CN115368483A - 一种香菇菌渣蛋白聚糖及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及菌渣废弃物利用领域，特别是涉及一种香菇菌渣蛋白聚糖及其制备方法和应用。本发明提供的香菇菌渣蛋白聚糖是一种从香菇菌渣中获得的高纯度且质量稳定，可长期保存，不会变质的蛋白聚糖，具有显著的抗炎作用，可以应用于动物饲料或者药品中。

Description

一种香菇菌渣蛋白聚糖及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及菌渣废弃物利用领域，特别是涉及一种香菇菌渣蛋白聚糖及其制备方法和应用。
背景技术
香菇是我国栽培量最高、产量最大的食用菌，其营养价值高，具有显著的健康促进作用。然而，随着香菇产业的快速发展，香菇栽培采收后产生了大量的废弃培养基及菌渣。香菇采收后，大部分菌渣得不到及时处理和有效的利用，不仅会造成资源上的浪费，还容易发生霉变，污染水源和土地资源，给环境带来了很大影响。香菇菌渣中通常还有菌丝残体及经酶解、结构发生质变的粗纤维等复合物，其中含有丰富的蛋白质、氨基酸、碳水化合物、维生素和微量元素等营养活性成分。因此，科学有效地利用香菇菌渣，对环境保护、废物回收利用以及农业经济生可持续发展具有重要意义。
蛋白聚糖是一种蛋白或者肽与多糖形成的复合物，即蛋白质或者肽通过共价键连接到多糖侧链的特定位置，多糖的含量显著高于蛋白质或肽。蛋白聚糖因具有抗肿瘤、抗菌和抗凝血等多种功效，在食品、医药和生物材料等领域具有广阔的开发与应用前景。
目前，香菇菌渣的资源化利用已受到广泛关注，包括用于制备农作物有机肥或生态环境修复材料等多种用途，但是大多数用途的研究不够深入，香菇菌渣的高值化利用率还相对较低。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种香菇菌渣蛋白聚糖及其制备方法和应用。本发明提供的香菇菌渣蛋白聚糖是一种从香菇菌渣中获得的高纯度且质量稳定的蛋白聚糖，具有显著的抗炎作用，可以应用于动物饲料或者药品中。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了一种香菇菌渣蛋白聚糖，包括多糖和连接于多糖的蛋白；所述蛋白和多糖的质量比为8.5：88.9；所述多糖包括6～12个重复单元；
所述重复单元的主链含有α-1,3-糖苷键连接的阿拉伯糖残基、β-1,2-糖苷键连接的阿拉伯糖残基、β-1,4-糖苷键连接的木糖残基、α-1,6-糖苷键连接的葡萄糖残基、α-1,4-糖苷键连接的葡萄糖残基、α-1,4-糖苷键连接的甘露糖残基、β-1,3-糖苷键连接的半乳糖残基和α-1,2-糖苷键连接的木糖残基；
所述α-1,4-糖苷键连接的甘露糖残基的C-3位上连接着半乳糖侧基，所述β-1,3-糖苷键连接的半乳糖残基的C-6位上连接着木糖侧基，所述α-1,2-糖苷键连接的木糖残基的C-6位上连接着甘露糖侧基；
所述蛋白中的氨基酸包括：天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨酸和精氨酸；
所述蛋白中的苏氨酸连接在所述α-1,6-连接的葡萄糖残基的C-3位上；
所述蛋白中的丝氨酸连接在所述α-1,4-连接的葡萄糖残基的C-6位上；
所述香菇菌渣蛋白聚糖的平均分子量为1.1万～1.3万道尔顿。
优选的，所述葡萄糖残基、阿拉伯糖残基、半乳糖残基、木糖残基和甘露糖残基的摩尔比为1.2:1.2:1.0:2.3:1.1。
本发明还提供了上述香菇菌渣蛋白聚糖的制备方法，包括以下步骤：
1)将香菇菌渣和提取剂混合，进行高温高压处理；所述高温高压处理的条件包括：温度120～130℃，压力0.05～0.25MPa，时间15～30min；所述提取剂包括缓冲液或水；所述缓冲液的pH为4.5～6.0；
2)将高温高压处理的菌渣用复合酶进行酶解，得到提取液；
所述复合酶包括纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶；以香菇菌渣的质量计，所述纤维素酶的添加量为1100～1500U/g，所述木聚糖酶的添加量为400～800U/g，所述β-葡聚糖酶的添加量为1100～1500U/g；
