CN102458448A - 乳铁蛋白和成人的脑健康和保护 - Google Patents

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Abstract

概括而言，本发明涉及脑健康、脑保护、认知功能的保持，认知功能减退和认知障碍的预防领域。脑中的神经元细胞可以被保护。也可以增强认知能力。

Description

乳铁蛋白和成人的脑健康和保护
概括而言，本发明涉及脑健康、脑保护、认知功能的保持，认知功能减退(cognitive decline)和认知障碍的预防领域。脑中的神经元细胞可以被保护。也可以增强认知能力。
在几乎每一个国家，年龄60岁以上的人群比例的增长都快于任何其他的年龄组，这至少部分是由于更长的预期寿命。因此这种人口老龄化可被视为健康意识的增加以及公共健康事业的有效性和运行的改善的成功的回应。根据WHO目前超过60岁的世界人口有6.5亿。到2050，“老龄化”人口预计将达到20亿。
然而，老龄化增加了出现一些疾病的风险，并且保持老年人群的健康一直是当今社会的一个目标。生活质量的关键-特别是对于老龄化人群-是正常的认知能力及其保持。
多数常见的精神障碍影响认知功能，主要是记忆处理、知觉和问题解决。多数直接的认知障碍是遗忘、痴呆和谵妄。阿尔茨海默病(AD)是最常见的痴呆形式。这种目前不能治愈的、变性的和晚期的疾病被AloisAlzheimer在1906年首次描述。通常阿尔茨海默病在年龄超过65岁的人中被诊断出来，尽管不太普遍的早期发作的阿尔茨海默病可以更早出现。2006年世界范围内预计有2660万人患有阿尔茨海默病；到2050年可能有这个数字的四倍。
一些年龄相关障碍可通过适当的营养而治疗或预防。然而，就认知障碍而言，罕有营养措施已知可以确保预防。因此对可用于保护正常的认知功能的组合物有着巨大的需求。
所以，本发明的目标是改善该领域的状况，具体而言提供可以用于保持认知功能和预防认知功能减退和/或认知障碍的组合物。
本发明人惊奇地发现他们可以通过独立权利要求的主题得以实现该目的。
本发明人已经能够证明，乳铁蛋白、例如补充有乳铁蛋白的组合物可用于实现本发明目的。
乳铁蛋白(LF)也称作乳运铁蛋白(LTF)，它是一种球形多功能蛋白质，已知其显示出抗微生物活性并且是先天防御的一部分(主要是在粘液)。
乳铁蛋白例如可以在乳和乳清以及在多种粘膜分泌物如泪液和唾液中发现。照此，可以例如从乳中纯化出或者可以经重组生产乳铁蛋白。
本发明涉及可获自任何来源的乳铁蛋白。
来自乳或乳清的乳铁蛋白例如具有这样的优点：它是获自食品级组合物的天然成分，因此可以未经进一步纯化用作食品组合物的富含级分。
经重组获得的乳铁蛋白具有这样的优点：可以容易地以高浓度生产它。
人初乳具有相对高浓度的乳铁蛋白，其次是人乳，然后是牛乳。
因此，本发明的一项实施方案是富含乳铁蛋白的可摄入的组合物。
富含指将乳铁蛋白加入到组合物中，从而使所得的组合物的乳铁蛋白含量高于未添加乳铁蛋白的组合物的乳铁蛋白含量，或者指组合物以浓缩组合物中天然乳铁蛋白含量的方式被处理。
乳铁蛋白还可以作为纯化合物被提供。
或者，乳铁蛋白可以作为富含乳铁蛋白的级分、例如富含乳铁蛋白的乳或乳清级分被提供。
作为乳或乳清来源，可以使用例如牛乳、人乳、羊乳、骆驼乳、马乳和/或驴乳。也可以使用初乳。
在治疗应用中，组合物以足以至少部分地治愈或阻止障碍和/或其并发症症状的量被施用。足以达到该目的的量被定义为“治疗有效剂量”。有效用于该目的的量将取决于本领域技术人员已知的众多因素，例如障碍的严重性和患者的体重和总体状态。在预防应用中，本发明的组合物以足以至少部分地减少障碍发生风险的量施用于易患特定障碍或具有患特定障碍的风险的患者。该量被定义为“预防有效剂量”。同样，精确量取决于众多的患者具体因素如患者健康状态和体重。
乳铁蛋白可以在本发明的框架内以治疗有效剂量和/或预防有效剂量被施用。
典型的富含乳铁蛋白的组合物可以包含至少1.6g/L的量的乳铁蛋白。
例如，本发明的组合物可以含有至少0.75％(w/w)、优选至少1％(w/w)浓度的乳铁蛋白。
在一项实施方案中，本发明的组合物意欲以相当于摄入至少0.25g乳铁蛋白、优选至少0.5g乳铁蛋白、更优选至少1g乳铁蛋白/天/kg体重的量施用。
例如，对于妊娠和/或泌乳的母亲而言，组合物可以以相当于摄入至少1g乳铁蛋白/kg体重/天的量被消耗。
对于儿童而言，组合物还可以以相当于摄入至少200mg乳铁蛋白/kg体重/天的量被消耗。
乳铁蛋白可以以至少0.01g/100kcal、优选至少0.1g/100kcal的浓度存在于组合物中。例如，乳铁蛋白可以以约0.01g-100g、优选0.1g-50g、甚至更优选2g-25g/100kcal组合物的范围存在于组合物中。
乳铁蛋白还可以与其它化合物如例如唾液酸和/或铁联合使用。
唾液酸是神经氨酸(一种具有9-碳骨架的单糖)的N-或O-取代的衍生物的上位概念。
任何唾液酸均可用于本发明的目的。但是，如果唾液酸具有下式结构则是优选的：
Figure BDA0000130108050000031
R1＝H、乙酰基、乳酰基、甲基、硫酸酯基(sulfate)、磷酸酯基(phosphate)、脱水唾液酸、岩藻糖、葡萄糖或半乳糖
R2＝N-乙酰基、N-羟乙酰基、氨基、羟基、N-羟乙酰基-O-乙酰基或N-羟乙酰基-O-甲基
