CN102408495A

CN102408495A - 具有抗炎症活性的香菇β-葡聚糖及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN102408495A
Application number: CN2011104495847A
Authority: CN
Inventors: 许小娟; 陈攀; 贾学伟; 张俐娜
Original assignee: Wuhan University WHU
Current assignee: Wuhan University WHU
Priority date: 2011-12-29
Filing date: 2011-12-29
Publication date: 2012-04-11
Anticipated expiration: 2031-12-29
Also published as: CN102408495B

Abstract

本发明公开了一种香菇β-葡聚糖，其主链为β-(1→3)-D-葡聚糖，平均每7～10个主链葡萄糖残基含2～3个(1→6)键接的葡萄糖侧基，它在水中呈棒状链。其制法是，将香菇子实体粉碎，脱脂，用生理盐水浸泡，离心，收集残渣；取残渣在100～130℃沸水下提取，离心，收集残渣在纯水中进行超声提取，离心得提取液；提取液脱色后，除去游离的蛋白质，用水透析，浓缩，冷冻干燥得到香菇β-葡聚糖。本发明香菇β-葡聚糖具有显著的激活巨噬细胞作用，以及较高的抑制炎症调节因子NO和TNF-α释放的效应，可用于制备提高免疫机能和抗炎症的药物或保健品。

Description

具有抗炎症活性的香菇β-葡聚糖及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种具有抗炎症活性的棒状香菇β-葡聚糖及其制备方法。它属于高分子物理领域，也属于生物学领域。

背景技术

炎症是宿主对内在或外在环境刺激的一种响应。该响应过程严格受控于生理条件，短时间内的急性炎症具有治疗效果，然而由于生理失控导致炎症持续时间过长或转变成慢性炎症时，它就会对机体产生伤害作用，甚至导致一些重大疾病出现，如心脑血管疾病、糖尿病、关节炎、老年痴呆症、自身免疫性疾病和癌症等。近年来，很多研究者致力于抗炎症药物的研究和开发。在众多抗炎症药物中，有机化合物类居多，不可避免地会产生不同程度的毒副作用。

香菇(Lentinus edodes)是一种兼食用和药用为一体的大型真菌，香菇中最重要的香菇多糖有很明显的抗肿瘤活性，增强宿主对细菌、真菌、病毒和寄生虫感染的抵抗能力，增强自然杀伤细胞和细胞毒性T细胞活性等多种生物学和免疫学活性。香菇多糖有多种类型，目前研究表明，香菇多糖中存在四种杂多糖(L-FI_L-FIVn)和两种葡聚糖(L-FV和L-FVIn)。但对香菇多糖的进一步研究相对较少，尤其是新多糖的发现和研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有抗炎症活性的棒状香菇β-葡聚糖，该葡聚糖具有显著的抑制LPS(革兰氏阴性菌)诱导的炎症调节因子一氧化氮(NO)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素IL-1α和IL-1γα等的释放。

本发明的另一个目的在于还提供上述香菇β-葡聚糖的制备方法，该制备方法简单易行、成本较低廉。

本发明目的还在于提供上述香菇β-葡聚糖在制备抗炎症或提高免疫机能的药物或保健品中的用途。

为实现上述目的，本发明首先提供一种具有抗炎症活性的棒状香菇β-葡聚糖，其主链为β-(1→3)-葡聚糖，平均每7～10个主链葡萄糖残基含2～3个(1→6)键接的葡萄糖侧基，它在水中呈棒状链。研究表明，该葡聚糖具有显著的抑制LPS(革兰氏阴性菌)诱导的炎症调节因子一氧化氮(NO)和肿瘤坏死因子(TNF-α)释放的作用。

本发明还提供了上述棒状香菇β-葡聚糖的制备方法，其包括如下步骤：将香菇子实体粉碎，脱脂，用生理盐水浸泡，离心，收集残渣；取残渣在100～130℃沸水下提取，离心，收集残渣在纯水中进行超声提取，离心得提取液；提取液脱色后，除去游离的蛋白质，用水透析，浓缩，冷冻干燥得到白色香菇β-葡聚糖纯品。

