KR20160028736A - 표피 세린 라세마아제 및/또는 d-세린 양을 지표로 하는, 피부 배리어 기능 항진 약제의 스크리닝 방법 및 피부 배리어 기능 평가 방법 - Google Patents

표피 세린 라세마아제 및/또는 d-세린 양을 지표로 하는, 피부 배리어 기능 항진 약제의 스크리닝 방법 및 피부 배리어 기능 평가 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명의 과제는, 시험관내 실험에서 피부 배리어 기능을 높이는 효과를 갖는 약제의 스크리닝법을 개발하여, 피부에서의 피부 배리어 기능을 평가하는 것에 있다. 세린 라세마아제의 활성 및/또는 발현량을 지표로 함으로써, 후보 약제의 스크리닝이 가능해졌다.

Description

표피 세린 라세마아제 및/또는 D-세린 양을 지표로 하는, 피부 배리어 기능 항진 약제의 스크리닝 방법 및 피부 배리어 기능 평가 방법{METHOD FOR SCREENING SKIN BARRIER FUNCTION-ENHANCING MEDICAMENT AND METHOD FOR EVALUATING SKIN BARRIER FUNCTION, UTILIZING EPIDERMAL SERINE RACEMASE AND/OR AMOUNT OF D-SERINE AS INDICATION}
본 발명은, 피부 배리어 기능 항진 약제의 스크리닝 방법 및 피부에 있어서의 피부 배리어 기능의 평가 방법에 관한 것이다.
피부의 배리어 기능이 상실되면, 피부의 수분이 상실되고, 또한 외부로부터 이물질이 침입하여, 민감한 피부나 건조한 피부, 거친 피부를 비롯하여, 피부염 및 알레르기 등의 원인이 된다. 따라서, 기능성 식품, 화장품 또는 의약품의 개발의 관점에서 피부의 배리어 기능을 높이는 약제의 개발이 요구되고 있다. 피부 배리어 기능을 높이는 요소로는 세포간 지질의 양을 증가시키거나, 배열을 정비하는 등의 방법이 알려져 있고, 예컨대 특허문헌 1에 나타낸 바와 같이 세포간 지질의 생성을 촉진시키는 약제 등이 개발되어 있다.
피부 배리어 기능의 지표로서, 경표피 수분 증발량(TEWL)이나 색소 등의 지표 물질을 이용한 피부에 대한 침투도 등을 들 수 있다. 피부의 TEWL은, Vapometer 등의 장치를 이용하여 측정할 수 있지만, 수분량의 측정은 대기 중의 수분량이나 공기의 흐름, 본인의 체온, 심리 상태, 땀 등의 측정 환경에 크게 영향을 받아 불안정해지기 쉬운 지표이므로, 보다 안정적으로 피부의 배리어 기능을 평가할 수 있는 방법이 요구되고 있다. 지표 물질의 침투도를 피부 배리어 기능의 지표로 하는 경우, 색소 등의 지표 물질을 피부에 적용해야 하여, 피부에 대한 부담이 컸다.
피부의 배리어 기능을 높이는 효과를 갖는 약제를 수많은 후보 약제로부터 스크리닝하기 위해서는, 피부 배리어 기능의 지표로서 TEWL을 이용하여 생체내에서 실험을 행할 수 있지만, 측정 환경에 크게 영향을 받아 불안정하며, 생리적 또는 구조적으로 피부 배리어 기능을 높이는 효과를 갖는 약제를 수많은 후보 약제로부터 스크리닝하는 것은 어려웠다. 한편, 이러한 스크리닝 방법으로서, 단리한 피부를 이용하여, 배리어 기능의 회복 및 항진에 관여하는 피부 내재성의 인자를 측정하여, 배리어 기능의 회복 및 항진을 평가하는 방법도 생각할 수 있지만, 소량의 시료로 간편하게 평가할 수 있는 적절한 인자가 없어, 그와 같은 인자의 특정이 요구되었다.
한편, 아미노산에는, 광학 이성체로서 L체와 D체가 있는 것이 알려져 있고, 생체를 구성하는 아미노산은 주로 L체이며, D체의 아미노산은 세균의 펩티드 글리칸 등 매우 한정된 생체 성분이라고 생각되었다. 그러나, 최근의 연구의 성과에 의해, 미생물뿐만 아니라, 식물이나 포유동물에도 다양한 D-아미노산이 유리형으로서 또는 단백질을 구성하는 아미노산 잔기로서 존재하며, 다양한 생리 기능을 발휘하고 있는 것이 분명해졌다. 포유동물에서의 유리형의 D-아미노산으로는, D-세린과 D-아스파라긴산이 최초로 발견되었다. D-세린은, 대뇌, 해마에 국재하며, NMDA 수용체의 코아고니스트로서 작용하여, 흥분성의 신경 전달의 제어에 역할을 하는 것이 발견되었다(비특허문헌 1). 또한, D-아스파라긴산은, 정소나 송과체에 국재가 확인되며, 호르몬 분비의 제어에 관여하는 것이 발견되었다. 한편 최근의 D-아미노산 연구의 성과에 의해, D-세린, D-아스파라긴산, D-알라닌, D-글루타민산 및 D-프롤린이, 진피와 표피에 존재하는 것이 명확해졌고, 또한 나이가 들면서 감소하는 것이 나타났다(비특허문헌 2). 그 중에서, D-세린은 표피ㆍ각층에서 가장 함량이 높은 D-아미노산이면서도, D-세린이 피부에서 담당하는 역할에 관해서는, 진피에서의 섬유아 세포에서 자외선 장애를 경감하는 작용은 발견되었지만(특허문헌 2), 함량이 높은 표피에서는 아직 밝혀지지 않았다.
D-아미노산의 생성에 관한 효소로서 아미노산 라세마아제가 알려져 있고, 피리독살인산(PLP)에 의존하는 효소와, 보인자를 요구하지 않는 라세마아제로 분류되어 있다. 포유동물을 포함하는 진핵 세포에 D-아미노산이 존재한다는 보고를 계기로, PLP 의존성의 세린 라세마아제가 포유동물에 존재하는 것이 보고되어 있지만(비특허문헌 3), 아스파라긴산 라세마아제에 관해서는, 포유동물에서는 아직 라세마아제 활성을 수반하여 존재하는지의 여부는 확인되지 않았다. D-세린이 대뇌, 해마에 국재하기 때문에, 세린 라세마아제는 뇌에서 발현하는 것이 인간을 포함한 포유류에서 확인되고 있지만, 그 밖의 조직에서의 발현에 관해서는 거의 보고되지 않았다(비특허문헌 3).
특허문헌 1 : 일본 특허 공개 제2012-92032호 공보 특허문헌 2 : WO2011/030903호 공보
비특허문헌 1 : S.H. Snyder, et al., NeuroChem Res 25, 553 (2000) 비특허문헌 2 : Y. Tojo, Food Style 21, 2013, August, (Vo.17, No.8) 비특허문헌 3 : Molecular Brain Research, Vo 1. 125, pp.96-104, 2004 비특허문헌 4 : 기능성 화장품 소재 개발을 위한 실험 프로토콜집, 씨엠씨 출판, 2010년, 제214∼216페이지
피부의 배리어 기능을 높이기 위해, 세포간 지질의 양을 증가시키거나, 배열을 정비하는 것이 주목받고 있다. 한편, 피부의 배리어 기능을 항진ㆍ수복하는 데에 있어서, 건강한 각층의 층수 그 자체를 증가시키는 것이, 생리적 또는 구조적으로 피부 배리어 기능을 높이는 관점에서 보다 유효한 접근이라고 생각된다. 그러나, 지금까지 그와 같은 작용을 갖는 약제는 알려져 있지 않고, 또한 이것을 스크리닝에 의해 발견하는 것은 전술한 바와 같이 어려웠다. 따라서, 생리적 또는 구조적으로 피부 배리어 기능을 높이는 효과를 갖는 약제의 스크리닝 방법의 개발이 요구되었다.