R3＝H、半乳糖、N-乙酰基葡糖胺、N-乙酰基半乳糖胺、唾液酸或N-羟乙酰基神经氨酸
R1可以选自H、乙酰基、乳酰基、甲基、硫酸酯基、磷酸酯基、脱水唾液酸、岩藻糖、葡萄糖和/或半乳糖。
R2可以选自N-乙酰基、N-羟乙酰基、氨基、羟基、N-羟乙酰基-O-乙酰基和/或N-羟乙酰基-O-甲基。
R3可以选自H、半乳糖、N-乙酰基葡糖胺、N-乙酰基半乳糖胺、唾液酸和/或N-羟乙酰基神经氨酸。
R1位上的基团可以彼此相同或不同。
例如，唾液酸可以是其中R1＝H、R2＝N-乙酰基和R3＝H的N-乙酰基神经氨酸。根据本发明的另一项实施方案，唾液酸可以选自2-酮基-5-乙酰氨基-3，5-双脱氧-d-甘油-d-半乳糖nonulosonic acid(Neu5Ac)和2-酮基-3-脱氧-d-甘油-d-半乳糖nononic acid(KDN)或其混合物。
如本发明所用的唾液酸包括N-乙酰基神经氨酸，其具有以下同义词和缩写：o-唾液酸；5-乙酰氨基-3，5-双脱氧-D-甘油-D-半乳糖-2-nonulosonicacid；5-乙酰氨基-3，5-双脱氧-D-甘油-D-半乳糖nulosonic acid；醋纽拉酸；N-乙酰基-神经氨酸盐/酯；N-乙酰基神经氨酸；NANA和Neu5Ac。
特别优选的含有乳铁蛋白的组合物可以另外含有唾液酸，所述唾液酸的量为100mg/100g(w/w)至1000mg/100g(w/w)组合物，例如500mg/100g(w/w)至650mg/100g(w/w)组合物。
本发明的组合物可以例如包含至少约0.001重量-％的唾液酸。在本发明的其它实施方案中，组合物可以包含至少约0.005重量-％或至少约0.01重量-％的唾液酸。
或者或另外，含有乳铁蛋白的组合物可以含有铁，所述铁的量为约1mg/100g(w/w)至1g/100g(w/w)组合物，例如100mg/100g(w/w)至300mg/100g(w/w)组合物。
一种含有乳铁蛋白的组合物可以含有例如约580mg/100g(w/w)的唾液酸和22mg/100g(w/w)的铁。
本发明的含有乳铁蛋白的组合物可以具有30kcal/100g至1000kcal/100g组合物、优选50kcal/100g至450kcal/100g组合物的热量密度(caloric density)。它可以例如具有约400kcal/100g的热量密度。
对组合物的性质没有特别限制。优选用于口服或经肠施用的组合物。
组合物可以例如选自食品、动物食品、药物组合物、营养配制物、营养保健品、饮料、食品添加剂和营养配方产品。
在本发明的一项典型实施方案中，组合物含有蛋白质源、脂质源和碳水化合物源。
例如，这类组合物可以包含蛋白质、脂质和/或碳水化合物，所述蛋白质的范围是约1.8-6g/100kcal，所述脂质的范围是约4.4-6.5g/100kcal，所述碳水化合物的范围是约1.7-12g/100kcal。
如果组合物是液体，则其能量密度可以为60至75kcal/100ml。
如果组合物是固体，则其能量密度可以为60至75kcal/100g。
蛋白质的类型不被认为是本发明的关键。因此，例如，可以使用基于乳清、酪蛋白及其混合物的蛋白质源。当涉及乳清蛋白时，可以以所需要的任何比例使用酸乳清(acid whey)或甜乳清或其混合物以及α-乳清蛋白和β-乳球蛋白。乳清蛋白可以是改性的甜乳清。甜乳清是可容易获得的制造乳酪的副产品，其经常用于制备基于牛乳的营养配方产品。但是，甜乳清包含不合需要地富含苏氨酸且色氨酸含量贫瘠的组分，其称为酪蛋白糖巨肽(CGMP)。从甜乳清中除去CGMP得到苏氨酸含量接近于人乳的苏氨酸含量的蛋白质。这种改性的甜乳清然后可以用在其自身中含量低的那些氨基酸(主要是组氨酸和色氨酸)进行补充。
从甜乳清中除去CGMP的方法在EP 880902中有记载，基于这种改性的甜乳清的营养配方产品在WO 01/11990中有记载。蛋白质可以是完整的或水解的或者完整及水解蛋白质的混合物。可以期望提供部分水解的蛋白质(水解度为2-20％)，例如对于据信处于发生牛乳过敏风险的对象而言。如果需要水解蛋白质，则水解方法可以酌情按照本领域已知的那样进行。例如，乳清蛋白水解物可以通过如EP 322589中所述以两步步骤使乳清级分进行酶促水解来制备。就广泛水解的蛋白质而言，可以使用Alcalase 2.4L(EC 940459)、然后使用Neutrase 0.5L(可获自Novo Nordisk Ferment AG)、然后使用胰酶制剂于55℃使乳清蛋白进行三重水解。如果用作原料的乳清级分基本上不含乳糖，则发现蛋白质在水解过程中遭受少得多的赖氨酸阻断。这使得赖氨酸阻断的程度能够从以总赖氨酸的重量计约15％减少至以赖氨酸重量计少于约10％；例如以赖氨酸重量计约7％，这极大地提高了蛋白质源的营养价值。
本发明的组合物可以含有碳水化合物源。可以使用任何的碳水化合物源，例如乳糖、蔗糖、麦芽糖糊精合剂、淀粉及其混合物。
本发明的组合物可以含有脂质源。脂质源可以是任何脂质。优选的脂肪源包括乳脂、棕榈油酸甘油酯(palm olein)、高油酸向日葵油和高油酸红花油。也可加入必需脂肪酸亚油酸和α-亚麻酸，同样可加入少量的包含大量预制的花生四烯酸和二十二碳六烯酸的油，诸如鱼油或微生物油。脂质源优选具有约5∶1至约15∶1、例如约8∶1至约10∶1的n-6与n-3脂肪酸的比例。