3)将所述提取液和无水乙醇混合醇沉，得到醇沉物；
4)将所述醇沉物进行第一透析，得到初级蛋白聚糖；所述第一透析的截留分子量为3500道尔顿；
5)将所述初级蛋白聚糖层析分离，得到洗脱液；所述层析分离的凝胶柱包括丙烯葡聚糖凝胶柱；所述层析时的洗脱剂包括NH4HCO3溶液；所述NH4HCO3溶液的浓度为0.1～0.3mol/L；
6)将所述洗脱液进行第二透析，得到所述香菇菌渣蛋白聚糖；所述第二透析的截留分子量为3500道尔顿。
优选的，所述提取液和乙醇溶液混合前，还包括将提取液依次进行浓缩和离心处理；所述离心的转速为8000～10000rpm，所述离心的时间为20～30min。
优选的，所述浓缩后的提取液的料液比为1g：(6～10)mL。
优选的，所述提取液和无水乙醇混合后，混合液中乙醇的体积浓度为70％～80％。
优选的，所述提取液和无水乙醇混合醇沉的时间为8～12h。
优选的，所述第一透析和第二透析的时间分别为48～72h。
优选的，所述酶解的转速为100～200r/min，所述酶解的温度为40～55℃，所述酶解的时间为4～7h。
本发明还提供了上述的香菇菌渣蛋白聚糖或利用上述制备方法制备得到的香菇菌渣蛋白聚糖在制备抗炎药物中的应用。
有益效果：
本发明提供了一种香菇菌渣蛋白聚糖，包括多糖和连接于多糖的蛋白；所述蛋白和多糖的质量比为8.5：88.9；所述多糖包括6～12个重复单元；所述重复单元的主链含有α-1,3-糖苷键连接的阿拉伯糖残基、β-1,2-糖苷键连接的阿拉伯糖残基、β-1,4-糖苷键连接的木糖残基、α-1,6-糖苷键连接的葡萄糖残基、α-1,4-糖苷键连接的葡萄糖残基、α-1,4-糖苷键连接的甘露糖残基、β-1,3-糖苷键连接的半乳糖残基和α-1,2-糖苷键连接的木糖残基；所述α-1,4-糖苷键连接的甘露糖残基的C-3位上连接着半乳糖侧基，所述β-1,3-糖苷键连接的半乳糖残基的C-6位上连接着木糖侧基，所述α-1,2-糖苷键连接的木糖残基的C-6位上连接着甘露糖侧基；所述蛋白中的氨基酸包括：天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨酸和精氨酸；所述蛋白中的苏氨酸连接在所述α-1,6-连接的葡萄糖残基的C-3位上；所述蛋白中的丝氨酸连接在所述α-1,4-连接的葡萄糖残基的C-6位上；所述香菇菌渣蛋白聚糖的平均分子量为1.1万～1.3万道尔顿。本发明提供的香菇菌渣蛋白聚糖是一种从香菇菌渣中获得的高纯度且质量稳定，可长期保存，不会变质的蛋白聚糖，具有显著的抗炎作用，可以应用于动物饲料或者药品中。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为香菇菌渣蛋白聚糖的化学结构式，其中n＝6～12；
图2为香菇菌渣蛋白聚糖的红外吸收光谱；
图3为香菇菌渣蛋白聚糖的核磁共振H谱；
图4为香菇菌渣蛋白聚糖的核磁共振C谱；
图5为香菇菌渣蛋白聚糖的1H-13C HSQC图谱；
图6为Griess标准曲线；
图7为香菇菌渣蛋白聚糖对LPS诱导巨噬细胞RAW264.7释放NO的抑制作用；
图8为香菇菌渣蛋白聚糖对LPS诱导巨噬细胞RAW264.7释放TNF-α的影响；
图9为香菇菌渣蛋白聚糖对LPS诱导巨噬细胞RAW264.7释放IL-1β的影响；
图10为香菇菌渣蛋白聚糖对LPS诱导巨噬细胞RAW264.7释放IL-6的影响；
其中图7～10中LEPS1为香菇菌渣蛋白聚糖。
具体实施方式
本发明提供了一种香菇菌渣蛋白聚糖，包括多糖和连接于多糖的蛋白；所述蛋白和多糖的质量比为8.5：88.9。在本发明中，所述香菇菌渣蛋白聚糖的平均分子量为1.1万～1.3万道尔顿，优选为1.15～1.2万道尔顿，更优选为1.18万道尔顿。
在本发明中，所述多糖包括6～12个重复单元；所述重复单元的主链含有α-1,3-糖苷键连接的阿拉伯糖残基、β-1,2-糖苷键连接的阿拉伯糖残基、β-1,4-糖苷键连接的木糖残基、α-1,6-糖苷键连接的葡萄糖残基、α-1,4-糖苷键连接的葡萄糖残基、α-1,4-糖苷键连接的甘露糖残基、β-1,3-糖苷键连接的半乳糖残基和α-1,2-糖苷键连接的木糖残基。
