TWI666444B - 以表皮絲胺酸消旋酶及／或ｄ－絲胺酸量為指標之皮膚之障壁機能促進藥劑之篩選方法及皮膚障壁機能評價方法 - Google Patents

Abstract

本發明之課題在於開發在活體外(in vitro)實驗中具有提高皮膚之障壁機能之效果的藥劑之篩選法，並評價皮膚中之皮膚之障壁機能。藉由以絲胺酸消旋酶之活性及/或表現量為指標，而可進行候補藥劑之篩選。

Description

以表皮絲胺酸消旋酶及/或D-絲胺酸量為指標之皮膚之障壁機能促進藥劑之篩選方法及皮膚障壁機能評價方法

本發明係關於一種皮膚之障壁機能促進藥劑之篩選方法、及皮膚中之皮膚之障壁機能之評價方法。

若皮膚之障壁機能喪失，則會使皮膚喪失水分，且產生來自外部之雜質之侵入，從而導致以敏感肌膚或乾燥肌膚、肌膚粗糙為代表之皮膚炎及過敏等。因此，就開發機能性食品、化妝品或醫藥品之觀點而言，期待開發提高皮膚之障壁機能之藥劑。作為提高皮膚障壁機能之要素，已知有增加細胞間脂質之量、或調整序列等方法，例如，如專利文獻1所示般開發出促進細胞間脂質之產生之藥劑等。

作為皮膚之障壁機能之指標，可列舉經表皮水分蒸發量(TEWL，Transepidermal Water Loss)或使用色素等指標物質時該指標物質對皮膚之滲透度等。皮膚之TEWL可使用水蒸氣滲透性能測定儀(Vapometer)等裝置進行測定，但水分量之測定係受大氣中之水分量或空氣之流動、本人之體溫、心理狀態、汗等測定環境之較大影響而容易變得不穩定的指標，因此期待可更穩定地評價皮膚之障壁機能之方法。於以指標物質之滲透度作為皮膚之障壁機能之指標之情形時，必須將色素等指標物質應用於皮膚，對皮膚之負擔較大。

為了自大量候補藥劑中篩選具有提高皮膚之障壁機能之效果之藥劑，可使用TEWL作為皮膚障壁機能之指標，於活體內(in vivo)進 行實驗，但受測定環境之較大影響而不穩定，難以自大量候補藥劑中篩選具有生理上或結構上提高皮膚障壁機能之效果之藥劑。另一方面，作為該篩選方法，亦考慮如下方法，即，使用單離之皮膚，測定參與障壁機能之恢復及促進之皮膚內在性之因子，而評價障壁機能之恢復及促進，但不存在可以少量之試樣簡便地進行評價之適當之因子，而期待特定出此種因子。

另一方面，已知胺基酸中存在作為光學異構物之L體與D體，一般認為，構成活體之胺基酸主要為L體，D體之胺基酸係細菌之肽聚糖(Peptidoglycan)等極其受限之活體成分。然而，根據近年來之研究之成果明確，不僅於微生物中，於植物或哺乳動物中各種D-胺基酸亦以游離型之形式或以構成蛋白質之胺基酸殘基之形式存在，而發揮多種生理機能。作為哺乳動物中之游離型之D-胺基酸，最初發現有D-絲胺酸與D-天冬胺酸。發現，D-絲胺酸局部存在於大腦、海馬區，作為NMDA(N-Methyl-D-Aspartic Acid，N-甲基-D-天冬胺酸)受體之共同促效劑(co-agonist)而起作用，對興奮性之神經傳導之控制發揮作用(非專利文獻1)。又，D-天冬胺酸被確認到局部存在於睾丸或松果體中，且發現參與激素分泌之控制。另一方面，根據近年來之D-胺基酸研究之成果明確，D-絲胺酸、D-天冬胺酸、D-丙胺酸、D-麩胺酸、及D-脯胺酸存在於真皮與表皮，且顯示隨著年齡增長而減少(非專利文獻2)。其中，D-絲胺酸係於表皮、角質層中含量最高之D-胺基酸，但關於D-絲胺酸於皮膚中所發揮之作用，雖於真皮之纖維母細胞中發現減輕紫外線損傷之作用(專利文獻2)，但於含量較高之表皮中尚未明確。

作為與D-胺基酸之生成有關之酶，已知有胺基酸消旋酶，且分類為依賴於磷酸吡哆醛(PLP，pyridoxal phosphate)之酶與不要求輔因子之消旋酶。以於包括哺乳動物之真核細胞中存在D-胺基酸之報告為 契機，報告稱PLP依賴性之絲胺酸消旋酶存在於哺乳動物中(非專利文獻3)，但關於天冬胺酸消旋酶，尚未確認是否伴有消旋酶活性地存在於哺乳動物中。由於D-絲胺酸局部存在於大腦、海馬區，因此於包括人類在內之哺乳類確認到絲胺酸消旋酶於腦中進行表現，但對在其他組織中之表現幾乎未報告(非專利文獻3)。

[先前技術文獻] [專利文獻]

[專利文獻1]日本專利特開2012-92032號公報

[專利文獻2]WO2011/030903號公報

[非專利文獻]

[非專利文獻1]S. H. Snyder, et al., NeuroChem Res 25, 553 (2000)

[非專利文獻2]Y. Tojo, Food Style 21, 2013, August, (Vo. 17, No. 8)

[非專利文獻3]Molecular Brain Research, Vol. 125, pp. 96 - 104, 2004

[非專利文獻4]用於開發機能性化妝品素材之實驗操作集，CMC出版，2010年，第214~216頁

為了提高皮膚之障壁機能，業界著眼於增加細胞間脂質之量、或調整序列。另一方面，認為，於促進、修復皮膚之障壁機能之方面，就生理上或結構上提高皮膚之障壁機能之觀點而言，更有效之方法係增加健康之角質層之層數本身。然而，迄今為止具有此種作用之藥劑尚不為人所知，進而如上所述難以藉由篩選發現該藥劑。因此，期待開發具有生理上或結構上提高皮膚之障壁機能之效果的藥劑之篩選方法。

本發明者等人對在皮膚中之機能尚不為人知曉之D-絲胺酸進行努力研究，結果發現D-絲胺酸有助於皮膚障壁機能。又，調查D-絲胺酸對培養角質形成細胞造成之影響，結果發現，以對障壁機能形成具有重要作用之絲聚蛋白為代表之參與邊緣區(CE(cornified cell envelope，角化性細胞被膜))形成之Cornulin或Repetin之表現。基於該等見解，藉由以角質形成細胞中D-絲胺酸量、進而自L-絲胺酸生成D-絲胺酸之絲胺酸消旋酶之表現量或活性為指標，而提供一種具有提高皮膚之障壁機能之效果的藥劑之篩選方法，進而可進行對被試驗者負擔較少、簡便且穩定之皮膚之障壁機能促進之評價，從而完成本發明。藉由使用該篩選方法，已篩選出促進皮膚障壁機能之藥劑。

