CN102458398A - 癌症治疗中作为放射增敏剂的吡咯烷取代的黄酮 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于治疗癌症的联合物，其中，该联合物显示出协同效应。所述联合物包括放射线和至少一种细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂，后者选自于化学式I的化合物或者其药学上可接受的盐或溶剂化物。本发明也涉及一种治疗癌症的方法，该方法包括向需要其治疗的受试对象施用有效治疗剂量的该联合物。本发明还涉及一种选自于化学式I的化合物并作为放射增敏剂的CDK抑制剂的应用，该CDK抑制剂大大提高了放射疗法治疗癌症的疗效，尤其是头颈癌。

Description

癌症治疗中作为放射增敏剂的吡咯烷取代的黄酮
技术领域
本发明涉及一种用于癌症治疗的联合物(combination)，其中，该联合物显示出协同效应。该联合物包括放射线(radiation)和至少一种细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂，后者选自于化学式I(如文中所述)的化合物或者其药学上可接受的盐或溶剂化物。本发明还涉及一种治疗癌症的方法，尤其是头颈癌的治疗方法，该方法包括向需要其治疗的患者施用该联合物的有效治疗剂量。本发明还涉及一种选自于化学式I的化合物的CDK抑制剂作为放射增敏剂的应用，大大提高了放射线在癌症治疗(尤其是头颈癌)中的疗效。
背景技术
大多数在癌症治疗中有用的放射增敏剂已经由经验试验或临床观察得以确定，但对这些制剂相互作用的分子机制还不是很清楚。提高放射疗效的工作是基于对辐射效应和抗性机制的利用。存在六种通用机制，具体如下：缺氧敏感化(hypoxic sensitization)、DNA损伤加剧、DNA修复降低、因DNA损伤导致凋亡性细胞死亡增加、对肿瘤血管的影响以及细胞周期的影响(Nature ClinicalPractice Oncology，2007，4(5)，282-294)。几十年来，研究都集中在将肿瘤缺氧问题作为产生抗辐射性的原因(British Journal of Cancer，2000，83(3)，354-359)。缺氧细胞对体外辐射和体内辐射都有抗性。早期的实验表明在施用放射线时，DNA损伤需要适量的氧气；但存在氧气的阈值(比如，在正常组织中)，给予更多的氧气不会进一步提高放射效果。氧气对自由基介导放射线诱导的DNA损伤是必要的。研究人员认为抗缺氧细胞群可能是治疗失败的主要原因，可以通过提高氧输送或给药(其作用像分子氧)来克服该问题。优先杀死缺氧肿瘤细胞的药物，比如丝裂霉素和替拉扎明(tirapazamine)，显示出具有潜在效果并正在研究中。
尽管缺氧现象很重要，致力于肿瘤缺氧的工作还从未成功。失败的几个潜在原因包括：制剂的毒性，限制了制剂的剂量；在分次施用放射线的过程中发生缺氧的自调节，使常氧(normoxic)细胞在氧气达到原来缺氧细胞的水平才发生死亡；缺氧介导的抗性基因上调；以及，事实证明缺氧的存在是抗性肿瘤的标志，而不是其具有侵袭力(aggressiveness)的原因(Nature Clinical PracticeOncology，2007，4(5)，282-294)。
克服缺氧的成功例子有限，从而导致研究其它方法以提高放射疗效。对抗肿瘤缺氧研究最多且临床最成功的方法是肿瘤化疗用药与放射线联合进行。使用该联合物产生了改进的效果，其机制包括：杀死细胞的简单独立累加效应；将细胞阻滞在细胞周期中的放射敏感部分(比如G2-M)；靶定抗性细胞群，比如缺氧细胞或者处于细胞周期中抗性部分的细胞；以及，增加放射线诱导的DNA损伤或阻止损伤DNA的修复。此外，肿瘤在施用放射线的时候发生增殖，其增长率可以抵消放射线大部分的细胞毒素影响。该增殖称为加速再群体化，是增加的营养和血液供应给存活细胞或剩余的抗放射性细胞的的结果。该增殖反应可以通过使用除放射线以外的细胞毒性剂来克服。化学疗法与放射疗法联合使用，以优化癌症治疗中放射疗法的治疗指数。研究人员希望开发出增加癌症放射疗法疗效的放射增敏剂，这样治疗方法可具有较低的放射线剂量、潜在的靶向专一性和临床上可接受的毒性。
PCT专利公开号WO2004004632(对应于美国专利7,272,193)，PCT专利公开号WO2007148158描述了吡咯烷取代的黄酮作为CDK抑制剂应用于不同类型癌症的治疗。CDK抑制剂的毒性较小，因此有利于评估CDK抑制剂提高人类肿瘤放射敏感度的效果及其可能机制。这对于癌症通过放射线治疗是很有利的。
发明内容
本发明的一方面涉及一种联合物，该联合物包括放射线和CDK抑制剂，其中，该CDK抑制剂选自于化学式I(如文中所述)的化合物或者其药学上可接受的盐或溶剂化物；其中该联合物在癌症治疗中显示出协同效应。
本发明的另一方面涉及一种联合物，该联合物包括放射线和CDK抑制剂，其中，该CDK抑制剂选自于化学式I的化合物或者其药学上可接受的盐或溶剂化物；同时或顺序地施用该放射线和该CDK抑制剂，以治疗癌症。
本发明的进一步方面涉及一种该联合物的应用，该联合物包括放射线和CDK抑制剂，该CDK抑制剂选自于化学式I(如文中所述)的化合物或者其药学上可接受的盐或溶剂化物，该联合物用于治疗癌症。
本发明的另一方面涉及一种治疗癌症的方法，该方法包括向需要其治疗的受试对象联合施用有效治疗剂量的放射线和有效治疗剂量的CDK抑制剂，该CDK抑制剂选自于化学式I的化合物或者其药学上可接受的盐或溶剂化物。
本发明的又一方面涉及一种作为放射增敏剂的CDK抑制剂的应用，该CDK抑制剂选自于化学式I的化合物，以提高放射疗法治疗癌症的疗效。
在随后的详细说明中，本发明实用性的其他方面和进一步范围会变的很明显。
附图说明
图1示出了1μM化合物A(处理48小时)对FaDu细胞系(3500细胞/板)的放射性反应的影响；
图2示出了1μM化合物A(处理96小时)对FaDu细胞系(3500细胞/板)的放射性反应的影响；
图3示出了1μM化合物A(处理72小时)对FaDu细胞系(1500细胞/板)的放射性反应的影响；
图4示出了1μM化合物A(处理96小时)对FaDu细胞系(1500细胞/板)的放射性反应的影响；
图5示出了经过施用放射线、化合物A、联合物和对照物一段时间后的组平均体重；
图6示出了经过施用放射线、化合物A、联合物和对照物一段时间后头颈癌(FaDu)移植瘤的平均％肿瘤重量。
具体实施方式
本发明涉及一种联合物，该联合物包括放射线和CDK抑制剂，后者选自于化学式I(如文中所述)的化合物或者其药学上可接受的盐或溶剂化物。该联合物在治疗癌症(尤其是头颈癌)时，显示出协同效应。
下列化学式I所示的CDK抑制剂公开于PCT专利公开号WO2004004632(对应于美国专利7,272,193)和PCT专利公开号WO2007148158，其以援引的方式并入本文中。化学式I的化合物是CDK抑制剂，能够抑制多种癌细胞的增殖。如本发明所用的化学式I的化合物可以有效对抗各种实体的恶性肿瘤和血液系统的恶性肿瘤。本发明的发明人观察到化学式I的CDK抑制剂和放射线联合使用可以增加细胞凋亡或者程序性细胞死亡。
上下文中所用的一般术语优选在本发明中具有以下含义(除非另作说明)：
单数形式“一种(a、an)”和“这种(the)”包括复数形式，除非文中有另外明确说明。
如本文所用，术语“协同的”意思是用本发明的方法和联合物所得到的效果好于相同剂量下单独使用放射线和化学式I的CDK抑制剂或其药学上可接受的盐或溶剂化物得到的效果总和。有利地，这样的协同效应在同样剂量下具有更大疗效，和/或防止或延迟多重耐药性的累积。
如本文所用，术语“有效治疗剂量”指的是放射线或者化学式I的CDK抑制剂的用量，其在对非增殖细胞具有最小毒性的同时使增殖细胞具有最大细胞凋亡量。
如本文所用，术语“治疗的协同效应”指的是在放射线和化学式I的CDK抑制剂的可耐受联合治疗方案下得到的治疗效果，该治疗效果超过了单独使用任何可耐受剂量的放射线或者CDK抑制剂的单一疗法所得到的最佳效果。