본 발명자들은, 피부에서의 기능이 아직 알려져 있지 않은 D-세린에 관해 예의 연구를 행한 바, D-세린이 피부 배리어 기능에 기여하는 것을 발견했다. 이 지견에 기초하여, 케라티노사이트에 있어서 D-세린 양, 나아가 L-세린으로부터 D-세린을 생성하는 세린 라세마아제의 발현량 혹은 활성을 지표로 함으로써, 피부의 배리어 기능을 높이는 효과를 갖는 약제의 스크리닝 방법을 제공하는 것, 또한 피험자에게 부담이 적고, 간편하며 안정적인 피부 배리어 기능 항진의 평가가 가능해져 본 발명에 이르렀다. 이러한 스크리닝 방법을 이용함으로써, 피부 배리어 기능을 항진 시키는 약제를 스크리닝할 수 있었다.
구체적으로, 본 발명자들은 이하의 발명을 완성시켰다 :
[1] 케라티노사이트에 있어서, 세린 라세마아제의 활성 혹은 발현량, 및/또는 D-세린 양을 지표로 하는, 피부 배리어 기능 항진 약제의 스크리닝 방법.
[2] 이하의 :
케라티노사이트에 후보 약제를 첨가하는 공정,
케라티노사이트에 있어서 세린 라세마아제의 활성 혹은 발현량, 및/또는 D-세린 양을 측정하는 공정,
세린 라세마아제 발현량 혹은 활성, 및/또는 D-세린 양으로부터, 후보 약제의 피부 배리어 기능 항진 작용을 결정하는 공정
을 포함하는 항목 1에 기재된 스크리닝 방법.
[3] 케라티노사이트를 분화 유도하는 공정을 더 포함하는 항목 2에 기재된 스크리닝 방법.
[4] 상기 스크리닝 방법이, 분화 유도된 케라티노사이트에 있어서 행해지는 항목 1에 기재된 스크리닝 방법.
[5] 세린 라세마아제 발현량의 측정이, 세린 라세마아제의 mRNA 또는 단백질의 양을 측정함으로써 행해지는 항목 1∼4 중 어느 한 항에 기재된 스크리닝 방법.
[6] 세린 라세마아제 활성의 측정이, 기질의 변환 효율의 측정 혹은 D-아미노산 생성물의 양을 측정하는 것에 의한 항목 1∼4 중 어느 한 항에 기재된 스크리닝 방법.
[7] 항목 1∼6에 기재된 스크리닝 방법에 의해 얻어진 가수분해 귀리 단백, 름뿌양(lempuyang) 추출물 및 시로바나이가코조리나(Elephantopus mollis) 추출물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 또는 복수의 물질을 유효 성분으로 하는 세린 라세마아제 활성화제.
[8] 인간 피부로부터 단리한 피부 샘플로부터 세린 라세마아제 활성 혹은 발현량 및/또는 D-세린 양을 지표로 하는, 피부 배리어 기능을 평가하는 방법.
[9] 이하의 :
대상으로부터 단리된 피부 샘플에 있어서, 세린 라세마아제 활성 혹은 발현량 및/또는 D-세린 양을 측정하는 공정,
세린 라세마아제 활성 혹은 발현량 및/또는 D-세린 양으로부터, 대상의 피부 배리어 기능을 결정하는 공정
을 포함하는 항목 8에 기재된 피부 배리어 기능을 평가하는 방법.
[10] 세린 라세마아제 발현량의 측정이, 세린 라세마아제의 mRNA 또는 단백질의 양을 측정함으로써 행해지는 항목 8 또는 9에 기재된 피부 배리어 기능을 평가하는 방법.
[11] 세린 라세마아제 활성의 측정이, 세린 라세마아제에 의한 기질의 변환 효율의 측정 혹은 D-아미노산 생성물의 양을 측정하는 것에 의한 항목 8 또는 9에 기재된 방법.
본 발명의 스크리닝 방법을 이용함으로써, 피부 배리어 기능을 개선 또는 항진할 수 있는 약제의 선택이 가능해진다. 또한, 본 발명의 피부 배리어 기능의 평가 방법에 의해, 피부 배리어 기능을 세포 레벨 또는 조직 레벨로, 또는 생화학적으로 판정할 수 있다.
도 1의 (A)는, 고TEWL군과 저TEWL군의 피부에서의 유리(遊離) L-세린의 양의 비교를 나타낸다. 도 1의 (B)는, 고 TEWL군과 저 TEWL군의 피부에서의 유리 D-세린의 양의 비교를 나타낸다.
도 2는, 배양 케라티노사이트에 있어서, 분화 유도 자극을 부여하기 전후에서의 세포내 D-세린을 검출한 크로마토그램이다.
도 3의 (A)는, 후보 약제의 하나인 가수분해 귀리 단백액이 유리 D-세린 양을 증가시킨 것을 나타내는 도면이다. 도 3의 (B)는, 후보 약제의 하나인 가수분해 귀리 단백액이 세린 라세마아제의 발현을 증가시킨 것을 나타내는 도면이다.
본 발명은, 케라티노사이트에 있어서, 세린 라세마아제의 발현량, 활성 및 D-세린 양인 지표의 1종 또는 2종 이상을 조합한, 피부 배리어 기능 항진 약제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
본 발명의 스크리닝 방법에서는, 피부 배리어 기능 항진 작용을 갖는 약제의 취득이 가능해진다. 여기서 피부 배리어 기능이란, 피부의 수분을 유지하거나, 외부로부터 이물질이 침입하는 것을 막는 기능이며, 표피 중에서도 특히 각질층이 이러한 기능을 담당하고 있다. 피부 배리어 기능은 경표피 수분 증발량(TEWL)에 의해 측정 가능하며, 이 수분 증발량이 높을수록 피부 배리어 기능은 낮다고 생각되고 있다. 피부 배리어 기능의 항진은, 예컨대 각질층의 층수의 증가나, 각질층에서의 각화 외막(코니파이드 인벨로프)의 성숙화나, 세포간 지질, 예컨대 콜레스테롤이나 세라마이드의 증가 등에 의해 달성될 수 있지만, 이들에 한정되는 것을 의도하는 것은 아니다. 따라서, 이론에 속박되는 것을 의도하는 것은 아니지만, 본 발명의 스크리닝 방법에 의해 선택된 약제는, 피부에 대하여 적용함으로써, 세린 라세마아제의 발현 또는 활성을 항진하는 것, 또는 D-세린 양을 증가시킬 수 있고, 그 결과 각질층에서의 층수 증가 등의 효과를 발휘하여 피부 배리어 기능을 항진할 수 있다고 생각된다.