具體而言，本發明者等人完成了如下發明：

[1]一種皮膚之障壁機能促進藥劑之篩選方法，其以角質形成細胞中絲胺酸消旋酶之活性或表現量、及/或D-絲胺酸量為指標。

[2]如項目1之篩選方法，其包括如下步驟：於角質形成細胞中添加候補藥劑；測定角質形成細胞中絲胺酸消旋酶之活性或表現量、及/或D-絲胺酸量；根據絲胺酸消旋酶表現量或活性、及/或D-絲胺酸量，決定候補藥劑之皮膚之障壁機能促進作用。

[3]如項目2之篩選方法，其進而包括使角質形成細胞分化誘導之步驟。

[4]如項目1之篩選方法，其中上述篩選方法係於經分化誘導之角質形成細胞中進行。

[5]如項目1至4中任一項之篩選方法，其中絲胺酸消旋酶表現量之測定係藉由測定絲胺酸消旋酶之mRNA(Messenger Ribonucleic Acid，信使核糖核酸)或蛋白質之量而進行。

[6]如項目1至4中任一項之篩選方法，其中絲胺酸消旋酶活性之測定係藉由測定基質之轉化效率或者測定D-胺基酸產物之量而進行。

[7]一種絲胺酸消旋酶活化劑，其係以藉由如項目1至6中任一項之篩選方法所獲得之選自由水解燕麥蛋白、香薑萃取物、柔毛地膽草萃取物、磷酸吡哆醛、及維生素B₆類所組成之群中之1種或複數種物質作為有效成分。

[8]一種評價皮膚障壁機能之方法，其係根據自人類皮膚單離之皮膚樣品，以絲胺酸消旋酶活性或表現量及/或D-絲胺酸量為指標。

[9]如項目8之評價皮膚障壁機能之方法，其包括如下步驟：測定自對象單離之皮膚樣品中絲胺酸消旋酶活性或表現量及/或D-絲胺酸量；根據絲胺酸消旋酶活性或表現量及/或D-絲胺酸量，決定對象之皮膚之障壁機能。

[10]如項目8或9之評價皮膚障壁機能之方法，其中絲胺酸消旋酶表現量之測定係藉由測定絲胺酸消旋酶之mRNA或蛋白質之量而進行。

[11]如項目8或9之方法，其中絲胺酸消旋酶活性之測定係藉由測定利用絲胺酸消旋酶之基質之轉化效率或者測定D-胺基酸產物之量而進行。

[12]一種皮膚之障壁機能促進劑，其包含藉由如項目1至6中任一項之篩選方法所獲得之選自由水解燕麥蛋白、香薑萃取物、柔毛地膽草萃取物、磷酸吡哆醛、及維生素B₆類所組成之群中之1種或複數種物質。

[13]一種皮膚障壁機能促進方法，其包括對皮膚障壁機能降低之對象，投予選自由水解燕麥蛋白、香薑萃取物、柔毛地膽草萃取物、磷酸吡哆醛、及維生素B₆類所組成之群中之1種或複數種物質之步 驟。

[14]一種絲胺酸消旋酶活化方法，其包括對絲胺酸消旋酶活性降低之對象，投予選自由水解燕麥蛋白、香薑萃取物、柔毛地膽草萃取物、磷酸吡哆醛、及維生素B₆類所組成之群中之1種或複數種物質之步驟。

[15]一種水解燕麥蛋白、香薑萃取物、柔毛地膽草萃取物、磷酸吡哆醛、及維生素B₆類之用途，其係用於製造絲胺酸消旋酶活化劑。

[16]一種水解燕麥蛋白、香薑萃取物、柔毛地膽草萃取物、磷酸吡哆醛、及維生素B₆類之用途，其係用於製造皮膚障壁機能促進劑。

藉由使用本發明之篩選方法，可選擇能改善或促進皮膚障壁機能之藥劑。又，藉由本發明之皮膚障壁機能之評價方法，可於細胞等級或組織等級、或於生物化學上判定皮膚障壁機能。

圖1(A)表示高TEWL群與低TEWL群之皮膚中之游離L-絲胺酸之量的比較。圖1(B)表示高TEWL群與低TEWL群之皮膚中之游離D-絲胺酸之量的比較。

圖2(A)及圖2(B)係檢測培養角質形成細胞中未賦予分化誘導刺激之對照群(A)及賦予分化誘導刺激之試驗群(B)之細胞內D-絲胺酸所得的層析圖。

圖3(A)係表示作為候補藥劑之一的水解燕麥蛋白液使游離D-絲胺酸量增加的圖。圖3(B)係表示作為候補藥劑之一的水解燕麥蛋白液使絲胺酸消旋酶之表現增加的圖。

圖4係表示藉由將作為候補藥劑之一的磷酸吡哆醛(PLP)添加至培養角質形成細胞中而使游離D-絲胺酸量增加的圖。

圖5係表示D-絲胺酸於3維皮膚樣本中使絲聚蛋白基因之表現增加的圖。

圖6係表示D-絲胺酸於3維皮膚樣本中使Cornulin基因之表現增加的圖。

圖7係表示D-絲胺酸於3維皮膚樣本中使Repetin基因之表現增加的圖。

本發明係關於一種皮膚之障壁機能促進藥劑之篩選方法，其係將作為指標之角質形成細胞中之絲胺酸消旋酶之表現量、活性、及D-絲胺酸量之1種或2種以上組合。

於本發明之篩選方法中，可獲取具有促進皮膚障壁機能作用之藥劑。此處，所謂皮膚之障壁機能，係保持皮膚之水分、或防止雜質自外部侵入之機能，表皮之中，尤其是角質層擔負該機能。皮膚障壁機能可藉由經表皮水分蒸發量(TEWL)測定，一般認為該水分蒸發量越高，皮膚障壁機能越低。皮膚障壁機能之促進例如可藉由角質層之層數之增加、或角質層中之角化外膜(角化包囊)之成熟化、或細胞間脂質、例如膽固醇或腦醯胺之增加等而達成，但並無意限定於該等。因此，雖無意為理論所限制，但可認為，藉由本發明之篩選方法所選擇之藥劑藉由應用於皮膚，而可促進絲胺酸消旋酶之表現或活性、或增加D-絲胺酸量，其結果可發揮角質層之層數增加等效果，從而促進皮膚障壁機能。

供至本發明之篩選方法之候補藥劑可為任意化合物、例如自重組庫(recombinatorial library)獲得之化合物，亦可為混合物或萃取物。作為候補藥劑，例如亦可使用食品素材、化妝品素材或醫藥品素材之化合物、混合物或萃取物庫。藉由本發明，被認為具有促進皮膚障壁機能作用之藥劑可應用於機能性食品或營養食品等食品、化妝品、醫藥品或準藥品。作為化妝品，例如可應用於化妝水、乳霜、乳液、凝膠、美容液、軟膏、面膜、沐浴劑、沐浴乳、洗髮精、潤絲 精、粉底等，但並無意限定於該等。更佳為應用於敏感肌膚用之化妝料、例如化妝水、乳霜、乳液、美容液等。只要為醫藥品或準藥品，則可應用於經皮投予用之各種軟膏、乳霜等形態或經口投予用之形態。

本發明之篩選方法中，使用角質形成細胞中絲胺酸消旋酶之表現量或活性、及/或D-絲胺酸量作為指標。所謂作為指標，係指考慮絲胺酸消旋酶之表現量或活性、及/或D-絲胺酸量。因此，於添加候補藥劑之情形時，只要將絲胺酸消旋酶之表現量或活性、及/或D-絲胺酸量作為判斷之基準，選擇具有皮膚之障壁機能促進作用之藥劑，則符合本發明之篩選方法。

