CN102481278B

CN102481278B - 紫外线损伤减轻组合物

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Publication number: CN102481278B
Application number: CN201080036677.0A
Authority: CN
Inventors: 芦田丰; 东条洋介; 水本智惠子; 三田真史
Original assignee: Shiseido Co Ltd
Current assignee: Shiseido Co Ltd
Priority date: 2009-09-14
Filing date: 2010-09-14
Publication date: 2014-04-16
Anticipated expiration: 2030-09-14
Also published as: EP2478899B1; WO2011030903A1; JPWO2011030903A1; KR20120041740A; RU2012108105A; TWI473624B; CN102481278A; AU2010293364A1; BR112012008146A2; RU2537187C2; EP2478899A4; HK1166708A1; EP2478899A1; ES2677618T3; US20120148509A1; TW201116303A; JP5795960B2

Abstract

本发明开发一种可日常使用、稳定且安全的紫外线损伤减轻组合物和含有其的药物组合物、皮肤外用剂、食品组合物及白内障用药物。本发明提供一种紫外线损伤减轻组合物，其含有选自由蛋氨酸及D-丝氨酸和它们的衍生物和/或盐组成的组中的1种或2种以上的化合物。所述组合物可以为皮肤外用剂、抗皱剂、防晒剂、皮肤病治疗和/或预防用药物组合物、食品组合物、及白内障用药物。本发明的紫外线损伤减轻组合物中，所述蛋氨酸可以为D-体。所述D-丝氨酸的衍生物可以为D-环丝氨酸。

Description

紫外线损伤减轻组合物

技术领域

本发明涉及一种紫外线损伤减轻组合物，其含有选自由蛋氨酸及D-丝氨酸和它们的衍生物和/或盐组成的组中的1种或2种以上的化合物；以及一种改善由紫外线暴晒所导致的皮肤病及改善皮肤的美容状态的方法，该方法包括投与含有选自由蛋氨酸及D-丝氨酸和它们的衍生物和/或盐组成的组中的1种或2种以上的化合物的步骤。

背景技术

紫外线可分为长于约320nm的长波长区域紫外线(UV-A)、约320nm～约280nm的中波长区域紫外线(UV-B)、短于约280nm的短波长区域紫外线(UV-C)。其中，由于UV-C被臭氧层吸收，所以到达地面上的太阳光中不含有UV-C。UV-A及UV-B虽共同含有在到达地面上的太阳光中，但UV-B被臭氧层部分吸收。但是，由于UV-A不被臭氧层所吸收，所以UV-A占到达地面上的紫外线的大部分，从而引起皮肤损伤。根据非专利文献1，与紫外线相关的疾病可列举出皱纹、红斑、着色性干皮病、慢性光化性皮炎、扁平上皮癌、基底细胞癌、恶性黑素瘤、鲍温病、日光性角化病、光敏症、牛痘样水疱病及光接触皮肤炎；根据非专利文献2，可列举出日光性皮炎、慢性光化性皮炎、光化性角化病、光化性唇炎、结节性类弹性纤维病、光敏症、光接触性皮炎、伯洛克皮炎、光敏性药疹、多形性日光疹、牛痘样水疱病、日光性荨麻疹、慢性光敏性皮炎、着色性干皮病、雀斑、卟啉症、糙皮病、哈特纳普病、日光性角化病、皮肌炎、扁平苔藓、毛囊角化病、毛发红糠疹、酒渣鼻、异位性皮炎、黄褐斑、单纯疱疹及红斑狼疮等。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：皮肤病最新的治疗2005-2006(南江堂)

非专利文献2：标准皮肤科学第7版(医学书院)

发明内容

发明要解决的问题

以往由紫外线导致的皮肤损伤的预防剂和/或治疗剂已知有像用于阻碍皮肤吸收紫外线的氧化钛那样的紫外线散射剂、像对甲氧基肉桂酸-2-乙基己酯那样的紫外线吸收剂、及用于除去由紫外线所产生的游离自由基的抗氧化剂。然而，紫外线散射剂、紫外线吸收剂对在室外的防晒有效，但不适于日常使用。此外，抗氧化剂在稳定性及安全性方面存在问题。进而，针对紫外线所引起的皮肤损伤的治疗剂仅知对症疗法药。因此，需要开发能够日常使用、稳定且安全的紫外线损伤减轻组合物、皮肤外用剂、抗皱剂、防晒剂、皮肤病治疗用和/或预防用药物组合物、食品组合物、白内障用药品。