本发明的组合物还可以含有被认为是每日膳食中必需的和营养显著量的所有维生素和矿物质。已确定了某些维生素和矿物质的最小需要量。任选存在于组合物中的矿物质、维生素和其它营养物的实例包括维生素A、维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素B12、维生素E、维生素K、维生素C、维生素D、叶酸、肌醇、烟酸、生物素、泛酸、胆碱、钙、磷、碘、铁、镁、铜、锌、锰、氯、钾、钠、硒、铬、钼、牛磺酸和L-肉碱。矿物质通常以盐的形式加入。特定矿物质和其它维生素的存在和量将根据多种因素的不同而改变，例如组合物所被施用的人或动物的年龄、体重和情况。
所述组合物还可以包含至少一种益生菌株。益生菌(probiotic)是对宿主的健康或安康具有有益作用的微生物细胞制备物或微生物细胞组分。适宜的益生菌株包括可以以商标LGG从芬兰的Valio Oy获得的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)ATCC 53103、鼠李糖乳杆菌CGMCC 1.3724、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)CNCM I-2116、可从BioGaia AB获得的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)ATCC 55730和罗伊氏乳杆菌DSM 17938、特别由丹麦的Christian Hansen公司以商标Bb12销售的乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)CNCM I-3446和由日本的Morinaga MilkIndustry Co.Ltd.以商标BB536销售的长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)ATCC BAA-999。如果存在益生菌的话，其量同样优选作为人或动物年龄的函数而改变。
一般而言，益生菌含量可以随着年龄的增加而增加，例如从103至1012cfu/g组合物、更优选104至108cfu/g组合物(干重)。
所述组合物还可以含有0.3-10重量％的量的至少一种益生元(prebiotic)。益生元是一种不可消化的食物成分，其通过选择性地刺激结肠中的一种或有限数目的细菌的生长和/或活性来有益地影响宿主并由此改善宿主健康。这类成分不可消化的含义是：它们在胃或小肠中不被分解和吸收，由此完整地通过结肠，在那里它们被有益细菌选择性地发酵。益生元的实例包括某些低聚糖，例如低聚果糖(FOS)和低聚半乳糖(GOS)。可以使用益生元的组合，例如90％GOS与10％短链低聚果糖，例如以商标销售的产品；或10％菊糖，例如以商标
Figure BDA0000130108050000072
销售的产品。
特别优选的益生元是低聚半乳糖、N-乙酰化低聚糖和唾液酰化低聚糖的混合物，其中N-乙酰化低聚糖占低聚糖混合物的0.5-4.0％，低聚半乳糖占低聚糖混合物的92.0-98.5％，唾液酰化低聚糖占低聚糖混合物的1.0-4.0％。该混合物在下文中称作“CMOS-GOS”。以干物质为基础，用于本发明的组合物优选含有2.5-15.0wt％CMOS-GOS，条件是该组合物包含至少0.02wt％的N-乙酰化低聚糖、至少2.0wt％的低聚半乳糖和至少0.04wt％的唾液酰化低聚糖。
适宜的N-乙酰化低聚糖包括GalNAcα1，3Galβ1，4Glc和Galβ1，6GalNAcα1，3Galβ1，4Glc。N-乙酰化低聚糖可以通过氨基葡糖苷酶和/或氨基半乳糖苷酶对N-乙酰基-葡萄糖和/或N-乙酰基半乳糖的作用来制备。同样，N-乙酰基-半乳糖基转移酶和/或N-乙酰基-糖基转移酶可用于该目的。N-乙酰化的寡糖还可使用相应的酶类(重组体或天然的)通过发酵技术和/或微生物发酵制备。在后者的情况下微生物可表达其天然的酶和底物或可对其进行改造以产生相应的底物和酶。可使用单一微生物培养物和/或混合培养物。N-乙酰化的寡糖的形成能由始于从DP＝1起的任何聚合度(DP)的受体底物开始。另一个选择是将游离或与低聚糖(例如乳果糖)结合的酮基-己糖(例如果糖)化学转化为N-乙酰基己糖胺或含有N-乙酰基己糖胺的低聚糖，如Wrodnigg，T.M.；Stutz，A.E.(1999)Angew.Chem.Int.Ed.38：827-828中所述。
适合的半乳寡糖包括Galβ1，6Gal、Galβ1，6Galβ1，4Glc、Galβ1，6Galβ1，6Glc、Galβ1，3Galβ1，3Glc、Galβ1，3Galβ1，4Glc、Galβ1，6Galβ1，6Galβ1，4Glc、Galβ1，6Galβ1，3Galβ1，4Glc、Galβ1，3Galβ1，6Galβ1，4Glc、Galβ1，3Galβ1，3Galβ1，4Glc、Galβ1，4Galβ1，4Glc和Galβ1，4Galβ1，4Galβ1，4Glc。合成的半乳寡糖诸如Galβ1，6Galβ1，4Glc、Galβ1，6Galβ1，6Glc、Galβ1，3Galβ1，4Glc、Galβ1，6Galβ1，6Galβ1，4Glc、Galβ1，6Galβ1，3Galβ1，4Glc和Galβ1，3Galβ1，6Galβ1，4Glc、Galβ1，4Galβ1，4Glc和Galβ1，4Galβ1，4Galβ1，4Glc及其混合物可以以商标