所謂角質形成細胞，係構成表皮之約95%之細胞。活體中於表皮之基底層存在角質形成細胞之幹細胞，隨著成熟而移動至外側之層，形成有棘層、顆粒層、角質層。角質形成細胞隨著成熟而改變其性質，於有棘層或顆粒層中，細胞發生扁平化，腦醯胺等脂質被釋放至細胞間隙，於最外層之角質層中產生脫核。可將該一系列之成熟過程稱為角質形成細胞之分化。關於產生脫核之細胞，細胞形態消失並進行重層化而形成角質層，最終以污垢之形式自最外層剝落。

本發明中所使用之培養角質形成細胞可為自表皮之基底層、有棘層、顆粒層、角質層之任一者獲取之細胞，亦可為自幹細胞、例如皮膚上表皮幹細胞、多能性幹細胞、例如ES細胞(embryonic stem cells，胚胎幹細胞)、iPS細胞(induced pluripotent stem cells，誘導性多功能幹細胞)、EG細胞(embryonic germ cells，胚胎生殖細胞)等分化誘導而成之細胞。自表皮獲取並經培養之細胞可為經初代培養之細胞，可為經繼代培養之細胞，進而亦可為經癌化或永生化之細胞。又，本發明中所使用之培養角質形成細胞例如亦可為源自人類或動物等之角質形成細胞株。該等角質形成細胞之細胞株可自官方機構或經 銷商獲取。

所謂培養物，可僅指所需之細胞，亦可包含其他細胞，進而亦可包含細胞與培養基。因此，所謂角質形成細胞培養物，可僅指角質形成細胞，可包含角質形成細胞與其他細胞，亦可包含單獨之角質形成細胞及培養基或包含角質形成細胞與其他細胞及培養基。作為上述培養物，可列舉：單層培養物、混合培養物、三維培養物等。培養角質形成細胞之培養基只要為可進行角質形成細胞之培養之培養基，則可為任意培養基，例如可於HuMedia-KB2(Kurabo)、或Keratinocyte-SFM(Invitrogen)之培養基中添加各種添加劑而使用，但並無意限定於該等。培養條件通常係於37℃、5%CO₂存在下進行培養，但亦可於產生角質形成細胞之增生之範圍內進行變更。關於D-絲胺酸存在量，就絲胺酸消旋酶活性之觀點而言，培養基較佳為L-絲胺酸富集狀態。於培養培養基中，通常不特意地添加D-胺基酸，培養基中之L-絲胺酸相對於D-絲胺酸之存在量至少為1.1倍，更佳為10倍，進而較佳為50倍以上。例如於HuMedia-KB2(Kurabo)中，於添加有HuMedia-KG增生添加劑套組之培養基(KGM(konjac glucomannan，魔芋葡甘聚糖)培養基)中，L-絲胺酸相對於D-絲胺酸之存在量為100倍以上。

角質形成細胞培養物係於播種後進行培養，可將成為約50%匯合~融合者供於實驗。就進行分化誘導之觀點而言，匯合度較佳為70%以上，進而較佳為80%以上。對角質形成細胞培養物添加候補藥劑之步驟可藉由將角質形成細胞培養物之培養基置換為包含候補藥劑之培養基而進行，亦可將候補藥劑直接、或以稀釋液之形式添加至包含角質形成細胞與培養基之培養物中。

絲胺酸消旋酶係作為維生素B₆輔酶型之吡哆醛5'磷酸(PLP)依賴性之消旋酶。雖並無意為理論所限定，但絲胺酸消旋酶係可藉由奪取絲胺酸之α-氫，經由陰離子性中間物之生成而進行L-絲胺酸與D-絲胺 酸之間之轉化之酶。於L-絲胺酸與D-絲胺酸之間之轉化反應中，於反應前後焓未發生變化，反應係由熵驅動，因此於平衡狀態下L-絲胺酸與D-絲胺酸成為等量。於活體中，L-絲胺酸之存在量多於D-絲胺酸，故而因存在絲胺酸消旋酶，而使活體中之L-絲胺酸向D-絲胺酸轉化。於培養條件下，通常培養基中含有大量L體，故而同樣地因絲胺酸消旋酶之存在，而使L-絲胺酸向D-絲胺酸轉化。於本發明中，消旋酶與根據非專利文獻3於腦中確認到表現之消旋酶相同，或亦可為其同源物(homologue)或直系同源物(orthologue)。因此，係指可藉由該文獻中所使用之引子對進行擴增、且可藉由該文獻中所記載之抗消旋酶抗體進行檢測者。關於絲胺酸消旋酶，只要為本領域業者，則可根據NCBI(National Center for Biotechnology Information，美國國家生物技術信息中心)等官方機構之網站，根據動物種類適當地加以特定。

於本發明之一態樣中，可以角質形成細胞中之絲胺酸消旋酶之活性為指標，而評價皮膚之障壁機能、或進行皮膚之障壁機能促進藥劑之篩選。關於絲胺酸消旋酶之活性，於未添加成為酶之基質之物質之情形時，可基於藉由通常之培養基中所含之L-絲胺酸進行轉化而產生之D-絲胺酸量，亦可基於包括D-絲胺酸之其他D-胺基酸之合計量。又，亦可藉由添加可成為絲胺酸消旋酶之基質之絲胺酸以外之物質，而進行基於該添加物之轉化的產物之量之測定或者轉化效率之測定。關於絲胺酸消旋酶，由於將過剩之光學異構物轉化為另一種光學異構物直至D體與L體成為50：50，因此當然可於活性測定中添加D體。於該情形時，亦可藉由測定由轉化所產生之L-絲胺酸之增加部分，而評價酶活性。除此以外，若添加例如環絲胺酸或絲胺酸之衍生物(N-甲基化物、乙醯化物、磷酸化物等)，則亦可藉由調查向對應之光學異構物之轉化效率而評價酶活性。於基於D-絲胺酸量測定絲胺酸消旋酶之活性之情形時，可根據自對象單離之皮膚樣品中、或角質形 成細胞培養物中、即培養基中、細胞中、或其兩者中之D-絲胺酸之存在量而決定，亦可根據酶學參數而決定，該酶學參數係基於皮膚樣品中或角質形成細胞培養物中之D-絲胺酸之存在量之變化而決定。該方法於成為酶之基質之上述物質中均可應用。作為表示絲胺酸消旋酶之活性之酶學參數，可藉由決定V_max、K_m值而表示。

於本發明之又一態樣中，可以角質形成細胞中之D-絲胺酸量為指標，而評價皮膚之障壁機能、或進行皮膚之障壁機能促進藥劑之篩選。D-絲胺酸量可於自對象單離之皮膚樣品中、或角質形成細胞培養物中、即培養基中、細胞中、或其兩者中進行測定。D-絲胺酸量之測定方法可使用已知之方法進行，例如可藉由使用光學異構物分離管柱之HPLC(High Performance Liquid Chromatography，高效液相層析)法、或氣相層析法、電泳法、酶法而進行。於藉由D-絲胺酸量之測定進行絲胺酸消旋酶活性之測定之情形時，為了增加D-絲胺酸量，亦可對角質形成細胞培養物添加L-絲胺酸。絲胺酸消旋酶於進行L-絲胺酸與D-絲胺酸之間之轉化反應之情形時，於反應前後焓未發生變化，反應係由熵驅動，因此可藉由添加L-絲胺酸，使D-絲胺酸量對應於絲胺酸消旋酶之活性而增加，從而使D-絲胺酸量之測定變得更容易。