术语“细胞凋亡”指的是一种细胞死亡类型，经过细胞中一系列分子步骤导致细胞死亡。这是身体摆脱不需要的细胞或异常细胞的的正常方式。细胞凋亡过程在癌细胞中可能被阻断。细胞凋亡也被称为程序性细胞死亡。如本文所用，术语“细胞凋亡增加”被认为是程序性细胞死亡速率的增加，即，与单独暴露于(接触)放射线或者CDK抑制剂相比，更多的细胞被诱导进入死亡过程。
如本文所用，术语“受试对象(subject)”指的是治疗、观察或实验的对象是动物，优选为哺乳动物，最优选为人。
头颈癌指的是生物学上一组同类癌症，源于上呼吸道-消化道(upper aerodigestive tract)，包括唇、口腔、鼻腔、鼻窦、咽和喉。头颈鳞状细胞癌(HNSCC′s)占头颈癌的绝大部分，且源于该解剖部位的粘膜表面，包括鼻腔、鼻窦、口腔、鼻咽、口咽、下咽和喉头的肿瘤。
通过其起始部位对头颈癌进行识别：
1、口腔：口腔的鳞状细胞癌是普遍的，包括内唇、舌、口底、牙龈和硬腭；
2、鼻咽：鼻咽癌起源于鼻咽，在该部位，鼻腔和咽鼓管与咽喉的上部相连；
3、口咽：口咽癌始于口咽、喉的中部，包括软腭、舌根和扁桃体；与头颈其它部位的癌症相比，扁桃体的鳞状细胞癌与人类乳头状瘤病毒感染有更强的关系；
4、下咽：下咽包括梨状窦、后咽壁和环状软骨后区(postcricoid area)；下咽肿瘤经常在晚期才诊断出来，并且是喉头肿瘤最不利的情况；因为喉周围大量的淋巴网络，使这些肿瘤易于发生早期转移；
5、喉头：喉癌始于喉头；癌症可能发生于声带自身(“声门”喉癌)，或者发生在真声带(true cord)以上和以下的组织(分别为“声门上”喉癌和“声门下”喉癌)；
6、气管：气管癌是罕见的恶性肿瘤，其在生物学上有很多方面与头颈癌类似，有时被分类为头颈癌。
HNSCC′s患者的治疗方式取决于疾病的部位和发展阶段，以及患者整体的健康状况。手术切除和放射治疗是治疗大部分头颈癌的主要方法，并且在大部分情况下维持标准治疗。对于晚期的头颈癌患者由于无法实施切除和/或不能进行局部手术而只能施用放射疗法，且得到的结果是不令人满意的，因此正在对同时施用化学疗法-放射疗法进行研究。
本发明所用的CDK抑制剂选自由以下化学式I所示的化合物：
Figure BDA0000123347850000061
其中，Ar是苯基，其未被取代或者被1个、2个或3个相同或者不同的取代基取代；该取代基选自：如氯、溴、氟或碘的卤素，硝基，氰基，C1-C4-烷基，三氟甲基，羟基，C1-C4-烷氧基，羧基，C1-C4-烷氧羰基，CONH2和NR1R2；
其中，R1和R2分别独立地选自于氢或C1-C4-烷基。
在一个实施例中，CDK抑制剂是化学式I的化合物的(+)-反式异构体，如下面的化学式IA所示。
Figure BDA0000123347850000062
其中，Ar是苯基，其未被取代或者被1个、2个或3个相同或者不同的取代基取代；该取代基选自：如氯、溴、氟或碘的卤素，硝基，氰基，C1-C4-烷基，三氟甲基，羟基，C1-C4-烷氧基，羧基，C1-C4-烷氧羰基，CONH2和NR1R2；
其中，R1和R2分别独立地选自于氢或C1-C4-烷基。
按照PCT专利公开号WO2004004632和PCT专利公开号WO2007148158所公开的方法可以制备化学式I的化合物，其以援引的方式并入本文。如以下方案I所述的方法可以用于制备化学式(VIA)的中间体。
Figure BDA0000123347850000071
US4900727中描述了由化学式II的化合物开始至化学式V的化合物的制备步骤，其以援引的方式并入本文。1-甲基-4-哌啶酮(化学式III的化合物)与溶于冰醋酸的1，3，5-三甲氧基苯(化学式II的化合物)的溶液反应，产生1-甲基-4-(2，4，6-三甲氧基苯)-1，2，3，6-四氢吡啶(化学式IV的化合物)。化学式IV的化合物与三氟化硼乙醚络合物(boron trifluoride diethyl etherate)、硼氢化钠和四氢呋喃反应得到化学式V的化合物。在上述方案中，化学式V的化合物转化为化学式VIA的化合物时：在氧亲核试剂(比如三乙胺、吡啶、碳酸钾或者碳酸钠)的存在下，通过用适当的试剂(比如对甲苯磺酰氯、甲烷磺酰氯、三氟甲磺酸酐或者五氯化磷)处理，随后在溶于酒精溶剂(比如异丙醇、乙醇或者丙醇)的氧亲核试剂(比如溶有醋酸钠或者醋酸钾)的存在下进行缩环反应(ringcontraction)，使哌啶环上的羟基可以转化为离去基团，比如甲苯磺酰基、甲磺酰基、三氟甲基磺酸盐或者卤化物。本步骤所包含的缩环反应可以在黄酮形成之前进行，如以上方案所述，或者也可以在形成具有所需取代物的黄酮之后完成。
如本文定义的化学式VIA的中间化合物的光学纯(-)-反式对映异构体用于制备化学式I的光学纯化合物。在该过程中，使用具有高光学纯度的中间体作为起始化合物，生成的化学式I所示的吡咯烷取代的黄酮(+)-反式对映异构体具有相对高的光学纯度。
用溶解的化学式VIA的中间化合物的光学纯(-)-反式对映异构体，制备化学式I的化合物的光学纯(+)-反式对映异构体或者其药学上可接受的盐的过程包括以下步骤：
(a)在路易斯(Lewis)酸催化剂存在的条件下，用乙酸酐处理溶解的化学式VIA的中间化合物的光学纯(-)-反式对映异构体，得到溶解的化学式VIIA的乙酰化化合物；
Figure BDA0000123347850000081
(b)在碱和溶剂的存在下，使溶解的化学式VIIA的乙酰化化合物与化学式为ArCOOH的酸、或者化学式为ArCOCl的酰氯(acid chloride)、或者化学式为(ArCO)2O的酸酐、或者化学式为ArCOOCH3的酯发生反应，得到溶解的化学式VIIIA的化合物，其中，Ar如上所述；
Figure BDA0000123347850000091
(c)在适当的溶剂中，用碱处理溶解的化学式VIIIA的化合物，得到相应的溶解的化学式IXA的β-二酮化合物，其中，Ar如上所述；
Figure BDA0000123347850000092
(d)用酸(如盐酸)处理溶解的化学式IXA的β-二酮化合物，得到相应的化学式XA的环状化合物；
(e)加热化学式XA的化合物和脱烷基试剂至温度范围为120℃-180℃，发生化学式XA的化合物脱烷基反应，得到化学式I化合物的(+)-反式对映异构体，可选地，将目标化合物转化为药学上可接受的盐。
上述步骤(a)中所使用的Lewis酸催化剂可以选自：三氟化硼(BF3)、乙醚(Et2O)、氯化锌、氯化铝和氯化钛。
过程中步骤(b)所使用的碱可以选自：三乙胺、嘧啶和DCC-DMAP组合物(N，N’-二环己基碳化二亚胺和4-二甲氨基吡啶的组合物)。
本领域的技术人员可知，化学式VIIIA的化合物重排为相应的化学式IXA的β-二酮化合物是已知的贝克-文卡塔拉曼(Baker-Venkataraman)重排(J.Chem.Soc.，1381(1933)and Curr.Sci.，4，214(1933))。
过程中步骤(c)所使用的碱可以选自：六甲基二硅基胺基锂、六甲基二硅基胺基钠、六甲基二硅基胺基钾、氢化钠和氢化钾。优选的碱是六甲基二硅基胺基锂。
过程中步骤(e)化学式IXA化合物发生脱烷基反应所使用的脱烷基试剂可以选自：吡啶盐酸盐、三溴化硼、三氟化硼乙醚络合物和三氯化铝。优选的脱烷基试剂是吡啶盐酸盐。
在一个实施例中，CDK抑制剂是化学式I的化合物，其中，苯基被1个、2个或3个相同或者不同的取代基取代，该取代基选自：选自氯、溴、氟或碘的卤素、C1-C4-烷基或三氟甲基。
在另一实施例中，CDK抑制剂是化学式I的化合物，其中，苯基被1个、2个或3个卤素取代，卤素选自：氯、溴、氟或碘。
在另一实施例中，CDK抑制剂是化学式I的化合物，其中，苯基被氯取代。
制备化学式I的化合物(其中该化合物可以是药学上可接受的盐或溶剂化物的形式)，和制备含有以上化合物的口服和/或肠外药物组合物的方法在PCT专利公开号WO2004004632和PCT专利公开号WO2007148158的专利中公开。这些PCT专利公布文本公开了化学式I所示的CDK抑制剂可以抑制多种癌细胞的增殖。如本文所述，化学式I的CDK抑制剂可以以其盐或者溶剂化物的形式使用。优选的化学式I的化合物的盐包括盐酸盐、甲磺酸盐和三氟醋酸盐。