在本发明中，所述α-1,4-糖苷键连接的甘露糖残基的C-3位上连接着半乳糖侧基，所述β-1,3-糖苷键连接的半乳糖残基的C-6位上连接着木糖侧基，所述α-1,2-糖苷键连接的木糖残基的C-6位上连接着甘露糖侧基。
在本发明中，所述葡萄糖残基、阿拉伯糖残基、半乳糖残基、木糖残基和甘露糖残基的摩尔比优选为1.2:1.2:1.0:2.3:1.1。
在本发明中，所述蛋白中的氨基酸包括：天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨酸和精氨酸。
在本发明中，所述香菇菌渣蛋白聚糖中优选包括以下含量的氨基酸：天冬氨酸6.45mg/g、苏氨酸6.55mg/g、丝氨酸6.59mg/g、谷氨酸7.71mg/g、脯氨酸4.26mg/g、甘氨酸4.75mg/g、丙氨酸3.61mg/g、半胱氨酸0.84mg/g、缬氨酸2.91mg/g、甲硫氨酸0.83mg/g、异亮氨酸1.58mg/g、亮氨酸1.79mg/g、酪氨酸0.80mg/g、苯丙氨酸1.32mg/g、赖氨酸2.12mg/g、组氨酸1.25mg/g和精氨酸1.57mg/g。
在本发明中，所述蛋白中的苏氨酸连接在所述α-1,6-连接的葡萄糖残基的C-3位上；所述蛋白中的丝氨酸连接在所述α-1,4-连接的葡萄糖残基的C-6位上。
本发明所述香菇菌渣蛋白聚糖的化学结构式见图1，其中聚合度n优选为6～12。
本发明提供的香菇菌渣蛋白聚糖质量稳定，可长期保存不会变质，纯度超过95％，具有体外抑制LPS(细菌脂多糖)诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7释放NO的作用，还可以降低LPS诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7产生炎症因子TNF-α，IL-1β和IL-6的水平，可以作为抗炎试剂或者抗炎症相关的肿瘤药物开发中的原料。
本发明还提供了上述香菇菌渣蛋白聚糖的制备方法，包括以下步骤：
1)将香菇菌渣和提取剂混合，进行高温高压处理；所述高温高压处理的条件包括：温度120～130℃，压力0.05～0.25MPa，时间15～30min；所述提取剂包括缓冲液或水；所述缓冲液的pH为4.5～6.0；
2)将高温高压处理的菌渣用复合酶进行酶解，得到提取液；
所述复合酶包括纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶；以香菇菌渣的质量计，所述纤维素酶的添加量为1100～1500U/g，所述木聚糖酶的添加量为400～800U/g，所述β-葡聚糖酶的添加量为1100～1500U/g；
3)将所述提取液和无水乙醇混合醇沉，得到醇沉物；
4)将所述醇沉物进行第一透析，得到初级蛋白聚糖；所述第一透析的截留分子量为3500道尔顿；
5)将所述初级蛋白聚糖层析分离，得到洗脱液；所述层析分离的凝胶柱包括丙烯葡聚糖凝胶柱；所述层析时的洗脱剂包括NH4HCO3溶液；所述NH4HCO3溶液的浓度为0.1～0.3mol/L；
6)将所述洗脱液进行第二透析，得到所述香菇菌渣蛋白聚糖；所述第二透析的截留分子量为3500道尔顿。
本发明将香菇菌渣和提取剂混合，进行高温高压处理。
在本发明中，所述香菇菌渣优选包括香菇菌渣粉，所述香菇菌渣粉的粒径优选为50～100目，香菇菌渣粉更容易被复合酶降解，使香菇菌渣粉中的活性物质充分释放。
本发明优选在所述高温高压处理前还包括将香菇菌渣和提取剂混合。在本发明中，所述提取剂优选包括缓冲液或水，进一步优选为磷酸氢二钠-柠檬酸的缓冲液。在本发明中，所述缓冲液的pH优选为4.5～6.0，进一步优选为5.0。在本发明中，所述缓冲液的浓度优选为0.1～0.4moL/L，进一步优选为0.1～0.3moL/L。本发明对缓冲液的种类没有特殊要求，满足上述pH值和浓度的要求即可。本发明实施例中的缓冲液优选为磷酸氢二钠-柠檬酸的缓冲液。