於另一態樣中，可以絲胺酸消旋酶之表現量為指標，而評價皮膚障壁機能、或進行皮膚之障壁機能促進藥劑之篩選。絲胺酸消旋酶之表現量可藉由利用使用抗絲胺酸消旋酶抗體之免疫學方法測定絲胺酸消旋酶之蛋白質而決定。作為免疫學方法，例如亦可藉由西方點墨法、螢光免疫染色法或ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，酶結合免疫吸附分析)法進行。抗絲胺酸消旋酶之抗體可使用市售之單株抗體或多株抗體，亦可使用對兔子或小鼠等實驗動物將絲胺酸消旋酶蛋白質或抗原肽免疫化而回收之抗體。

絲胺酸消旋酶之表現量亦可藉由決定細胞中之絲胺酸消旋酶之 mRNA量而進行。mRNA之測定可藉由任意方法進行，例如可基於定量性PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈反應)之方法加以測定。定量性PCR法通常以如下方式進行，但並無意限定於此。自所回收之細胞萃取mRNA，使用聚T引子與反轉錄酶而製作cDNA(Complementary Deoxyribonucleic Acid，互補去氧核糖核酸)。對所製作之cDNA，可藉由使用Syber Green法或螢光探針法定量細胞中所含之mRNA量。

更具體而言，本發明之篩選方法亦可包括如下步驟：於角質形成細胞中添加候補藥劑；測定角質形成細胞中絲胺酸消旋酶表現量或活性、及/或D-絲胺酸量；及根據絲胺酸消旋酶表現量或活性、及/或D-絲胺酸量，決定候補藥劑之皮膚之障壁機能促進作用。本發明之篩選方法亦可進而包括使角質形成細胞分化誘導之步驟。

分化誘導步驟係藉由對角質形成細胞賦予分化誘導刺激而進行。藉由對角質形成細胞賦予分化誘導刺激，而產生如下細胞之變化：細胞之扁平化、細胞內之纖維物或顆粒之增加、細胞間隙之不明確化、重層化(尤其是單層培養之情形時)、最終脫核等形態之變化，或者產生角蛋白1、角蛋白10、包殼蛋白(involucrin)、轉麩胺醯胺酶之活化等蛋白質及蛋白質之變化等(參照日皮會誌90(12),1089-1101,http：//drmtl.org/data/090121089.pdf、Drug News Perspect 2004,17(2)p117)。作為該分化誘導刺激，只要可產生如上所述之角質形成細胞之分化則可為任意刺激，例如亦可為使鈣離子之濃度增加之鈣離子刺激、利用佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯之刺激(Hawley-Nelson P,Stanley JR et al,Exp Cell Res,137：155-167,1982)、電壓或氣相暴露等物理刺激、利用活體液之刺激。於藉由鈣離子進行刺激之 情形時，可以使鈣離子以最終濃度計成為0.1mM~10mM之濃度之方式添加鈣鹽或其稀釋液，亦可置換成預先以包含最終濃度之鈣離子之方式製備之培養基。作為所使用之鈣鹽，例如可使用氯化鈣、碳酸氫鈣、碳酸鈣、硝酸鈣、乙酸鈣等。關於鈣離子之最終濃度之上限，就不對細胞培養造成不良影響之觀點而言，較佳為5mM以下，進而較佳為2mM以下。就促進分化誘導之觀點而言，濃度之下限值較佳為0.5mM以上，進而較佳為1.0mM以上。

分化誘導步驟與候補藥劑之添加步驟可同時進行，亦可於分化誘導步驟後進行候補藥劑之添加步驟，反之，即亦可於候補藥劑之添加步驟後進行分化誘導步驟。雖並無意為理論所限定，但可根據候補藥劑之被期待之作用機理而改變分化誘導與添加候補藥劑之時機。例如，就研究與分化誘導刺激物質拮抗之藥劑之觀點而言，添加步驟較佳為與刺激步驟同時或者於刺激前進行。進而就促進、抑制分化誘導後之細胞變化(形態變化、各種細胞內因子之表現等)之觀點而言，添加步驟較佳為與刺激步驟同時或者於其後進行，就探索將分化誘導刺激所作用之受體等預先阻斷等機理之觀點而言，較佳為於添加步驟後進行刺激步驟。於未同時進行候補藥劑之添加步驟與分化誘導之刺激步驟之情形時，亦可於添加步驟與刺激步驟之間包括數分鐘~數小時之細胞培養步驟。

於分化誘導之刺激與候補藥劑之添加後且絲胺酸消旋酶之表現量或活性、及/或D-絲胺酸量之測定步驟前，亦可進而包括細胞培養步驟。該細胞培養步驟之時間可根據所使用之分化誘導劑之種類或濃度、或角質形成細胞之種類而任意選擇，例如可進行6小時~1週之培養。就充分地表現絲胺酸消旋酶之觀點而言，培養時間之下限較佳為12小時以上，進而較佳為1天以上。另一方面，培養時間之上限根據單層培養或重層化培養、三維培養等培養方法而有所不同，故而並無 特別規定，但就維持細胞之健康之培養條件之觀點而言，於單層培養之情形時，較佳為一週以內，更佳為3天以內。

本發明之篩選方法亦可進而包括損傷賦予步驟。損傷賦予步驟可為藉由物理刺激或化學刺激對所培養之角質形成細胞賦予損傷者，例如可列舉：紫外線照射、氧化劑等自由基源之添加、界面活性劑之添加、置換為不良營養培養基等。可認為，於藉由損傷賦予步驟而被賦予損傷之角質形成細胞中，絲胺酸消旋酶之表現降低。因此，於在候補藥劑之添加步驟後進行損傷賦予步驟之篩選方法中，於消旋酶表現量或消旋酶活性、及/或D-絲胺酸量之降低被抑制之情形時，該候補藥劑可設為對皮膚之障壁機能之損傷之預防劑。另一方面，於在損傷賦予步驟後進行候補藥劑之添加步驟之篩選方法中，於降低之消旋酶表現量或消旋酶活性、及/或D-絲胺酸量增加之情形時，該候補藥劑可設為皮膚障壁機能之恢復、改善或治療劑。於未進行損傷賦予之篩選方法中，使消旋酶表現量或消旋酶活性、及/或D-絲胺酸量增加之候補藥劑可稱為皮膚障壁機能之促進劑。