用干解决问题的方案

本发明提供一种紫外线损伤减轻组合物，其含有选自由蛋氨酸和它们的衍生物和/或盐组成的组中的1种或2种以上的化合物。

本发明的紫外线损伤减轻组合物中，所述蛋氨酸可以为D-体。

本发明提供一种紫外线损伤减轻组合物，其含有选自由D-丝氨酸和它们的衍生物和/或盐组成的组中的1种或2种以上的化合物。

本发明的紫外线损伤减轻组合物中，所述D-丝氨酸的衍生物可以为D-环丝氨酸。

本发明的紫外线损伤减轻组合物可被用作皮肤外用剂。

本发明的紫外线损伤减轻组合物中，所述皮肤外用剂可以为抗皱剂。

本发明的紫外线损伤减轻组合物中，所述皮肤外用剂可以为防晒剂。

本发明的紫外线损伤减轻组合物中，所述皮肤外用剂可以被用作皮肤病用药物。

所述皮肤病可以选自由红斑、日光性皮炎、慢性光化性皮炎、光化性角化病、光化性唇炎、结节性类弹性纤维病、光敏症、光接触性皮炎、伯洛克皮炎、光敏性药疹、多形性日光疹、牛痘样水疱病、日光性荨麻疹、慢性光敏性皮炎、着色性干皮病、雀斑、卟啉症、糙皮病、哈特纳普病、日光性角化病、皮肌炎、扁平苔藓、毛囊角化病、毛发红糠疹、酒渣鼻、异位性皮炎、黄褐斑、单纯疱疹、红斑狼疮、扁平上皮癌、基底细胞癌及鲍温病所组成的组。

本发明的紫外线损伤减轻组合物中，所述皮肤病用药物可以为皮肤病用治疗剂。

本发明的紫外线损伤减轻组合物中，所述皮肤病用药物可以为皮肤病用预防剂。

本发明的紫外线损伤减轻组合物可以被用作食品。

本发明的紫外线损伤减轻组合物可以被用作白内障用药物。

本发明的紫外线损伤减轻组合物中，所述白内障用药物可以为白内障用治疗剂或白内障用预防剂。

本发明的紫外线损伤减轻组合物可被用作滴眼药。

前述白内障可以为老年性白内障。

本发明提供一种紫外线损伤减轻组合物，其含有选自由蛋氨酸和它们的衍生物和/或盐组成的组中的1种或2种以上的化合物，并且口服组合物除外。所述蛋氨酸可以为D-体。

本发明提供一种用于治疗和/或预防由紫外线暴晒所导致的皮肤病的方法，所述方法包括投与紫外线损伤减轻组合物的步骤，所述紫外线损伤减轻组合物含有选自由蛋氨酸及D-丝氨酸和它们的衍生物和/或盐组成的组中的1种或2种以上的化合物。所述皮肤病可以选自由红斑、日光性皮炎、慢性光化性皮炎、光化性角化病、光化性唇炎、结节性类弹性纤维病、光敏症、光接触性皮炎、伯洛克皮炎、光敏性药疹、多形性日光疹、牛痘样水疱病、日光性荨麻疹、慢性光敏性皮炎、着色性干皮病、雀斑、卟啉症、糙皮病、哈特纳普病、日光性角化病、皮肌炎、扁平苔藓、毛囊角化病、毛发红糠疹、酒渣鼻、异位性皮炎、黄褐斑、单纯疱疹、红斑狼疮、扁平上皮癌、基底细胞癌及鲍温病所组成的组。前述蛋氨酸可以为D-体。前述D-丝氨酸的衍生物可以为D-环丝氨酸。

本发明提供一种治疗和/或预防由紫外线暴晒所导致的皮肤病的方法，所述方法包括投与紫外线损伤减轻组合物的步骤，所述紫外线损伤减轻组合物含有选自由蛋氨酸及其衍生物和/或盐组成的组中的1种或2种以上的化合物，并且口服组合物除外的包括投与紫外线损伤减轻组合物的步骤。所述皮肤病可以选自由红斑、日光性皮炎、慢性光化性皮炎、光化性角化病、光化性唇炎、结节性类弹性纤维病、光敏症、光接触性皮炎、伯洛克皮炎、光敏性药疹、多形性日光疹、牛痘样水疱病、日光性荨麻疹、慢性光敏性皮炎、着色性干皮病、雀斑、卟啉症、糙皮病、哈特纳普病、日光性角化病、皮肌炎、扁平苔藓、毛囊角化病、毛发红糠疹、酒渣鼻、异位性皮炎、黄褐斑、单纯疱疹、红斑狼疮、扁平上皮癌、基底细胞癌及鲍温病所组成的组。前述蛋氨酸可以为D-体。

本发明提供一种改善皮肤的美容状态的方法，所述方法包括投与紫外线损伤减轻组合物的步骤，所述紫外线损伤减轻组合物含有选自由蛋氨酸及D-丝氨酸和它们的衍生物和/或盐组成的组中的1种或2种以上的化合物。所述皮肤的美容状态的改善方法中，所述含有选自由蛋氨酸及D-丝氨酸和它们的衍生物和/或盐组成的组中的1种或2种以上的化合物的紫外线损伤减轻组合物可以为皮肤外用剂或食品组合物。所述蛋氨酸可以为D-体。所述D-丝氨酸的衍生物可以为D-环丝氨酸。

本发明提供一种改善皮肤的美容状态的方法，所述方法包括投与紫外线损伤减轻组合物的步骤，所述紫外线损伤减轻组合物含有选自由蛋氨酸和它们的衍生物和/或盐组成的组中的1种或2种以上的化合物，并且口服组合物除外。在所述皮肤的美容状态的改善方法中，所述含有选自由蛋氨酸和它们的衍生物和/或盐组成的组中的1种或2种以上的化合物、并且口服组合物除外的紫外线损伤减轻组合物可以为皮肤外用剂。前述蛋氨酸可以为D-体。