化学式I的化合物含有至少两个手性中心，因此以两种不同的光学异构体(即(+)或(-)对映异构体)的形式存在。所有含有外消旋混合物的所述对映异构体及其混合物都包含在本发明的保护范围中。可以通过PCT专利公开号WO2004004632、WO2008007169和WO2007148158公开的方法得到化学式I的化合物的对映异构体(如上所述)，或者化学式I的化合物的对映异构体也可以通过本领域已经熟知的方法来得到，比如手性高效液相色谱法(HPLC)和酶法拆分。可选地，化学式I的化合物的对映异构体可以通过使用光学活性原料合成得到。因此，化学式I的CDK抑制剂的定义是包括所有可能的立体异构体及其混合物。化学式I的定义包括外消旋形式和具有特定活性的独立的光学异构体。
本发明的联合物中使用的放射线是γ-射线。在一个实施例中，γ-射线的辐射源为钴-60、铱-192或者铯-137。在优选实施例中，γ-射线的辐射源为钴60。
在一个实施例中，γ-射线可容许的剂量范围是1戈瑞(Gy)/天至25Gy/天。
在一个实施例中，联合物包括放射线和CDK抑制剂；其中，该CDK抑制剂由化学式I表示，或者是其药学上可接受的盐或溶剂化物。
在另一实施例中，该联合物包括放射线和CDK抑制剂；其中，该CDK抑制剂是化学式I的化合物的(+)-反式异构体(如化学式IA所示)，或者是其药学上可接受的盐或溶剂化物。
在又一实施例中，该联合物包括放射线和CDK抑制剂；其中，该CDK抑制剂是(+)-反式-2-(2-氯苯基)-5，7-二羟基-8-(2-羟甲基-1-甲基吡咯烷-3-基)-苯并吡喃-4-酮，或者其药学上可接受的盐。
在一个实施例中，包括放射线和化学式I的CDK抑制剂的该联合物通过单独施用，或同时、顺序或者间隔一段时间施用，以便获得该联合物的最大疗效。
为了达到本发明的目的，选自于化学式I的化合物的CDK抑制剂可以(比如)先于放射线、后于放射线或者与放射线同时施用。在本发明的优选实施例中，放射线先于化学式I的CDK抑制剂或其药学上可接受的盐或者溶剂化物施用，且该放射线的剂量范围描述如下。然而，在一定的条件下，可由本领域的技术人员通过以下常规技术和本说明书所含的信息，适当选择最佳方法以及放射线和CDK抑制剂的施用顺序。
在一个实施例中，化学式I的CDK抑制剂可以通过口服或者是肠外给药，以产生并维持其最佳的血药浓度。
对于口服使用，化学式I的CDK抑制剂可以以(比如)片剂或胶囊、粉剂、粒剂、或扁囊剂、或者作为水溶液或悬浮液的形式服用。对于口服的片剂来说，常用的载体包括乳糖、玉米淀粉、碳酸镁、滑石粉、糖以及润滑剂(比如通常加入硬脂酸镁)。对于口服的胶囊形式，有用的载体包括乳糖、玉米淀粉、碳酸镁、滑石粉和糖。
在肌肉内、腹膜内、皮下和静脉内给药时，通常使用CDK抑制剂的无菌溶液，且应该适当地调整溶液的pH值并加入缓冲液进行缓冲。
在一个实施例中，本发明联合物治疗的癌症选自由头颈癌、宫颈癌、乳腺癌、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌和肺腺癌)、卵巢癌、胰腺癌(包括外分泌胰腺癌)、胃癌、结肠直肠癌、肝细胞癌、多发性骨髓癌、细胞淋巴癌和恶性黑色素瘤组成的组中。
在优选实施例中，本发明的联合物用于治疗头颈癌。
在一个实施例中，本发明的联合物显示出治疗的协同效应。
在另一实施例中，本发明涉及一种治疗癌症的方法，该方法包括向需要这样治疗的受试对象施用该联合物能够有效治疗癌症的剂量。因此，在本发明的方法中，治疗受试对象的癌症是通过给该受试对象联合施用有效治疗癌症剂量的放射线和有效治疗剂量的CDK抑制剂，该方法产生协同效应；其中，该CDK抑制剂选自化学式I的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物。
在一个实施例中，本发明涉及一种治疗癌症的方法，该方法包括向需要这样治疗的受试对象联合施用有效治疗癌症剂量的放射线和有效治疗剂量的CDK抑制剂，该方法产生协同效应；其中，该CDK抑制剂选自化学式I(如化学式IA所示)的化合物的(+)-反式对映异构体或其药学上可接受的盐或溶剂化物。
在另一实施例中，本发明涉及一种治疗癌症的方法，该方法包括向需要这样治疗的受试对象联合施用有效治疗癌症剂量的放射线和有效治疗剂量的CDK抑制剂；其中，该CDK抑制剂是(+)-反式-2-(2-氯苯基)-5，7-二羟基-8-(2-羟甲基-1-甲基吡咯烷-3-基)-苯并吡喃-4-酮或者是其药学上可接受的盐。在一个实施例中，本发明提供了一种治疗头颈癌、宫颈癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、结肠直肠癌、肝细胞癌、多发性骨髓癌、细胞淋巴癌和恶性黑色素瘤的方法，该方法包括向需要这样治疗的受试对象联合施用有效治疗癌症剂量的放射线和有效治疗剂量的CDK抑制剂。
在另一实施例中，本发明提供了一种治疗头颈癌的方法，该方法包括向需要这样治疗的受试对象联合施用有效治疗癌症剂量的放射线和有效治疗剂量的CDK抑制剂。
如在此之前所示，放射线和CDK抑制剂可以同时或者顺序施用。
在一个实施例中，该治疗癌症的方法包括：向需要这样治疗的受试对象同时施用治疗剂量的放射线和治疗剂量的CDK抑制剂。
在另一实施例中，该治疗癌症的方法包括：向需要这样治疗的受试对象顺序施用治疗剂量的放射线和治疗剂量的CDK抑制剂。
在另一实施例中，该治疗癌症的方法包括：向需要其治疗的受试对象施用治疗剂量的放射线，然后施用CDK抑制剂。
在一个实施例中，本发明涉及一种化学式I的化合物所示的CDK抑制剂或其药学上可接受的盐或溶剂化物作为放射增敏剂的应用，提高了放射疗法治疗头颈癌、宫颈癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、结肠直肠癌、肝细胞癌、多发性骨髓癌、细胞淋巴癌和恶性黑色素瘤的疗效。
在另一实施例中，本发明涉及一种CDK抑制剂作为放射增敏剂的应用，提高了放射疗法治疗头颈癌、宫颈癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、结肠直肠癌、肝细胞癌、多发性骨髓癌、细胞淋巴癌和恶性黑色素瘤的疗效；其中，CDK抑制剂选自化学式I化合物的(+)-反式同分异构体或其药学上可接受的盐或溶剂化物。
在另一实施例中，本发明涉及一种CDK抑制剂作为放射增敏剂的应用，提高了放射疗法治疗头颈癌、宫颈癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、结肠直肠癌、肝细胞癌、多发性骨髓癌、细胞淋巴癌和恶性黑色素瘤的疗效；其中，该CDK抑制剂为(+)-反式-2-(2-氯苯基)-5，7-二羟基-8-(2-羟甲基-1-甲基吡咯烷-3-基)-苯并吡喃-4-酮或者是其药学上可接受的盐。
在另一实施例中，本发明涉及一种化学式I的CDK抑制剂作为放射增敏剂的应用，提高了放射疗法治疗头颈癌的疗效。
在一个实施例中，本发明涉及一种用于制备制剂(或者药剂)的化学式I的CDK抑制剂的应用，该制备的制剂(或者药剂)用于提高放射疗法治疗头颈癌、宫颈癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、结肠直肠癌、肝细胞癌、多发性骨髓癌、细胞淋巴癌和恶性黑色素瘤的疗效。
在优选实施例中，本发明涉及一种用于制备制剂(或者药剂)的化学式I所示的CDK抑制剂的应用，该制备的制剂(或者药剂)用于提高放射疗法治疗头颈癌的疗效。
在一个实施例中，本发明的联合物是一种用于治疗头颈癌、宫颈癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、结肠直肠癌、肝细胞癌、多发性骨髓癌、细胞淋巴癌和恶性黑色素瘤的药物，包括与放射疗法联合使用的所述CDK抑制剂。
在优选实施例中，本发明的联合物是一种用于治疗头颈癌的药物，包括与放射疗法联合使用的化学式I的CDK抑制剂。
联合物中有效成分的实际剂量可以根据患者的需要和治疗的健康情况的严重程度进行改变。对用于具体情况的适当剂量的确定在本领域的技术范围内。通常，开始治疗时使用较小剂量，小于复合物的最佳剂量。之后，少量增加各种成分的剂量，直到达到这种情况下的最佳效果。然而，联合物中各种成分的量一般都小于如果其单独使用时可以产生疗效的量。在优选实施例中，顺序施用γ-射线和化学式I的化合物所示的CDK抑制剂或者其药学上可接受的盐或溶剂化物；这样，施用的γ-射线是在协同有效剂量范围内，为1Gy/天-25Gy/天，优选为1Gy/天-10Gy/天；且施用的CDK抑制剂也是在协同有效剂量范围内，为5mg-750mg，优选为100mg-500mg。
