CN118021819B

CN118021819B - Xpo1抑制剂和mettl3抑制剂联合在制备治疗胃癌的药物中的应用

Info

Publication number: CN118021819B
Application number: CN202410445267.5A
Authority: CN
Inventors: 余佳; 王芳; 芦东旭
Original assignee: Institute of Basic Medical Sciences of CAMS
Current assignee: Institute of Basic Medical Sciences of CAMS
Filing date: 2024-04-15
Publication date: 2024-07-09
Anticipated expiration: 2044-04-15

Abstract

本发明公开了XPO1抑制剂和METTL3抑制剂联合在制备治疗胃癌的药物中的应用，本发明首次发现XPO1抑制剂KPT‑330和METTL3抑制剂STM2457两者联合对胃癌的治疗具有协同增效的作用，通过联合KPT‑330和STM2457的方式能够显著提高对胃癌的治疗效果，本发明为胃癌治疗这一技术领域提供了一种全新的治疗方案，具有重要的科学意义和临床应用价值。

Description

XPO1抑制剂和METTL3抑制剂联合在制备治疗胃癌的药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体地，涉及一种治疗胃癌的联合用药物组合物，更具体地，涉及XPO1抑制剂KPT-330和METTL3抑制剂STM2457联合在制备治疗胃癌的药物中的应用。

背景技术

胃癌（gastric cancer，GC）是全球范围内常见的消化系统恶性肿瘤之一，严重威胁着人类健康。胃癌的发病机制与胃黏膜损伤、亚硝基化合物攻击及幽门螺杆菌感染等因素密切相关。由于胃癌及癌前病变起病隐匿，非特异性症状较多，临床上难以早期发现，因此，早期胃癌的诊断率、手术切除率均较低。因其早期症状缺乏特异性，大多数患者在确诊时已为晚期并伴有肿瘤浸润和转移，治疗效果欠佳，晚期胃癌患者的5年生存率较低。

目前，胃癌常采用手术治疗、放射治疗、靶向治疗、化学治疗和免疫治疗等，其中，以手术治疗（手术切除）为主。然而，单纯的手术治疗的效果欠佳，患者术后5年生存率仍较低，仅为20%-30%。化疗作为胃癌手术后的辅助治疗，能够提高手术治疗效果，降低复发率，是综合治疗胃癌的主要方式。然而，目前临床上应用的化疗方案仅能缓解症状、延长生存期，且化疗方案具有较强的毒副作用，因此，目前本领域仍缺乏有效治疗胃癌的药物。

可见，针对胃癌治疗的化疗方案存在较强的毒副作用以及本领域仍缺乏更有效的胃癌治疗药物的现状极大地影响了目前临床上胃癌治疗的疗效，因此，寻找新型的更加有效的胃癌治疗手段具有特殊的重要性和迫切性。

发明内容

有鉴于此，为了解决目前本领域面临的上述技术问题，本发明的目的在于提供一种治疗胃癌的联合用药物组合物，为胃癌的治疗提供有效的药物联用策略，所述联合用药物组合物包含XPO1抑制剂和METTL3抑制剂，所述XPO1抑制剂为KPT-330，所述METTL3抑制剂为STM2457，本发明首次发现KPT-330和STM2457两者联合对胃癌的治疗具有协同增效的作用。

本发明的上述发明目的通过以下技术方案得以实现：

本发明的第一方面提供了一种用于治疗和/或预防胃癌的药物组合物。

进一步，所述药物组合物包含XPO1抑制剂和METTL3抑制剂。

进一步，所述XPO1抑制剂为KPT-330，或其可药用盐、水合物、对映异构体、非对映异构体、溶剂合物或结晶形式；

所述METTL3抑制剂为STM2457，或其可药用盐、水合物、对映异构体、非对映异构体、溶剂合物或结晶形式。

进一步，所述XPO1抑制剂和METTL3抑制剂的浓度比例为( 0.01 μM - 50 μM )：(0.01 μM - 100 μM )。

进一步，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体和/或辅料。

在本发明的具体实施方案中，本发明的发明人首次发现XPO1抑制剂KPT-330和METTL3抑制剂STM2457两者联合对胃癌的治疗具有协同增效的作用，本发明通过实验证明了两者联合能够显著抑制胃癌细胞的生长、促进胃癌细胞的凋亡，并且能够显著抑制胃癌类器官的增殖、促进胃癌类器官的凋亡，表现出显著的协同杀伤效果。