在本发明中，所述提取液中磷酸氢二钠的浓度优选为0.1～0.4moL/L，进一步优选为0.2moL/L；所述柠檬酸的浓度为优选0.1～0.3moL/L，进一步优选为0.1moL/L，在本发明的提取剂的条件下复合酶的酶活性最强，利于提高后续酶解步骤的酶解效率。
在本发明中，所述香菇菌渣的质量和所述提取剂的体积比优选为1g：(10～40)mL，进一步优选为1g：(15～30)mL，更优选为1g：20mL，本发明特定的料液比可使提取物中的多糖含量和得率最高。
将香菇菌渣和提取剂混合后，本发明进行高温高压处理。在本发明中，所述高温高压处理的温度优选120～130℃，进一步优选为120～125℃，更优选为121℃；所述高温高压处理的压力优选为0.05～0.0.25MPa，进一步优选为0.1～0.2MPa，更优选为0.15MPa；所述高温高压处理的时间优选为15～30min，进一步优选为20～30min，更优选为30min。本发明高温高压条件处理香菇菌渣后，使香菇菌渣的结构更加松散，更利于酶解步骤的进行，提高活性物质的释放。
高温高压处理后，本发明将高温高压处理的菌渣用复合酶进行酶解，得到提取液。在本发明中，所述复合酶优选包括纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶；以香菇菌渣的质量计，所述纤维素酶的添加量优选为1100～1500U/g，进一步优选为1150～1300U/g，更优选为1200U/g；所述木聚糖酶的添加量优选为400～800U/g，进一步优选为450～650U/g，更优选为500U/g；所述β-葡聚糖酶的添加量优选为1100～1500U/g，进一步优选为1150～1300U/g，更优选为1200U/g。本发明特定的复合酶组合对香菇菌渣的酶解效率最好，提高了香菇菌渣的利用率。本发明对纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶的来源没有特殊要求，采用普通市售产品即可。
在本发明中，所述酶解的转速优选为100～200r/min，进一步优选为150～180r/min，更优选为160r/min；所述酶解的温度优选为40～50℃，进一步优选为43～48℃，更优选为45℃；所述酶解的时间优选为5～7h，进一步优选为5.5～6.5h，更优选为6h，本发明特定的酶解条件使酶解效率达到最高。
本发明在酶解后还优选包括灭酶和离心。本发明优选在酶解后对酶解液进行灭酶步骤，以使酶解液中的复合酶灭活。本发明灭酶优选沸水浴灭酶，沸水浴的时间优选为5～30min，进一步优选为8～20min，更优选为10min。
灭酶后，本发明将灭酶后的酶解液进行离心，得到滤液和滤渣，所述离心的转速优选为6000～10000r/min，进一步优选为7000～9000r/min，更优选为8000r/min；所述离心的时间优选为10～30min，进一步优选为13～20min，更优选为15min。
得到所述滤液后，本发明优选将所述滤渣按上述方案进行高温高压处理和酶解处理1～2次，合并多次处理的滤液，得到所述提取液。本发明通过将处理后的滤渣再次进行高温高压处理和酶解，可以提高香菇菌渣的原料利用率。
得到所述提取液后，本发明优选将提取液依次进行浓缩和离心处理，得到上清液为离心后的提取液。在本发明中，所述浓缩优选包括减压浓缩；所述浓缩后的提取液的料液比优选为1g：(6～10)mL，进一步优选为1g：(8～10)mL，更优选为1g：8mL。本发明通过将提取液浓缩至适宜的料液比，可以有利于后续制备纯沉物，从而提高香菇菌渣蛋白聚糖的纯度。
在本发明中，所述离心的转速优选为8000～10000rpm，进一步优选为8500～9500rpm，更优选为9000rpm；所述离心的时间优选为20～30min，进一步优选为25～30min，更优选为30min。本发明通过在适宜的转速和时间下离心，能够将提取液中的不溶物分离干净，从而提高香菇菌渣蛋白聚糖的纯度。
得到离心后的提取液后，本发明所述得到离心后的提取液和无数乙醇混合醇沉，得到醇沉物。
