CN102391168A - 对称性双功能偶联剂及其偶合分子显像剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供对称性双功能偶联剂化合物(I)N-芴甲氧羰基-L-beta-谷氨酸-二-N-琥珀酰亚胺(Fmoc-beta-Glu(OSu)-OSu)及其生产方法。在上述基础上，通过偶联配体分子，制备了系列新型含对称性双功能偶联基beta-Glu(β-谷氨酸基)的偶合化合物，其结构式如(II)所示，其中M1为靶分子T1的含-NH2配基，M2为靶分子T2的含-NH2配基；L为联结基；S为报告信号基团。本发明化合物(I)，已用于偶联靶向整合素αvβ3受体配基、胃泌素释放肽受体配基、端粒酶抑制剂药效基团和表皮生长因子受体配基，合成了多种偶合双配基分子显像剂和偶合三配基分子显像剂。本发明还涉及化合物(I)及其系列偶合化合物(II)在制备显像剂药物中的应用。

Description

对称性双功能偶联剂及其偶合分子显像剂
【技术领域】
本发明涉及对称性双功能偶联剂、偶合化合物及其制备方法，以及其在制备显像剂药物中的应用。
【背景技术】
多靶分子显像(MMI)是对某种病变组织细胞中的两种或两种以上靶分子进行显像的分子影像学技术，包括多种显像剂-多靶显像、融合分子多靶显像、偶合分子多靶显像和多靶多功能分子显像[1]，其中，偶合分子多靶显像是最有前景的多靶分子显像技术之一，包括多价分子显像和杂交分子显像。偶合分子多靶显像是针对某病变组织细胞中多种(个)靶分子，设计合成某种特异性偶合分子显像剂，选择性地作用于多个靶点，对多种靶分子同时进行分子显像。如果偶联分子显像剂中连接的多个配基分子药效基团是相同的，即为多价分子显像剂，用其进行分子显像即为多价分子显像，多价分子显像是偶合分子多靶显像最简单最基本形式；若连接的多个配基分子药效基团是不同的，即为杂交分子显像剂，用其进行多靶分子显像即为杂交分子显像，多价分子显像是杂交分子显像的特殊形式。偶合分子多靶显像使用的多靶点显像剂能同时结合多个靶分子，是分别与多个靶分子结合以及同时与多个靶分子结合的多种结合方式的综合结果，可增加结合位点总数、增强总结合力以及提高靶/非靶信号比值，因而可显著提高分子显像效果。用多价多肽、多价抗体、杂二聚肽或杂二聚大分子多肽蛋白质显像剂进行杂交分子显像已有文献报道。但是，用非多肽蛋白质小分子显像剂进行的杂交小分子显像尚无文献报道，研究杂交小分子显像，并解决其小分子配基偶联关键性技术问题，具有非常重要价值，可开辟杂交小分子多靶显像新领域。
偶合分子多靶显像剂的研制是分子影像学研究的热点领域[1]。18F(或99mTc、64Cu、68Ga)标记多价环状精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)，是研究较多的多价分子显像剂[2]。双靶受体诊疗剂111In或177Lu标记杂二聚肽(RGD-111In-DTPA-Tyr3-octreotate或RGD-177Lu-DTPA-Tyr3-octreotate)[3]，是研制最早的杂交多肽分子探针。尔后，核医学杂交分子显像剂[123I]-mAb-穿膜肽(tat)和[111In]-mIgG-tat也有文献报道[4]。虽然杂交双抗体全氟化碳微泡超声造影剂[5]和杂交双抗体氧化铁微球MRI造影剂[6]也很有应用前景，但研究最为深入的仍是偶合分子正电子发射断层(PET)显像剂。以整合素αvβ3受体和胃泌素释放肽受体(GRPR)两种受体为靶分子，研制的杂二聚肽PET显像剂：RGD-(18F-FB-Glu)-蛙皮素(BBN)[7]，是报道的第-个典型双靶杂交分子PET显像剂。对于RGD-(18F-FB-Glu)-BBN，由于18F有合适半衰期，选用18F标记较实用。应用不对称偶联基Glu(谷氨酸基)制备前体杂二聚肽，再用报告基团18F标记辅基(如最常用的标记辅基N-琥珀酰亚胺-4-18F-氟苯甲酸酯，18F-SFB)修饰前体杂二聚肽Glu中的胺基，合成18F标记杂二聚肽。此后，Chen等人[8]也用64Cu和68Ga标记了杂交分子BBN-RGD。偶联基主要有Glu和聚乙烯乙二醇链基(PEG)[2]。Glu是最常用的不对称性双功能偶联基，所制备的杂交分子为两种同分异构体，很难分离；且Glu长度较短，杂二聚肽RGD-Glu-BBN中Glu游离氨基空间位阻较大，会阻碍RGD和BBN同时与靶分子的结合，也会影响18F-SFB与RGD-Glu-BBN中Glu氨基反应，造成18F-FB-RGD-Glu-BBN放射化学产率较低。与Glu相比，PEG偶联基的最大特点就是PEG链的长度可以调节，但通常需结合Glu使用。这样，一种改进的18F标记杂交分子18F-FB-PEG3-Glu-RGD-BBN(纯净物)[8]和一种用新型对称性偶联基3，3’-(2-胺乙基氮烷基)二丙酸基(AEADP)连接RGD和BBN的显像剂(18F-FB-AEADP-BBN-RGD)也研制成功[9]，这两种18F标记杂交分子放化产率较高，并显示出较好药代动力学特性。然而，该法制备的18F-FB-PEG3-Glu-RGD-BBN较复杂，18F-FB-AEADP-BBN-RGD中AEADP体内稳定性较差，其毒性也有待于进一步研究。