对于香菇子实体，采用干燥子实体，更易于粉碎，优选可以粉碎至3～7目，使其提取效率更高。

其中所述脱脂的方法可以采用索氏提取法提取去除脂肪，具体可以依次用乙酸乙酯、丙酮作为提取溶剂进行，提取6～10小时。

生理盐水浸泡可以去除细胞壁外的水溶性小分子，浸泡时间为8～24小时，重复1～4次。

其中所述沸水提取方法是用残渣3～5倍体积的水煮20～40分钟，重复1～4次。

其中所述超声提取的条件为温度20～30℃，频率18～30KHz，功率400～600W，时间16～20min。

其中所述脱色可以用H₂O₂进行脱色。

其中所述游离蛋白的去除采用Sevag法除去游离的蛋白质，一般6～10次。

本发明香菇β-葡聚糖具有显著的抑制LPS(革兰氏阴性菌)诱导的炎症调节因子一氧化氮(NO)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素IL-1α和IL-1γα等的释放。因而本发明香菇β-葡聚糖可以用于抗炎症或提高免疫机能的药物或保健品中。进而，本发明还提供含有上述香菇β-葡聚糖的抗炎症或提高免疫机能的药物或保健品。

本发明具有如下优点：

1、该β-葡聚糖来源于我国特产资源，产量丰富、成本低廉；

2、该β-葡聚糖提取工艺简单，提取过程容易控制；

3、该β-葡聚糖抑制NO和TNF-α效率高，可达70％以上；抑制IL-1α和IL-1γα可达100％。

4、该β-葡聚糖无毒副作用，生物相容性好。

附图说明

图1.香菇β-葡聚糖LNT-S的13CNMR，IR，和GC图谱。

图2.香菇β-葡聚糖LNT-S对LPS体外诱导的炎症因子--NO(图2A)和TNF-α(图2B)的抑制率。

图3.LNT-S对炎症因子合成酶iNOS(图3A)、炎症基因iNOSmRNA(图3B)和TNF-αmRNA(图3C)表达的抑制。

图4.LNT-S对LPS诱导的炎症因子IL-1α和IL-1γα的抑制率。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的生化试剂为市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1

购买市售的湖北随州产香菇子实体，取香菇子实体200g，粉碎至5目，依次用乙酸乙酯600ml、丙酮600ml进行索氏提取各8小时。然后用0.9％NaCl水溶液在室温下搅拌过夜，离心，收集残渣，重复三次。残渣用4倍体积的热水(100℃)浸提三次，每次半小时，离心，收集残渣；残渣在纯水中进行超声波提取(25℃，20KHz，600W，16min)离心得提取液；上清提取液用H₂O₂脱色，6次Sevag法除去游离的蛋白质后，分别用清水和二次蒸馏水透析(cutoff M_w＝8,000)，浓缩，冷冻干燥得到香菇β-葡聚糖(LNT-S)。用NMR，IR，GC-MS等证明LNT-S为β-(1→3)-D-葡聚糖，平均每10个主链葡萄糖残基含3个(1→6)键接的葡萄糖侧基。用粘度计、光散射及其与尺寸排除色谱联用仪检测各多糖试样的特性粘数、重均分子量和均方旋转半径，按照高分子溶液理论和方法及计算机模拟，计算出表征高分子在溶液中链的分子参数，由此推断出LNT-S在水溶液中呈现棒状链构象。

香菇β-葡聚糖LNT-S对LPS诱导的炎症因子——NO和TNF-α的抑制率见图2。(NO用Griess试剂检测，TNF-α用Elisa Kit检测)

显然，该多糖对LPS诱导的炎症因子具有抑制率具有剂量依赖性。高剂量时显示较高抗炎症活性，NO和TNF-α抑制率分别达70％以上。同时，LNT-S显著抑制了LPS诱导的炎症调节酶iNOS和炎症基因iNOSmRNA、TNF-αmRNA的表达，抑制率达70％以上，结果见图3。