在本发明中，所述XPO1抑制剂是指核输出蛋白1（exportin 1，XPO1）抑制剂，XPO1是一种转运受体蛋白，负责超过200多种蛋白的出核转运，在血液系统恶性肿瘤中，XPO1常过度表达而导致细胞生长凋亡调节异常或细胞周期异常，因此，抑制XPO1的转运功能可影响肿瘤细胞增殖、分化、凋亡、黏附及转移等过程，达到抗肿瘤的目的。

在一些实施方案中，所述XPO1抑制剂包括任何能够抑制XPO1表达的试剂，示例性地，所述XPO1抑制剂包括但不限于：KPT-330、KPT-185、KPT-251、KPT-276、KPT-8620、KPT-335、德琪医药ATG-016、德琪医药ATG-527、君境生物WJ01075、君境生物WJ01024。在本发明的具体实施方案中，所述XPO1抑制剂为KPT-330，购自于GLPBIO，其对应的产品目录号为GC12467。

在本发明中，所述METTL3抑制剂是指甲基转移酶样3（methyltransferase like3，METTL3）抑制剂，目前，相关研究人员已经证明了METTL3抑制剂通过结合METTL3的SAM（S-adenosyl methionine，腺苷甲硫氨酸）结合位点抑制METTL3的甲基转移酶的活性，进而显著降低了白血病患者来源的肿瘤细胞系的生长和增殖，并诱发白血病患者来源的肿瘤细胞凋亡以杀死癌细胞。

在一些实施方案中，所述METTL3抑制剂包括任何能够抑制METTL3表达的试剂，示例性地，所述METTL3抑制剂包括但不限于：STM2457、STC-15、Cpd-564。在本发明的具体实施方案中，所述METTL3抑制剂为STM2457，购自于MedChemExpress，其对应的产品目录号为HY-134836。

在一些实施方案中，所述可药用盐是指与无机和/或有机酸形成的酸式盐及与无机和/或有机碱形成的碱式盐。另外，当所述化合物含有碱性部分（例如但不限于，吡啶或咪唑）和酸性部分（例如但不限于，羧酸）时，可形成两性离子且所述两性离子包含在本申请所述的可药用盐中。优选为药用（即无毒的、生理学上可接受的）盐，但其它盐也是有用的。所述化合物的可药用盐可例如通过以下方法形成：在介质中使所述化合物与一定量的酸或碱反应，所述介质为例如盐在其中析出的介质或为含水介质（反应后冻干）。

具体的可药用盐包括在可靠的医学判断范围内，适合与人和低等动物的组织接触而没有过度毒性、刺激性、变态反应等，并且与合理的益处或危险比例相称的那些盐。药学上可接受的盐（可药用盐）在本领域是公知的。本发明所述化合物的可药用盐包括衍生自合适的无机和有机酸和无机和有机碱的盐。

药学上可接受的无毒的酸加成盐的实例是与无机酸形成的盐，例如盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸和高氯酸，或与有机酸形成的盐，例如乙酸、草酸、马来酸、酒石酸、枸橼酸、琥珀酸或丙二酸。也包括使用本领域常规方法形成的盐，例如，离子交换方法。其它药学上可接受的盐包括：已二酸盐、海藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、重硫酸盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡萄糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙磺酸盐、乳糖酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐。衍生自合适的碱的药学上可接受的盐包括碱金属、碱土金属、铵盐。代表性的碱金属或碱土金属盐包括钠、锂、钾、钙、镁盐等。

在一些实施方案中，所述水合物是指与水相结合的化合物，本领域技术人员将理解，有机化合物可以与溶剂形成复合物，其在该溶剂中发生反应或从该溶剂中沉淀或结晶出来，这些复合物称为溶剂合物。当溶剂是水时，复合物称为水合物。