Figure BDA0000130108050000081
和
Figure BDA0000130108050000082
自商业途径获得。低聚糖的其它供应商有Dextra Laboratories、Sigma-Aldrich Chemie GmbH和Kyowa Hakko Kogyo Co.，Ltd。或者，特异性的糖基转移酶如半乳糖基转移酶可用于生产天然低聚糖。
适宜的唾液酰化低聚糖包括NeuAcα2，3Galβ1，4Glc和NeuAcα2，6Galβ1，4Glc。可以通过色谱或过滤技术从天然来源如动物乳中分离出这些唾液酰化低聚糖。或者，它们还可以通过采用特异性的唾液酸转移酶的生物技术、经由基于酶的发酵技术(重组或天然酶)或经由微生物发酵技术来生产。在后一种情况中，微生物可表达其天然的酶和底物或可对其进行改造以产生相应的底物和酶。可使用单一微生物培养物和/或混合培养物。唾液酸基-寡糖的形成能由始于从DP＝1起的任何聚合度(DP)的受体底物开始。
组合物还可以任选含有其它可具有有益作用的物质如核苷酸、核苷等。
用于本发明的组合物可以以任何适宜的方式来制备。例如，可以通过将蛋白质源、碳水化合物源和脂肪源以适当的比例混合来制备组合物。如果使用乳化剂，可以将其包括在混合物中。在此时可以添加维生素和矿物质，但是它们通常稍后被添加以避免热降解。任何的亲脂性的维生素、乳化剂等可以在混合前被溶于脂肪源中。然后可以混入水、优选已经进行了反渗透的水以形成液体混合物。然后可以将液体混合物进行热处理以减少细菌载量。例如，可以将液体混合物快速加热至约80℃至约110℃温度达约5秒至约5分钟。这可以通过注入蒸汽或热交换器如片式热交换器来进行。然后可以将液体混合物冷却至约60℃至约85℃，例如通过瞬时冷却进行。然后可以将液体混合物进行匀化，例如以两个阶段、在第一阶段以约7MPa至约40MPa和在第二阶段以约2MPa至约14MPa进行。然后可以将匀化混合物进一步冷却以加入任何的热敏感性组分，例如维生素和矿物质。此时方便地使匀化混合物的pH和固体含量合乎标准。将匀化混合物转入适宜的干燥仪器如喷雾干燥器或冷冻干燥器中并转化成粉末。该粉末应具有低于以重量计约5％的含水量。如果期望加入益生菌的话，可以例如按照任何适宜的方法来培养并对于添加入组合物而言通过冷冻干燥或喷雾干燥来制备它们。或者，可以从专业供应商如Christian Hansen和Morinaga获得细菌制备物，它们已经被制备成适于添加入食品的形式。可以通过干混合将该细菌制备物加入到粉末状组合物中。
可以在该方法的任何阶段加入乳铁蛋白，但是优选在加热步骤后加入。
组合物包含蛋白质源，其可以以1.4至100g/100kcal、优选1.4至4.0g/100kcal组合物的范围存在。由于乳铁蛋白是蛋白质，所以它应当被视为是蛋白质源的一部分。
已知乳清蛋白提供了多种健康益处。例如，它易于消化。乳清中的蛋白质级分(在乳清中总干燥固体的约10％)包含数种蛋白质级分，例如β-乳球蛋白、α-乳清蛋白、牛血清清蛋白和免疫球蛋白。在一项实施方案中，以重量计至少50％、优选至少75％、甚至更优选至少85％的蛋白质源是乳清蛋白。
如果存在脂质源，则其可以构成组合物总能量的30至55％。碳水化合物源可以构成组合物总能量的35至65％。
对于本发明的目的重要的是组合物含有乳铁蛋白或在消耗后产生乳铁蛋白的化合物。虽然富含乳铁蛋白可以是优选的，因为通过这种方式可以以较小的体积施用较多的乳铁蛋白，但该组合物并不是必须富含乳铁蛋白。
乳铁蛋白可用于制备任何类型的组合物。然而优选的是，将乳铁蛋白作为按照上文所述那样的组合物被提供。
可以证明施用乳铁蛋白或本发明中描述的组合物能够改善认知功能。
还可以证明施用乳铁蛋白或本发明中描述的组合物可以增加神经元密度和神经元存活。
在施用乳铁蛋白后海马区中的代谢改变表明学习和短时记忆得到改善。
施用乳铁蛋白后皮质中的代谢改变意味着长时记忆得到改善。
乳铁蛋白和本发明中描述的组合物被发现在当施用于成人和/或老年人时特别有效。
如果个体已超过其出生国平均预期寿命的一半、优选如果其已超过其出生国平均预期寿命的三分之二、更优选其已超过其出生国平均预期寿命的四分之三、最优选其超过其出生国平均预期寿命的五分之四时，则该个体被认为是“老人”。
本发明的一项实施方案涉及乳铁蛋白或富含乳铁蛋白的组合物在制备用于治疗或预防认知障碍的组合物中的应用。
本发明人还发现乳铁蛋白或富含乳铁蛋白的组合物可用于治疗或预防神经变性疾病。目前乳铁蛋白被认为促进神经元存活和修复和/或限制神经元氧化应激和细胞死亡。
乳铁蛋白或富含乳铁蛋白的组合物还可以用于保护神经元细胞免于变性。此类变性可发生于例如应激之后。乳铁蛋白被发现促进神经元存活和/或限制或预防神经元死亡。还发现乳铁蛋白和/或本发明组合物可用于逆转神经元细胞损伤和/或神经元细胞变性。因此，本发明不但能够预防或阻止神经元细胞损伤和/或神经元细胞变性和与之相关的障碍，而且还能使此类状况逆转。
因此本发明还涉及乳铁蛋白和/或本发明组合物治疗或预防与神经元细胞损伤和/或神经元细胞变性相关的障碍。