γ-射线或化学式I的CDK抑制剂的选定剂量水平取决于若干不同的因素，包括：所用CDK抑制剂的活性和其用药途径；药物服用时间；所用CDK抑制剂的排泄速度；治疗持续的时间；与所用CDK抑制剂联合使用的其它药物、化合物和/或材料；所治疗的癌症的类型和阶段；年龄；性别；体重；状态；患者的健康状况和先前的病史；以及，医术上熟知的相似因素。
本发明提供的联合物已在某些测试系统和几个不同的体外服药计划(administrative schedule)中进行了评估。实验细节如本文下面所提供的。本文提供的数据清楚地表明当放射线和化学式I的CDK抑制剂联合使用时，具有协同效应。从表1-表4提供的数据可以明显地观察到，在对头颈癌细胞的体外分析中，CDK抑制剂协同性地提高了放射线的细胞毒性；其中CDK抑制剂为化学式I的典型化合物，本文指定为化合物A。
用于药理分析的典型化合物(化合物A)指(+)-反式-2-(2-氯苯基)-5，7-二羟基-8-(2-羟甲基-1-甲基吡咯烷-3-基)-苯并吡喃-4-酮盐酸盐，是已公布的PCT专利申请WO2004004632和WO2007148158公开的化合物之一，其以援引的方式并入本文中。现在，参考优选实施例，对本发明联合物的协同效应进行更详细地解释，其中该联合物包括γ-射线和CDK抑制剂。要注意的是，这些只是作为实例而提供，并非用于限定本发明。实例1-实例10提供了化合物A(实例10的化合物)的合成方法，同时实例11和实例12提供了在体外对放射线与化合物A联合使用的研究。实例13提供了体内治疗方案，同时实例14提供临床治疗方案。
本文所用的缩写词或者术语如下：
ATCC：美国模式培养物保藏所
BF3：三氟化硼
CHCl3：氯仿
CO2：二氧化碳
DBTA：二苯甲酰酒石酸
DMSO：二甲亚砜
EtOAc：乙酸乙酯
Gy：戈瑞
HCl：盐酸
IPA：异丙醇
KBr：溴化钾
MeOH：甲醇
MTT：3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基溴化四唑
Na2CO3：碳酸钠
Na2SO4：硫酸钠
NaBH4：硼氢化钠
NaOH：氢氧化钠
TFA：三氟乙酸
THF：四氢呋喃
实例
实例1：
制备1-甲基-4-(2，4，6-三甲氧苯基)-1，2，3，6-四氢吡啶
将1-甲基-4-哌啶酮(340g，3.0mol)缓慢加入到溶于冰醋酸(600mL)的1，3，5-三甲氧基苯(500g，2.97mol)溶液中，维持反应混合物的温度低于40℃。在超过20分钟的时间内加入浓盐酸(450mL)。将反应混合物的温度升高到85℃-90℃，并搅拌3.5小时。可以冷却到40℃，倒入碎冰(4kg)并搅拌20分钟。过滤除去未反应的1，3，5-三甲氧基苯沉淀物。在低于10℃下，用50％的NaOH溶液碱化滤液至pH11-12。过滤得到的白色固体，用水洗涤，干燥，得到化合物1-甲基-4-(2，4，6-三甲氧苯基)-1，2，3，6-四氢吡啶。
产量：580g(74％)；熔点：112℃-114℃；红外光谱(IR)(KBr法)：3045cm-1，2900cm-1，2837cm-1，1600cm-1，1585cm-1；1H核磁共振分析(NMR)(CDCl3，300MHz)：δ6.15(s，2H)，5.55(s，1H)，3.85(s，3H)，3.75(s，6H)，3.10(d，2H)，2.55(t，2H)，2.40(s，3H)，2.35(m，2H)；质谱分析(MS)(电子轰击法(EI))：m/z 263(M+)。
实例2：
制备(±)-反式-1-甲基-4-(2，4，6-三甲氧苯基)-哌啶-3-醇
在0℃，氮气环境中，边搅拌边将三氟化硼乙醚络合物(300mL，2.36mol)缓慢加入到溶于干燥的THF(2.25L)中的实例(1)的化合物(300g，1.14mol)和NaBH4(75g，1.97mol)的溶液中。将反应混合物的温度缓慢升至55℃，并搅拌1.5小时。然后冷却至30℃。缓慢加入冰水(100mL)，然后使用浓HCl(375mL)酸化。反应混合物在50℃-55℃下搅拌1小时。冷却至30℃，并用50％的NaOH溶液碱化至pH11-12。在超过0.5小时的时间内加入过氧化氢溶液(30％，225mL)。反应混合物在55℃-60℃下搅拌1.5小时。冷却至30℃，并加入足够的水以溶解沉淀的盐。使用EtOAc(2×1L)分离有机层，萃取水溶液部分。干燥有机萃取物(无水Na2SO4)，并进行浓缩。用4当量(N)HCl(1.2L)处理得到的未加工的粘性棕色油，并用EtOAc(2×500mL)进行萃取。冷却水溶液部分，用50％的NaOH水溶液碱化，并用EtOAc(2×1L)进行萃取。干燥有机萃取物(无水Na2SO4)，并浓缩得到化合物(±)-反式-1-甲基-4-(2，4，6-三甲氧苯基)-哌啶-3-醇。
产量：210g(65.6％)；熔点：96℃-97℃；IR(KBr法)：3582cm-1，3374cm-1，3017cm-1；1H NMR(CDCl3，300MHz)：δ6.15(s，2H)，4.40(m，1H)，3.79(s，3H)，3.74(s，6H)，3.20(dd，1H)，3.00(m，1H)，2.80(m，1H)，2.40(m，1H)，2.37(s，3H)，2.00(m，1H)，1.90(t，1H)，1.52(m，1H)；MS(化学离子法(CI))：m/z 282(M+1)。
实例3：
制备(±)-反式-乙酸-1-甲基-3-(2，4，6-三甲氧苯基)-吡咯烷-2-基甲酯
将甲基磺酰氯(30.27mL，44.8g，0.4mol)滴加到冷却搅拌的溶于干燥的THF(1.0L)中的实例(2)的化合物(100g，0.35mol)和三乙胺(71.88g，0.7mol)的溶液中。在0℃下，进一步搅拌反应混合物45分钟。过滤三乙胺盐酸盐的沉淀物并用干燥的THF(2×100mL)洗涤。将滤液滴加到回流的溶于异丙醇(1.0L)的醋酸钠(115g，1.40mol)悬浮液中。进一步回流反应混合物15分钟，用EtOAc(1.0L)稀释，并过滤盐。用EtOAc(2×100mL)洗涤盐的混合物。浓缩合并的滤液以生产胶。搅拌过程中，向胶中加入水(50mL)得到固体，过滤并干燥固体，生产化合物(±)-反式-乙酸-1-甲基-3-(2，4，6-三甲氧苯基)-吡咯烷-2-基甲酯。
产量：90g(81％)；熔点：74℃-77℃；1H NMR(CDCl3，300MHz)：δ6.13(s，2H)，4.00(m，2H)，3.81(m，1H)，3.79(s，3H)，3.76(s，6H)，3.20(m，1H)，2.75(m，1H)，2.69(m，1H)，2.47(s，3H)，2.00(m，2H)，1.99(s，3H)。
实例4：
制备(±)-反式-[1-甲基-3-(2，4，6-三甲氧苯基)-吡咯烷-2-基]-甲醇
将10％的NaOH水溶液(596mL)加入到溶于甲醇(596mL)的实例(3)的化合物(241g，0.75mol)的溶液中。在50℃下，搅拌反应混合物45分钟。浓缩成胶，然后倒入冰水(2L)。过滤产生的固体，得到化合物(±)-反式-[1-甲基-3-(2，4，6-三甲氧苯基)-吡咯烷-2-基]-甲醇。
产量：198g(94％)；熔点：82℃-85℃；IR(KBr法)：3421cm-1，3009cm-1，1607cm-1；1HNMR(CDCl3，300MHz)：δ6.15(s，2H)，3.92(m，1H)，3.80(s，9H)，3.60(dd，1H)，3.45(d，1H)，3.20(m，1H)，2.78(m，1H)，2.50(m，1H)，2.42(s，3H)，2.00(m，1H)，1.92(m，1H)；MS(ES+)：m/z 282(M+1)。
实例5：
制备(-)-反式-[1-甲基-3-(2，4，6-三甲氧苯基)-吡咯烷-2-基]-甲醇
将(-)-DBTA(321.7g，897.7mmol)加入到实例(4)的化合物(250g，889.6mmol)中，随后加入甲醇(1715mL)。回流混合物10分钟，室温下缓慢搅拌3小时，过滤并干燥结晶盐。