在一些实施方案中，所述溶剂合物是指通常由溶剂分解反应形成的与溶剂相结合的化合物或其盐的形式。这个物理缔合可包括氢键键合。常规溶剂包括水、甲醇、乙醇、乙酸、DMSO、THF、乙醚等。在一些情况下，所述溶剂合物将能够分离，例如，当一个或多个溶剂分子掺入结晶固体的晶格中时。溶剂合物包括溶液状态的溶剂合物和可分离的溶剂合物。

在一些实施方案中，所述结晶形式是指特定晶体堆积排列的化合物的结晶形式。不同的结晶形式通常具有不同的X射线衍射图、红外光谱、熔点、密度、硬度、晶体形状、光电性质、稳定性和溶解度。重结晶溶剂、结晶速率、贮存温度和其他因素可导致一种结晶形式占优。化合物的各种多晶型物可在不同的条件下通过结晶制备。

在一些实施方案中，所述KPT-330，或其可药用盐、水合物、对映异构体、非对映异构体、溶剂合物或结晶形式，所述STM2457，或其可药用盐、水合物、对映异构体、非对映异构体、溶剂合物或结晶形式，其均在本发明的保护范围内，在本发明的一个实施方案中，所述药物组合物为包含KPT-330和STM2457的药物组合物。

在本发明中，所述治疗和/或预防是指推迟疾病发展、防止疾病发展和/或降低将会发展或预期会发展的所述症状的严重性。因此，这些术语包括改善已有的疾病症状、预防另外的症状、改善或预防症状的潜在的代谢原因、抑制障碍或疾病，例如，阻止障碍或疾病的发展、减轻障碍或疾病、使障碍或疾病退行、减轻由疾病或障碍导致的病症，或使疾病或障碍的症状停止。

在本发明中，所述药学上可接受的载体和/或辅料包括但不限于：稀释剂、粘合剂、表面活性剂、致湿剂、吸附载体、润滑剂、填充剂、崩解剂。

在一些实施方案中，所述稀释剂包括但不限于：乳糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、淀粉、水等。所述粘合剂包括但不限于：淀粉、预胶化淀粉、糊精、麦芽糖糊精、蔗糖、阿拉伯胶、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素、海藻酸及海藻酸盐、黄原胶、羟丙基纤维素等。所述表面活性剂包括但不限于：十二烷基硫酸钠、硬脂酸单甘油酯、十六烷醇等。所述致湿剂包括但不限于：甘油、淀粉等。所述吸附载体包括但不限于：淀粉、乳糖、斑脱土、皂粘土等。所述润滑剂包括但不限于：硬脂酸锌、滑石粉、硬脂酸钙和镁、聚乙二醇、聚氧乙烯单硬脂酸酯、单月桂蔗糖酸酯、十二烷基硫酸镁等。所述填充剂包括但不限于：甘露醇、木糖醇、山梨醇、麦芽糖、葡萄糖、乳糖、蔗糖、糊精、淀粉等。所述崩解剂包括但不限于：交联乙烯吡咯烷酮、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基甲基、交联羧甲基纤维素钠、大豆多糖等。

在一些实施方案中，所述药物组合物包括单一的复方制剂或两种单独的单方制剂的组合，具体地，所述复方制剂为包含KPT-330和STM2457的复方制剂，所述单方制剂的组合为包含KPT-330的单方制剂和包含STM2457的单方制剂的组合。在具体实施方案中，所述单方制剂的组合中两种单方制剂的施用方式为同时施用或依次施用。

在一些实施方案中，所述药物组合物中的KPT-330和STM2457可以同时、分别或相继给药。其中，同时是指两种药物同步给药。如果不同时给药，则在一个时间范围内相继给药，使得二者在同一时间范围内可在治疗上起作用。因此，相继给药可允许在提供一种药物后5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、1小时、2小时或几小时内给药另一种药物，前提是第一种给药的药物的循环半衰期使得二者同时存在治疗有效量。各成分间给药的时间延迟将根据成分的准确性质、其间的相互作用、及其各自的半衰期而改变。与同时或相继不同，分别是指给药一种药物和另一种药物之间的间隔显著，即当给药第二种药物时，第一种给药的药物可以不再以治疗有效量存在于血流中。