可通过使用本发明而治疗或预防的认知障碍可选自神经变性疾病、认知功能减退、记忆丧失、睡眠障碍、心境障碍、抑郁及其组合。这方面典型的神经变性疾病是阿尔茨海默病、克雅氏病、亨廷顿病、帕金森病及其组合。
本发明组合物还可以用于治疗或预防记忆丧失、特别是短时间记忆丧失和/或长时记忆丧失、学习能力受损、精神行为(mental performance)受损或注意力持续时间降低。
本领域技术人员将理解，他们可以自由地组合本文所述的本发明的所有特征而不背离所公开的本发明的范围。特别是，可将对本发明的用途所述的特征应用于本发明的组合物，反之亦然。
本发明的其它优点和特征从如下实施例和附图中是显而易见的。
图1显示了在基础条件(未经处理的细胞)下和用神经营养因子CNTF(100ng/mL，阳性对照)或不同浓度的富含乳铁蛋白的牛乳级分处理细胞后轴突外生的阳性NS20Y细胞的百分比。数据为平均值±SEM，根据各组n＝3至7(基础，n＝7；CNTF，n＝3；1ug/L，n＝3；10ug/L，n＝7；100ug/L，n＝3；1mg/L，n＝3；10mg/L，n＝5；100mg/L，n＝7；1g/L，n＝6)。采用Student t检验将数据与未经处理的基础组进行比较。当P＜0.05时差异被视为显著。
图2显示了在H2O2攻击和用牛乳乳铁蛋白保护后肠神经元原代培养物释放的神经元特异性烯醇化酶(NSE)，NSE是神经元细胞死亡的标记物。数据为平均值±SEM，n＝8。当P＜0.05时差异被视为显著。
图3显示了在有或无0.001至1g/L的不同浓度的牛乳乳铁蛋白的存在下用H2O2攻击后所培养的SH-SY5Y细胞中7-AAD阳性细胞的百分比。
图4a显示了在P1时正常和IUGR大鼠脑与体重之比。在正常大鼠和甚至更多地在IUGR大鼠中发现脑与体重之比在施用乳铁蛋白后增加。
图4b显示了在P7时正常和IUGR大鼠脑与体重之比。在正常大鼠和甚至更多地在IUGR大鼠中发现脑与体重之比在施用乳铁蛋白后增加。
图5显示了在P7时指示脑活动和发育的数种代谢标记物在正常大鼠、IUGR大鼠和用乳铁蛋白处理的IUGR大鼠的海马区中的存在。海马区活动与学习和短时记忆相关。
图6显示了在P7时指示脑活动和发育的数种代谢标记物在正常大鼠、IUGR大鼠和用乳铁蛋白处理的IUGR大鼠的皮质中的存在。皮质活动与长时记忆相关。
图7显示了DAPI染色后海马区CA2-CA3视野中的核形态。
图8显示了乳铁蛋白补充还增加了脑源性神经营养因子(BDNF)的基因表达。
实施例：
富含乳铁蛋白的牛乳级分的生物活性：其对体外促进神经元细胞存活和轴突外生具有作用。
轴突外生过程包括轴突从神经元向外生长，它是神经元发育的一部分。采用充分建立的和常用的体外生物测定法测定了富含乳铁蛋白的牛乳级分对轴突外生的影响。
简言之，将低温存储NS20Y鼠成神经细胞瘤细胞(DSMZ)解冻，以约27×103个细胞/cm2的密度铺在组织培养物处理的烧瓶(Falcon)中，在含有10％FCS(Gibco)和2mM L-谷氨酰胺(Gibco)的DMEM(Gibco)的存在下扩展。铺板2天后，通过机械搅拌(轻敲烧瓶)从烧瓶中分离出细胞，通过使混悬液数次通过火焰精制的玻璃吸管得到单一细胞混悬液。然后将细胞在含有10％FCS和2mM L-谷氨酰胺的DMEM的存在下、以2,000个细胞/盖玻片的密度铺在13mm圆形玻璃盖玻片上。第二天，将培养基转换成含有0.5％FCS、2mM L-谷氨酰胺和待测试的不同浓度的乳级分的DMEM。一天后，将细胞用4％低聚甲醛固定，将盖玻片固定在载玻片上。
采用Axioplan 2显微镜(Zeiss)对所有盖玻片进行成像。从25个穿过盖玻片直径的确定视野取数字图像(20X物镜，Axiocam MRc，Zeiss)。从处于盖玻片边缘的第一个视野开始穿过盖玻片对细胞系统地进行计数，直到已经计数了100个细胞。针对轴突外生阳性或阴性对细胞进行评分。如果由细胞体发出的类似轴突的突出物达到比细胞体长的长度，则视为轴突外生阳性细胞。
采用Student t检验对比了一个对照参比群体的平均值和各组中来自所有其它处理的平均值的差异。
测试了下列浓度的富含乳铁蛋白的牛乳级分：1μg/L、10μg/L、100μg/L、1mg/L、10mg/L、100mg/L和1g/L。进行了阳性对照(CNTF，睫状神经营养因子，100ng/mL)，它是以前被报道促进不同神经元群体轴突外生的熟知的神经营养因子(Oyesiku NM，Wigston DJ：Ciliary neurotrophic factorstimulates neunte outgrowth from spinal cord neu-rons.J Comp Neurol1996；364：68-77.)。基础对照组由未经处理的细胞组成。结果示于图1中。保护神经元细胞对抗应激
将大鼠肠神经元细胞原代培养物接种入各孔，与不同浓度的富含牛乳铁蛋白的级分一起温育48小时。用磷酸盐缓冲盐水(无菌PBS，37℃)洗涤3次后，将细胞在不含乳铁蛋白且含有H2O2或其媒介物(对照)的细胞培养基中温育12小时。通过测定细胞培养基中神经元特异性烯醇化酶(NSE)的释放评价了乳铁蛋白对H2O2-诱导的神经元细胞死亡的保护作用。在氧化性应激后，收集不同组的培养基，以12,000rpm离心10分钟(4℃)。收集上清液，通过免疫放射分析对培养基中释放的NSE进行定量。结果以ng/mL表示。如图2所示，H2O2诱导培养基中的NSE显著增加(p＜0.05，n＝8)。如图2所示，用富含乳铁蛋白的级分处理原代肠神经元细胞显著阻止了H2O2-诱导的NSE释放(p＜0.05，n＝8)，如图2所示。