产量：185g(30％)；熔点：102℃-105℃；[α]D 25＝-82.66°(c＝0.7，甲醇)。
搅拌盐与10％的Na2CO3(765mL)和EtOAc(200×3mL)的水溶液，得到存在于EtOAc层中的游离碱。浓缩EtOAc层，得到化合物(-)-反式-[1-甲基-3-(2，4，6-三甲氧苯基)-吡咯烷-2-基]-甲醇。
产量：80g(98.3％)；[α]D 25＝-20.0°(c＝0.7，甲醇)；
1H NMR(CDCl3，300MHz)：δ6.13(s，2H)，3.90(m，1H)，3.79(s，9H)，3.57(dd，1H)，3.38(d，1H)，3.13(m，1H)，2.69(m，1H)，2.47(m，1H)，2.34(s，3H)，2.00(m，1H)，1.93(m，1H)。
使用手性HPLC分析该化合物。手性HPLC使用手性柱OD-H(250×4.6mm)，溶剂系统为TFA(0.4％)和乙烷∶乙醇(92∶08)。在记录264nm处的结果，溶剂流速为1mL/min。如图1所示，手性HPLC示出了e.e值为100％的化合物(-)-反式-[1-甲基-3-(2，4，6-三甲氧苯基)-吡咯烷-2-基]-甲醇。
实例6：
制备(-)-反式-乙酸-3-(3-乙酰基-2-羟基-4，6-二甲氧基苯基)-1-甲基-吡咯烷-2-基甲酯
0℃下，在氮气环境中，搅拌的同时将三氟化硼乙醚(25.2g，178mmol)滴加到溶于乙酸酐(19.48mL，176mmol)的实例(5)化合物(10g，35.58mmol)的溶液中。室温下，搅拌反应混合物2小时。加入碎冰(1kg)，用饱和Na2CO3溶液碱化，并用EtOAc(3×200mL)萃取。用盐水洗涤有机萃取物，干燥(无水Na2SO4)，浓缩得到化合物(-)-反式-乙酸-3-(3-乙酰基-2-羟基-4，6-二甲氧基苯基)-1-甲基-吡咯烷-2-基甲酯。
产量：10g(83％)；1H NMR(CDCl3，300MHz)：δ14.20(s，1H)，5.96(s，1H)，4.10(d，2H)，3.90(s，3H)，3.89(s，3H)，3.85(m，1H)，3.26(m，1H)，2.82(m，1H)，2.74(m，1H)，2.66(s，3H)，2.52(s，3H)，2.21(m，2H)，2.10(s，3H)。
实例7：
制备(-)-反式-1-[2-羟基-3-(2-羟甲基-1-甲基吡咯烷-3-基)-4，6-二甲氧基苯]-乙酮
室温下，搅拌的同时将10％的NaOH水溶液(25ml)加入到溶于甲醇(25ml)的实例(6)化合物(10g，28.4mmol)的溶液中。将反应混合物的温度升至50℃，保持45分钟。冷却到室温，用浓盐酸酸化，并浓缩以除去甲醇。用饱和的Na2CO3溶液碱化。过滤，用水洗涤并干燥得到化合物(-)-反式-1-[2-羟基-3-(2-羟甲基-1-甲基吡咯烷-3-基)-4，6-二甲氧基苯]-乙酮。
产量：7.14g(82％)；IR(KBr法)：3400cm-1，3121cm-1，3001cm-1，1629cm-1，1590cm-1；
1H NMR(CDCl3，300MHz)：δ5.96(s，1H)，3.93(m，1H)，3.90(s，3H)，3.88(s，3H)，3.59(dd，1H)，3.37(d，1H)，3.13(m，1H)，2.75(m，1H)，2.61(s，3H)，2.59(m，1H)，2.37(s，3H)，2.00(m，2H)；MS(ES+)：m/z 310(M+1)。
实例8：
制备(+)-反式-2-(2-氯苯基)-8-(2-羟甲基-1-甲基吡咯烷-3-基)-5，7-二甲氧基-苯并吡喃-4-酮
0℃下，氮气环境中，搅拌的同时将氢化钠(50％，0.54g，11.25mmol)分步加入到溶于干燥DMF(15ml)含有实例(7)化合物(0.7g.，2.2mmol)的溶液中。10分钟后，加入邻氯苯甲酸甲酯(1.15g，6.75mmol)。25℃，搅拌反应混合物2小时。低于20℃，小心加入甲醇。反应混合物中加入碎冰(300g)，用1∶1的HCl(pH 2)酸化，并用EtOAc(2×100mL)萃取。水溶液层用饱和Na2CO3(pH 10)碱化，并用CHCl3(3×200mL)萃取。干燥(无水Na2SO4)并浓缩有机层。室温下，向残渣中加入浓盐酸(25mL)并搅拌2小时。反应混合物中加入碎冰(300g)，并用饱和Na2CO3溶液碱化。用CHCl3(3×200mL)萃取混合物。用水洗涤有机萃取物，干燥(无水Na2SO4)并浓缩以得到化合物(+)-反式-2-(2-氯苯基)-8-(2-羟甲基-1-甲基吡咯烷-3-基)-5，7-二甲氧基-苯并吡喃-4-酮。
产量：0.67g(64％)；熔点：91℃-93℃；[α]D 25＝+5.8°(c＝0.7，甲醇)；
IR(KBr法)：3431cm-1，1648cm-1，1598cm-1，1571cm-1；1HNMR(CDCl3，300MHz)：δ7.70(dd，1H)，7.52(m，1H)，7.45(m，2H)，6.50(s，1H)，6.44(s，1H)，4.17(m，1H)，4.00(s，3H)，3.97(s，3H)，3.64(dd，1H)，3.40(d，1H)，3.15(m，1H)，2.74(d，1H)，2.52(m，1H)，2.32(s，3H)，2.00(m，2H)；MS(ES+)：m/z 430(M+1)。
实例9：
制备(+)-反式-2-(2-氯苯基)-5，7-二羟基-8-(2-羟甲基-1-甲基吡咯烷-3-基)-苯并吡喃-4-酮
将熔融的吡啶盐酸盐(4.1g，35.6mmol)加入到实例(8)的化合物(0.4g，0.9mmol)中，并加热到180℃，保持1.5小时。反应混合物冷却至25℃，用甲醇(10mL)稀释，并用Na2CO3碱化到pH 10。过滤混合物，并浓缩有机层。残渣悬浮在水(5mL)中，搅拌30分钟，过滤并干燥得到化合物(+)-反式-2-(2-氯苯基)-5，7-二羟基-8-(2-羟甲基-1-甲基吡咯烷-3-基)-苯并吡喃-4-酮。
产量：0.25g(70％)；IR(KBr法)：3422cm-1，3135cm-1，1664cm-1，1623cm-1，1559cm-1；
1H NMR(CDCl3，300MHz)：δ7.56(d，1H)，7.36(m，3H)，6.36(s，1H)，6.20(s，1H)，4.02(m，1H)，3.70(m，2H)，3.15(m，2H)，2.88(m，1H)，2.58(s，3H)，2.35(m，1H)，1.88(m，1H)；MS(ES+)：m/z 402(M+1)；分析：C21H20ClNO5C，62.24(62.71)；H，5.07(4.97)；N，3.60(3.48)；Cl，9.01(8.83)。
实例10：
制备(+)-反式-2-(2-氯苯基)-5，7-二羟基-8-(2-羟甲基-1-甲基吡咯烷-3-基)-苯并吡喃-4-酮盐酸盐
(化合物A)
将实例(9)的化合物(0.2g，0.48mmol)悬浮在IPA(5mL)中，并加入3.5％的盐酸(25mL)。加热悬浮液，得到澄清溶液。冷却溶液，并过滤固体得到化合物(+)-反式-2-(2-氯苯基)-5，7-二羟基-8-(2-羟甲基-1-甲基吡咯烷-3-基)-苯并吡喃-4-酮盐酸盐或化合物A。
产量：0.21g(97％)；熔点：188℃-192℃；[α]D 25＝+21.3°(c＝0.2，甲醇)；
1H NMR(CD3OD，300MHz)：δ7.80(d，1H)，7.60(m，3H)，6.53(s，1H)，6.37(s，1H)，4.23(m，1H)，3.89(m，2H)，3.63(m，1H)，3.59(dd，1H)，3.38(m，1H)，2.90(s，3H)，2.45(m，1H)，2.35(m，1H)；MS(ES+)：m/z 402(M+1)(游离碱)。
使用手性HPLC分析该化合物。手性HPLC使用手性柱OD-H(250×4.6mm)，溶剂系统为TFA(0.4％)和乙烷∶乙醇(92∶08)。在记录264nm处的结果，溶剂流速为1mL/min。如图3所示，手性HPLC示出了e.e值为100％的化合物(+)-反式-2-(2-氯苯基)-5，7-二羟基-8-(2-羟甲基-1-甲基吡咯烷-3-基)-苯并吡喃-4-酮盐酸盐。