本发明的第二方面提供了一种用于治疗和/或预防胃癌的药物制剂。

进一步，所述药物制剂包含本发明第一方面所述的药物组合物。

进一步，所述药物制剂的剂型包括经肠胃道给药剂型、非经胃肠道给药剂型。

进一步，所述经肠胃道给药剂型包括片剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、干混悬剂、散剂、缓释剂、泡腾剂、乳剂、混悬剂、糖浆剂、滴剂、咀嚼剂；

所述非经胃肠道给药剂型包括注射给药剂型、呼吸道给药剂型、腔道给药剂型、粘膜给药剂型、皮肤给药剂型。

在一些实施方案中，所述注射给药剂型包括但不限于：静脉注射剂、肌内注射剂、皮下注射剂、皮内注射剂及腔内注射剂等多种注射剂；所述呼吸道给药剂型包括但不限于：喷雾剂、气雾剂、粉雾剂等；所述腔道给药剂型包括但不限于：栓剂、气雾剂、泡腾片、滴剂、滴丸剂等，用于在直肠、阴道、尿道、鼻腔、耳道等；所述粘膜给药剂型包括但不限于：滴眼剂、滴鼻剂、眼用软膏剂、含漱剂、舌下片剂、粘贴片剂、贴膜剂等；所述皮肤给药剂型包括但不限于：外用溶液剂、洗剂、搽剂、软膏剂、硬膏剂、糊剂、贴剂等。

在一些实施方案中，所述药物组合物或药物制剂还可包含其它能够用于治疗和/或预防、或辅助治疗和/或预防的药物或试剂，所述其它药物或试剂并无特别限制，只要其能够对胃癌产生预期的治疗和/或预防、或辅助治疗和/或预防的效果，其均在本发明的保护范围内。

在一些实施方案中，所述其它能够用于治疗和/或预防、或辅助治疗和/或预防的药物或试剂包括但不限于：化疗药物，具体地，所述化疗药物包括但不限于：紫杉烷类药物（紫杉醇、多西他赛、卡巴他赛）、抗生素类药物（阿霉素、表柔比星、柔红霉素、吡柔比星、依托泊苷、伊立替康、米托蒽醌）、抗代谢类药物（顺铂、卡铂、洛铂、奈达铂、奥沙利铂、吉西他滨、5-氟尿嘧啶）、烷化剂类药物（环磷酰胺、异环磷酰胺）。

在一些实施方案中，本发明所述的药物组合物或药物制剂的适合的给药剂量根据制剂化方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、病态、饮食、给药时间、给药途径、排泄速度及反应灵敏性之类的因素而可以进行多种处方，熟练的医生通常能够容易地决定处方及所希望的对治疗有效的给药剂量，只要其能够对胃癌产生预期的治疗和/或预防效果，这样的给药剂量均在本发明的保护范围内。

本发明的第三方面提供了一种体外非治疗目的地抑制胃癌细胞或胃癌类器官生长和/或促进胃癌细胞或胃癌类器官凋亡的方法。

进一步，所述方法包括：采用本发明第一方面所述的药物组合物或本发明第二方面所述的药物制剂处理胃癌细胞或胃癌类器官。

在本发明的具体实施方案中，本发明通过实验证明了所述药物组合物具有显著协同抑制胃癌细胞系和胃癌类器官生长和增殖的作用，因此，所述药物组合物能够作为一种以非治疗目的地抑制胃癌细胞或胃癌类器官生长、增殖的抑制剂，以用于科研领域，例如更深入地研究胃癌细胞系或胃癌类器官生长和代谢机制或行为、筛选能够用于治疗胃癌的潜在药物等。

本发明还提供了一种治疗和/或预防胃癌的方法，所述方法包括：给有需要的受试者施用治疗和/或预防有效量的本发明第一方面所述的药物组合物或本发明第二方面所述的药物制剂。

在本发明中，所述受试者包括哺乳动物和非哺乳动物。哺乳动物的实例包括但不限于哺乳动物纲的任何成员：人、非人灵长类如黑猩猩及其它猿类和猴类；农场动物如牛、马、绵羊、山羊、猪；家养动物如兔、狗和猫；实验室动物，包括啮齿类动物如大鼠、小鼠和豚鼠等。非哺乳动物的实例包括但不限于鸟、鱼等。在本发明的一个实施方案中，所述受试者为人。术语受试者包括确诊患者。