在本发明的皮肤的美容状态的改善方法中，皮肤的美容状态的改善可以为抗皱和/或防晒，但不限定于这些。

本发明提供一种治疗和/或预防白内障的方法，其包括投与组合物的步骤，所述组合物含有选自由蛋氨酸及D-丝氨酸和它们的衍生物和/或盐组成的组中的1种或2种以上的化合物。所述蛋氨酸可以为D-体。所述D-丝氨酸的衍生物可以为D-环丝氨酸。

在本发明的治疗和/或预防白内障的方法中，所述白内障用药物可以为滴眼药。

在本发明的治疗和/或预防白内障的方法中，所述白内障可以为老年性白内障。

本说明书中蛋氨酸、D-丝氨酸及D-环丝氨酸的“盐”是指在不损害蛋氨酸、D-丝氨酸及D-环丝氨酸的紫外线损伤的减轻效果的条件下，包括金属盐、胺盐等在内的任意的盐。所述金属盐可以包括碱金属盐、碱土金属盐等。所述胺盐可以包括三乙胺盐、苄胺盐等。

本说明书中蛋氨酸及D-丝氨酸的“衍生物”是指在不损害蛋氨酸及D-丝氨酸的紫外线损伤的减轻效果的条件下，蛋氨酸及D-丝氨酸分子在氨基、或羧基、或侧链上与任意的原子团以共价键连接而成的化合物。所述任意的原子团包括像N-苯基乙酰基、4，4’-二甲氧基三苯甲基(DMT)等这样的保护基，像蛋白质、肽、糖、脂质、核酸等这样的生物高分子，像聚苯乙烯、聚乙烯、聚乙烯基化合物、聚酯等这样的合成高分子，像酯基等这样的官能团，但不限定于这些。前述酯基可以包括例如甲酯、乙酯等脂肪族酯，或芳香族酯。所述D-丝氨酸的衍生物中，可以像D-环丝氨酸那样，由与氨基酸的α碳邻接的氨基和/或羧基与任意的原子团形成杂环。

氨基酸中存在作为光学异构体的L-体和D-体，天然的蛋白质为L-氨基酸以肽键键合而成的蛋白质，由于除了细菌的细胞壁等例外情况以外仅L-氨基酸被利用，因此认为以人类为首的哺乳类中仅存在L-氨基酸并且仅利用L-氨基酸。按照(木野内忠稔等，蛋白质核酸酶，50：453-460(2005)，Lehninger的新生物化学[上]第2版pp 132-147(1993)广川书店，哈珀·生物化学原文书22版pp21-30(1991)丸善)。一直以来，学术上也好产业上也好，作为氨基酸主要仅使用L-氨基酸。

作为例外地使用D-氨基酸的例子，有用作在细菌中产生抗生物质的原料的情况；以及为了节省从化学合成氨基酸时等量获得的L-氨基酸与D-氨基酸混合物中仅分离提取L-氨基酸的成本，而直接以DL-氨基酸混合物的形式使用D-氨基酸的食品添加物的例子。然而，从来没有在产业中仅使用不含有L-氨基酸的D-氨基酸作为生理活性物质的例子。

D-丝氨酸、D-天冬氨酸由于D-体的比例高，因此研究进展较快。D-丝氨酸局部存在于大脑、海马中，已清楚其为脑内的NMDA受体的调控因子。确认到D-天冬氨酸局部存在于精巢、松果体中，显示参与控制激素的分泌(日本特开2005-3558号公报)。但是D-丝氨酸、D-天冬氨酸在皮肤中的生理作用尚不明确。

如以下的实施例所示的那样，L-体或D-体、或者作为其混合物的蛋氨酸、D-丝氨酸、D-环丝氨酸用于减轻紫外线损伤的效果迄今未曾被知晓。因此，本发明的含有蛋氨酸、D-丝氨酸和/或D-环丝氨酸的紫外线损伤减轻组合物为新发明。

近年来，有报道显示，使ddY小鼠两周内自由摄入10mM的D-氨基酸水溶液，然后测定各器官中的D-氨基酸浓度，结果：松果体中，D-氨基酸浓度相对于1个作为分泌器官的松果体为3-1000pmol；脑组织中，D氨基酸浓度相对于1克湿重量为2-500nmol(Morikawa，A.等，Amino Acids，32：13-20(2007))。基于此，算出以下说明的本发明的组合物中所含有的蛋氨酸、D-丝氨酸及D-环丝氨酸的一日摄入量的下限。

如以下的实施例所示的那样，本发明的蛋氨酸在0.001～100μM的浓度范围内对培养的人成纤维细胞具有减轻紫外线损伤的效果。因此，本发明的药物组合物、抗皱剂及防晒剂、皮肤外用剂、白内障用药物中所含的蛋氨酸的量只要满足该浓度范围的蛋氨酸能够送达至生物体皮肤组织的成纤维细胞的条件，则可以为任意含量。本发明的组合物为外用剂时，蛋氨酸的含量只要为本发明的组合物总量中0.0000015质量％至50质量％或可配合的最大质量浓度为止的范围即可。即，前述组合物为外用剂时，蛋氨酸的优选含量为0.000003质量％～30质量％，最优选含量为0.00003质量％～3质量％。另外，本发明的组合物中所含的D-蛋氨酸的一日摄入量的下限只要每1kg体重为0.01ng即可，优选摄入量为0.1ng，更优选摄入量为1ng。本发明的组合物中所含的L-蛋氨酸的一日摄入量的下限为少于临床药投与量(每1kg体重为2mg以上)的量，只要每1kg体重为0.01mg即可，优选投与量为0.1mg，更优选投与量为1mg。