实例11：
体外MTS检测
根据Molecular Cancer Therapeutics，2007，6(9)中描述的方法进行该检测；其公开的内容以援引的方式并入本文中，以指导该检测过程。
MTS(普洛麦格公司(Promega)，货号(Cat#)G1111)是四唑化合物(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧苯基)-2-(4-磺酸苯基)-2氢-四唑，内盐；MTS)，用于比色分析法，以确定在细胞增殖、细胞毒性或者化学敏感性试验中活细胞的数量。MTS与电子耦合试剂吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)一同使用。细胞将MTS生物降解为甲臜，甲臜则溶于组织培养液中。可以从96孔检测板直接检测甲臜在490nm处的吸光度，而不需要附加工序。新陈代谢活跃的细胞中存在的脱氢酶将MTS转化为水溶性的甲臜。甲臜产物的量(检测490nm的吸光度)直接与培养液中活细胞的数量成正比。
在检测化合物A对FaDu(人类头颈癌，ATCC，美国(USA))细胞的放射敏感度的影响之前，通过MTS检测确定单独使用化合物A的剂量依赖性细胞毒性。肿瘤细胞在存在不同浓度的化合物A的培养基中培养48小时，然后对其进行MTS检测。FaDu细胞中，化合物A的IC30、IC50和IC70分别为0.7μM、1.0μM和2μM。单独使用放射线也引起细胞存活率的剂量依赖性降低。
实验方案
将Fa-Du(人类头颈癌，ATCC，USA)细胞以1500细胞/孔的密度接种于组织培养级的96孔板中的180μL MEM培养基(最基本培养基)中，置于潮湿的含5％二氧化碳(CO2)的培养箱中，37±1℃，生长24小时。
制备三个相同的细胞组。接种24小时后，在室温下辐射处理第一细胞组和第二细胞组不同孔中的细胞，剂量分别为2Gy、4Gy、6Gy、8Gy和10Gy。辐射处理后24小时(即实验的第三天)，第二组进一步用IC30浓度的化合物A进行处理。第三组在实验的第三天用IC30浓度的化合物A单独进行处理。
为了在任意孔中得到IC30浓度(0.7μM)的化合物A，将20μL浓度为10×IC30(即7μM)的储备液加入孔中(先溶于DMSO，然后溶于细胞培养基，DMSO的最终浓度不可以超过0.5％)，且用MEM稀释至200μL。在37±1℃，潮湿的含5％CO2的培养箱中，孔板分别培养48小时和96小时。在分别培养48小时和96小时之后，除去所有孔中的培养基，并加入新鲜的MEM，然后孔板继续培养额外的4天-6天，或者从试验开始总共培养8天-10天。试验最后，除去所有孔中的培养基，并在每个孔中加入20μL MTS(2mg/ml，溶于磷酸盐缓冲液，pH 6-6.5且经过滤除菌)和1μL PMS(3mM，溶于PBS，pH 7.3，且经过滤除菌)，并加入培养基，以将总体积调整至200μL/孔。孔板在37±1℃，潮湿的含5％CO2的培养箱中，培养2小时-4小时。然后在分光光度计(SpectraMax，分子设备公司(Molecular Devices)，USA)490nm处读板，用SpectraMax的SoftMax软件计算细胞毒性百分数。
用化合物A的IC50浓度和IC70浓度重复上述实验。
如Pharmacological Reviews，2006，58，621-681中所述，周(Chou)和特拉雷(Talalay)使用CompuSyn软件计算了FaDu细胞系放射效应的增加，其以援引的方式并入本文中。组合系数(CI)用于评估联合物是累加的、协同的还拮抗的。CI＜1是协同的，CI＝1是累加的，CI＞1是拮抗的。比如，用IC70浓度的化合物A处理48小时，联合物在所有的放射剂量下都是协同的(CI＝0.7)。在两种情况下(即IC30浓度和IC50浓度的化合物A分别处理96小时)，该联合物系数在所有放射剂量下都是累加的(CI＝1)。用IC70浓度的化合物A处理96小时，2Gy、4Gy和6Gy的放射剂量下，该联合物是协同的(CI＜1)。
表1、表2和表3给出了结果。
表1：在对FaDu细胞系的MTS检测中，单独使用IC30浓度的化合物A(处理48小时和96小时)、单独使用放射线、以及联合物对细胞存活率的影响
Figure BDA0000123347850000241
表2：在对FaDu细胞系的MTS检测中，单独使用IC50浓度的化合物A(处理48小时和96小时)、单独使用放射线、以及联合物对细胞存活率的影响
表3：在对FaDu细胞系的MTS检测中，单独使用IC70浓度的化合物A(处理48小时和96小时)、单独使用放射线、以及联合物对细胞胞存活率的影响
Figure BDA0000123347850000243
Figure BDA0000123347850000251
结论
MTS检测显示，FaDu细胞系经剂量为6Gy、8Gy和10Gy的放射线协同处理后，在IC30浓度和IC50浓度的化合物A中暴露48小时，能够提高放射效应。即使是只有临床相关剂量2Gy、4Gy和6Gy，也可以观察到放射反应有相当大的提高。同样地，在使用IC70浓度的化合物A的情况下，联合物在所有放射剂量都具有协同性。
用化合物A处理96小时，也可以观察到放射反应的增加。即使在两种情况下，即IC30浓度和IC50浓度的化合物A，组合系数在所用剂量下都是累加的，也可以清楚地观察到放射反应的增加，在6Gy的时候非常显著。同样地，在使用IC70浓度的化合物A的情况下，联合物在2Gy、4Gy和6Gy也具有协同效应。
实例12：
体外克隆形成检测(Clonogenic assay)
根据Radiotherapy and Oncology，2004，71，213-221中描述的方法进行检测；其公开的内容以援引的方式并入本文，以指导该检测过程。
随着对临床化放疗和具有放射增强潜力的新制剂开发的兴趣越来越大，导致对放射疗法和化学治疗制剂之间联系的临床前研究的需求也在增长。通常认为克隆形成测定是体外放射研究的最佳试验系统。的确，对于化学敏感性试验、比色测定(如四唑(MTT/MTS)和磺酰罗丹明B(SRB)检测)，已经取代了克隆形成测定。然而，对于放射敏感性试验，克隆形成测定仍是黄金标准(goldstandard)。研究人员认为比色测定对测量放射敏感性是不足的，因为比色测定持续的时间短。放疗后，注定会死亡的细胞仍会经历一次或者多次细胞分裂。因此，这些被辐射的细胞仍需要相当长得一段时间才会表现出放射诱导性损伤。
实验方案
经胰蛋白酶消化得到指数期的FaDu细胞，计数，以1500细胞/孔的细胞密度接种到六孔板中，且制备四个相同的组。作为对照组，第一组不经处理。接种24小时后，室温下分别用2Gy、4Gy、6Gy、8Gy和10Gy的剂量辐射第二组和第三组的不同孔。辐射后24小时(即实验的第三天)，使用IC50浓度的化合物A进一步处理第三组。在实验的第三天，单独使用IC50浓度的化合物A处理第四组。
分别培养72小时和96小时后，换掉将从实验的第一天(即接种细胞的那天)开始总共培养12天-14天的所有孔和板中的培养基，以保证细胞有足够的时间形成有至少50个细胞的克隆。吸走培养基，克隆经比例为2∶1的甲醇和乙酸混合物固定。经水洗涤后，重复固定步骤。干燥板且克隆用0.1％结晶紫染色5分钟。最后用水冲洗孔并干燥。克隆计数，其结果在示在表4中。
最初，用3500细胞/孔进行试验，且用1μM剂量的化合物A处理48小时和96小时，但是对照组的克隆数太多，因此无法对克隆计数。然而，可直观看到放射反应的增加，如图1和图2。图3和图4示出了FaDu细胞系(接种密度：1500细胞/板)通过1μM剂量的化合物A处理直观看到放射反应的增加。
表4：在对FaDu细胞系(接种密度：1500细胞/板)的克隆形成测定中，单独使用IC50浓度的化合物A(72小时和96小时)、单独使用放射线、以及联合物对细胞存活率的影响
Figure BDA0000123347850000261
结论
用1μM剂量的化合物A处理72小时和96小时后，都增加了细胞在4Gy和6Gy放射线处理下的放射反应。
实例13：
体内研究
按照Clinical Cancer Research，2003，9，6052-6061中描述的方法进行试验；其公开的内容以援引的方式并入本文，以指导该试验过程。