在本发明中，所述混合醇沉的方式优选包括：向离心后的提取液中缓慢加入无水乙醇，边加边搅拌，至混合液中乙醇的体积浓度达到70％～80％，室温静置8～12h，离心，得到沉淀为所述醇沉物；所述混合液中乙醇的体积浓度进一步优选为75％～80％，更优选为80％；所述室温的温度优选为20～25℃；所述静置的时间进一步优选为10～12h，更优选为12h；所述离心的转速和时间同上，在此不作赘述。本发明通过将适宜量的无水乙醇和离心后的提取液混合，可以得到特定分子量的蛋白聚糖，通过静置适宜的时间，可以尽可能将提取液中的蛋白聚糖沉淀出来，制备得到的蛋白聚糖抗炎效果更好。
得到醇沉物后，本发明优选将醇沉物加蒸馏水充分溶解，离心后取上清液用于第一透析，得到透析液；所述离心的转速和时间同上，在此不作赘述；所述第一透析的截留分子量为3500道尔顿。在本发明中，所述第一透析的时间优选为48～72h，进一步优选为60～72h，更优选为72h。本发明通过适宜的截留分子量进行透析，可以将小分子糖和蛋白聚糖分离，从而进一步提高蛋白聚糖的纯度。
得到所述透析液后，本发明优选将所述透析液进行冷冻干燥处理，得到所述初级蛋白聚糖。本发明对所述冷冻干燥处理的方法没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知的方法即可。
得到所述初级蛋白聚糖后，本发明优选将所述初级蛋白聚糖溶解在蒸馏水中，离心，取上清液用于层析分离，根据紫外和视差信号，在信号峰的峰顶处收集洗脱液；所述离心的转速和时间同上，在此不在赘述。本发明所述层析分离的凝胶柱包括丙烯葡聚糖凝胶柱，优选为Sephacryl S-300HR凝胶柱；所述层析时的洗脱剂包括NH4HCO3溶液；所述NH4HCO3溶液的浓度为0.1～0.3mol/L，优选为0.2mol/L。本发明通过适宜的层析分离，可以进一步提高蛋白聚糖的纯度。
得到所述洗脱液后，本发明将所述洗脱液进行第二透析，得到所述香菇菌渣蛋白聚糖；所述第二透析的截留分子量为3500道尔顿。在本发明中，所述第二透析的时间优选为48～72h，进一步优选为60～72h，更优选为72h。
本发明提供的方法制备得到的香菇菌渣蛋白聚糖质量稳定，可长期保存不会变质，纯度超过95％，具有体外抑制LPS(细菌脂多糖)诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7释放NO的作用，还可以降低LPS诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7产生炎症因子TNF-α，IL-1β和IL-6的水平，可以作为抗炎试剂或者抗炎症相关的肿瘤药物开发中的原料。
本发明还提供了上述香菇菌渣蛋白聚糖或利用上述制备方法制备得到的香菇菌渣蛋白聚糖在制备抗炎药物中的应用。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例和附图对本发明提供的一种香菇菌渣蛋白聚糖及其制备方法和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
香菇菌渣蛋白聚糖的制备
1、香菇菌渣的预处理：香菇采摘后的废弃香菇菌渣晒干、粉碎，过60目筛，得到香菇菌渣粉，其中香菇菌渣来源于上海诚营农业发展有限公司；
2、香菇菌渣高温高压辅助复合酶提取：称取10.0g香菇菌渣粉到锥形瓶中，加入200mL提取剂，其中提取剂为磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，磷酸氢二钠的浓度为0.2moL/L，柠檬酸的浓度为0.1moL/L，pH＝5.0；摇匀后置入高压灭菌锅内，设置温度121℃、0.15MPa，30min，反应结束后，取出并冷却至室温。加入复合酶进行酶解，其中复合酶为纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶，三种酶均购自上海源叶生物科技有限公司；以香菇菌渣的质量计，纤维素酶的添加量为1500U/g，木聚糖酶的添加量为1000U/g，β-葡聚糖酶的添加量为1500U/g。在摇床中160r/min，45℃恒温振荡条件下酶解6h，酶解反应结束后，沸水浴10min灭酶，然后8000r/min离心15min，得到滤液和滤渣。