如以下的实施例所示的那样，本发明的D-丝氨酸在0.01～100μM的浓度范围内对培养的人成纤维细胞具有减轻紫外线损伤的效果。因此，本发明的药物组合物、抗皱剂及防晒剂、皮肤外用剂、食品组合物、白内障用药物中所含的D-丝氨酸的量只要满足该浓度范围的D-丝氨酸能够送达至生物体皮肤组织的成纤维细胞的条件，则可以为任意含量。本发明的组合物为外用剂时，D-丝氨酸的含量只要为本发明的组合物总量中0.000015质量％至50质量％或可配合的最大质量浓度为止的范围即可。即前述组合物为外用剂时，D-丝氨酸的优选含量为0.00003质量％～30质量％，最优选含量为0.0003质量％～3质量％。本发明的组合物为内服剂时，D-丝氨酸的含量只要为0.00001质量％～100质量％的范围即可。本发明的组合物为内服剂时，D-丝氨酸的优选含量为0.00002质量％～80质量％，最优选含量为0.0002质量％～60质量％。另外，本发明的组合物中所含的D-丝氨酸的一日摄入量的下限只要每1kg体重为0.01ng即可，优选摄入量为0.1ng，更优选摄入量为1ng。

如以下的实施例所示的那样，本发明的D-环丝氨酸在1～100μM的浓度范围内对培养的人成纤维细胞具有减轻紫外线损伤的效果。因此，本发明的药物组合物、抗皱剂及防晒剂、皮肤外用剂、食品组合物、白内障用药物中所含的D-环丝氨酸的量只要满足该浓度范围的D-环丝氨酸能够送达至生物体皮肤组织的成纤维细胞的条件，则可以为任意含量。本发明的组合物为外用剂时，D-环丝氨酸的含量只要为本发明的组合物总量中0.0000015质量％至50质量％或可配合的最大质量浓度为止的范围即可。即前述组合物为外用剂时，D-环丝氨酸的优选含量为0.000003质量％～30质量％，最优选含量为0.00003质量％～3质量％。另外，本发明的组合物中所含的D-环丝氨酸的一日摄入量的下限只要每1kg体重为0.01μg即可，优选摄入量为0.1μg，更优选摄入量为1μg。

本发明的药物组合物除了含有蛋氨酸及D-丝氨酸、蛋氨酸及D-丝氨酸的盐、和/或能够在生物体内通过药物代谢酶等释放蛋氨酸及D-丝氨酸的衍生物之外，在不损害蛋氨酸及D-丝氨酸的紫外线损伤的减轻效果的条件下，还可以含有1种或2种以上药学上所允许的添加物。所述添加物可以包括稀释剂及膨胀剂、粘合剂及粘接剂、润滑剂、助流剂、增塑剂、崩解剂、载体溶剂、缓冲剂、着色材料、香料、甜味剂、防腐剂及稳定化剂、吸附剂、本领域技术人员所知的其他药物添加剂，但不限于这些。

本发明的抗皱剂和/或防晒剂也可以仅使用蛋氨酸、D-丝氨酸及D-环丝氨酸、蛋氨酸、D-丝氨酸及D-环丝氨酸的盐、和/或能够在生物体内通过药物代谢酶等释放蛋氨酸、D-丝氨酸及D-环丝氨酸的衍生物作为有效成分进行制备，但通常在不损害本发明效果的范围内，可以根据需要适当配合包括准药物在内的化妆品、药物等皮肤外用剂等中使用的其他成分。作为前述其他成分(任意配合成分)，例如可列举出油分、表面活性剂、粉末、着色材料、水、醇类、增稠剂、螯合剂、硅酮类、抗氧化剂、紫外线吸收剂、保湿剂、香料、各种药效成分、防腐剂、pH调节剂、中和剂等。

本发明的皮肤外用剂只要是例如软膏、乳霜、乳液、化妆水、面膜、浴用剂等现有皮肤外用剂及化妆品组合物中所用者即可，其剂型不限。

本发明的皮肤外用剂在不损害蛋氨酸、D-丝氨酸及D-环丝氨酸的紫外线损伤的减轻效果的条件下，根据需要可以适当配合包括准药物在内的化妆品、药物等皮肤外用剂等中使用的其他成分。作为前述其他成分(任意配合成分)，例如可列举出油分、表面活性剂、粉末、着色材料、水、醇类、增稠剂、螯合剂、硅酮类、抗氧化剂、紫外线吸收剂、保湿剂、香料、各种药效成分、防腐剂、pH调节剂、中和剂等。

本发明的食品组合物除了含有D-丝氨酸及D-环丝氨酸、D-丝氨酸及D-环丝氨酸的盐、和/或能够在生物体内通过药物代谢酶等释放D-丝氨酸及D-环丝氨酸的衍生物之外，在不损害D-丝氨酸及D-环丝氨酸的紫外线损伤的减轻效果的条件下，还可以含有调料、着色材料、保存料等作为食品所允许的成分。