在本发明中，所述有效量是指有效产生理想预防、缓解或治疗效果的化合物的量。根据化合物、症状及其严重程度、被治疗哺乳动物的年龄等因素的不同，达到有效量的本发明所述的药物组合物或药物制剂的量也会随之变化，但可由本领域普通技术人员根据其所掌握的本领域的知识结合本发明公开的内容惯常地确定具体用量，能够产生上述效果的剂量均在本发明的保护范围内。

在一些实施方案中，所述药物组合物或药物制剂的施用可采用任何形式进行，包括但不限于：采用口服、局部、肠胃外、肌内、静脉内、皮下、经皮（其可包括渗透增强剂）、口腔和/或栓剂施用，以及其它施用途径进行。在本发明的一个实施方案中，如前所述的活性化合物或化合物组合以本领域公知的固体剂型提供。最有效的剂型将取决于所选特定药剂的生物利用度或药代动力学以及患者的疾病严重程度。口服剂型是特别优选的，因为其易于施用且预期的有利患者依从性。

在一些实施方案中，可采用口服给药、注射给药或局部给药的给药方式向受试者施用所述药物组合物或药物制剂。例如，该方法可以包括向受试者施用药物组合物或药物制剂一天三次、一天一次、每两天一次等。在一些实施例中，注射给药可以包括皮下注射、肌内注射、静脉内注射等。在一些实施例中，注射给药可以包括将药物组合物直接注射到病灶或靠近病灶的区域中。在一些实施例中，可以采用不同给药方式的组合。

本发明的第四方面提供了如下任一方面应用：

(1) XPO1抑制剂和METTL3抑制剂联合在制备用于治疗和/或预防胃癌的药物组合物中的应用；

(2) XPO1抑制剂和METTL3抑制剂联合在制备用于治疗和/或预防胃癌的药物制剂中的应用；

(3) XPO1抑制剂和METTL3抑制剂联合在体外非治疗目的地抑制胃癌细胞或胃癌类器官生长和/或促进胃癌细胞或胃癌类器官凋亡中的应用。

所述METTL3抑制剂为STM2457，或其可药用盐、水合物、对映异构体、非对映异构体、溶剂合物或结晶形式；

所述XPO1抑制剂和METTL3抑制剂的浓度比例为( 0.01 μM - 50 μM )：( 0.01 μM- 100 μM )。

本发明具有的有益效果：

本发明首次发现KPT-330和STM2457两者联合对胃癌的治疗具有协同增效的作用，通过联合KPT-330和STM2457的方式能够显著提高对胃癌的治疗效果、实现更优的抗肿瘤疗效，本发明为胃癌治疗这一技术领域提供了一种全新的治疗方案，具有重要的科学意义和临床应用价值。

附图说明

图1为胃癌细胞体外增殖抑制实验中KPT-330、STM2457单独用药及KPT-330+STM2457联合用药对应的结果图；

图2为患者来源的胃癌类器官增殖抑制实验中KPT-330、STM2457单独用药及KPT-330+STM2457联合用药对应的结果图；

图3为KPT-330、STM2457单独用药及KPT-330+STM2457联合用药对胃癌类器官增殖抑制的形态学观察结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，具体实施例仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

本发明所使用的药物、试剂和原料为本领域普通技术人员容易获得，如无特殊说明，均可从商业途径得到，本发明未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测，特别地，下面实施例仅用于说明本发明，不应以任何方式限制本发明的范围。

实施例1 胃癌细胞体外增殖抑制实验

1、实验材料

人胃癌细胞系HGC27细胞，CCK-8试剂盒，1640培养基，药物：KPT-330（GLPBIO，GC12467）、STM2457（MedChemExpress，HY-134836）。

2、实验方法

（1）取对数生长期的HGC27细胞按一定密度（1500-2000/孔）种于96孔板中，共分为三组，每组设置6个浓度梯度，每个浓度梯度设置5个复孔，每孔加入100 μL培养基，培养24小时；