实施例2

购买市售的湖北随州产香菇子实体，取香菇子实体200g，粉碎至3目，依次用乙酸乙酯500ml、丙酮500ml进行索氏提取各6小时。然后用生理盐水在室温下搅拌8小时，离心，收集残渣，重复4次。残渣用5倍量的热水(120℃)浸提4次，每次20min，离心，收集残渣；残渣在纯水中进行超声波提取(30℃，18KHz，500W，20min)离心得提取液；上清提取液用H₂O₂脱色，5次Sevag法除去游离的蛋白质后，分别用清水和二次蒸馏水透析(cutoff M_w＝8,000)，浓缩，冷冻干燥得到香菇β-葡聚糖(LNT-S)。经鉴定，其与实施例1制得的香菇β-葡聚糖(LNT-S)相同。

实施例3

购买市售的湖北随州产香菇子实体，取香菇子实体200g，粉碎至3目，依次用乙酸乙酯500ml、丙酮500ml进行索氏提取各10小时。然后用生理盐水在室温下搅拌24小时，离心，收集残渣，重复2次。残渣用5倍量的热水(120℃)浸提2次，每次40min，离心，收集残渣；残渣在纯水中进行超声波提取(20℃，30KHz，500W，18min)离心得提取液；上清提取液用H₂O₂脱色，10次Sevag法除去游离的蛋白质后，分别用清水和二次蒸馏水透析(cutoff M_w＝8,000)，浓缩，冷冻干燥得到香菇β-葡聚糖(LNT-S)。经鉴定，其与实施例1制得的香菇β-葡聚糖(LNT-S)相同。

实施例4

所用香菇子实体为福建产。将香菇子实体200g粉碎至7目依次用乙酸乙酯500mL、丙酮700mL进行索氏提取各8小时。然后用0.9％NaCl水溶液在室温下提取三次：浸泡在0.9％NaCl水溶液中过夜，离心，收集残渣。残渣用热水(130℃)提取三次，每次半小时，离心，收集残渣；残渣在纯水中进行超声波提取(25℃，30KHz，400W，20min)，离心得提取液；上清提取液用H₂O₂脱色，8次Sevag法除去游离的蛋白质后，分别用清水和二次蒸馏水透析，浓缩，冷冻干燥得到香菇β-葡聚糖(LNT-S)。用NMR、IR、GC-MS等证明LNT-S为β-(1→3)-D-葡聚糖，平均每7个主链葡萄糖残基含2个(1→6)键接的葡萄糖侧基。多糖构象表征方法同实施例1。结果表明该多糖在水溶液中呈现棒状链构象，而在DMSO中均呈现单股无规线团构象。LNT-S对LPS诱导的炎症调节因子的抑制作用见图4。

由图4可知，LNT-S完全抑制了LPS诱导的炎症因子IL-1α和IL-1γα的释放，即抑制率达到100％。

因此，香菇β-葡聚糖可用于制备抗炎症药物和提高机体免疫功能的保健品，具有极大的推广和应用前景。

Claims

1.一种具有抗炎症活性的香菇β-葡聚糖，主链为β-(1→3)-葡聚糖，平均每7～10个主链葡萄糖残基含2～3个(1→6)键接的葡萄糖侧基。

2.权利要求1所述香菇β-葡聚糖的制备方法，其包括如下步骤：将香菇子实体粉碎，脱脂，用生理盐水浸泡，离心，收集残渣；取残渣在100～130℃沸水下提取，离心，收集残渣在纯水中进行超声提取，离心得提取液；提取液脱色后，除去游离的蛋白质，用水透析，浓缩，冷冻干燥得到香菇β-葡聚糖。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述脱脂的方法是依次用乙酸乙酯、丙酮进行索氏提取去除脂肪。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，生理盐水浸泡时间为8～24小时，重复1～4次。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述沸水提取方法是用残渣3～5倍体积的水煮20～40分钟，重复1～4次。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，超声提取的条件为20～30℃，频率18～30KHz，功率400～600W，时间16～20min。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述脱色是用H₂O₂脱色。

8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，采用Sevag法除去游离的蛋白质。

9.权利要求1所述的香菇β-葡聚糖在制备抗炎症或提高免疫机能的药物或保健品中的应用。

10.含有权利要求1所述香菇β-葡聚糖的抗炎症或提高免疫机能的药物或保健品。