3、将步骤2得到的滤渣按步骤2所述的方法再次进行高温高压辅助复合酶提取，合并两次滤液，并减压浓缩至料液比为1g:8mL；浓缩液再用离心机以9000rpm转速离心30min取上清。
4、向步骤3得到的上清液中缓慢加入无水乙醇，边加边搅拌，至乙醇含量达到80％(体积分数)，室温静置12h，9000rpm离心去除醇沉上清，收集沉淀。沉淀加水充分溶解，离心机以8000rpm转速离心30min取上清。用3500道尔顿大小的透析袋常温下，蒸馏水透析72h，透析液冷冻干燥后得857.4mg灰色固体样品(得率为28.58％)。
5、取1g步骤4得到的固体样品，加20mL水溶解后，离心，上清液釆用
Figure BDA0003851209680000091
primeFPLC层析系统分离，经Sephacryl S-300HR凝胶柱(Φ4.6cm×100cm)对样品进行凝胶柱层析分离，以2倍柱体积的0.2mol/LNH4HCO3溶液做洗脱液进行洗脱，根据视差检测器的信号，在信号峰顶处收集样品浓缩，用3500道尔顿大小的透析袋常温下，蒸馏水透析48h后冷冻干燥即得香菇菌渣蛋白聚糖(850mg)，苯酚硫酸法检测其多糖含量为88.9％，BCA法测定其蛋白含量为8.5％。
经高效凝胶色谱(waters公司2695泵分离系统)串联TSK-GEL系列G3000PWXL和G4000PWXL色谱柱(7.8mm×300mm，TOSOH，日本)进行分离，以八角度激光光散射检测器(MALLS，Wyatt公司)和Waters 2414示差检测器(RI)进行分析，结果见图2～图5。
由图2可知，在3418.39cm-1处有一个强而宽的吸收峰，这是O-H和N-H的拉伸振动。在2933.14cm-1处的弱吸收峰被指定为C-H的拉伸振动。1714.43cm-1处的弱吸收峰为羰基的吸收峰。1638.80cm-1和1402.41cm-1处的特征吸收峰分别为酰胺和氨基的弯曲振动吸收峰。1070.29cm-1和1044.05cm-1处的特征吸收峰说明在蛋白聚糖中存在吡喃糖苷。897.51cm-1处的吸收峰归因于C-H拉伸振动，这表明蛋白聚糖组分中存在β构型。
由图2～5可知，该蛋白聚糖的分子量为1.18万道尔顿。通过高效阴离子色谱对其单糖组成进行分析，结果显示该蛋白聚糖的多糖部分含有葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖和甘露糖残基，摩尔比为1.2:1.2:1.0:2.3:1.1。用NMR、IR和甲基化分析证明该蛋白聚糖的多糖部分主链含有α-1,3-连接的阿拉伯糖残基(图1中的A)、β-1,2-连接的阿拉伯糖残基(图1中的B)、β-1,4-连接的木糖残基(图1中的C)、α-1,6-连接的葡萄糖残基(图1中的D)、α-1,4-连接的葡萄糖残基(图1中的E)、α-1,3,4-连接的甘露糖残基(图1中的F)、β-1,3,6-连接的半乳糖残基(图1中的G)和α-1,2,4-连接的木糖残基(图1中的H)，甘露糖残基、半乳糖残基和木糖残基上还分别连接着半乳糖(图1中的I)，木糖(图1中的J)和甘露糖侧基(图1中的K)。氨基酸分析结果显示该蛋白聚糖的蛋白部分由天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸和甘氨酸等氨基酸组成，通过β-消除反应证实蛋白部分分别通过苏氨酸和丝氨酸连接在α-1,6-连接的葡萄糖残基和α-1,4-连接的葡萄糖残基的C-3位和C-6位。综合以上结果，得出该蛋白聚糖的结构式如图1所示。
实施例2
香菇菌渣蛋白聚糖体外抑制LPS诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7释放NO活性分析
1.样品的配制
精密称取实施例1中步骤5制备的固体样品4mg，加入1mL的PBS溶液使其充分溶解后，18000g离心30min除菌，上清液利用无菌滤头转移至无菌管中，稀释成100μg/mL、200μg/mL和400μg/mL的溶液，备用。
2.抑制LPS诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7释放NO活性分析