（2）24小时后弃去旧培养基，加入含有不同药物浓度的培养基，浓度梯度设置6个浓度，其中组1单独加入STM2457，浓度设置为：10 mM、1 mM、100 μM、10 μM、1 μM、100 nM、10nM、0 nM；组2单独加入KPT-330，浓度设置为：10 mM、1 mM、100 μM、10 μM、1 μM、100 nM、10nM、0 nM；组3同时加入STM2457以及KPT-330，浓度设置为：依次为10 mM+10 mM、1 mM+1 mM、100 μM+100 μM、10 μM+10 μM、1 μM+1 μM、100 nM+100 nM、10 nM+10 nM、0 nM+0 nM；

（3）培养48小时后加入10 μL CCK-8检测试剂，置于37℃培养箱中孵育2小时，然后用酶标仪检测450 nm的OD值。

以DMSO组为基准，细胞存活率=（加药组OD值-空白组OD值）/（DMSO组OD值-空白组OD值）×100%，比较各组细胞的存活情况。

3、实验结果

检测结果如图1和表1所示，结果显示，在单独使用STM2457的组1中，其IC50约为19.635 μM，在单独使用KPT-330的组2中，其IC50约为192.764 nM，在联合使用KPT-330和STM2457的组3中，IC50值得到显著的降低，为4.518 nM，远低于单独用药时的IC50值。由此可见，KPT-330和STM2457联合使用能够显著提升对胃癌细胞的杀伤作用，提示其为胃癌的临床治疗的潜在治疗方案。

表1 胃癌细胞体外增殖抑制实验中KPT-330、STM2457单独给药及联合用药IC50值

为了进一步验证KPT-330和STM2457两者联合对胃癌具有协同增效的治疗效果，本实施例以DMSO组为基准，对各组抑制率进行了相应的协同效果评价，采用金氏公式对联合用药效应进行分析（Q值）：Q=E_(A+B)/(E_A+E_B-E_A×E_B)，其中，E_(A+B)：KPT-330和STM2457两者联合用药对胃癌细胞的抑制率，E_A：A药（KPT-330）单独用药对胃癌细胞的抑制率，E_B：B药（STM2457）单独用药对胃癌细胞的抑制率。当Q＞1.15时，表示两药为协同作用；0.85≤Q≤1.15时，表示两药为相加作用；Q＜0.85时，表示两药为拮抗作用。

KPT-330和STM2457联合用药对胃癌细胞增殖抑制的影响与联合指数评价的结果如表2所示，结果显示，在KPT-330和STM2457的浓度为0.01 μM+0.01 μM、0.1 μM+0.1 μM、1μM+1 μM时，KPT-330和STM2457显示出对胃癌细胞的协同杀伤效果（Q＞1.15），联合KPT-330和STM2457比单独使用两种药物对胃癌细胞的抑制效果显著更优。

以上结果证明了KPT-330和STM2457两者联合使用能够产生明显的抗肿瘤协同增效作用，从而有助于大大降低KPT-330的临床使用剂量而能够始终保持其高效的治疗效果、防止由于长期单独使用两种药物产生的耐药性，避免大剂量使用药物造成的严重不良反应，提高用药安全性和病人的生活质量。

表2 KPT-330和STM2457联合用药对胃癌细胞增殖抑制的影响与联合指数评价

实施例2 患者来源胃癌类器官体外增殖抑制实验

1、实验材料

HBSS/DPBS、传代消化液、基质胶、1% BSA溶液、完全培养基、冰盒、384孔板、无菌枪头、无酶枪头、无菌EP管及离心管、吸水纸；低温水平离心机、CO₂培养箱、生物安全柜、酶标仪、可拍照的倒置显微镜；KPT-330（GLPBIO，GC12467）、STM2457（MedChemExpress，HY-134836）；

患者来源（季XX，男，经病理诊断为胃癌）的胃癌类器官：术中从患者体内获得胃癌组织，清洗并剪碎成大约1 mm³的组织块，使用组织消化液在37℃下进行消化15分钟，用缓冲液终止消化，并使用100 μm孔径的筛网进行过滤。滤液离心后，获得细胞沉淀，加基质胶，将细胞和基质胶的混合物加入到培养皿中，添加胃癌类器官培养基进行铺板培养，传代。