本发明的食品组合物只要是例如清凉饮料、橡皮糖、糖果(candy)、清凉果片等现有食品组合物中所用者即可，但不限定于所述例示。

附图说明

图1为显示正常人真皮成纤维细胞于照射紫外线前添加L-或D-蛋氨酸的效果的坐标图。

图2为显示正常人真皮成纤维细胞于照射紫外线前添加D-蛋氨酸的效果的坐标图。

图3为显示正常人真皮成纤维细胞于照射紫外线后添加D-蛋氨酸的效果的坐标图。

图4为显示正常人真皮成纤维细胞于照射紫外线前添加L-或D-丝氨酸的效果的坐标图。

图5为显示正常人真皮成纤维细胞于照射紫外线前添加D-丝氨酸的效果的坐标图。

图6为显示正常人真皮成纤维细胞于照射紫外线后添加D-丝氨酸的效果的坐标图。

图7为显示正常人真皮成纤维细胞于照射紫外线后添加D-环丝氨酸的效果的坐标图。

具体实施方式

以下说明的本发明的实施例仅以例示为目的，不限定本发明的保护范围。本发明的保护范围仅受权利要求书的记载范围所限定。

本说明书中言及的全部文献以引用其整体的方式引入本说明书中。

实施例1

蛋氨酸的紫外线损伤减轻效果

方法

细胞培养

细胞使用市售的人新生儿真皮成纤维细胞(CryoNHDF-Neo，三光纯药)。所述细胞按照2×10⁵个/mL的方式接种于市售的35mm直径的培养皿(BD FALCON 353001，日本Becton·Dickinson)中，使用在市售的细胞培养用培养基(D-MEM(1g/L葡萄糖)，和光纯药)中添加了10％胎牛血清的培养基(以下称为“普通培养基”。)进行培养。所述细胞可以用在所述普通培养基中添加了1％抗生物质(15240-062，GIBCO)的培养基进行培养。所述细胞在37℃、5％CO₂及饱和水蒸气条件下培养约24小时。

之后，将用于培养所述细胞的培养基更换为添加有1×10^-3％作为谷胱甘肽的生物合成抑制剂的BSO(L-buthionine-(S，R)-sulfoximine，和光纯药)的BSO培养基1mL，在37℃、5％CO₂及饱和水蒸气条件下培养约24小时。所述BSO培养基如下配制：将乙醇中溶解有0.2％BSO的保存用原液在所述普通培养基中稀释200倍。

照射紫外线前添加氨基酸

研究照射紫外线前添加蛋氨酸(以下称为“照射前添加蛋氨酸”。)的效果时，在照射24小时前，更换为添加有0.0001至100μM的L-蛋氨酸(131-01603，和光纯药)或D-蛋氨酸(2807，肽研究所)的BSO培养基。将更换为添加有0.1μM的D-脯氨酸(165-14671，和光纯药)的培养基后的照射紫外线作为阳性对照，将不添加这些氨基酸的培养基原样时的照射紫外线作为阴性对照。

照射紫外线用培养基

将氯化铁(II)按照2×10^-3％的方式溶解至蒸馏水中，用含有钙离子、镁离子的磷酸缓冲液PBS(+)按照稀释200倍(最终浓度1×10^-5％)的方式稀释该溶解液，将如此制作的培养基(以下称为“照射紫外线用培养基”。)预先加热至37℃后再使用。

照射紫外线

在照射UV-A前将培养基置换为所述照射紫外线用培养基1mL。照射UV-A如下实施：使用紫外光均匀曝光装置UVE-502S+EL-160(三永电机制作所)，在除去培养皿盖的状态下，从该培养皿的大约20cm上方，以8J/cm²或9J/cm²照射320nm至400nm的紫外线。紫外线量使用UV RADIOMETERUVR-3036/S(株式会社TOPCON)进行测定。

照射紫外线后添加氨基酸

在照射8J/cm²的UV-A后，返回至前述普通培养基中，在37℃、5％CO₂及饱和水蒸气条件下培养40小时。研究照射紫外线后添加蛋氨酸(以下称为“照射后添加蛋氨酸”。)的效果时，向该40小时培养的培养基中添加0.001至100μM的L-或D-蛋氨酸。将更换为添加了0.1μM的D-脯氨酸的培养基后的照射紫外线作为阳性对照，将不添加这些氨基酸的培养基直接进行照射紫外线作为阴性对照。

照射前添加及照射后添加时的细胞损伤的定量

之后，按照最终浓度为10％的方式向培养基中添加alamarBlue(商标，Biosource，Biosource·International 及Invitrogen)，3小时后，按照Ahmed S.A.等(J.Immunol.Method.170，211-224(1994))、及制造商的说明书以激发波长544nm、荧光波长590nm测定上清的荧光强度。活细胞率(％)以如下方式计算：各实验条件下的alamarBlue的荧光强度除以不添加氨基酸的阴性对照群的荧光强度而得到的商的百分率。

照射前添加蛋氨酸的结果(1)

图1示出了调查L-及D-蛋氨酸对由照射UV-A 9J/cm²的紫外线所导致的成纤维细胞的损伤的效果的实验结果。各实验条件的误差柱表示在同一条件下重复4次的实验结果的测定值的标准偏差。另外，B onferroni/Dunn检验中，星号(*)表示p值不足5％，星号(**)表示p值不足1％，星号(***)表示p值不足0.1％。