對化妝品素材基因庫實施以絲胺酸消旋酶表現量為指標之本發明之篩選方法，結果成功地選擇水解燕麥蛋白、香薑萃取物、柔毛地膽草萃取物作為可增加於角質形成細胞中絲胺酸消旋酶之表現量之藥劑。若絲胺酸消旋酶之表現量增高，則絲胺酸消旋酶活性亦增高，角質層中之D-絲胺酸含量增加，而可更新皮膚障壁機能。因此，亦可將該等物質稱為絲胺酸消旋酶表現促進劑、絲胺酸消旋酶活化劑或皮膚障壁機能促進劑。藉由本發明之篩選方法，篩選所得之藥劑並不限定於源自香姜或柔毛地膽草之萃取物，其近緣種萃取物亦同樣地具有皮膚障壁機能促進效果。因此，作為本發明之絲胺酸消旋酶表現促進劑、絲胺酸消旋酶活化劑或皮膚障壁機能促進劑，可列舉：姜(Zingiberaceae)科薑(Zingiber)屬植物或菊(Compositae)科地膽草 (Elephamtopus)屬植物之萃取物。因此，藉由將該等物質調配於化妝料中，可製造發揮出皮膚障壁機能促進效果之化妝料。

又，對化妝品素材基因庫實施以絲胺酸消旋酶活性為指標之本發明之篩選方法，結果成功地於角質形成細胞中選擇磷酸吡哆醛(PLP：活性型維生素B₆)。若促進絲胺酸消旋酶活性，則角質層中之D-絲胺酸含量增加，而可更新皮膚障壁機能。因此，可將磷酸吡哆醛稱為絲胺酸消旋酶活化劑或皮膚障壁機能促進劑。

本發明中所使用之所謂水解燕麥蛋白，係自燕麥(Avene satiba)取得之蛋白質之水解產物。燕麥之蛋白質例如係自種子、葉、根、麩皮等中萃取，尤佳為種子。上述燕麥較佳為提取後立即進行乾燥並進行粉碎者。乾燥可利用陽光進行，亦可利用通常所使用之乾燥機進行。蛋白質於萃取過程中或萃取後藉由酸或酶處理而進行水解。燕麥係於西亞至歐洲、北美為食用而栽培之植物。本發明中所使用之萃取溶劑只要為通常萃取中所使用之溶劑，則可為任意溶劑，尤其可將甲醇、乙醇等醇類、含水醇類、丙酮、乙酸乙酯等有機溶劑單獨使用或組合使用，亦可利用水進行萃取。

關於本發明中之水解燕麥蛋白之調配量，只要為本領域業者，則可於發揮出效果之範圍內任意進行選擇。例如調配量於外用劑總量中以乾燥物計為0.00005~20.0質量%。關於調配量之上限，就製劑化與效果之觀點而言，較佳為10質量%以下，進而較佳為5質量%以下。關於調配量之下限，就發揮出充分之皮膚障壁機能促進效果之觀點而言，較佳為0.0001質量%以上，進而較佳為0.0005質量%以上。

作為本發明中所使用之薑(Zingiberaceae)科薑(Zingiber)屬植物，較適宜為香薑(Lempuyang，學名：Zingiber aromaticumMal.)。香姜係尤其生長於印度尼西亞之乾性草原、牧草等中之植物。本發明中所使用之萃取物可將上述植物之葉、包括地下莖之莖、果實等植物全草與 萃取溶劑一起浸漬，視情形於進行加熱回流後進行過濾濃縮而獲得。本發明中所使用之萃取溶劑只要為通常萃取中所使用之溶劑，則可為任意溶劑，尤其可將甲醇、乙醇等醇類、含水醇類、丙酮、乙酸乙酯等有機溶劑單獨使用或組合使用，亦可利用水進行萃取。

關於本發明中之薑(Zingiberaceae)科薑(Zingiber)屬植物之萃取物之調配量，只要為本領域業者，則可於發揮出效果之範圍內任意進行選擇。例如調配量於外用劑總量中以乾燥物計為0.00005~20.0質量%。關於調配量之上限，就製劑化與效果之觀點而言，較佳為10質量%以下，進而較佳為5質量%以下。關於調配量之下限，就發揮出充分之皮膚障壁機能促進效果之觀點而言，較佳為0.0001質量%以上，進而較佳為0.0005質量%以上。

作為本發明中所使用之菊(Compositae)科地膽草(Elephamtopus)屬植物，較適宜為柔毛地膽草(學名：Elephantopus mollis)。柔毛地膽草係原產於南非之委內瑞拉，且於熱帶亞洲廣泛地馴化之植物。本發明中所使用之菊(Compositae)科地膽草(Elephamtopus)屬植物之萃取物可將上述植物之葉、莖、花、樹皮、種子或果實、植物全草等與萃取溶劑一起浸漬或加熱回流後，進行過濾濃縮而獲得。本發明中所使用之萃取溶劑只要為通常萃取中所使用之溶劑，則可為任意溶劑，尤其可將甲醇、乙醇等醇類、含水醇類、丙酮、乙酸乙酯等有機溶劑單獨使用或組合使用。

關於本發明中之菊(Compositae)科地膽草(Elephamtopus)屬植物之萃取物之調配量，只要為本領域業者，則可於發揮出效果之範圍內任意進行選擇。例如調配量於外用劑總量中以乾燥物計為0.00005~20.0質量%。關於調配量之上限，就製劑化與效果之觀點而言，較佳為10質量%以下，進而較佳為5質量%以下。關於調配量之下限，就發揮出充分之皮膚障壁機能促進效果之觀點而言，較佳為0.0001質量%以 上，進而較佳為0.0005質量%以上。

於本發明中所使用之磷酸吡哆醛係用作絲胺酸消旋酶之輔酶之物質。磷酸吡哆醛係作為維生素B₆類而已知之吡哆醛之活性型之形態。雖然並未意圖受理論所限定，但可認為磷酸吡哆醛作為輔酶可增加絲胺酸消旋酶之活性，藉此產生之D-絲胺酸對角質形成細胞起作用，促進與皮膚障壁機能相關之基因群、例如絲聚蛋白、Cornulin及Repetin等之表現，藉此促進皮膚障壁機能。已知維生素B₆類係除了包含吡哆醛以外亦包含吡哆醇、吡哆胺，且調配於化妝料中之成分，但為水溶性之維生素，若經皮投予，則存在於吸收率或穩定性方面有問題之情形。因此，已知有為了改善經皮吸收而增加脂溶性之維生素B₆衍生物，例如吡哆醇三己基癸酸酯、吡哆醇三棕櫚酸酯、吡哆醇二棕櫚酸酯、吡哆醇二辛酸酯等維生素B₆衍生物亦包含於維生素B₆類中。又，為了改善穩定性，已知有吡哆醇環狀磷酸酯、鹽酸吡哆醇。不僅磷酸吡哆醛，維生素B₆類亦被用作絲胺酸消旋酶活化劑或皮膚機能促進劑。該等之調配量例如為0.000001~10質量%。關於調配量之上限，就製劑化與效果之觀點而言，較佳為10質量%以下，進而較佳為1質量%以下。關於調配量之下限，就發揮出充分之皮膚障壁機能促進效果之觀點而言，較佳為0.000001質量%以上，進而較佳為0.00001質量%以上。