采用人神经元样细胞系(SH-SY5Y-成神经细胞瘤细胞)证实了牛乳铁蛋白的神经保护性质。简言之，将SH-SY5Y细胞铺板，经24小时，将富含牛乳铁蛋白的级分以不同浓度加入到培养基中，经随后的48小时。用H2O2处理6小时或将其媒介物(对照)直接加入细胞培养基中。最后用0.1MPBS洗涤细胞，然后用胰蛋白酶-EDTA收获细胞。然后将细胞混悬液与上清液汇集，以2,000rpm离心5分钟。离心后，将沉淀重新混悬于500微升PBS 0.1M中。通过流式细胞仪、采用7-AAD作为荧光标记物评价了膜渗透性。就此而言，将200微升细胞混悬液与7-AAD一起温育10分钟，然后采用BD FACS ArrayTM生物分析仪采集。这种采用7-氨基放线菌素D(7-AAD)的流式细胞分析可以区分活的(7-AAD阴性)和响应于氧化性应激的晚期细胞凋亡/坏死(7-AAD阳性)的SH-SY5Y细胞。图3所示的结果表示为7-AAD阳性细胞/细胞总数的百分比。
如图3所示，H2O2诱导7-AAD阳性细胞百分比显著增加(p＜0.05，n＝6)。用乳铁蛋白处理SH-SY5Y细胞阻止了H2O2诱导的7-AAD阳性细胞百分比增加。
经H2O2处理细胞死亡大大增加，达到约22％。用富含牛乳铁蛋白的级分对细胞进行的预防性处理以剂量依赖的方式限制了细胞死亡(黑色(深色)棒)。富含牛乳铁蛋白的级分自身在测试浓度不显示毒性作用(灰色(浅色)棒)。
乳铁蛋白改善正常和IUGR大鼠的脑/体重之比。
大鼠模型：Wister大鼠
在妊娠第3周期间用地塞米松(DEX)处理母鼠。这种皮质类固醇将在妊娠第3周通过皮下包埋的渗透泵
Figure BDA0000130108050000141
递送；具有含盐水缓冲液的渗透泵的假给药动物将被用作对照。这种设计代表了模拟人种属在围产期期间脆弱情况的幼仔高脆弱模型，它是排除任何其他干扰而证实乳铁蛋白能够增进脑发育的能力的性能模型。乳铁蛋白补充将在1)妊娠和泌乳期间；2)泌乳期间；和3)无补充的情况下进行测试。为了建立允许恰当比较的合乎逻辑的实验设计，相同的补充方案将应用于正常妊娠。
IUGR幼仔：通过在妊娠第3周期间用地塞米松(100μg/kg/天)处理母鼠得到宫内生长迟缓(IUGR)模型。对于妊娠母鼠的营养补充，从妊娠第15天开始到断奶经口服给予乳铁蛋白，食物可随意取食。尽早给新生鼠递送乳铁蛋白，直至它们断奶。
使用以下6组动物：
第1组：正常幼仔；对照母鼠无营养干预(假给药＝含盐水缓冲液的渗透泵)。
第2组：IUGR幼仔；DEX处理的母鼠无营养干预。
第3组：正常幼仔；从开始妊娠到泌乳结束对对照母鼠(假给药)补充bLf(1g/Kg/天)。
第4组：IUGR幼仔；从开始妊娠到泌乳结束对DEX处理的母鼠补充bLf(1g/Kg/天)。
第5组：IUGR幼仔；DEX处理的母鼠无营养干预；从出生后1至21天，除哺乳外，给幼仔滴喂200mg/kg/天模拟酪蛋白的氨基酸混合物(媒介物(与bLf体积相同))。
第6组：IUGR幼仔；DEX处理的母鼠无营养干预；从出生后1至21天，除哺乳外，给幼仔滴喂补充bLf(200mg/Kg/天)。
结果如下并如图4a)和b)中所示。
DEX对照和乳铁蛋白补充DEX的后代在出生时的体重比对照媒介物组约轻20～25％。这显示DEX模型是模拟人种属在围产期期间脆弱情况的有效工具。
因此，该模型是排除任何其他干扰而证明乳铁蛋白能够增进脑发育的能力的性能模型。
DEX对照组和DEX乳铁蛋白补充组的脑重量均比对照媒介物组的脑重量轻。但是，在Lf补充组，脑重量的减少小于体重的减少，因而在出生后第1天，Dex LF处理组的脑与体重之比大于Dex对照组。
令人感兴趣的是，在出生后第21天，Dex Lf组的脑重量赶上了对照媒介物组。
乳铁蛋白增加脑中的代谢
采用LC模型分析，对来自皮质和海马区二者的以下18种代谢物进行定量：丙氨酸(Ala)、天冬氨酸(Asp)、肌酸(Cr)、-氨基丁酸(GABA)、葡萄糖(Glc)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、谷胱甘肽(GSH)、甘油磷酰胆碱(GPC)、磷酰胆碱(PCho)、肌-肌醇(Ins)、乳酸盐(Lac)、N-乙酰天冬氨酸(NAA)、N-乙酰天冬氨酰谷氨酸(NAAG)、磷酸肌酸(PCr)、磷酸乙醇胺(PE)、鲨-肌醇和牛磺酸(Tau)。
目的是采用体内MR技术(在EPFL使用9.4Tesla扫描器)使出生前的不良暴露引起的大脑发育中的变化显像，以及评价早期营养干预对脑发育和代谢的作用，主要是在本发明的啮齿动物模型的生命第一个月期间。对于特定的局部大脑和海马区代谢使用了快速自旋回波(FSE)成像和波谱编辑(spectra edition)1H-MR波谱法。简言之，实行了FSE成像(TR/TE＝6000/80ms；FOV＝25×25mm和矩阵大小＝256×128)以对感兴趣的MRS体素(VOI＝1.5×1.5×2.5mm3)进行定位。采用FASTMAP调整一级和二级补偿[Martin E，2001，Ann Neurol 49：518-521]。水线宽为8至15Hz。采用超短回波时间(TE/TR＝2.7/4000ms)SPECIAL波谱法进行了皮质损伤和对侧皮质区内的波谱获取。该方法将垂直(Y)方向上的1D在体选择图像波谱术(ISIS)与X和Z方向上的层面选择自旋回波(slice selective spin echo)组合，并且提供了在激发区域可获得的全信号强度。获取35至70系列的FIDs(各自12个平均值)，单独地对频率漂移进行校准，合计在一起，并采用参比水信号对残留涡流作用进行校准。