본 발명의 스크리닝 방법에 사용되는 후보 약제는, 임의의 화합물, 예컨대 리콤비나토리얼 라이브러리로부터 얻어지는 화합물이어도 좋고, 혼합물이나 추출물이어도 좋다. 후보 약제로는, 예컨대 식품 소재, 화장품 소재 또는 의약품 소재의 화합물, 혼합물 또는 추출물 라이브러리를 이용할 수도 있다. 본 발명에 의해 피부 배리어 기능 항진 작용을 갖는다고 하는 약제는, 기능성 식품이나 영양 식품 등의 식품, 화장품, 의약품 또는 의약부외품에 적용할 수 있다. 화장품으로는, 예컨대 화장수, 크림, 유액, 젤, 미용액, 연고, 팩, 입욕제, 바디 솝, 샴푸, 린스, 파운데이션 등에 적용할 수 있지만, 이들에 한정되는 것을 의도하는 것은 아니다. 보다 바람직하게는, 민감성 피부용의 화장료, 예컨대 화장수, 크림, 유액, 미용액 등에 적용된다. 의약품 또는 의약부외품이라면, 경피 투여용의 각종 연고, 크림 등의 형태나, 경구 투여용의 형태에 적용할 수 있다.
본 발명의 스크리닝 방법에서는, 케라티노사이트에 있어서, 세린 라세마아제의 발현량 혹은 활성, 및/또는 D-세린 양이 지표로서 이용된다. 지표로 한다는 것은, 세린 라세마아제의 발현량 혹은 활성, 및/또는 D-세린 양을 고려하고 있는 것을 말한다. 따라서, 후보 약제를 첨가한 경우에, 세린 라세마아제의 발현량 혹은 활성, 및/또는 D-세린 양을 판단의 기준으로 하여 피부 배리어 기능 항진 작용을 갖는 약제를 선택하면, 본 발명의 스크리닝 방법에 해당한다.
케라티노사이트란, 표피의 약 95%를 구성하는 세포이다. 생체에 있어서 표피의 기저층에 케라티노사이트의 줄기 세포가 존재하며, 성숙함에 따라 외측의 층으로 이동하여 유극층, 과립층, 각층을 형성한다. 케라티노사이트는, 성숙함에 따라 그 성질을 변화시키고 있어, 유극층이나 과립층에서는 세포가 편평화하고, 세라마이드 등의 지질이 세포 간극에 방출되어, 최외층의 각질층에서 탈핵이 생긴다. 이 일련의 성숙 과정을 케라티노사이트의 분화라고 할 수 있다. 탈핵이 생긴 세포는, 세포 형태가 소실되고 중층화하여 각층을 형성하고, 최종적으로 최외층으로부터 때(垢)로서 박리된다.
본 발명에서 이용되는 배양 케라티노사이트는, 표피의 기저층, 유극층, 과립층, 각층 중의 어느 것으로부터 취득된 세포이어도 좋고, 줄기세포, 예컨대 피부 상피 줄기세포, 다능성 줄기세포, 예컨대 ES 세포, iPS 세포, EG 세포 등으로부터 분화 유도된 세포이어도 좋다. 표피로부터 취득되어 배양된 세포는, 초대 배양된 세포이어도 좋고 계대 배양된 세포이어도 좋으며, 나아가 암화 또는 불사화한 세포이어도 좋다. 또한, 본 발명에서 이용되는 배양 케라티노사이트는, 예컨대 인간이나 동물 유래 등의 주화(株化) 케라티노사이트이어도 좋다. 이들 케라티노사이트의 세포주는, 공적 기관이나 판매업자로부터 취득할 수 있다.
배양물이란, 원하는 세포만을 가리켜도 좋고, 다른 세포를 포함해도 좋으며, 나아가 세포와 배지로 구성되어도 좋다. 따라서, 케라티노사이트 배양물이란, 케라티노사이트만을 가리켜도 좋고, 케라티노사이트와 다른 세포를 포함해도 좋고, 케라티노사이트 단독 또는 케라티노사이트와 다른 세포와 배지로 구성되어도 좋다. 이러한 배양물로서, 단층 배양물, 혼합 배양물, 삼차원 배양물 등을 들 수 있다. 케라티노사이트를 배양하는 배지는, 케라티노사이트의 배양을 가능하게 하는 배지라면 임의의 배지이어도 좋으며, 예컨대 HuMedia-KB2(쿠라보)나, Keratinocyte-SFM(인비트로젠)의 배지에 각종 첨가제를 첨가하여 이용되어도 좋지만, 이들에 한정되는 것을 의도하는 것은 아니다. 배양 조건은, 통상 37℃, 5% CO2 존재하에서 배양되지만, 케라티노사이트의 증식이 생기는 범위에서 변경을 하는 것도 가능하다. D-세린 존재량을 세린 라세마아제 활성으로 하는 관점에서, 배지는 L-세린 부화(富化) 상태인 것이 바람직하다. 배양 배지 중에는, 통상 의도적으로 D-아미노산이 첨가되어 있지 않고, 배지 중의 D-세린에 대한 L-세린의 존재량은, 적어도 1.1배, 보다 바람직하게는 10배, 더욱 바람직하게는 50배 이상이다. 예컨대, HuMedia-KB2(쿠라보)에 HuMedia-KG 증식 첨가제 셋트를 첨가한 배지(KGM 배지)에 있어서, D-세린에 대한 L-세린의 존재량은 100배 이상이다.
케라티노사이트 배양물은, 파종후 배양이 행해지고 있고, 대략 50% 집밀(集密)∼컨플루언트가 된 것을 실험에 사용할 수 있다. 집밀도는 분화 유도를 행하는 관점에서, 70% 이상이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 80% 이상이다. 케라티노사이트 배양물에 대하여 후보 약제를 첨가하는 공정은, 케라티노사이트 배양물의 배지를, 후보 약제를 포함하는 배지로 치환함으로써 행해져도 좋고, 케라티노사이트와 배지를 포함하는 배양물에 대하여, 후보 약제가 그대로 또는 희석액으로서 첨가되어도 좋다.
세린 라세마아제는, 비타민 B6 보(補)효소형인 피리독살 5' 인산(PLP) 의존성의 라세마아제다. 이론에 한정되는 것을 의도하는 것은 아니지만, 세린 라세마아제는, 세린의 α-수소를 빼내는 것에 의해, 음이온성 중간체의 생성을 통해 L-세린과 D-세린 사이의 변환을 행할 수 있는 효소이다. L-세린과 D-세린 사이의 변환 반응에 있어서, 반응 전후에 엔탈피는 변화하지 않고, 반응은 엔트로피에 의해 구동되기 때문에, 평형 상태에서는 L-세린과 D-세린은 등량이 된다. 생체 내에서는 D-세린보다 L-세린의 존재량이 많기 때문에, 세린 라세마아제가 존재함으로써 생체 내의 L-세린이 D-세린으로 변환된다. 배양 조건에서도, 통상 배지 중에는 L체가 많이 포함되어 있기 때문에, 마찬가지로 세린 라세마아제의 존재에 의해 L-세린이 D-세린으로 변환된다. 본 발명에서 라세마아제는, 비특허문헌 3에 의해 뇌에서 발현이 보인 라세마아제와 동일하거나, 또는 그 호모로그 또는 오르토로그이어도 좋다. 따라서, 비특허문헌 3에 의해 이용된 프라이머쌍에 의해 증폭 가능하고, 또한 비특허문헌 3에 기재된 항(抗)라세마아제 항체에 의해 검출 가능한 것을 말한다. 세린 라세마아제에 관해서는, 당업자라면 NCBI 등의 공적 기관의 웹사이트로부터, 동물종에 따라서 적절하게 특정할 수 있다.