偶合杂交小分子显像剂目前尚无文献报道。若将现有研究成熟已初步用于临床的靶向小分子药物配基药效基团，用合适对称性双功能偶联基(如beta-Glu)连接起来，可创制一系列新型偶合杂交小分子显像剂(分子探针)。这样，不仅可极大节约分子显像剂药物研究成本，而且可显著减少分子显像剂药物研究时间，从而可开辟分子显像研究新领域和新方向。但是，目前最大问题是缺乏有效对称性双功能偶联剂连接有关小分子配基药效基团。
参考文献
[1]唐刚华，张祥松.多靶分子显像.中华核医学杂志，2010，30(1)：68-69
[2]Liu S.Radiolabeled multimeric cycl ic RGD peptides as integrin αvβ3targetedradiotracers for tumor imaging.Mol Pharm，2006，3(5)：472-487
[3]Bernard B，Capello A，van Hagen M，et al.Radiolabeled RGD-DTPA-Tyr3-octreotatefor receptor-targeted radionucl ide therapy.Cancer Biotherapy Radiopharm.2004，19(2)：173-180
[4]Cornelissen B，McLarty K，Kersemans V，et al.Properties of[111In]-labeled HIV-1tat peptide radioimmunoconjugates in tumor-bearing mice following intravenousor intratumoral injection.Nucl Med Biol，2008，35：101-110
[5]Willmann JK，Lutz AM，Paulmurugan R，et al.Dual-targeted contrast agent forUS assessment of tumor angiogenesis in vivo.Radiology，2008，248(3)：936-944
[6]McAteer MA，Schneider JE，Ali ZA，et al.Magnetic resonance imaging ofendotheliai adhesion molecules in mouse atherosclerosis using dual-targetedmicroparticles of iron oxide.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2008，28：77-83
[7]Li ZB，Wu Z，Chen K，et al.18F-Labeled BBN-RGD heterodimer for prostate cancerimaging.J Nucl Med，2008，49：453-461
[8]Yan Y，Chen X.Peptide heterodimers for molecular imaging.Amino Acids，DOI10.1007/s00726-010-0546-y.Published online：16March 2010
[9]Yan Y，Chen K，Yang M，et al.A new 18F-labeled BBN-RGD peptide heterodimer witha symmetric linker for prostate cancer imaging. Amino Acids，DOI10.1007/s00726-010-0762-5
【发明内容】