於根據絲胺酸消旋酶表現量或活性、或D-絲胺酸量決定候補藥劑之皮膚之障壁機能促進作用之步驟中，可使用如下之表決定，該表表示預先設定所測得之絲胺酸消旋酶表現量或活性、及/或D-絲胺酸量之表現量或活性、及/或D-絲胺酸量與障壁機能促進作用之關係。上述表可使用藉由使用如下對照藥劑同樣地進行實驗而測得之消旋酶表現量或活性、及/或D-絲胺酸量來製作，該對照藥劑係已知會使藉由作為對照而不含候補藥劑地同樣地進行實驗所測得之消旋酶表現量 或活性、及/或D-絲胺酸量、或絲胺酸消旋酶表現量或活性、及/或D-絲胺酸量增加。於另一態樣中，可根據與對照之比較預先設定閾值，以是否具有統計學上顯著差異地高於該閾值來決定候補藥劑之皮膚之障壁機能促進作用。只要為本領域業者，則可根據所要求之促進皮膚障壁機能作用適當設定該閾值。作為上述閾值，例如可相對於未添加藥劑對照之絲胺酸消旋酶之表現量或活性、及/或D-絲胺酸量設定任意倍率之閾值，亦可以例如1.1倍以上具有統計學上顯著差異及傾向差地設定值。所謂統計學上之顯著差異，係指p<0.05之時，所謂傾向差，係指p<0.1之時。又，於另一態樣中，於與藉由作為對照而不含候補藥劑地同樣地進行實驗所測得之消旋酶表現量或活性、及/或D-絲胺酸量相比，具有較高之表現量或活性之情形時，可決定為具有皮膚之障壁機能促進作用，於該情形時，表現量或活性、及/或D-絲胺酸量越高，越可決定為具有皮膚之障壁機能促進作用。

於另一態樣中，本發明亦可關於一種評價、判定、或鑑別皮膚障壁機能之方法，該方法係以絲胺酸消旋酶表現量或活性、及/或D-絲胺酸量為指標。該評價、判定、或鑑別亦可藉由如下方式進行：針對自對象獲取之皮膚樣品、例如藉由膠帶剝離獲取之角質層樣品，測定D-絲胺酸含量、絲胺酸消旋酶活性或絲胺酸消旋酶之表現量。皮膚障壁機能之評價、判定、或鑑別方法通常使用水蒸氣滲透性能測定儀(Vapometer)等藉由TEWL之測定而進行，但TEWL被皮膚之狀態所左右，數值亦會因洗淨或摩擦等而發生變化，進而，對皮膚疾病患者而言，數值與皮膚之健康性之間未必存在關聯。本發明之評價、判定、或鑑別方法藉由以絲胺酸消旋酶活性或表現量、及/或D-絲胺酸量為指標，可測定皮膚本來所具有之細胞等級之皮膚障壁機能。進而，本發明之評價方法由於決定與細胞等級之皮膚障壁機能有關之健康性，因此較之目前之皮膚障壁機能，更可預測將來之皮膚障壁機能。皮膚 障壁機能之評價、判定、或鑑別可使用表示預先設定之絲胺酸消旋酶表現量或活性、及/或D-絲胺酸量與障壁機能促進作用之關係的圖表或閾值而決定。上述圖表或閾值可基於自具有健康之皮膚之被試驗者群、具有粗糙之皮膚之被試驗者群、進而年齡不同之被試驗者群等提取並單離之皮膚樣品中所獲得之表現量或活性、及/或D-絲胺酸量而加以設定。

可知，藉由將D-絲胺酸添加至培養細胞中，而使若干基因之表現增加。可知，其中，對障壁機能形成具有重要作用之絲聚蛋白、及有助於邊緣區(CE)形成之Cornulin及Repetin之表現增加。雖然並未意圖受理論所限定，但可認為，藉由本發明篩選出之絲胺酸消旋酶活化或表現促進劑可增加角質形成細胞中之D-絲胺酸含量，D-絲胺酸促進角質形成細胞中參與障壁機能之蛋白質之表現，藉此促進皮膚障壁機能。因此，D-絲胺酸本身亦可用作皮膚障壁機能促進劑。又，D-絲胺酸亦可稱為絲聚蛋白基因、Cornulin基因、及Repetin基因之表現促進劑，又，亦可稱為角化促進劑。

絲聚蛋白係富含組胺酸、精胺酸、絲胺酸、甘胺酸、麩胺酸等之鹼性之蛋白質，具有沈積於角蛋白纖維而使之凝聚之機能。藉此，藉由角質細胞內部之角蛋白纖維進行凝聚，使細胞整體扁平化，自顆粒層變化為角質層而進行角質化。絲聚蛋白係於表皮之顆粒細胞中以稱為絲聚蛋白原(profilaggrin)之前驅物之形式表現，於顆粒細胞進行角質化時，受到蛋白質分解酶之作用而分解為絲聚蛋白。認為絲聚蛋白之減少為魚鱗癬或異位性皮膚炎之主要發病因素，且於該等症狀中可見皮膚障壁機能之顯著降低。

Cornulin或Repetin為構成支撐角質細胞之細胞膜之邊緣區(cornified cell envelope)之蛋白質。Cornulin或Repetin與作為構成邊緣區之其他成分之包殼蛋白、兜甲蛋白(loricrin)等蛋白質相同，為存在 於1q21之染色體位置之基因，於角化之最終階段，於表皮之最外層中表現。構成邊緣區之蛋白質係藉由絲聚蛋白之作用而進行凝聚之角蛋白，並且與皮膚之障壁機能相關。

藉由本發明之篩選方法，皮膚障壁機能促進劑或絲胺酸消旋酶活化劑可調配於化妝品中，亦可調配於醫藥品中。此種化妝品可於皮膚障壁機能降低之對象、例如具有異位性皮膚炎、魚鱗癬、牛皮癬、肌膚粗糙等症狀之對象中使用。又，於調配於醫藥品中之情形時，醫藥品可用作異位性皮膚炎、魚鱗癬、牛皮癬等之治療用之醫藥組合物。

藉由以下之實施例，更具體地說明本發明。再者，本發明並不限定於此。

[實施例] 實施例1：角質層中D-絲胺酸含量與障壁機能之相關性之驗證

被試驗者為57名被試驗部位健康之志願者，依據慣例將被試驗部位洗淨後擦拭因洗淨而潤濕之被試驗部位，於恆溫、恆濕條件(室溫22℃，濕度45%)下等待30分鐘。其後，藉由Vapometer(Delfin公司)測定經皮水分蒸發量(TEWL)。測定係進行3次，將其平均值用於其後之解析。繼而，使用膠帶將測定了TEWL之位置之角質層剝離2次後，將第2片於95%甲醇水溶液中萃取胺基酸。萃取所得之胺基酸之光學異構物係依據已報告之方法進行分析(參考文獻：Yurika Miyoshi等人，Journal of Chromatography B,877(2009)2506-2512)。將概要示於以下。藉由4-氟-7-硝基-2,1,3-苯并二唑(NBD-F)將萃取所得之胺基酸於硼酸鹽緩衝液(pH值8.0)中進行螢光衍生物化，利用三氟乙酸形成酸性條件，然後供給至二維微型HPLC(High Performance Liquid Chromatography，高效液相層析儀)(資生堂)。第一維使用微型獨塊體ODS(octadecyl silane，十八烷基矽烷)管柱(內徑0.53mm，總 長500、750、1000mm，資生堂)，第二維之光學離析使用適於各胺基酸之內徑1.5mm之光學離析管柱與流動相。NBD-胺基酸係藉由530nm之螢光發光(激發波長470nm)進行檢測。將結果示於表1及圖1。