본 발명의 하나의 양태에서는, 케라티노사이트에서의 세린 라세마아제의 활성을 지표로 하여 피부 배리어 기능을 평가, 또는 피부 배리어 기능 항진 약제의 스크리닝을 할 수 있다. 세린 라세마아제의 활성은, 효소의 기질이 되는 물질을 첨가하지 않는 경우는 통상의 배지에 포함되는 L-세린이 변환되는 것에 의해 생기는 D-세린 양에 기초해도 좋고, D-세린을 포함하는 그 밖의 D-아미노산의 합계량에 기초해도 좋다. 또한, 세린 라세마아제의 기질이 될 수 있는 세린 이외의 물질을 첨가함으로써, 그 첨가물의 변환에 기초하는 생성물의 양의 측정 혹은 변환 효율의 측정을 해도 좋다. 세린 라세마아제는 D체와 L체가 50:50이 될 때까지 과잉의 광학 이성체를 다른 하나의 광학 이성체로 변환함으로써, 활성 측정에서 D체를 첨가하는 것도 당연히 가능하다. 그 경우는 변환에 의해 생기는 L-세린의 증가분을 측정하는 것으로도 효소 활성을 평가할 수 있다. 그 밖에도 예컨대 시클로세린이나 세린의 유도체(N-메틸화체, 아세틸화체, 인산화체 등)를 첨가하면, 대응하는 광학 이성체로의 변환 효율을 조사함으로써 효소 활성을 평가할 수 있다. D-세린 양에 기초하여 세린 라세마아제의 활성을 측정하는 경우, 대상으로부터 단리된 피부 샘플 중, 또는 케라티노사이트 배양물 중, 즉 배지 중, 세포 중 혹은 그 양쪽에서의 D-세린의 존재량에 의해 결정되어도 좋고, 피부 샘플 중 또는 케라티노사이트 배양물 중에서의 D-세린의 존재량의 변화에 기초하여 결정된 효소학적 파라미터에 의해 결정되어도 좋다. 이 방법은 효소의 기질이 되는 전술한 물질에도 모두 적용 가능하다. 세린 라세마아제 효소의 활성을 나타내는 효소학적 파라미터로서, Vmax, Km값을 결정함으로써 표시되어도 좋다.
본 발명의 또 다른 양태에서는, 케라티노사이트에서의 D-세린 양을 지표로 하여, 피부 배리어 기능을 평가, 또는 피부 배리어 기능 항진 약제의 스크리닝을 할 수 있다. D-세린 양은, 대상으로부터 단리된 피부 샘플 중, 또는 케라티노사이트 배양물 중, 즉 배지 중, 세포 중 혹은 그 양쪽에서 측정되어도 좋다. D-세린 양의 측정 방법은 이미 알려진 방법을 이용하여 행할 수 있고, 예컨대 광학 이성체 분리 컬럼을 이용한 HPLC법이나, 가스 크로마토그래피법, 전기 영동법, 효소법에 의해 행할 수 있다. 세린 라세마아제 활성의 측정이 D-세린 양의 측정에 의해 행해지는 경우, D-세린 양을 증가시키기 위해, 케라티노사이트 배양물에 대하여 L-세린을 첨가해도 좋다. 세린 라세마아제가 L-세린과 D-세린 사이의 변환 반응을 행하는 경우, 반응 전후에 엔탈피는 변화하지 않고, 반응은 엔트로피에 의해 구동되기 때문에, L-세린을 첨가함으로써, 세린 라세마아제의 활성에 따라서 D-세린 양을 증가시킬 수 있어, D-세린 양의 측정이 보다 용이해진다.
다른 양태에서는, 세린 라세마아제의 발현량을 지표로 하여, 피부 배리어 기능을 평가, 또는 피부 배리어 기능 항진 약제의 스크리닝을 할 수 있다. 세린 라세마아제의 발현량은, 세린 라세마아제의 단백질을, 항세린 라세마아제 항체를 이용한 면역학적 방법에 의해 측정함으로써 결정할 수 있다. 면역학적 방법으로서, 예컨대 웨스턴 블랏법, 형광 면역 염색법 또는 ELISA법에 의해 행해져도 좋다. 항세린 라세마아제의 항체는, 시판하는 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체를 이용해도 좋고, 토끼나 마우스 등의 실험 동물에 세린 라세마아제 단백질 또는 항원 펩티드를 면역화하여 회수된 항체를 이용해도 좋다.
세린 라세마아제의 발현량은, 세포 중의 세린 라세마아제의 mRNA량을 결정함으로써 행해져도 좋다. mRNA의 측정은 임의의 방법에 의해 행해져도 좋으며, 예컨대 정량적 PCR의 방법에 기초하여 측정되어도 좋다. 정량적 PCR법은 통상 이하와 같이 행해지지만, 이것에 한정되는 것을 의도하는 것은 아니다. 회수된 세포로부터 mRNA를 추출하고, 폴리 T 프라이머와 역전사 효소를 이용하여 cDNA를 작성한다. 작성한 cDNA에 대하여, Syber 그린법이나 형광 프로브법을 이용함으로써, 세포중에 포함되는 mRNA량을 정량할 수 있다.
보다 구체적으로는, 본 발명의 스크리닝 방법은, 이하의 :
케라티노사이트에 후보 약제를 첨가하는 공정,
케라티노사이트에 있어서 세린 라세마아제 발현량 혹은 활성, 및/또는 D-세린 양을 측정하는 공정, 및
세린 라세마아제 발현량 혹은 활성, 및/또는 D-세린 양으로부터, 후보 약제의 피부 배리어 기능 항진 작용을 결정하는 공정
을 포함해도 좋다. 본 발명의 스크리닝 방법은, 또한 케라티노사이트를 분화 유도시키는 공정을 더 포함해도 좋다.
분화 유도 공정은, 케라티노사이트에 대하여 분화 유도 자극을 부여하는 것에 의해 행해진다. 케라티노사이트에 대하여 분화 유도 자극을 부여하는 것에 의해, 세포의 편평화, 세포 내에서의 섬유물 또는 과립의 증가, 세포 간극의 불명료화, 중층화(특히 단층 배양의 경우), 최종적으로는 탈핵과 같은 형태적인 변화나, 케라틴 1, 케라틴 10, 인볼루크린, 트랜스글루타민아제의 활성화 등의 단백질 및 단백질의 변화가 생기는 등의 세포의 변화가 생긴다(일피회지 90(12), 1089-1101, http://drmtl.org/data/090121089.pdf, Drug News Perspect 2004, 17(2) p117을 참조한 것). 이 분화 유도 자극으로는, 앞서 설명한 케라티노사이트의 분화를 생기게 할 수 있다면 임의의 자극이어도 좋고, 예컨대 칼슘 이온의 농도를 증가시키는 칼슘 이온 자극, 포르볼-12-미리스테이트-13-아세테이트에 의한 자극(Hawley-Nelson P, Stanley JR et al, Exp Cell Res, 137 : 155-167, 1982), 전압이나 기상 폭로 등의 물리적 자극, 생체액에 의한 자극이어도 좋다. 칼슘 이온에 의해 자극하는 경우, 칼슘 이온을 종농도로서 0.1 mM∼10 mM의 농도가 되도록, 칼슘염 또는 그 희석액이 첨가되어도 좋고, 미리 종농도의 칼슘 이온을 포함하도록 조제된 배지와 치환되어도 좋다. 사용되는 칼슘염으로서, 예컨대 염화칼슘, 탄산수소칼슘, 탄산칼슘, 질산칼슘, 아세트산칼슘 등이 이용된다. 칼슘 이온의 종농도의 상한은, 세포 배양에 악영향을 주지 않는 관점에서, 5 mM 이하가 바람직하고, 더욱 바람직하게는 2 mM 이하이다. 분화 유도를 촉진하는 관점에서, 농도의 하한치는 0.5 mM 이상이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 1.0 mM 이상이다.