在照射UV-A 9J/cm²前不添加氨基酸时(阴性对照)的活细胞率为24％。照射前添加0.1μM的D-脯氨酸时(阳性对照)的活细胞率为100％，细胞死亡得到抑制。照射前添加0.01μM、0.1μM、1μM、10μM或100μM的D-蛋氨酸时的活细胞率为102％、81％、97％、114％或76％。照射前添加0.001μM、0.01μM、0.1μM、1μM、10μM或100μM的L-蛋氨酸时的活细胞率为40％、72％、67％、45％、73％或62％。由以上的结果可知，添加L-或D-蛋氨酸时活细胞率增大，细胞死亡减轻。

照射前添加蛋氨酸的结果(2)

图2中示出了调查D-蛋氨酸对由照射UV-A 9J/cm²的紫外线所导致的成纤维细胞的损伤的效果的实验结果。各实验条件的误差柱表示在同一条件下重复3～4次的实验结果的测定值的标准偏差。另外，Bonferroni/Dunn检验中，星号(*)表示标准偏差不足5％。

未照射紫外线且未添加氨基酸(以下称为“紫外线非照射”。)时的活细胞率(％)为100％。在照射UV-A 9J/cm²前不添加氨基酸时(阴性对照)的活细胞率为69％。照射前添加0.1μM的D-脯氨酸时(阳性对照)的活细胞率为88％，细胞死亡得到抑制。照射前添加0.0001μM及0.1μM的D-蛋氨酸时的活细胞率为50％及101％。由以上的结果可知，由照射紫外线所导致的细胞损伤在添加0.0001μM的D-蛋氨酸时活细胞率不增大，添加0.1μM的D-蛋氨酸时活细胞率增大，细胞死亡减轻。

照射后添加蛋氨酸的结果

图3示出了调查D-蛋氨酸对由照射UV-A 8J/cm²的紫外线所导致的成纤维细胞的损伤的效果的实验结果。各实验条件的误差柱表示在同一条件下重复4次的实验结果的测定值的标准偏差。另外，星号(***)表示B onferroni/Dunn检验中p值不足0.1％。

在照射UV-A 8J/cm²后不添加氨基酸时(阴性对照)的活细胞率为64％。照射后添加0.1μM的D-脯氨酸时的活细胞率增大为82％，细胞死亡减轻。照射后添加0.01μM、0.1μM、1μM、10μM或100μM的D-蛋氨酸时的活细胞率为93％、84％、82％、81％或约87％。由以上的结果可知，添加D-蛋氨酸时活细胞率增大，细胞死亡减轻。另外，细胞死亡的减轻效果与在照射紫外线之前还是之后添加D-蛋氨酸无关。另外，L-蛋氨酸也减轻由照射紫外线所导致的细胞死亡。因此，提示了细胞死亡的减轻效果与在照射紫外线之前还是之后添加L-蛋氨酸无关。

实施例2

丝氨酸的紫外线损伤减轻效果

方法

细胞培养、照射紫外线前的氨基酸添加、照射紫外线、照射紫外线后的氨基酸添加及细胞损伤的定量与实施例1同样地进行。以7.5或9J/cm²照射紫外线(UV-A)。研究照射紫外线前添加丝氨酸(以下称为“照射前添加丝氨酸”。)和照射紫外线后添加丝氨酸(以下称为“照射后添加丝氨酸”。)的效果时，使用0.0001至100μM的L-丝氨酸(197-00403，和光纯药)及D-丝氨酸(197-08823，和光纯药)。照射后添加丝氨酸的效果通过如下进行评价：对细胞照射7.5J/cm²的UV-A后，返回至普通培养基培养21小时，向该21小时培养的培养基中添加D-丝氨酸，从而进行评价。

照射前添加丝氨酸的结果(1)

图4示出了调查照射前添加L-及D-丝氨酸对由照射UV-A9J/cm²的紫外线所导致的成纤维细胞的损伤效果的实验结果。各实验条件的误差柱表示在同一条件下重复4至6次的实验结果的测定值的标准偏差。另外，星号(*)表示Bonferroni/Dunn检验中p值不足5％。

未照射紫外线时的alamarBlue(商标)的荧光强度为794。在照射9J/cm²的UV-A前不添加氨基酸时(阴性对照)的荧光强度为140。照射前添加0.1μM的D-脯氨酸时(阳性对照)的荧光强度增大为610，细胞损伤减轻。照射前添加0.01μM、0.1μM、1μM或10μM的D-丝氨酸时的荧光强度为445、402、371或491。照射前添加0.1μM、1μM或10μM的L-丝氨酸时的荧光强度为265、227或270。由以上的结果可知，照射前添加L-丝氨酸时，细胞损伤几乎不减轻。但是，照射前添加D-丝氨酸时，荧光强度在统计学上显著增大，细胞损伤减轻。

照射前添加丝氨酸的结果(2)

图5示出了调查在照射前添加D-丝氨酸对由照射UV-A8J/cm²的紫外线所导致的成纤维细胞的损伤效果的实验结果。各实验条件的误差柱表示在同一条件下重复4次的实验结果的测定值的标准偏差。另外，星号(*)表示Bonferroni/Dunn检验中p值不足5％。