Griess试剂配制：0.1wt.％N-萘乙二胺盐酸盐水溶液与1wt.％对氨基苯磺酸溶液等体积混合。用NaNO2溶液绘制Griess标准曲线，见图6。
抑制LPS诱导巨噬细胞RAW264.7释放NO：将RAW264.7用无色1640培养液稀释成5×105个/mL的细胞悬液，每组160μL，37℃培养细胞至完全贴壁后，样品组加入20μL LPS(LPS的作用浓度2μg/mL)和20μL待测样品(待测样品的作用浓度分别为100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL)，LPS组每孔加入20μL LPS(LPS的作用浓度2μg/mL)和20μLPBS(pH＝7)，PBS组每孔加入40μLPBS，37℃培养48h后吸取上清液100μL，加入50μL Griess试剂，反应10min，测定543nm处的OD值，代入标准曲线计算NO释放量。结果见图7和表1。
表1 不同组NO释放量
Figure BDA0003851209680000111
注：“-”表示PBS组，下表同理。
从图7和表1中可以看出香菇菌渣蛋白聚糖具有抑制LPS诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7释放NO活性，起到一定的抗炎作用。
实施例3
香菇菌渣蛋白聚糖降低LPS诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7产生炎症因子TNF-α，IL-1β和IL-6的水平分析
1、样品的配制
精密称取样品约4mg，加入定量的PBS溶液使其充分溶解后，18000g离心30min除菌，上清液用无菌滤头过滤，转移至无菌管中，稀释成100μg/mL、200μg/mL和400μg/mL的溶液，备用。
2、LPS诱导的巨噬细胞RAW264.7上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6含量的测定及比较
将RAW264.7用无色1640培养液稀释成5×105个/mL的细胞悬液，每组160μL，37℃培养细胞至完全贴壁后，样品组加入20μL LPS(LPS的作用浓度2μg/mL)和20μL待测样品(待测样品的作用浓度分别为100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL)，LPS组每孔加入20μL(LPS的作用浓度2μg/mL)和20μL PBS(pH＝7)，PBS组每孔加入40μLPBS，37℃培养48h后吸取上清液，利用北京正四柏公司的TNF-α、IL-1β和IL-6测定用ELISA试剂盒测定上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量。结果见图8～10和表2。
表2 不同组上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量结果
Figure BDA0003851209680000121
从图8～10和表2的结果可以看出，香菇菌渣蛋白聚糖具有很好的抑制LPS刺激巨噬细胞RAW264.7释放炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的活性，具有显著的体外抗炎活性。
综上所述，本发明提供的香菇菌渣蛋白聚糖是一种从香菇菌渣中获得的高纯度且质量稳定的蛋白聚糖，具有显著的抗炎作用，可以应用于动物饲料或者药品中。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种香菇菌渣蛋白聚糖，其特征在于，包括多糖和连接于多糖的蛋白；所述蛋白和多糖的质量比为8.5：88.9；所述多糖包括6～12个重复单元；
所述重复单元的主链含有α-1,3-糖苷键连接的阿拉伯糖残基、β-1,2-糖苷键连接的阿拉伯糖残基、β-1,4-糖苷键连接的木糖残基、α-1,6-糖苷键连接的葡萄糖残基、α-1,4-糖苷键连接的葡萄糖残基、α-1,4-糖苷键连接的甘露糖残基、β-1,3-糖苷键连接的半乳糖残基和α-1,2-糖苷键连接的木糖残基；