结果如下并如图5和图6中所示。
在出生后7天时，在对照媒介物(n＝5)与对照Dex幼仔(n＝4)之间在磷酸肌酸(PCr)、N-乙酰天冬氨酰谷氨酸(NAAG)、N-乙酰天冬氨酸(NAA)、NAA+NAAG和肌酸(Cr)+磷酸肌酸(PCr)浓度方面具有显著性差异(P＜0.05～0.01)。但是，LF处理Dex幼仔组(n＝6)具有逆转在P7在对照-Dex组中发现的上述代谢性标记物的浓度的趋势，但是在海马区和皮质中差异均未达到统计学显著性。
N-乙酰天冬氨酸(NAA)或N-乙酰天门冬氨酸是天冬氨酸衍生物，其具有C6H9NO5式，分子量为175.139。NAA是位于氨基酸谷氨酸之后在脑中第二富集的分子。NAA在神经元中由氨基酸天冬氨酸和乙酰辅酶A合成。其提出的主要功能包括：
-它是少突神经胶质细胞中脂质和髓磷脂合成的乙酸基来源，少突神经胶质细胞是使神经元轴突生成髓鞘的神经胶质细胞
-它是合成重要的神经元二肽N-乙酰天冬氨酰谷氨酸的前体
-它是在脑的体液平衡中有牵涉的神经元渗透物
-NAA还可能在神经元线粒体中由氨基酸谷氨酸产生能量中有牵涉NAA信号反映了NAA和N-乙酰天冬氨酰谷氨酸(NAAG)的组织浓度。
NAA已经被报道反映了在CNS中存在神经元、少突神经胶质谱系细胞和轴突(Urenjak J，1993，J Neurosci 13：981-989；Martin E，2001，Ann Neurol49：518-521；Bjartmar C，2002，Ann Neurol 51：51-58)。已经启示，NAA(G)可以是神经元细胞中线粒体与细胞质之间的乙酰基载体(Patel TB，1979，Biochem J 184：539-546；Truckenmiller ME，1985，J Neurochem 45：1658-1662)。NAA信号减少通常解释为神经元数量减少，但是它还可以反映出神经元线粒体的功能改变。以前详细描述了作为成熟结果的脑组织中NAA/Cho之比增加，并且在本研究中得以证实(van der Knaap MS，1990，Radiology 176：509-515；Kreis R，2002，Magn Reson Med 48：949-958)。
N-乙酰天冬氨酰谷氨酸(N-乙酰天门冬氨酰谷氨酸或NAAG)是一种神经肽，它是哺乳动物神经系统中第三普遍的神经递质。NAAG由经由肽键偶联的N-乙酰天冬氨酸(NAA)和谷氨酸组成。Curatolo和同事在1965年发现NAAG是神经系统特异性肽(Isaacks RE，1994，Neurochem Res 19：331-338)，但是近20年未进行深入研究。它满足神经递质的标准，包括在神经元中富集、在突触囊泡中装填、以钙依赖性方式释放和通过酶活性在突触间隙中水解。NAAG使特异性受体、即3型代谢型谷氨酸受体活化。它以酶促方式由其两种前体合成，在突触中被NAAG肽酶分解代谢。抑制NAAG肽酶在数种神经病学病症和障碍的动物模型中潜在地具有重要治疗作用。
肌-肌醇是活细胞的关键组成，其参与数种生理功能。它是主要的渗透物，还用作磷脂酰肌醇的前体。肌-肌醇已经被用作神经胶质细胞标记物(Isaacks RE，1994，Neurochem Res 19：331-338)。Lac可用作脑的燃料，而且还可用于合成髓磷脂(Sanchez-Abarca LI，2001，Glia 36：321-329)。
窒息的足月新生儿中N-乙酰天冬氨酸/胆碱(NAA/Cho)之比减小预示了不良的神经发育结果(Groenendaal F，1994，Pediatr Res 35：148-151；Peden CJ，1993，Dev Med Child Neurol 35：502-510；Roelants-van Rijn AM，2001，Pediatr Res 49：356-362)。在星形胶质细胞中可以发现作为脑渗透调节物之一的肌-肌醇(mI)，它被视为神经胶质细胞标记物(Isaacks RE，1994，Neurochem Res 19：331-338)。
乳铁蛋白改善神经元密度和神经元存活。它还能保护神经元免于细胞死亡。
在MR获取后进行形态学检查。收集在纹状体、背海马和侧海马水平上的连续切片以评价皮质和海马区结构和白质损伤。采用免疫组织化学标记特异性的细胞类型，目的是确定特异性的细胞响应。对神经元(NeuN)、星形胶质细胞(GFAP)和放射状神经胶质(Nestin)以及白质髓鞘形成的标记物(MBP)进行特异性标记。简要方法如下：
分别在P7和P21时，用氯胺酮使各组的幼仔深度麻醉(50mg/ml；0.2-0.5ml，i.p.)。给动物经贲门内灌注0.9％NaCl，然后灌注4％低聚甲醛。取出脑，称重，在4％低聚甲醛中后固定过夜，然后在30％蔗糖中后固定最少24小时，于-80℃贮存至切片。在低温恒温器(Microm Cryo-Star HM560M，Microm International，德国)上切下在背海马区水平上的冠状切片(10μm)。从每只动物中采集200μm间隔的3个切片。