按照下述方法，在重症联合免疫缺陷(SCID)的小鼠品系CBySmn.CB 17-Prkdcscid/J中使用移植瘤模型(Xenograft model)进行体内试验。每组小鼠选择统计学上有效的数量(n＝6)，目的是可以在统计学上评估研究数据。使用六周到八周龄的SCID小鼠。在37℃，含5％CO2的培养箱中，将头颈癌细胞培养在含10％胎牛血清的MEM培养基中。以转速1000rpm离心10分钟，沉淀细胞。使用生理盐水重悬细胞，得到30×106细胞/mL的悬浮液；将0.2mL该细胞悬浮液皮下注射至SCID小鼠的右侧腹。每天观察小鼠的明显肿瘤块。一旦肿瘤直径达到5mm-10mm，动物被随机分成药物/放射线组和赋形剂(生理盐水)处理组。按照时刻表施用化合物A(皮下注射(i.p.))和放射线，并每天进行肿瘤测量。记录整个时间段内所有组的体重。每天记录肿瘤大小和其它毒性症状(外部)。使用长椭球的公式估算肿瘤重量(mg)：{长(mm)×[宽(mm)2]×0.5}。在化合物处理的动物中，肿瘤生长计算为：T/C(治疗组/对照组)×100％，生长抑制百分比(GI％)为[100-T/C％]。
研究组的分配
当肿瘤直径达到为5mm-10mm，将小鼠随机分成对照组和实验组。
研究设计
使用分次剂量的放射线。所用总的放射剂量为15Gy。
分次放射剂量为3Gy，每周两次；然后每天施用化合物A35mpk(mg/kg)给药18天。
剂量安排
通过i.p.途径，所有小鼠都施用CDK抑制剂。对照组(未治疗组)小鼠注射生理盐水。如研究设计所述，持续治疗18天。
观察报告和测量结果
观察以下的参数
1、总体动物健康-每天
2、体重-每天
3、肿瘤测量，每隔一天
使用长椭球的公式计算肿瘤重量(毫克)：
肿瘤重量(mg)＝长(mm)×[宽(mm)2]×0.5
在给定日期，使用下面的公式计算治疗组与对照组的比值(T/C％)：
Figure BDA0000123347850000281
4、生长抑制(GI)计算如下：
GI(第X天)＝100-T/C％(第X天)
CDK抑制剂非常有效GI％≥75％
CDK抑制剂中等有效GI％≥50％
CDK抑制剂弱有效GI％＝30％-50％
CDK抑制剂无效GI％≤30％
最终步骤
实验结束时，用大剂量的戊巴比妥钠(100mg/kg i.p./i.v.)或者将小鼠置于二氧化碳气体中使其安乐死。
结果
结果如表5所示。图5示出了在服药期间标绘的组平均体重。图6示出了18天中头颈癌(FaDu)移植瘤的平均％肿瘤重量。
表5：相对于对照组，各组的平均％生长抑制(％GI)
  组   只施用放射线   只施用化合物A   放射线+化合物A
  ％生长抑制   43   42   75
结论
在人类FaDu移植瘤模型中，与单独施用放射线或单独施用化合物A相比，施用放射线后施用化合物A的联合物在体内具有显著疗效。
实例14：
临床方案：
根据下述方法进行临床研究。
主要目的：
为了在患有复发性和/或局部晚期头颈鳞状细胞癌(SCCHN)的受试对象中，确定与放射线联合施用的化合物A的最大耐受剂量(MTD)和剂量限制性毒性(ies)(DLT/s)。
次要目的：
1、评估在研究人群中包括化合物A和放射线的联合物的安全性和耐受性；
2、分析在研究人群中化合物A的药物动力学(PK)；以及
3、评估在研究人群中包括化合物A和放射线的联合物的疗效。
研究设计：
该研究为临床研究(open label study)的阶段I/II，以评估在患有复发性和/或局部晚期头颈鳞状细胞癌(SCCHN)的受试对象中，与放射线联合施用的化合物A的安全性和有效性。预期大约有22-28位受试对象加入该研究中。
阶段I中，在21天的周期中，每组三个受试对象，施用化合物A和放射线进行治疗，随后进行安全评估。如果该疗法在第一周期中是可耐受的，则在下一组的三个受试对象中递增化合物A的剂量。
化合物A剂量递增进行如下：
1)三个受试对象从剂量水平1开始(100mg/m2/day，30分钟静脉(i.v.)注射)。
2)如果三个受试对象都没有在第一周期中出现DLT，则按照方案设计继续递增剂量。
3)如果三个受试对象中有一个出现DLT，则向该组中加入最多达三个的额外受试对象，一组最多6个，且如果这三个额外的受试对象都没有出现DLT，则允许递增剂量。
4)如果在最初或者扩大的组中有两个受试对象(六个中有两个)在第一周期出现DLT，则该剂量被称为最大给药剂量(MAD)和MTD，且同样建议阶段II的剂量(RPTD)使用前一个剂量，该剂量下≤1/6的受试对象出现DLT。在阶段II中，另外十个受试对象参加RPTD，以评估临床疗效且进一步明确该疗法的安全性。
下表6中示出阶段I的化合物A的剂量水平：
表6：阶段1的化合物A的剂量水平
 水平1   N/A   100mg/m2/day×5q3weeks
 水平2   40％(40mg)   140mg/m2/day×5q3weeks
 水平3   32％(44.8mg)   185mg/m2/day×5q3weeks
没有个体内差异性剂量递增。
在该研究中，化合物A的初始剂量(100mg/m2/day)是化合物A单独制剂RPTD的几乎一半。如阶段I所用的该剂量方案用于确定RPTD。
治疗研究：
每个21天的周期中，从第一天到第五天，在超过30分钟的时间内，按如上所述的剂量以静脉注射的方式向受试对象施用化合物A(溶于5％的葡萄糖中)。所有受试对象还接收对涉及部位的体外放射线治疗，使用标准常规分割，即，每天2Gy，每周五天，总放射剂量为60Gy。对脊髓的总放射剂量小于46Gy。经六周化合物A和放射线的治疗，即施用化合物A的两个周期和放射线60分次。组合治疗一个21天的周期，包括第一天至第五天化合物A给药和第一天至第五天、第八天至第十二天及第十五天至第十九天施用放射线(每天2Gy)。发生疾病恶化(临床上或客观上)或者出现不可耐受的毒性，则中断该受试对象的治疗。

Claims (30)

1.一种联合物，所述联合物包括放射线和细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂或者其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中，所述CDK抑制剂由下面的化学式I表示；
Figure FDA0000123347840000011
其中，Ar是苯基，其未被取代或者被1个、2个或3个相同或者不同的取代基取代；所述取代基选自：选自氯、溴、氟或碘的卤素，硝基，氰基，C1-C4-烷基，三氟甲基，羟基，C1-C4-烷氧基，羧基，C1-C4-烷氧羰基，CONH2和NR1R2；其中，R1和R2分别独立地选自氢或C1-C4-烷基。
2.根据权利要求1所述的联合物，其中，所述CDK抑制剂是化学式I的化合物的(+)-反式异构体或者其药学上可接受的盐或溶剂化物，所述化学式I的化合物的(+)-反式异构体如化学式IA所示；
Figure FDA0000123347840000012
其中，Ar是苯基，其未被取代或者被1个、2个或3个相同或者不同的取代基取代；所述取代基选自：选自氯、溴、氟或碘的卤素，硝基，氰基，C1-C4-烷基，三氟甲基，羟基，C1-C4-烷氧基，羧基，C1-C4-烷氧羰基，CONH2和NR1R2；其中，R1和R2分别独立地选自氢或C1-C4-烷基。
3.根据权利要求1或2所述的联合物，其中，化学式I的化合物所示的所述CDK抑制剂是(+)-反式-2-(2-氯苯基)-5，7-二羟基-8-(2-羟甲基-1-甲基吡咯烷-3-基)-苯并吡喃-4-酮或者其药学上可接受的盐。
4.根据前述权利要求1-3中任一项所述的联合物，其中，使用的所述放射线是γ-射线。
5.根据前述权利要求1-4中任一项所述的联合物，所述联合物用于治疗癌症，所述癌症选自由头颈癌、宫颈癌、乳腺癌、肺癌(包括小细胞肺癌或者非小细胞肺癌和肺腺癌)、卵巢癌、胰腺癌(包括外分泌胰腺癌)、胃癌、结肠直肠癌、肝细胞癌、多发性骨髓癌、细胞淋巴癌和恶性黑色素瘤组成的组。
6.根据权利要求5所述的联合物，其中，所述癌症为头颈癌。