분화 유도 공정과 후보 약제의 첨가 공정은, 동시에 행해져도 좋고, 분화 유도 공정의 후에 후보 약제의 첨가 공정이 행해져도 좋고, 그 반대, 즉 후보 약제의 첨가 공정의 후에 분화 유도 공정이 행해져도 좋다. 이론에 사로잡히는 것을 의도하는 것은 아니지만, 후보 약제가 요망되는 작용 메커니즘에 의해 분화 유도와 후보 약제 첨가의 타이밍을 바꿀 수 있다. 예컨대, 분화 유도 자극 물질과 길항하는 약제를 검토하는 관점에서는, 첨가 공정은 자극 공정과 동시 혹은 자극전에 행해지는 것이 바람직하다. 또한 분화 유도후의 세포 변화(형태 변화, 각종 세포 내 인자의 발현 등)를 촉진ㆍ억제하는 관점에서는, 첨가 공정은 자극 공정과 동시 혹은 후에 행해지는 것이 바람직하고, 분화 유도 자극이 작용하는 수용체 등을 미리 블록하는 등의 메커니즘을 탐색하는 관점에서는, 첨가 공정의 후에 자극 공정이 행해지는 것이 바람직하다. 후보 약제의 첨가 공정과 분화 유도의 자극 공정이 동시에 행해지지 않는 경우, 첨가 공정과 자극 공정 사이에 수분∼수시간의 세포 배양 공정이 포함되어도 좋다.
분화 유도의 자극과 후보 약제의 첨가후, 세린 라세마아제의 발현량 혹은 활성, 및/또는 D-세린 양의 측정 공정 전에, 세포 배양 공정이 더 포함되어도 좋다. 이 세포 배양 공정의 기간은, 사용되는 분화 유도제의 종류나 농도나, 케라티노사이트의 종류에 따라서 임의로 선택할 수 있지만, 예컨대 6시간∼1주일 배양을 행할 수 있다. 충분히 세린 라세마아제를 발현시키는 관점에서, 배양 기간의 하한은, 12시간 이상이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 1일 이상이다. 한편, 배양 기간의 상한은 단층 배양이나 중층화 배양, 삼차원 배양 등의 배양 방법에 따라 상이하기 때문에 특별히 규정하는 것은 아니지만, 세포의 건강한 배양 조건을 유지하는 관점에서, 단층 배양의 경우는 1주일 이내가 바람직하고, 보다 바람직하게는 3일 이내이다.
본 발명의 스크리닝 방법에는, 손상 부여 공정을 더 포함해도 좋다. 손상 부여 공정은, 배양되어 있는 케라티노사이트에 물리적 또는 화학적인 자극에 의해 손상을 주는 것이어도 좋고, 예컨대 자외선 조사, 산화제 등의 라디칼원의 첨가, 계면 활성제의 첨가, 빈(貧)영양 배지로의 치환 등을 들 수 있다. 손상 부여 공정에 의해 손상이 부여된 케라티노사이트에서는, 세린 라세마아제의 발현이 저하되어 있다고 생각된다. 따라서, 후보 약제의 첨가 공정후에, 손상 부여 공정을 행하는 스크리닝 방법에 있어서, 라세마아제 발현량 또는 라세마아제 활성, 및/또는 D-세린 양의 저하가 억제되는 경우, 이러한 후보 약제는, 피부 배리어 기능에 대한 손상의 예방제로 할 수 있다. 한편, 손상 부여 공정후에 후보 약제의 첨가 공정을 행하는 스크리닝 방법에 있어서, 저하된 라세마아제 발현량 또는 라세마아제 활성, 및/또는 D-세린 양이 증가하는 경우, 이러한 후보 약제는, 피부 배리어 기능의 회복, 개선 또는 치료제로 할 수 있다. 손상 부여를 행하지 않는 스크리닝 방법에 있어서, 라세마아제 발현량 또는 라세마아제 활성, 및/또는 D-세린 양이 증가시키는 후보 약제는, 피부 배리어 기능의 항진제라고 할 수 있다.
본 발명의 스크리닝 방법을 화장품 소재 라이브러리에 대하여 행한 결과, 피부의 배리어 기능을 높이는 약제로서, 가수분해 귀리 단백, 름뿌양 추출물, 시로바나이가코조리나 추출물을 선택할 수 있었다. 그러나, 이러한 약제는, 름뿌양이나 시로바나이가코조리나 유래의 추출물에 한정되지 않고, 그 근연종의 추출물도 마찬가지로 피부 배리어 기능 항진 효과를 갖는다. 본 발명의 피부 배리어 기능 항진제로는, 생강(Zingiberaceae)과 생강(Zingiber)속 식물이나 국화(Compositae)과 엘레판토푸스(Elephantopus)속 식물의 추출물을 들 수 있다. 따라서, 이러한 물질을 화장료에 배합함으로써, 피부 배리어 기능 항진 효과를 발휘하는 화장료를 제조할 수 있다.
본 발명에 이용되는 가수분해 귀리 단백이란, 귀리(Avena sativa L.)로부터 취득된 단백질의 가수분해 산물이다. 귀리의 단백질은, 예컨대 종자, 잎, 뿌리, 겨 등으로부터 추출되지만, 종자가 특히 바람직하다. 상기 귀리는, 채취후 즉시 건조시켜 분쇄한 것이 바람직하다. 건조는 햇빛으로 행해도 좋고, 통상 사용되는 건조기를 이용하여 행해도 좋다. 단백질은, 추출 과정에서 또는 추출후에 산이나 효소 처리에 의해 가수분해된다. 귀리는, 서아시아로부터 유럽, 북미에서 식용으로 재배되는 식물이다. 본 발명에 이용되는 추출 용매는, 통상 추출에 이용되는 용매라면 어느 것이어도 좋으며, 특히 메탄올, 에탄올 등의 알콜류, 함수 알콜류, 아세톤, 아세트산에틸에스테르 등의 유기 용매를 단독 혹은 조합하여 이용할 수 있고, 물로 추출을 행할 수도 있다.
본 발명에서의 귀리로부터 취득된 단백질의 가수분해 산물의 배합량은, 당업자라면, 효과를 발휘하는 범위에서 임의로 선택할 수 있다. 예컨대 배합량은, 외용제 전량 중, 건조물로서 0.00005∼20.0 질량%이다. 배합량의 상한은, 제제화와 효과의 관점에서 10 질량% 이하가 바람직하고, 5 질량% 이하가 더욱 바람직하다. 배합량의 하한은, 충분한 피부 배리어 기능 항진 효과를 발휘시키는 관점에서, 0.0001 질량% 이상이 바람직하고, 0.0005 질량% 이상이 더욱 바람직하다.
