔细胞培养板 | Costar公司 |
2.1.3实验方法
A药物处理
1)药物的溶解
化合物均为粉末状，使用DMSO溶解。配成浓度为100mmol/L的母液，储存于-20℃。临用时用相应的培养液将其稀释为100μmol/L、10μmol/L、1μmol/L及0.1μmol/L进行实验。DMSO配置的样品进行实验时，DMSO的终浓度为1‰。阳性药5-氟尿嘧啶浓度为100μmol/L、10μmol/L、1μmol/L、和0.1μmol/L。
2)给药处理
取对数生长期的细胞，调整适当的细胞密度，接种于96孔板内，100μl/well，培养于37℃，5％CO2的培养箱内。培养24h后加药，作用48h。分设空白组、给药组和阳性对照组，每组设4个复孔。
MTT检验
1)MTT法的基本原理
细胞成活率测定采用MTT分析法，以活细胞代谢还原四甲基偶氮唑盐(3-(4,5-dimethyl-2thiahiazoy1)-3,5-di-phenyl-tetrazolium bromide，MTT)为基础。MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下四氮唑环开裂，生成蓝色的Formazan结晶，Formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比。死细胞中此酶消失，不能和20％的十二烷基磺酸钠(pH4.7)的MTT溶解液中溶解，利用酶标仪在492nm测定光密度值(OD值)，OD值的大小与所生成的Formazan结晶的量成正比，从而反应出药物对细胞成活率的影响。
法的测定方法
药物作用48h后，将细胞与0.25mg/ml MTT于37℃下共同孵育3-4h，吸除培养液后每孔加入100μl二甲基亚砜(DMSO)，完全溶解后使用酶标仪于492nm测定其OD值。最后以空白组OD值为100％，计算各组细胞抑制率。
3、统计方法
全部资料采用SPSS(16.0)统计软件包进行检验分析。各组数据用均值±标准误(Mean±S.E.)表示，采用One-Way ANOVA评价整体性差异，并进行Dunnett或Dunnett’s T3检验进行组间比较。
IC50的计算方法[4]
将各剂量和抑制率等参数用非线性回归拟合计算IC50。
四.实验结果
蓓萨罗丁和蓓萨罗丁羟肟酸对10种肿瘤细胞的IC50(μmol/L)
| 细胞株 | 蓓萨罗丁 | 蓓萨罗丁羟肟酸 |
| 人肝癌细胞Hep3B | 2.77 | 2.27 |
| 人肝癌细胞HepG2 | >100 | 17.85 |
| 人非小细胞肺癌细胞A549 | 2.56 | 2.13 |
| 人白血病细胞HL60 | 28.30 | 27.06 |
| 人乳腺癌细胞MCF-7 | 1.54 | 9.99 |
| 人乳腺癌细胞MDA-MB-435 | 16.66 | 5.65 |
| 人脑胶质瘤细胞U251 | 5.04 | 2.95 |
| 人胃癌细胞HGC | >100 | 14.52 |
| 人结肠癌细胞Colon205 | >100 | 15.14 |
| 人脑胶质瘤细胞U87 | >100 | 15.82 |
结论：倍萨罗丁羟肟酸可作为癌症治疗药物。
Claims (7)
1.蓓萨罗丁羟肟酸，其特征在于：结构式如下：
。
2.如权利要求1所述的蓓萨罗丁羟肟酸在制备治疗肿瘤药物中的应用。
3.如权利要求1所述的蓓萨罗丁羟肟酸的制备方法，其特征在于：
合成反应流程如下：
。
4. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所用的溶剂选自乙醇、甲醇、异丙醇、丙酮、乙酸乙酯、N,N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、甲苯、二氯甲烷或1,2-二氯乙烷。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述的碱为无机碱或有机碱，所述无机碱选自氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾，所述的有机碱选自三乙胺、氢化钠、叔丁醇钠、叔丁醇钾。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：先将化合物（Ⅳ）在酸或碱催化下水解为蓓萨罗丁(Ⅴ)，然后将蓓萨罗丁(Ⅴ)与氯代试剂反应得到酰氯(Ⅵ)，化合物（Ⅵ）再在溶剂中，在碱作用下，与盐酸羟胺反应得到N-羟基-4-[1-(3,5,5,8,8-五甲基-5,6,7,8-四氢化萘-2-基)乙烯基]苯甲酰胺。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述的氯代试剂选自二氯亚砜、三氯化磷、五氯化磷、三氯氧磷。
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