类器官是能忠实体现原组织生理学的体外技术，可为药物开发和组织工程等应用提供快速且经济高效的模型。其原理是将患者来源的健康组织或新鲜肿瘤组织经体外三维细胞培养后建立的与患者体内基因形态、结构形态和生理特性高度相似的一种立体模型。肿瘤类器官与其来源的母体肿瘤组织具有高度相似性，并且能保留原本的基因特征和异质性，患者来源的类器官在新药靶点发现和验证、肿瘤药物筛选、个体化治疗和转化医学等临床癌症研究中有重要的价值。因此，本实施例用患者来源的胃癌细胞培养的胃癌类器官来表征单独用药和联合用药的效果更为精准，更具有临床应用意义。

2、实验方法

（1）前期准备

准备好需要检测的类器官培养样本（P10以内，且生长状态良好的类器官），384孔板提前37℃预热，并在盖板上做好相应的标记（类器官种类及批次、每组药物区域划分等），提前一夜从-20℃环境中将基质胶转移至4℃复融，准备足量的培养基和冰枪头，提前预热水浴锅37℃、预冷离心机4℃。

（2）实验操作

灭菌：超净工作台紫外灭菌30 min；

清洗：取出需要检测的类器官样本培养板，用1 mL的枪头将旧培养基吸弃，用1-2mL的HBSS/DPBS清洗1-2次，将残留的培养基洗掉；

消化：加入1.5 mL传代消化液至培养板中，轻轻吹打基质胶，吹打均匀后在37℃培养箱或37℃水浴锅中放置15 min；

终止消化：15 min后加入HBSS（消化液：培养基=2：1）终止消化；

细胞量计数：加1 mL HBSS吹打混匀，取20 μL混悬液点在计数板上，计数并记录；

铺胶：将复融好的基质胶置于冰上，计算好所需要的基质胶的量，用冰枪头加入到含细胞沉淀的离心管中，吹打混匀；

加培养基：准备好所需要的培养基，在37℃水浴锅中预热培养基，384孔板拿出后，以20 μL/孔将癌种培养基加入到含类器官的孔中，放入培养箱。

（3）配制实验药物

根据实验方案设计图，计算配制每种药物各个浓度所需药物量及其培养基的量（每种药物设置5/7个浓度梯度，每个浓度5个重复，可根据实验进行调整）。铺板24 h后加药（Day0），加药48 h后换药（Day3）。

KPT-330：浓度梯度设置6个浓度，依次为500 μM、50 μM、5 μM、500 nM、50 nM、0nM，每个浓度5个重复。

STM2457：浓度梯度设置6个浓度，依次为1 mM、100 μM、10 μM、1 μM、100 nM、0 nM，每个浓度5个重复。

KPT-330+STM2457：浓度梯度设置6个浓度，依次为500 μM+1 mM、50 μM+100 μM、5μM+10 μM、500 nM+1 μM、50 nM+100 nM、0 nM+0 nM，每个浓度5个重复。

（4）检测细胞存活率（Day6）

3D活力检测试剂提前放入4℃冰箱过夜融化，检测试剂使用前在22℃水浴中平衡30 min，轻轻搅拌均匀后再分装使用。加检测试剂前培养板先拿出室温（22℃-25℃）放置30min，准备无酶枪头，超净工作台紫外照射30 min，正式检测前每种药物每种浓度以及阴性对照需要在显微镜下拍照。具体实验操作如下：

室温放置后的384孔板中用无酶枪头加入与培养试剂等量的检测试剂（避光条件下加样），枪头1孔1换，避免污染检测试剂，微孔震荡仪上700 rpm震荡5 min，充分混匀使细胞裂解，室温避光放置25 min，平衡发光信号，用烧热的针头烫破每孔中液体的气泡后使用酶标仪读数并保存。根据酶标仪测定的数据，先计算每种药物每种浓度的平均值，除去每组复孔之间偏差数据最大的孔，计算剩余每孔的相对存活率。

3、实验结果

检测结果如图2和表3所示，结果显示，在对胃癌类器官进行药物处理时，单独使用STM2457时，其IC50约为165.27 μM，单独使用KPT-330时，其IC50约为107.05 μM，联合使用KPT-330和STM2457时，IC50值得到显著的降低，为15.46 μM，远低于两种药物单独用药时的IC50值。