未照射紫外线时的活细胞率为100％。在照射UV-A 8J/cm²前不添加氨基酸时(阴性对照)的活细胞率为77％。照射前添加0.0001μM、0.01μM及10μM的D-丝氨酸时的活细胞率为74％、92％及93％。由以上的结果可知，由照射紫外线所导致的细胞损伤在添加0.0001μM的D-丝氨酸时活细胞率不增大，但添加0.1μM及10μM的D-丝氨酸时活细胞率增大，细胞死亡减轻。

照射后添加丝氨酸的结果

图6示出了调查在照射后添加D-丝氨酸对由照射UV-A7.5J/cm²的紫外线所导致的成纤维细胞的损伤效果的实验结果。各实验条件的误差柱表示在同一条件下重复8次的实验结果的测定值的标准偏差。另外，星号(*)表示Bonferroni/Dunn检验中p值不足5％。

未照射紫外线时的alamarBlue(商标)的荧光强度为764。在照射7.5J/cm²的UV-A后不添加氨基酸时(阴性对照)的荧光强度为348。照射后添加0.1μM的D-脯氨酸时(阳性对照)的荧光强度增大为579，细胞损伤减轻。照射后添加0.01μM、0.1μM、1μM、10μM或100μM的D-丝氨酸时的荧光强度为697、735、742、664或663。由以上的结果可知，在照射后添加D-丝氨酸时，荧光强度在统计学上显著增大，细胞损伤减轻。另外，提示了细胞损伤的减轻效果与在照射紫外线之前还是之后添加D-丝氨酸无关。

实施例3

D-环丝氨酸的紫外线损伤减轻效果

方法

细胞培养、照射紫外线前的氨基酸添加、照射紫外线、照射紫外线后的氨基酸添加及细胞损伤的定量与实施例1同样地进行。以9J/cm²照射紫外线(UV-A)。研究照射紫外线前添加D-环丝氨酸(以下称为“照射前添加D-环丝氨酸”。)的效果时，使用0.0001至100μM的D-环丝氨酸(C6880，Sigma)。

照射前添加D-环丝氨酸的结果

图7示出了调查在照射前添加D-环丝氨酸对由照射UV-A9J/cm²的紫外线所导致的成纤维细胞的损伤效果的实验结果。各实验条件的误差柱表示在同一条件下重复3～4次的实验结果的测定值的标准偏差。另外，记号(+)及星号(***)分别表示Bonferroni/Dunn检验中p值不足10％及不足0.1％。

在照射UV-A 9J/cm²前不添加氨基酸时(阴性对照)的活细胞率为53％。照射前添加0.1nM、10nM、100nM、1μM、10μM及100μM的D-环丝氨酸时的活细胞率为60％、60％、63％、74％、69％及109％。由以上的结果可知，添加D-环丝氨酸时活细胞率增大，细胞死亡减轻。

以下示出基于本发明的含有蛋氨酸、D-丝氨酸和/或D-环丝氨酸的乳液制剂、贴剂、片剂、软胶囊、颗粒、饮料、糖果、饼干、味噌、法式色拉调味汁、蛋黄酱、法式面包、酱油、酸奶、撒在饭上的粉状食品、调料·纳豆的佐料汁、纳豆、醪黑醋、乳霜、身体用乳霜、凝胶剂、剥离型面膜、浸渗型面膜、乳液、化妆水及气雾剂的配合例。以下的配合例中的蛋氨酸为D-体和/或L-体。这些配合例以例示为目的而被列举，并不意图限定本发明的保护范围。

配合例1(乳液制剂)

配合例2(贴剂)

配合例3(片剂)

配合例4(片剂)

配合例5(软胶囊)

配合例6(软胶囊)

配合例7(颗粒)

配合例8(饮料)

配合例9(糖果)

配合例10(饼干)

配合例10(饼干)的制造方法

边搅拌黄油边缓慢地添加细砂糖，添加鸡蛋、D-丝氨酸和/或D-环丝氨酸、香料并搅拌。充分混合后，加入摇匀的低筋面粉，在低速度下搅拌，以块状在冰箱中存放。之后，进行成型，在170℃下烘焙15分钟制成饼干。

配合例11(味噌)

配合例11(味噌)的制造方法

将米曲和盐充分混合。将洗净的大豆在3倍量的水中浸泡一夜，然后去除水，边添加新的水边煮熟，过筛。收集煮出来的汤汁(原汁)，溶解D-丝氨酸和/或D-环丝氨酸使其浓度为10％w/v。立即将煮好的豆捣碎，加入混有盐的米曲，边加入所述溶解有D-丝氨酸和/或D-环丝氨酸的原汁边均匀混合至如粘土那样的硬度。将揉成的团状物以无间隙的状态紧密地填塞到桶中直至各个角落也填满，使表面平整后，用包裹物覆盖并密封。3个月后更换容器，使表面平整后，用包裹物覆盖。另外，也可以代替向原汁中加入D-丝氨酸和/或D-环丝氨酸而使用产生大量D-丝氨酸和/或D-环丝氨酸的米曲。为了得到所述米曲，可通过利用日本特开2008-185558中记载的方法对D-丝氨酸和/或D-环丝氨酸进行定量从而挑选。另外，也可以向市售的味噌中添加D-丝氨酸和/或D-环丝氨酸、或者它们的盐。