7.根据前述权利要求1-6中任一项所述的联合物，其中，将一定治疗剂量的放射线和一定治疗剂量的所述化学式I的CDK抑制剂或者其药学上可接受的盐或溶剂化物同时或者顺序地施用于需要其治疗的受试对象。
8.根据权利要求7所述的联合物，其中，将一定治疗剂量的放射线和一定治疗剂量的所述化学式I的CDK抑制剂或者其药学上可接受的盐或溶剂化物顺序地施用于需要其治疗的受试对象。
9.根据权利要求8所述的联合物，其中，在施用一定治疗剂量的所述化学式I的CDK抑制剂或者其药学上可接受的盐或溶剂化物之前，先向需要其治疗的受试对象施用一定治疗剂量的放射线。
10.根据前述权利要求1-9中任一项所述的联合物，其中，所述联合物显示出治疗的协同效应。
11.一种治疗癌症的方法，所述癌症选自由头颈癌、宫颈癌、乳腺癌、肺癌(包括小细胞肺癌或者非小细胞肺癌和肺腺癌)、卵巢癌、胰腺癌(包括外分泌胰腺癌)、胃癌、结肠直肠癌、肝细胞癌、多发性骨髓癌、细胞淋巴癌和恶性黑色素瘤组成的组；其中，所述方法包括向需要其治疗的受试对象施用一种联合物，所述联合物包括放射线和化学式I的CDK抑制剂或者其药学上可接受的盐或溶剂化物；
其中，Ar是苯基，其未被取代或者被1个、2个或3个相同或者不同的取代基取代；所述取代基选自：选自氯、溴、氟或碘的卤素，硝基，氰基，C1-C4-烷基，三氟甲基，羟基，C1-C4-烷氧基，羧基，C1-C4-烷氧羰基，CONH2和NR1R2；其中，R1和R2分别独立地选自氢或C1-C4-烷基。
12.根据权利要求11所述的方法，所述方法用于治疗头颈癌；其中，所述方法包括向需要其治疗的受试对象施用所述联合物，所述联合物包括所述放射线和所述化学式I的CDK抑制剂或者其药学上可接受的盐或溶剂化物。
13.根据权利要求11或12所述的方法，其中，所述CDK抑制剂是化学式I的化合物的(+)-反式异构体或者其药学上可接受的盐或溶剂化物，如化学式IA所示；
Figure FDA0000123347840000032
其中，Ar是苯基，其未被取代或者被1个、2个或3个相同或者不同的取代基取代；所述取代基选自：选自氯、溴、氟或碘的卤素，硝基，氰基，C1-C4-烷基，三氟甲基，羟基，C1-C4-烷氧基，羧基，C1-C4-烷氧羰基，CONH2和NR1R2；其中，R1和R2分别独立地选自氢或C1-C4-烷基。
14.根据前述权利要求11-13中任一项所述的方法，其中，所述化学式I的CDK抑制剂是(+)-反式-2-(2-氯苯基)-5，7-二羟基-8-(2-羟甲基-1-甲基吡咯烷-3-基)-苯并吡喃-4-酮或者其药学上可接受的盐。
15.根据前述权利要求11-14中任一项所述的方法，其中，将一定治疗剂量的放射线和一定治疗剂量的所述化学式I的CDK抑制剂或者其药学上可接受的盐或溶剂化物同时或者顺序地施用于需要其治疗的受试对象。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，将一定治疗剂量的放射线和一定治疗剂量的所述化学式I的CDK抑制剂或者其药学上可接受的盐或溶剂化物顺序地施用于需要其治疗的受试对象。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，在施用一定治疗剂量的所述化学式I的CDK抑制剂或者其药学上可接受的盐或溶剂化物之前，先向需要其治疗的受试对象施用一定治疗剂量的放射线。
18.根据前述权利要求11-17中任一项所述的方法，其中，所述联合物显示出治疗的协同效应。
19.一种化学式I的化合物所示的CDK抑制剂或者其药学上可接受的盐或溶剂化物的应用；
Figure FDA0000123347840000041
其中，Ar是苯基，其未被取代或者被1个、2个或3个相同或者不同的取代基取代；所述取代基选自：选自氯、溴、氟或碘的卤素，硝基，氰基，C1-C4-烷基，三氟甲基，羟基，C1-C4-烷氧基，羧基，C1-C4-烷氧羰基，CONH2和NR1R2；其中，R1和R2分别独立地选自氢或C1-C4-烷基；所述化学式I的化合物所示的CDK抑制剂或者其药学上可接受的盐或溶剂化物作为提高放射疗法疗效的放射增敏剂，所述放射疗法用于治疗头颈癌、宫颈癌、乳腺癌、肺癌(包括小细胞肺癌或者非小细胞肺癌和肺腺癌)、卵巢癌、胰腺癌(包括外分泌胰腺癌)、胃癌、结肠直肠癌和肝细胞癌。
20.根据权利要求19所述的应用，所述化学式I的化合物所示的CDK抑制剂或者其药学上可接受的盐或溶剂化物用于治疗头颈癌。
21.根据权利要求19或20所述的应用，其中，所述CDK抑制剂是化学式I的化合物的(+)-反式异构体或者其药学上可接受的盐或溶剂化物，如化学式IA所示；
其中，Ar是苯基，其未被取代或者被1个、2个或3个相同或者不同的取代基取代；所述取代基选自：选自氯、溴、氟或碘的卤素，硝基，氰基，C1-C4-烷基，三氟甲基，羟基，C1-C4-烷氧基，羧基，C1-C4-烷氧羰基，CONH2和NR1R2；其中，R1和R2分别独立地选自氢或C1-C4-烷基。
22.根据前述权利要求19-21中任一项所述的应用，其中，所述化学式I的CDK抑制剂是(+)-反式-2-(2-氯苯基)-5，7-二羟基-8-(2-羟甲基-1-甲基吡咯烷-3-基)-苯并吡喃-4-酮或者其药学上可接受的盐。
23.根据前述权利要求19-22中任一项所述的应用，其中，将一定治疗剂量的放射线和一定治疗剂量的所述化学式I的CDK抑制剂或者其药学上可接受的盐或溶剂化物同时或者顺序地施用于需要其治疗的受试对象。
24.根据权利要求23所述的应用，其中，将一定治疗剂量的放射线和一定治疗剂量的所述化学式I的CDK抑制剂或者其药学上可接受的盐或溶剂化物顺序地施用于需要其治疗的受试对象。
25.根据权利要求24所述的应用，其中，在施用一定治疗剂量的所述化学式I的CDK抑制剂或者其药学上可接受的盐或溶剂化物之前，先向需要其治疗的受试对象施用一定治疗剂量的放射线。
26.根据前述权利要求19-25中任一项所述的应用，其中，所述联合物显示出治疗的协同效应。
27.一种根据权利要求19、21或22所述的化学式I的化合物所示的CDK抑制剂或者其药学上可接受的盐或溶剂化物的应用，所述化学式I的化合物所示的CDK抑制剂或者其药学上可接受的盐或溶剂化物用于制备一种制剂或药剂以提高放射疗法的疗效，所述放射疗法用于治疗头颈癌、宫颈癌、乳腺癌、肺癌(包括小细胞肺癌或者非小细胞肺癌和肺腺癌)、卵巢癌、胰腺癌(包括外分泌胰腺癌)、胃癌、结肠直肠癌和肝细胞癌。
28.一种药物，所述药物用于治疗头颈癌、宫颈癌、乳腺癌、肺癌(包括小细胞肺癌或者非小细胞肺癌和肺腺癌)、卵巢癌、胰腺癌(包括外分泌胰腺癌)、胃癌、结肠直肠癌和肝细胞癌；所述药物包括化学式I的化合物所示的CDK抑制剂或者其药学上可接受的盐或溶剂化物；
Figure FDA0000123347840000061
其中，Ar是苯基，其未被取代或者被1个、2个或3个相同或者不同的取代基取代；所述取代基选自：选自氯、溴、氟或碘的卤素，硝基，氰基，C1-C4-烷基，三氟甲基，羟基，C1-C4-烷氧基，羧基，C1-C4-烷氧羰基，CONH2和NR1R2；其中，R1和R2分别独立地选自氢或C1-C4-烷基；所述CDK抑制剂或者其药学上可接受的盐或溶剂化物与放射线联合使用。
29.根据权利要求28所述的药物，其中，所述CDK抑制剂是化学式I的化合物的(+)-反式异构体或者其药学上可接受的盐或溶剂化物，如化学式IA所示；
Figure FDA0000123347840000071
其中，Ar是苯基，其未被取代或者被1个、2个或3个相同或者不同的取代基取代；所述取代基选自：选自氯、溴、氟或碘的卤素，硝基，氰基，C1-C4-烷基，三氟甲基，羟基，C1-C4-烷氧基，羧基，C1-C4-烷氧羰基，CONH2和NR1R2；其中，R1和R2分别独立地选自氢或C1-C4-烷基；所述CDK抑制剂或者其药学上可接受的盐或溶剂化物与放射线联合使用。
30.根据权利要求29所述的药物，其中，所述化学式I的CDK抑制剂是(+)-反式-2-(2-氯苯基)-5，7-二羟基-8-(2-羟甲基-1-甲基吡咯烷-3-基)-苯并吡喃-4-酮或者其药学上可接受的盐；所述CDK抑制剂或者其药学上可接受的盐与放射线联合使用。
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