所述α-1,4-糖苷键连接的甘露糖残基的C-3位上连接着半乳糖侧基，所述β-1,3-糖苷键连接的半乳糖残基的C-6位上连接着木糖侧基，所述α-1,2-糖苷键连接的木糖残基的C-6位上连接着甘露糖侧基；
所述蛋白中的氨基酸包括：天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨酸和精氨酸；
所述蛋白中的苏氨酸连接在所述α-1,6-连接的葡萄糖残基的C-3位上；
所述蛋白中的丝氨酸连接在所述α-1,4-连接的葡萄糖残基的C-6位上；
所述香菇菌渣蛋白聚糖的平均分子量为1.1万～1.3万道尔顿。
2.根据权利要求1所述的香菇菌渣蛋白聚糖，其特征在于，所述葡萄糖残基、阿拉伯糖残基、半乳糖残基、木糖残基和甘露糖残基的摩尔比为1.2:1.2:1.0:2.3:1.1。
3.权利要求1或2所述香菇菌渣蛋白聚糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将香菇菌渣和提取剂混合，进行高温高压处理；所述高温高压处理的条件包括：温度120～130℃，压力0.05～0.25MPa，时间15～30min；所述提取剂包括缓冲液或水；所述缓冲液的pH为4.5～6.0；
2)将高温高压处理的菌渣用复合酶进行酶解，得到提取液；
所述复合酶包括纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶；以香菇菌渣的质量计，所述纤维素酶的添加量为1100～1500U/g，所述木聚糖酶的添加量为400～800U/g，所述β-葡聚糖酶的添加量为1100～1500U/g；
3)将所述提取液和无水乙醇混合醇沉，得到醇沉物；
4)将所述醇沉物进行第一透析，得到初级蛋白聚糖；所述第一透析的截留分子量为3500道尔顿；
5)将所述初级蛋白聚糖层析分离，得到洗脱液；所述层析分离的凝胶柱包括丙烯葡聚糖凝胶柱；所述层析时的洗脱剂包括NH4HCO3溶液；所述NH4HCO3溶液的浓度为0.1～0.3mol/L；
6)将所述洗脱液进行第二透析，得到所述香菇菌渣蛋白聚糖；所述第二透析的截留分子量为3500道尔顿。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述提取液和乙醇溶液混合前，还包括将提取液依次进行浓缩和离心处理；所述离心的转速为8000～10000rpm，所述离心的时间为20～30min。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述浓缩后的提取液的料液比为1g：(6～10)mL。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述提取液和无水乙醇混合后，混合液中乙醇的体积浓度为70％～80％。
7.根据权利要求3或6所述的制备方法，其特征在于，所述提取液和无水乙醇混合醇沉的时间为8～12h。
8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述第一透析和第二透析的时间分别为48～72h。
9.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述酶解的转速为100～200r/min，所述酶解的温度为40～55℃，所述酶解的时间为4～7h。
10.权利要求1或2所述的香菇菌渣蛋白聚糖或利用权利要求3～9任一项所述制备方法制备得到的香菇菌渣蛋白聚糖在制备抗炎药物中的应用。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102408495A (zh) * 2011-12-29 2012-04-11 武汉大学 具有抗炎症活性的香菇β-葡聚糖及其制备方法和应用
CN113209144A (zh) * 2021-05-25 2021-08-06 上海市农业科学院 一种香菇菌渣的提取方法、香菇菌渣提取物和应用

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