為了驗證角質層中D-絲胺酸(D-Ser)含量與皮膚之障壁機能之相關性，將各被試驗者以TEWL之值之順序排列，分別比較值較高之17名(障壁機能不佳群)與值較低之17名(障壁機能優異群)之角質層中D-絲胺酸含量。兩群之顯著差異係藉由非配對學生t檢驗(non-paired Student's t-test)驗證。其結果顯示出皮膚之障壁較高之人之D-絲胺酸含量顯著較高。另一方面，根據針對L-絲胺酸之比較結果，可見障壁機能不佳群中L-絲胺酸之含量較低，障壁機能優異群中L-絲胺酸之含量較高之傾向，但無顯著差異。因此，障壁機能優異群中D-絲胺酸含量較高並不取決於作為前驅物質之L-絲胺酸之量，而可認為係消旋酶表現或活性之影響。

實施例2：伴隨角質形成細胞之分化誘導之D-絲胺酸含量之變化

細胞之培養與藥劑處理

將人類正常角質形成細胞以使細胞密度成為2.5×10⁴細胞/孔之方式播種於24孔板，於KGM培養基(Kurabo)中，於37℃、5%CO₂之條件下進行培養。3天後，更換成添加了1.8mM氯化鈣及10mM L-絲胺 酸之KGM培養基(試驗群)或僅添加了10mM L-絲胺酸之KGM培養基(對照群)，進而培養2天。

HPLC用之樣品製備及利用HPLC之游離D-絲胺酸分析

將細胞利用PBS(Phosphate Buffered Solution，磷酸鹽緩衝液)洗淨後，添加5%三氯乙酸水溶液500μL使細胞充分懸浮並進行回收，於冰上進行30分鐘超音波處理後，經由離心分離獲得上清液。相對於該上清液添加20倍量之甲醇而萃取胺基酸。萃取所得之胺基酸之光學異構物係依據已報告之方法進行分析(參考文獻：Yurika Miyoshi等人，Journal of Chromatography B,877(2009)2506-2512)。將概要示於以下。藉由4-氟-7-硝基-2,1,3-苯并二唑(NBD-F)將萃取所得之胺基酸於硼酸鹽緩衝液(pH值8.0)中進行螢光衍生物化，利用三氟乙酸形成酸性條件，然後供給至二維微型HPLC(資生堂)。第一維使用微型獨塊體ODS管柱(內徑0.53mm，總長750mm，資生堂)，第二維之光學離析使用適於各胺基酸之內徑1.5mm之光學離析管柱與流動相。NBD-胺基酸係藉由530nm之螢光發光(激發波長470nm)進行檢測。將試驗群與對照群之結果示於圖2。

實施例3：候補藥劑之篩選

細胞之培養與藥劑處理

將人類正常角質形成細胞以使細胞密度成為2.5×10⁴細胞/孔之方式播種於24孔板，於KGM培養基(Kurabo)中，於37℃、5%CO₂之條件下進行培養。3天後更換成包含1.8mM氯化鈣、10mM L-絲胺酸及候補藥劑之稀釋液之KGM培養基，進而培養2天。使用7種藥劑作為候補藥劑，且使用0.5%水解燕麥蛋白液作為其中之一。

HPLC用之樣品製備及利用HPLC之游離D-絲胺酸分析

將細胞利用PBS洗淨後，添加5%三氯乙酸水溶液500μL使細胞充分懸浮並進行回收，於冰上進行30分鐘超音波處理後，經由離心分離 獲得上清液。相對於該上清液添加20倍量之甲醇而萃取胺基酸。萃取所得之胺基酸之光學異構物係依據已報告之方法進行分析(參考文獻：Yurika Miyoshi等人，Journal of Chromatography B,877(2009)2506-2512)。將概要示於以下。藉由4-氟-7-硝基-2,1,3-苯并二唑(NBD-F)將萃取所得之胺基酸於硼酸鹽緩衝液(pH值8.0)中進行螢光衍生物化，利用三氟乙酸形成酸性條件，然後供給至二維微型HPLC(資生堂)。第一維使用微型獨塊體ODS管柱(內徑0.53mm，總長750mm，資生堂)，第二維之光學離析使用適於各胺基酸之內徑1.5mm之光學離析管柱與流動相。NBD-胺基酸係藉由530nm之螢光發光(激發波長470nm)進行檢測。將該結果示於下述表2及圖3A。

定量性PCR(RT-PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，反轉錄聚合酶鏈反應))

將細胞利用PBS洗淨後，使用MagNA Pure LC(麥格納純液晶)(羅氏醫學儀器(Roche Diagnostics))自細胞萃取mRNA。繼而使用反轉錄酶SuperScriptVILO(Invitrogen)之試劑盒合成cDNA。對該cDNA於鑄模中藉由LightCycler(羅氏醫學儀器)進行使用螢光色素CyberGreen之即時PCR。PCR反應係於95℃、10分鐘之酶活化後，重複30次95℃ 15秒/60℃ 10秒/72℃ 10秒之擴增反應。基因表現量係根據獲得一定量之PCR產物為止之循環數算出相對值。關於RT-PCR，除絲胺酸消旋酶基因以外，作為內部標準亦對G3PDH(甘油醛-3-磷酸酯)基因進行，利用G3PDH之相對表現量修正絲胺酸消旋酶之相對表現量，藉此進行藥劑之評價。關於RT-PCR中使用之引子，選擇使用非專利文獻3及非專利文獻4中所記載者。將該結果示於下述表2及圖3B。

顯示，供至本篩選之候補藥劑之中，水解燕麥蛋白液促進經分化誘導之角質形成細胞中絲胺酸消旋酶之表現。進而，亦顯示，水解燕麥蛋白液使經分化誘導之角質形成細胞中之D-絲胺酸含量增加。根據該等結果，可選擇水解燕麥蛋白液作為對皮膚障壁機能之促進有效之藥劑。

實施例4：候補藥劑之篩選

細胞之培養與藥劑處理

將人類正常角質形成細胞以使細胞密度成為2.5×10⁴細胞/孔之方式播種於24孔板，於KGM培養基(Kurabo)中，於37℃、5%CO₂之條件下進行培養。3天後更換成包含1.8mM氯化鈣、10mM L-絲胺酸及候補藥劑之稀釋液之KGM培養基，進而培養2天。使用12種藥劑作為候補藥劑，於其中含有0.5%香薑萃取物及0.5%柔毛地膽草萃取物。

定量性PCR(RT-PCR)

將細胞利用PBS洗淨後，使用MagNA Pure LC(麥格納純液晶)(羅氏醫學儀器)自細胞萃取mRNA。繼而使用反轉錄酶SuperScriptVILO(Invitrogen)之試劑盒合成cDNA。對該cDNA於鑄模中藉由LightCycler(羅氏醫學儀器)進行使用螢光色素CyberGreen之即時PCR。PCR反應係於95℃、10分鐘之酶活化後，重複30次95℃ 15秒/60℃ 10秒/72℃ 10秒之擴增反應。基因表現量係根據獲得一定量之PCR產物為止之循環數算出相對值。關於RT-PCR，除絲胺酸消旋酶 基因以外，作為內部標準亦對G3PDH(甘油醛-3-磷酸酯)基因進行，利用G3PDH之相對表現量修正絲胺酸消旋酶之相對表現量，藉此進行藥劑之評價。關於RT-PCR中使用之引子，選擇使用非專利文獻3及非專利文獻4中所記載者。將該結果示於下述表3。