본 발명에 이용되는 생강(Zingiberaceae)과 생강(Zingiber)속 식물로는, 름뿌양(Lempuyang, 학명 : Zingiber aromaticumMal.)이 바람직하다. 름뿌양은, 특히 인도네시아의 건성 초원, 목초 등에서 나는 식물이다. 본 발명에 이용되는 추출물은, 상기 식물의 잎, 땅속 줄기를 포함하는 줄기, 과실 등, 식물 전초를 추출 용매와 함께 침지하고, 경우에 따라 가열 환류한 후, 여과하고 농축하여 얻어진다. 본 발명에 이용되는 추출 용매는, 통상 추출에 이용되는 용매라면 어느 것이어도 좋으며, 특히 메탄올, 에탄올 등의 알콜류, 함수 알콜류, 아세톤, 아세트산에틸에스테르 등의 유기 용매를 단독 혹은 조합하여 이용할 수 있고, 물로 추출을 행할 수도 있다.
본 발명에서의 생강(Zingiberaceae)과 생강(Zingiber)속 식물의 추출물의 배합량은, 당업자라면, 효과를 발휘하는 범위에서 임의로 선택할 수 있다. 예컨대 배합량은, 외용제 전량 중 건조물로서 0.00005∼20.0 질량%이다. 배합량의 상한은, 제제화와 효과의 관점에서 10 질량% 이하가 바람직하고, 5 질량% 이하가 더욱 바람직하다. 배합량의 하한은, 충분한 피부 배리어 기능 항진 효과를 발휘시키는 관점에서, 0.0001 질량% 이상이 바람직하고, 0.0005 질량% 이상이 더욱 바람직하다.
본 발명에 이용되는 국화(Compositae)과 엘레판토푸스(Elephantopus)속 식물로는, 시로바나이가코조리나(학명 : Elephantopus mollis)가 바람직하다. 시로바나이가코조리나는, 남아메리카의 베네수엘라가 원산지이며, 열대 아시아에 널리 귀화한 식물이다. 본 발명에 이용되는 국화(Compositae)과 엘레판토푸스(Elephantopus)속 식물의 추출물은, 상기 식물의 잎, 줄기, 꽃, 수피, 종자 또는 과실, 식물 전초 등을 추출 용매와 함께 침지 또는 가열 환류한 후, 여과하고 농축하여 얻어진다. 본 발명에 이용되는 추출 용매는, 통상 추출에 이용되는 용매라면 어느 것이어도 좋으며, 특히 메탄올, 에탄올 등의 알콜류, 함수 알콜류, 아세톤, 아세트산에틸에스테르 등의 유기 용매를 단독 혹은 조합하여 이용할 수 있다.
본 발명에서의 국화(Compositae)과 엘레판토푸스(Elephantopus)속 식물의 추출물의 배합량은, 당업자라면, 효과를 발휘하는 범위에서 임의로 선택할 수 있다. 예컨대 배합량은, 외용제 전량 중 건조물로서 0.00005∼20.0 질량%이다. 배합량의 상한은, 제제화와 효과의 관점에서 10 질량% 이하가 바람직하고, 5 질량% 이하가 더욱 바람직하다. 배합량의 하한은, 충분한 피부 배리어 기능 항진 효과를 발휘시키는 관점에서, 0.0001 질량% 이상이 바람직하고, 0.0005 질량% 이상이 더욱 바람직하다.
세린 라세마아제 발현량 혹은 활성, 또는 D-세린 양으로부터, 후보 약제의 피부의 배리어 기능 항진 작용을 결정하는 공정에서는, 측정된 세린 라세마아제 발현량 혹은 활성, 및/또는 D-세린 양을, 미리 설정되어 있던 발현량 혹은 활성, 및/또는 D-세린 양과, 배리어 기능 항진 작용의 관계를 나타내는 표를 이용하여 결정할 수 있다. 이러한 표는, 대조로서, 후보 약제를 포함하지 않고 동일하게 실험을 행함으로써 측정한 라세마아제 발현량 혹은 활성, 및/또는 D-세린 양이나, 세린 라세마아제 발현량 혹은 활성, 및/또는 D-세린 양을 증가시키는 것이 이미 알려진 대조 약제를 이용하여 동일하게 실험을 행함으로써 측정한 라세마아제 발현량 혹은 활성, 및/또는 D-세린 양을 이용하여 작성할 수 있다. 다른 양태에서는, 대조와의 비교로부터 미리 임계치를 설정하여, 이러한 임계치보다 통계학적 유의차로 높은지의 여부로, 후보 약제의 피부 배리어 기능 항진 작용을 결정할 수 있다. 당업자라면, 요구하는 피부 배리어 기능 항진 작용에 따라서, 이러한 임계치를 적절하게 설정할 수 있다. 이러한 임계치로서, 예컨대 약제 비첨가 대조에서의 세린 라세마아제의 발현량 혹은 활성, 및/또는 D-세린 양에 대하여, 임의로 배율의 임계치를 설정할 수 있지만, 예컨대 1.1배 이상으로 통계적으로 유의차 및 경향차를 두고 값을 설정할 수도 있다. 통계적인 유의차란 p<0.05, 경향차란 p<0.1일 때를 가리킨다. 또한, 다른 양태에서는, 대조로서 후보 약제를 포함하지 않고 동일하게 실험을 행함으로써 측정한 라세마아제 발현량 혹은 활성, 및/또는 D-세린 양에 비교하여 높은 발현량 혹은 활성을 가진 경우에, 피부 배리어 기능 항진 작용을 갖는다고 결정해도 좋고, 그 경우, 발현량 혹은 활성, 및/또는 D-세린 양이 높을수록 피부 배리어 기능 항진 작용을 갖는다고 결정할 수 있다.
다른 양태에서는, 본 발명은, 세린 라세마아제 발현량 혹은 활성, 및/또는 D-세린 양을 지표로 하는 피부 배리어 기능을 평가, 판정 또는 감별하는 방법에 관해서도 좋다. 이러한 평가, 판정 또는 감별은, 대상으로부터 피부 샘플, 예컨대 테이프 스트리핑에 의해 취득한 각층 샘플에 있어서, D-세린 함량, 세린 라세마아제 활성 또는 세린 라세마아제의 발현량을 측정함으로써 행해져도 좋다. 피부 배리어 기능의 평가, 판정 또는 감별 방법은, 통상 Vapomaeter 등을 이용하여 TEWL의 측정에 의해 행해지지만, TEWL은 피부의 상태에 따라 좌우되며, 세정이나 마찰 등에 의해서도 수치가 변화하고, 또한 피부 질환 환자에서는, 반드시 수치와 피부의 건강성 사이에 상관이 있는 것은 아니다. 본 발명의 평가, 판정 또는 감별 방법은, 세린 라세마아제 활성 혹은 발현량, 및/또는 D-세린 양을 지표로 함으로써, 피부가 원래 갖는 세포 레벨에서의 피부 배리어 기능을 측정하는 것이 가능하다. 또한, 본 발명의 평가 방법은, 세포 레벨에서의 피부 배리어 기능에 관여하는 건강성을 결정하기 때문에, 현시점에서의 피부 배리어 기능이라기 보다는, 장래의 피부 배리어 기능의 예측을 가능하게 한다. 피부 배리어 기능의 평가, 판정, 또는 감별은, 미리 설정했던 세린 라세마아제 발현량 혹은 활성, 및/또는 D-세린 양과, 배리어 기능 항진 작용의 관계를 나타내는 도표 또는 임계치를 이용하여 결정할 수 있다. 이러한 도표 또는 임계치는, 건강한 피부를 갖는 피험자군, 거친 피부를 갖는 피험자군, 나아가 연령별 피험자군 등으로부터 채취되어 단리된 피부 샘플 중에서의 얻어진 발현량 혹은 활성, 및/또는 D-세린 양에 기초하여 설정할 수 있다.