免疫组织化学：采用抗生物素蛋白-生物素过氧化物酶复合物(ABC；Vector Laboratories，Burlingame，CA，USA)对脑组织进行处理用于MBP(1∶400Brand City Country)的免疫反应性。将切片在4％牛血清清蛋白(BSA Brand City Country)中封闭，然后与初级抗体一起于4℃温育24小时，此后将它们与二级抗体(1∶200Brand City Country)一起温育，然后与抗生物素蛋白-生物素复合物(1∶200，Vector Laboratories，Burlingame，CA，USA)一起温育。使切片与发色团3，3-二氨基联苯胺(DAB Brand CityCountry)在0.01％过氧化氢中反应，然后覆盖盖玻片。
相同方案用于Nestin(1∶500Brand City Country)、GFAP(1∶400 BrandCity Country)和NeuN(1∶200 Brand City Country)的荧光免疫组织化学，不同的是切片不在抗生物素蛋白-生物素复合物和DAB中温育。
同时对各实验组及其相应的对照组进行染色。当省略初级抗体处理时，染色不能发生。
采用
Figure BDA0000130108050000181
成像系统(Meta Imaging Software，MolecularDevices Corporation，宾夕法尼亚，U.S.A)进行定量分析。汇集每只动物的值，计算每组的平均值±SEM的平均值。在用不公开的代码对针对观察者设盲的编码载玻片上进行了测定，直到得出分析结论。
结果如下并如图7所示。
组织学分析揭示：在P7时，LF补充Dex幼仔(n＝5)与Dex对照幼仔相比显著增加了海马区CA2-CA3视野中的核形态和神经元密度。在P7时皮质中的神经元密度减小表明了神经元损失。神经元密度与正常对照媒介物组相似(图7)，这表明施用乳铁蛋白可以逆转神经细胞消亡。
乳铁蛋白补充还增加了在出生后第7天的脑源性神经营养因子(BDNF)的基因表达(图8)。
BDNF是促进周围神经系统和中枢神经系统(CNS)中神经元分化、存活和可塑性的神经营养因子。在CNS中，BDNF引起长时程增强，后者与突触可塑性相关。BDNF促进神经发生。谷氨酸还刺激BDNF的产生(在MRS中显示通过bLF而增加)。
BDNF是牵涉于多个神经元发育方面和成熟神经元的关键分子。具体而言，BDNF促进轴突外生和增加突触蛋白质的表达，它们是发育过程中建立突触连接或功能所需的。这些发现证实了膳食乳铁蛋白促进神经发育并提供神经保护。
因此膳食乳铁蛋白会影响海马区(极易因营养不良而受损的区域)的神经元密度和与应激相关的脑异常，这意味着LF施用促进神经元产生并增加神经元存活和神经元保护。

Claims (15)

1.可摄入的组合物，其包含浓度为至少0.1g/100kcal组合物的乳铁蛋白。
2.依据权利要求1组合物，其中组合物选自食品、动物食品、药物组合物、营养配制物、营养保健品、饮料、食品添加剂、营养配方产品。
3.依据前述权利要求中任意一项的组合物，其中乳铁蛋白作为富含乳铁蛋白的乳或乳清级分被提供。
4.依据前述权利要求中任意一项的组合物，其包含蛋白质源、脂质源和碳水化合物源。
5.依据前述权利要求中任意一项的组合物，其中蛋白质源以4至6.0g/100卡路里组合物的量存在。
6.依据前述权利要求中任意一项的组合物，其中以重量计50％以上的蛋白质源是乳清蛋白。
7.依据前述权利要求中任意一项的组合物，其中脂质源构成组合物总能量的30至55％和/或碳水化合物源构成组合物总能量的35至65％。
8.依据前述权利要求中任意一项的组合物，其中乳铁蛋白以约0.01g-100g、优选0.1g-50g、甚至更优选2g-25g/100kcal的浓度存在。
9.依据前述权利要求中任意一项的组合物，还包含至少约70mg/L的总唾液酸、以总脂肪酸重量计至少约0.1％的ω-3脂肪酸和/或以总脂肪酸重量计至少约0.25％ω-6脂肪酸。
10.依据前述权利要求中任意一项的组合物，其中组合物以相当于摄入至少0.01g乳铁蛋白/kg体重/天的量施用。
11.用于治疗或预防认知障碍的乳铁蛋白或依据前述权利要求中任意一项的组合物。
12.用于修复神经元细胞损伤和/或提升神经元细胞的寿命的乳铁蛋白或依据前述权利要求中任意一项的组合物。
13.用于应用的依据权利要求11的乳铁蛋白或组合物，其中认知障碍选自神经变性疾病、认知功能减退、记忆丧失、睡眠障碍、心境障碍和/或抑郁及其组合。
14.用于应用的依据权利要求13的乳铁蛋白或组合物，其中神经变性疾病选自阿尔茨海默病、克雅氏病、亨廷顿病、帕金森病及其组合。
15.施用于成人或老人的依据前述权利要求中任意一项的乳铁蛋白或组合物。
CN2010800312944A 2009-05-12 2010-05-07 乳铁蛋白和成人的脑健康和保护 Pending CN102458448A (zh)

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