单独用药和联合用药对胃癌类器官增殖抑制的形态学观察结果图如图3所示，结果显示，无论是单独使用KPT-330、单独使用STM2457，还是联合两种药物处理类器官，随着药物浓度的增加，类器官的形态都发生了变化，体现为类器官的增殖速度降低、尺寸变小，在高浓度下类器官发生凋亡破碎；而联合使用KPT-330和STM2457对胃癌类器官的增殖抑制效果以及凋亡促进效果更为强烈。由此可见，KPT-330和STM2457联合使用能够显著提升对胃癌类器官的杀伤作用，为胃癌的临床治疗提供了潜在的指导。

表3 患者来源的胃癌类器官增殖抑制实验中KPT-330、STM2457单独用药及联合用药IC50值

为了进一步验证KPT-330和STM2457两者联合对胃癌具有协同增效的治疗效果，本实施例以DMSO组为基准，对各组抑制率进行了相应的协同效果评价，采用金氏公式对联合用药效应进行分析（Q值）：Q=E_(A+B)/(E_A+E_B-E_A×E_B)，其中，E_(A+B)：KPT-330和STM2457两者联合用药对胃癌类器官的抑制率，E_A：A药（KPT-330）单独用药对胃癌类器官的抑制率，E_B：B药（STM2457）单独用药对胃癌类器官的抑制率。当Q＞1.15时，表示两药为协同作用；0.85≤Q≤1.15时，表示两药为相加作用；Q＜0.85时，表示两药为拮抗作用。

KPT-330和STM2457联合用药对胃癌类器官增殖抑制的影响与联合指数评价的结果如表4所示，结果显示，在KPT-330和STM2457的浓度为50 μM+100 μM、5 μM+10 μM、500 nM+1 μM时，金式公式的结果Q＞1.15，即显示出对胃癌类器官的协同杀伤效果，表明在上述浓度下联合KPT-330和STM2457比单独使用两种药物对胃癌类器官的抑制效果显著更强。以上结果进一步证明了KPT-330和STM2457两者联合对胃癌具有协同增效的治疗效果。

表4 KPT-330和STM2457联合用药对胃癌类器官增殖抑制的影响与联合指数评价

Claims

1.一种用于治疗胃癌的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的活性成分由XPO1抑制剂和METTL3抑制剂组成；

所述XPO1抑制剂为KPT-330，或其可药用盐；

所述METTL3抑制剂为STM2457，或其可药用盐；

所述XPO1抑制剂和METTL3抑制剂的浓度比例为( 0.01 μM - 50 μM )：( 0.01 μM -100 μM )。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包含药学上可接受的辅料。

3.一种用于治疗胃癌的药物制剂，其特征在于，所述药物制剂包含权利要求1或2所述的药物组合物。

4.XPO1抑制剂和METTL3抑制剂联合在制备用于治疗胃癌的药物组合物中的应用；

所述XPO1抑制剂为KPT-330，或其可药用盐；

所述METTL3抑制剂为STM2457，或其可药用盐。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述XPO1抑制剂和METTL3抑制剂的浓度比例为( 0.01 μM - 50 μM )：( 0.01 μM - 100 μM )。

6.XPO1抑制剂和METTL3抑制剂联合在制备用于治疗胃癌的药物制剂中的应用；

所述XPO1抑制剂为KPT-330，或其可药用盐；

所述METTL3抑制剂为STM2457，或其可药用盐。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述XPO1抑制剂和METTL3抑制剂的浓度比例为( 0.01 μM - 50 μM )：( 0.01 μM - 100 μM )。

8.XPO1抑制剂和METTL3抑制剂联合在制备用于体外非治疗目的地抑制胃癌细胞或胃癌类器官生长和/或促进胃癌细胞或胃癌类器官凋亡的药物中的应用；

所述XPO1抑制剂为KPT-330，或其可药用盐；

所述METTL3抑制剂为STM2457，或其可药用盐。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述XPO1抑制剂和METTL3抑制剂的浓度比例为( 0.01 μM - 50 μM )：( 0.01 μM - 100 μM )。