顯示，供至本篩選之候補藥劑之中，香薑萃取物及柔毛地膽草萃取物促進於經分化誘導之角質形成細胞中絲胺酸消旋酶之表現。根據該結果，可選擇香薑萃取物及柔毛地膽草萃取物作為對皮膚障壁機能之促進有效之藥劑。

實施例5：候補藥劑之篩選

細胞之培養與藥劑處理

將人類正常角質形成細胞以使細胞密度成為2.5×10⁴細胞/孔之方式播種於24孔板，於KGM培養基(Kurabo)中，於37℃、5%CO₂之條件下進行培養。3天後更換成包含1.8mM氯化鈣之KGM培養基，培養2天後更換成包含1.8mM氯化鈣及作為候補藥劑之磷酸吡哆醛(PLP)之稀釋液之KGM培養基，進而培養2天。

HPLC用之樣品製備及利用HPLC之游離D-絲胺酸分析

將於添加有磷酸吡哆醛之培養基中進行培養之細胞利用PBS洗淨後，添加5%三氯乙酸水溶液500μL使細胞充分懸浮並進行回收，於冰上進行30分鐘超音波處理後，經由離心分離獲得上清液。相對於該 上清液添加20倍量之甲醇而萃取胺基酸。萃取所得之胺基酸之光學異構物係依據已報告之方法進行分析(參考文獻：Yurika Miyoshi等人，Journal of Chromatography B,877(2009)2506-2512)。將概要示於以下。藉由4-氟-7-硝基-2,1,3-苯并二唑(NBD-F)將萃取所得之胺基酸於硼酸鹽緩衝液(pH值8.0)中進行螢光衍生物化，利用三氟乙酸形成酸性條件，然後供給至二維微型HPLC(資生堂)。第一維使用微型獨塊體ODS管柱(內徑0.53mm，總長750mm，資生堂)，第二維之光學離析使用適於各胺基酸之內徑1.5mm之光學離析管柱與流動相。NBD-胺基酸係藉由530nm之螢光發光(激發波長470nm)進行檢測。將關於D-絲胺酸之濃度之結果示於下述圖4。作為絲胺酸消旋酶之輔酶之PLP係可將絲胺酸消旋酶活化之藥劑，經由絲胺酸消旋酶之活化，可促進皮膚障壁機能。

實施例6：D-絲胺酸對皮膚造成之影響

表皮角化細胞之三維培養

將人類正常角質形成細胞播種於直徑12mm、孔徑0.4μm之聚碳酸酯小室(Millipore公司)中，於小室內外添加CnT-Prime,Epithelial Culture Medium(上皮細胞培養基)(CELLnTEC Advanced Cell Systems AG公司)，於37℃、5%CO₂氣氛下培養3天後，置換成Cnt-prime 3D Barrier medium(三維分化培養基)(CELLnTEC Advanced Cell Systems AG)而培養24小時。其後，去除小室內之培養基，於小室外添加以100μM之濃度包含D-Ser之培養基、或作為對照之未添加D-Ser之Cnt-prime 3D Barrier medium，於將細胞表面暴露於空氣之狀態下進行培養。2天進行1次培養基更換而培養7天後，利用切刀切割小室之薄膜，浸漬於Trizol reagent(試劑)(Invitrogen公司)中而對全部RNA(Ribonucleic Acid，核糖核酸)進行萃取。

利用即時(Real-time)PCR法之基因表現解析

對使用Trizol reagent(Invitrogen公司)萃取所得之全部RNA，使用NanoDrop 1000 Spectrophotometer(分光光度計)(Thermo Fisher Scientific公司)對RNA濃度進行測定後，使用SuperScriptVILO(Invitrogen公司)製作cDNA。以該cDNA為鑄模，於StepOne Real-Time PCR System(Applied Bioscience公司)中使用Platinum SYBER Green qPCR SuperMix-UDG(Invitrogen公司)，測定絲聚蛋白(FLG，filaggrin)、Cornulin(CRNN)、Repetin(RPTN，repetin)基因、及作為內部標準基因之線粒體核糖體蛋白質L19(MRPL19)之基因之相對表現量。所使用之引子如下所述：

利用作為內部標準之線粒體核糖體蛋白質L19基因(MRPL19)之表現量進行修正而求出各群之標的基因的相對表現量(圖5~7)。於該等基因中，藉由添加D-Ser，基因表現具有顯著差異地增加。

<110> 資生堂股份有限公司

<120> 以表皮絲胺酸消旋酶及/或D-絲胺酸量為指標之皮膚之 障壁機能促進藥劑之篩選方法及皮膚障壁機能評價方法

<130> P150102TW

<150> TW 103107578

<151> 2014-03-05

<160> 8

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 1

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 2

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 3

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 4

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 5

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 6

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 7

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 8

Claims (10)

1. 一種皮膚之障壁機能促進藥劑之篩選方法，其以角質形成細胞中絲胺酸消旋酶之活性或表現量、及/或D-絲胺酸量為指標。
2. 如請求項1之篩選方法，其包括如下步驟：於角質形成細胞中添加候補藥劑；測定角質形成細胞中絲胺酸消旋酶之活性或表現量、及/或D-絲胺酸量；根據絲胺酸消旋酶表現量或活性、及/或D-絲胺酸量，決定候補藥劑之皮膚之障壁機能促進作用。
3. 如請求項2之篩選方法，其進而包括使角質形成細胞分化誘導之步驟。
4. 如請求項1之篩選方法，其中上述篩選方法係於經分化誘導之角質形成細胞中進行。
5. 如請求項1至4中任一項之篩選方法，其中絲胺酸消旋酶表現量之測定係藉由測定絲胺酸消旋酶之mRNA或蛋白質之量而進行。
6. 如請求項1至4中任一項之篩選方法，其中絲胺酸消旋酶活性之測定係藉由測定利用絲胺酸消旋酶之基質之轉化效率或者測定D-胺基酸產物之量而進行。
7. 一種評價皮膚障壁機能之方法，其係根據自人類皮膚單離之皮膚樣品，以絲胺酸消旋酶活性或表現量及/或D-絲胺酸量為指標。
8. 如請求項7之評價皮膚障壁機能之方法，其包括如下步驟：測定自對象單離之皮膚樣品中絲胺酸消旋酶活性或表現量及/或D-絲胺酸量；根據絲胺酸消旋酶活性或表現量及/或D-絲胺酸量，決定對象 之皮膚之障壁機能。
9. 如請求項7或8之評價皮膚障壁機能之方法，其中絲胺酸消旋酶表現量之測定係藉由測定絲胺酸消旋酶之mRNA或蛋白質之量而進行。
10. 如請求項7或8之評價皮膚障壁機能之方法，其中絲胺酸消旋酶活性之測定係藉由測定利用絲胺酸消旋酶之基質之轉化效率或者測定D-胺基酸產物之量而進行。