이하의 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 또, 본 발명은 이것에 한정되는 것이 아니다.
실시예
실시예 1 : 각층 중 D-세린 함량과 배리어 기능의 관련성의 검증
피험자는 피험 개소가 건강한 자원자 57명이며, 피험 부위를 정해진 방법으로 세정한 후에 세정으로 젖은 피험 부위를 닦고, 항온ㆍ항습 조건(실온 22℃, 습도 45%)에서 30분간 대기했다. 그 후, 경피 수분 증산량(TEWL)을 Vapometer(Delfin사)에 의해 측정했다. 측정은 3회 행하여, 그 평균치를 그 후의 해석에 이용했다. 다음으로, TEWL을 측정한 위치의 각층을, 점착 테이프를 이용하여 2회 박리한 것 중 2장째를, 95% 메탄올 수용액 중에서 아미노산을 추출했다. 추출한 아미노산의 광학 이성체는 이미 알려진 방법에 따라 분석했다(참고 문헌 : Yurika Miyoshi 등 Journal of Chromatography B, 877 (2009) 2506-2512). 개요를 이하에 나타낸다. 추출한 아미노산을 붕산염 완충액(pH 8.0) 중에서 4-플루오로-7-니트로-2,1,3-벤조옥사디아졸(NBD-F)에 의해 형광 유도체화하고, 트리플루오로아세트산으로 산성 조건으로 한 후, 2차원 미크로 HPLC(시세이도)에 사용했다. 1차원째에는 미크로 모노리스 ODS 컬럼(내경 0.53 mm, 전체 길이 500, 750, 1000 mm, 시세이도), 2차원째의 광학 분할에는 각 아미노산에 적합한 내경 1.5 mm의 광학 분할 컬럼과 이동상을 이용했다. NBD-아미노산은 530 nm의 형광 발광(여기 파장 470 nm)에 의해 검출했다. 결과를 표 1 및 도 1에 나타낸다.
Figure pat00001
각층 중 D-세린(D-Ser) 함량과 피부 배리어 기능의 관련성을 검증하기 위해 각 피험자를 TEWL의 값의 순으로 나열하여, 상위 17명(배리어 기능 하위군)과 하위 17명(배리어 기능 상위군)의 각층 중 D-세린 함량을 각각 비교했다. 양 군의 유의차는 비대응(non-paired) Student's t-test에 의해 검증했다. 그 결과, 피부의 배리어가 높은 인간은 D-세린 함량이 유의미하게 높은 것이 나타났다. 한편, L-세린에 관한 비교의 결과에서는, 배리어 기능 하위군에서는 L-세린의 함량이 낮고, 배리어 기능 상위군에서는 L-세린의 함량이 높은 경향이 보였지만, 유의차는 없었다. 따라서, 배리어 기능 상위군에서 D-세린 함량이 높은 것은, 전구 물질인 L-세린의 양에 의한 것이 아니라, 라세마아제 발현이나 활성의 영향이라고 할 수 있다.
실시예 2 : 케라티노사이트의 분화 유도에 따른 D-세린 함량의 변화
<세포의 배양과 약제 처리>
인간 정상 케라티노사이트를 24웰 멀티플레이트에 세포 밀도가 2.5×104 세포/웰이 되도록 파종하여, KGM 배지(쿠라보) 중 37℃, 5% CO2의 조건하에서 배양했다. 3일 후에 1.8 mM 염화칼슘 및 10 mM L-세린을 첨가한 KGM 배지(시험군) 또는 10 mM L-세린만을 첨가한 KGM 배지(대조군)로 교환하여 2일간 더 배양했다.
<HPLC용 샘플 조제 및 HPLC에 의한 유리 D-세린 분석>
세포를 PBS로 세정한 후 5% 트리클로로아세트산 수용액을 500 μL 더하여 세포를 잘 현탁하여 회수하고, 얼음 위에서 30분간 초음파 처리한 후에 원심 분리를 거쳐상청을 얻었다. 이 상청에 대하여 20배량의 메탄올을 더하여 아미노산을 추출했다. 추출한 아미노산의 광학 이성체는 이미 알려진 방법에 따라 분석했다(참고 문헌 : Yurika Miyoshi 등 Journal of Chromatography B, 877 (2009) 2506-2512). 개요를 이하에 나타낸다. 추출한 아미노산을 붕산염 완충액(pH 8.0) 중에서 4-플루오로-7-니트로-2,1,3-벤조옥사디아졸(NBD-F)에 의해 형광 유도체화하여 트리플루오로아세트산으로 산성 조건으로 한 후, 2차원 미크로 HPLC(시세이도)에 사용했다. 1차원째에는 미크로 모노리스 ODS 컬럼(내경 0.53 mm, 전체 길이 750 mm, 시세이도), 2차원째의 광학 분할에는 각 아미노산에 적합한 내경 1.5 mm의 광학 분할 컬럼과 이동상을 이용했다. NBD-아미노산은 530 nm의 형광 발광(여기 파장 470 nm)에 의해 검출했다. 시험군과 대조군의 결과를 도 2에 나타낸다.
실시예 3 : 후보 약제의 스크리닝
<세포의 배양과 약제 처리>
인간 정상 케라티노사이트를 24웰 멀티플레이트에 세포 밀도가 2.5×104 세포/웰이 되도록 파종하여, KGM 배지(쿠라보) 중 37℃, 5% CO2의 조건하에서 배양했다. 3일 후에 1.8 mM 염화칼슘, 10 mM L-세린 및 후보 약제의 희석액을 포함하는 KGM 배지로 교환하여 2일간 더 배양했다. 후보 약제로서 7종류의 약제를 이용하고, 그 중의 하나로서 0.5% 가수분해 귀리 단백액을 이용했다.
<HPLC용 샘플 조제 및 HPLC에 의한 유리 D-세린 분석>
세포를 PBS로 세정한 후 5% 트리클로로아세트산 수용액을 500 μL 더하여 세포를 잘 현탁하여 회수하고, 얼음 위에서 30분간 초음파 처리한 후에 원심 분리를 거쳐 상청을 얻었다. 이 상청에 대하여 20배량의 메탄올을 더하여 아미노산을 추출했다. 추출한 아미노산의 광학 이성체는 이미 알려진 방법에 따라 분석했다(참고 문헌 : Yurika Miyoshi 등 Journal of Chromatography B, 877 (2009) 2506-2512). 개요를 이하에 나타낸다. 추출한 아미노산을 붕산염 완충액(pH 8.0) 중에서 4-플루오로-7-니트로-2,1,3-벤조옥사디아졸(NBD-F)에 의해 형광 유도체화하여 트리플루오로아세트산으로 산성 조건으로 한 후, 2차원 미크로 HPLC(시세이도)에 사용했다. 1차원째에는 미크로 모노리스 ODS 컬럼(내경 0.53 mm, 전체 길이 750 mm, 시세이도), 2차원째의 광학 분할에는 각 아미노산에 적합한 내경 1.5 mm의 광학 분할 컬럼과 이동상을 이용했다. NBD-아미노산은 530 nm의 형광 발광(여기 파장 470 nm)에 의해 검출했다. 그 결과를, 하기의 표 2 및 도 3의 (A)에 나타낸다.