配合例12(法式色拉调味汁)

配合例12(法式色拉调味汁)的制造方法

向醋中加入氯化钠、D-丝氨酸和/或D-环丝氨酸后，充分搅拌并溶解。添加色拉油、充分搅拌并添加胡椒。

配合例13(蛋黄酱)

配合例13(蛋黄酱)的制造方法

向鸡蛋黄(室温)中加入醋、氯化钠、D-丝氨酸和/或D-环丝氨酸、胡椒，用打蛋器充分搅拌。然后，一边一点点加入色拉油一边继续搅拌，直至制成乳化液。最后添加砂糖并进行搅拌。

配合例14(法式面包)

配合例14(法式面包)的制造方法

向温水中加入1g砂糖及干酵母进行前发酵。将高筋面粉、低筋面粉、氯化钠和5g砂糖以及D-丝氨酸和/或D-环丝氨酸放入钵中，向其中加入前发酵过的酵母。充分揉和后，制成球状，在30℃下进行主发酵中的第一次发酵。再次揉和面团，稍后，整形至适当的形状，使用电子发酵机进行后发酵。于面团表面划切痕后，在220℃的烤箱中烘焙30分钟。

配合例15(酱油)

配合例15(酱油)的制造方法

向市售的酱油中添加D-丝氨酸和/或D-环丝氨酸并充分搅拌。另外，也可以代替添加D-丝氨酸和/或D-环丝氨酸、或它们的盐而使用产生大量D-丝氨酸和/或D-环丝氨酸的米曲来酿造酱油。为了得到所述米曲，可通过利用日本特开2008-185558中记载的方法对D-丝氨酸和/或D-环丝氨酸进行定量从而挑选。

配合例16(酸奶)

配合例16(酸奶)的制造方法

在40℃～45℃下进行发酵。可以使用他市售的种菌，也可以向市售的酸奶中加入D-丝氨酸和/或D-环丝氨酸。另外，也可以代替添加D-丝氨酸和/或D-环丝氨酸或它们的盐而使用产生大量D-丝氨酸和/或D-环丝氨酸的菌。为了得到所述菌，可通过利用日本特开2008-185558中记载的方法对D-丝氨酸和/或D-环丝氨酸进行定量从而挑选。

配合例17(撒在饭上的粉状食品)

配合例18(调料·纳豆的佐料汁)

配合例19(纳豆)

配合例19(纳豆)的制造方法

也可以代替添加D-丝氨酸和/或D-环丝氨酸、或它们的盐而使用产生大量D-丝氨酸和/或D-环丝氨酸的菌来制作纳豆。为了得到前述菌，可通过利用日本特开2008-185558中记载的方法对D-丝氨酸和/或D-环丝氨酸进行定量从而挑选。

配合例20(醪黑醋)

配合例20(醪黑醋)的制造方法

也可以代替添加D-丝氨酸和/或D-环丝氨酸、或它们的盐而使用产生大量D-丝氨酸和/或D-环丝氨酸的菌来制作醋、黑醋、醪。为了得到前述菌，可以通过利用日本特开2008-185558中记载的方法对D-丝氨酸和/或D-环丝氨酸进行定量从而挑选。

配合例21(乳霜)

配合例22(身体用乳霜)

配合例23(身体用乳霜)

配合例24(凝胶剂)

配合例25(剥离型面膜)

配合例26(剥离型面膜)

配合例27(浸渗型面膜)

配合例28(乳液)

配合例29(乳液)

配合例30(化妆水)

配合例31(化妆水)

配合例32(化妆水)

配合例33(气雾尿素外用剂原液)

配合例34(气雾尿素喷剂)

配合例34(气雾尿素喷剂)的填充方法

将气雾尿素外用剂原液及二甲醚填充至内表面被teflon(注册商标)涂布处理过的耐压气溶胶铝罐中，制备气雾剂。

Claims

1.选自由D-蛋氨酸和其盐组成的组中的1种或2种以上的化合物在紫外线损伤减轻组合物的制备中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述组合物被用作皮肤外用剂。

3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述组合物为抗皱剂。

4.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述组合物为防晒剂。

5.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述组合物被用作皮肤病用药物。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述皮肤病选自由红斑、日光性皮炎、慢性光化性皮炎、光化性角化病、光化性唇炎、结节性类弹性纤维病、光敏症、光接触性皮炎、伯洛克皮炎、光敏性药疹、多形性日光疹、牛痘样水疱病、日光性荨麻疹、慢性光敏性皮炎、着色性干皮病、雀斑、卟啉症、糙皮病、哈特纳普病、日光性角化病、皮肌炎、扁平苔藓、毛囊角化病、毛发红糠疹、酒渣鼻、异位性皮炎、黄褐斑、单纯疱疹、红斑狼疮、扁平上皮癌、基底细胞癌及鲍温病所组成的组。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述皮肤病用药物为皮肤病用治疗剂。

8.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述皮肤病用药物为皮肤病用预防剂。

9.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述组合物被用作白内障用药物。

10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述白内障用药物为白内障用治疗剂或白内障用预防剂。

11.根据权利要求9或10所述的用途，其特征在于，所述组合物被用作滴眼药。