<정량적 PCR(RT-PCR)>
세포를 PBS로 세정한 후 MagNA Pure LC(로슈ㆍ다이어그노스틱스)를 이용하여 세포로부터 mRNA를 추출했다. 다음으로 역전사 효소 Super Script VILO(인비트로젠)의 키트를 이용하여 cDNA를 합성했다. 이 cDNA를 주형에 Light Cycler(로슈ㆍ다이어그노스틱스)로 형광 색소 Cyber Green을 이용한 리얼타임 PCR을 행했다. PCR 반응은 95℃, 10분간의 효소 활성화 후에 95℃ 15초ㆍ60℃ 10초ㆍ72℃ 10초의 증폭 반응을 30회 반복했다. 유전자 발현량은, 일정량의 PCR 산물이 얻어지기까지의 사이클수로부터 상대치를 산출했다. RT-PCR은 세린 라세마아제 유전자 외에 내부 표준으로서 G3PDH(글리세르알데히드-3-포스페이트: glyceraldehyde-3-phosphate) 유전자에 관해서도 행하고, 세린 라세마아제의 상대 발현량을 G3PDH의 상대 발현량으로 보정함으로써 약제를 평가했다. RT-PCR에 있어서 이용한 프라이머는, 비특허문헌 3 및 비특허문헌 4에 기재된 것을 선택하여 이용했다. 그 결과를, 하기 표 2 및 도 3의 (B)에 나타낸다.
Figure pat00002
본 스크리닝에 사용된 후보 약제 중, 가수분해 귀리 단백액이, 분화 유도된 케라티노사이트에 있어서 세린 라세마아제의 발현을 항진한 것이 나타났다. 또한, 가수분해 귀리 단백액이, 분화 유도된 케라티노사이트 중의 D-세린 함량을 증가시키는 것도 나타났다. 이러한 결과에 의해, 가수분해 귀리 단백액을, 피부 배리어 기능의 항진에 유효한 약제로서 선택할 수 있다.
실시예 4 : 후보 약제의 스크리닝
<세포의 배양과 약제 처리>
인간 정상 케라티노사이트를 24웰 멀티플레이트에 세포 밀도가 2.5×104 세포/웰이 되도록 파종하고, KGM 배지(쿠라보) 중 37℃, 5% CO2의 조건하에서 배양했다. 3일후에 1.8 mM 염화칼슘, 10 mM L-세린 및 후보 약제의 희석액을 포함하는 KGM 배지로 교환하여 2일간 더 배양했다. 후보 약제로서 12종류의 약제를 이용하고, 그 중에는 0.5% 름뿌양 추출물 및 0.5% 시로바나이가코조리나 추출물이 포함되어 있었다.
<정량적 PCR(RT-PCR)>
세포를 PBS로 세정한 후 MagNA Pure LC(로슈ㆍ다이어그노스틱스)를 이용하여 세포로부터 mRNA를 추출했다. 다음으로 역전사 효소 Super Script VILO(인비트로젠)의 키트를 이용하여 cDNA를 합성했다. 이 cDNA를 주형에 Light Cycler(로슈ㆍ다이어그노스틱스)로 형광 색소 Cyber Green을 이용한 리얼타임 PCR을 행했다. PCR 반응은 95℃, 10분간의 효소 활성화 후에 95℃ 15초ㆍ60℃ 10초ㆍ72℃ 10초의 증폭 반응을 30회 반복했다. 유전자 발현량은, 일정량의 PCR 산물이 얻어지기까지의 사이클수로부터 상대치를 산출했다. RT-PCR은 세린 라세마아제 유전자 외에 내부 표준으로서 G3PDH(글리세르알데히드-3-포스페이트) 유전자에 관해서도 행하고, 세린 라세마아제의 상대 발현량을 G3PDH의 상대 발현량으로 보정함으로써 약제를 평가했다. RT-PCR에 있어서 이용한 프라이머는, 비특허문헌 3 및 비특허문헌 4에 기재된 것을 선택하여 이용했다. 그 결과를 하기 표 3에 나타낸다.
Figure pat00003
본 스크리닝에 사용된 후보 약제 중, 름뿌양 추출물 및 시로바나이가코조리나 추출물이, 분화 유도된 케라티노사이트에 있어서 세린 라세마아제의 발현을 항진한 것이 나타났다. 이 결과에 의해, 름뿌양 추출물 및 시로바나이가코조리나 추출물을, 피부 배리어 기능의 항진에 유효한 약제로서 선택할 수 있다.

Claims (11)

  1. 케라티노사이트에 있어서, 세린 라세마아제의 활성 혹은 발현량, D-세린 양, 또는 세린 라세마아제의 활성 혹은 발현량 및 D-세린 양을 지표로 하는, 피부 배리어 기능 항진 약제의 스크리닝 방법.
  2. 제1항에 있어서, 이하의 :
    케라티노사이트에 후보 약제를 첨가하는 공정,
    케라티노사이트에 있어서 세린 라세마아제의 활성 혹은 발현량, D-세린 양, 또는 세린 라세마아제의 활성 혹은 발현량 및 D-세린 양을 측정하는 공정,
    세린 라세마아제의 발현량 혹은 활성, D-세린 양, 또는 세린 라세마아제의 발현량 혹은 활성 및 D-세린 양으로부터, 후보 약제의 피부 배리어 기능 항진 작용을 결정하는 공정
    을 포함하는 스크리닝 방법.
  3. 제2항에 있어서, 케라티노사이트를 분화 유도하는 공정을 더 포함하는 스크리닝 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 스크리닝 방법이, 분화 유도된 케라티노사이트에 있어서 행해지는 스크리닝 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 세린 라세마아제 발현량의 측정이, 세린 라세마아제의 mRNA 또는 단백질의 양을 측정함으로써 행해지는 스크리닝 방법.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 세린 라세마아제 활성의 측정이, 세린 라세마아제에 의한 기질의 변환 효율의 측정 혹은 D-아미노산 생성물의 양을 측정하는 것에 의한 스크리닝 방법.
  7. 제1항 내지 제4항에 기재된 스크리닝 방법에 의해 얻어진 가수분해 귀리 단백, 름뿌양(lempuyang) 추출물 및 시로바나이가코조리나(Elephantopus mollis) 추출물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 또는 복수의 물질을 유효 성분으로 하는 세린 라세마아제 활성화제.
  8. 인간 피부로부터 단리한 피부 샘플로부터 세린 라세마아제의 활성 혹은 발현량, D-세린 양, 또는 세린 라세마아제의 활성 혹은 발현량 및 D-세린 양을 지표로 하는, 피부 배리어 기능을 평가하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 이하의 :
    대상으로부터 단리된 피부 샘플에 있어서, 세린 라세마아제의 활성 혹은 발현량, D-세린 양, 또는 세린 라세마아제의 활성 혹은 발현량 및 D-세린 양을 측정하는 공정,
    세린 라세마아제의 활성 혹은 발현량, D-세린 양, 또는 세린 라세마아제의 활성 혹은 발현량 및 D-세린 양으로부터, 대상의 피부 배리어 기능을 결정하는 공정
    을 포함하는 피부 배리어 기능을 평가하는 방법.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 세린 라세마아제 발현량의 측정이, 세린 라세마아제의 mRNA 또는 단백질의 양을 측정함으로써 행해지는, 피부 배리어 기능을 평가하는 방법.
  11. 제8항 또는 제9항에 있어서, 세린 라세마아제 활성의 측정이, 세린 라세마아제에 의한 기질의 변환 효율의 측정 혹은 D-아미노산 생성물의 양을 측정하는 것에 의한 방법.
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