本发明的目的就是为了解决偶合分子显像剂偶联的关键性技术问题，提供一种对称性双功能偶联剂L-beta-谷氨酸-二-N-琥珀酰亚胺衍生物：N-芴甲氧羰基-L-beta-谷氨酸-二-N-琥珀酰亚胺(Fmoc-beta-Glu(OSu)-OSu，I)及其合成方法，并用其结合报告基团合成含有对称性beta-谷氨酸链基(beta-Glu)
Figure BDA0000091901780000041
的偶合分子显像剂，并提供其合成方法。
本发明还涉及这类化合物在制备医学显像剂药物中的应用。
Fmoc-beta-Glu(OSu)-OSu(I)是一种对称性双功能偶联剂，用它可连接含-NH2基的配体(如M1-NH2和M2-NH2)，形成酰胺键-CO-NH-，得偶合分子-NHCO-beta-Glu(Fmoc)-CONH-。尔后，脱去-Fmoc(芴甲氧羰基)，形成beta-Glu(β-谷氨酸基)中含游离-NH2基的前体化合物(-NHCO-beta-Glu-CONH-)。利用其-NH2基标记18F或其它报告基团，报告基团可采用核素标记辅基、顺磁性物质、荧光素、微泡等，即N-琥珀酰亚胺-4-18F-氟苯甲酸酯(18F-SFB)或其它报告基团与-NHCO-beta-Glu-CONH-中-NH2基反应，生成18F或其它报告基团标记偶合分子显像剂，如-NHCO-beta-Glu(18F-FB)-CONH-。-NHCO-beta-Glu-CONH-中-NH2也可先被联结基(L)，如COCH2CH2(OCH2CH2)nOCH2CH2NH(n≤5)修饰后，再引进报告基团S(如核素标记辅基、顺磁性物质、荧光素或微泡等)，制备含对称性beta-Glu基的偶合分子显像剂：II可用于肿瘤、心脑血管疾病多靶分子显像。
偶合分子显像剂的研制是多靶分子显像(MMI)最有发展前景的研究领域，其关键性技术是解决偶合分子偶联问题，但是，目前缺乏有效的对称性双功能偶联剂。本发明研制的对称性双功能偶联剂Fmoc-beta-Glu(OSu)-OSu(I)具有以下优势：(1)新型对称性双功能偶联基β-氨基谷氨酸链基(beta-Glu)是最常用不对称性偶联基谷氨酸基(Glu)的同分异构体，与对称性偶联基3，3’-(2-胺乙基氮烷基)二丙酸基(AEADP)相比，结构稳定，且具有较低的毒副作用。(2)beta-Glu偶联制备的偶合分子显像剂，不会产生其同分异构体，产品容易纯化，解决了Glu偶联化合物很难分离的难题。(3)与Glu相比，beta-Glu中游离-NH2处于对称性位置，其游离氨基空间位阻相对较少，有利于报告信号基团与游离氨基结合，从而可提高反应产率。(4)对称性双功能偶联基beta-Glu，通常不会阻碍其偶合的配基与其相应的靶分子结合。若靶分子间距较大，可通过修饰合适长度的PEG基调节联结基的长度，从而不会影响偶合的配基与其相应的靶分子结合。(5)含beta-Glu基的偶合分子显像剂和偶合杂交小分子显像剂目前尚无文献报道。若将现有研究成熟已初步用于临床的靶向小分子药物配基药效基团，用合适对称性双功能偶联基(如beta-Glu)偶联起来，可创制一系列提高与靶分子总的结合力和显像效果的新型偶合杂交小分子显像剂。这样，不仅可极大节约分子显像剂药物研制成本，而且可显著减少分子显像剂药物研发时间。可见，本发明不仅可解决偶合分子显像剂的关键性偶联技术问题，而且可开辟杂交小分子显像研究新领域和新方向。
另外，用稳定性较好的18F标记辅基18F-SFB和2-18F-氟代丙酸-4-硝基苯酯(18F-NFP)修饰beta-Glu氨基，可获得较高放化产率。从而解决了用新型对称性双功能偶联基制备偶合分子多靶显像剂的难题。
本发明用新型对称性双功能偶联剂(I)合成了一系列具有beta-Glu结构(II)的新型偶联分子显像剂，包括多价多肽分子显像剂、杂交多肽分子显像剂和杂交小分子显像剂。本发明合成的多价多肽分子显像剂，可用于靶向肿瘤细胞中整合素αvβ3受体的多价分子显像；杂交多肽分子显像剂可用于靶向肿瘤细胞中共存的整合素αvβ3受体和胃泌素释放肽受体(GRPR)多靶分子显像；合成的杂交小分子显像剂可用于靶向肿瘤细胞中共存的整合素αvβ3受体、端粒酶和表皮生长因子受体(EGFR)多靶PET显像；本发明不限于以上叙述的靶分子，也可根据其他靶分子设计合成一系列新型偶合分子显像剂。这些偶联分子显像剂可分别和同时作用于肿瘤细胞中多个靶分子，提高靶/非靶比值和结合力。因而，这些多靶点偶合分子显像剂可用于多种疾病的早期诊断和疗效评估，为疾病诊疗提供分子影像学新方法。
【发明详述】
1、对称性双功能偶联剂N-(9-芴甲氧羰酰基)-L-beta-谷氨酸-二-N-琥珀酰亚胺(Fmoc-beta-Glu(OSu)-OSu，I)，其结构式如下：
其中，化合物I中，9-芴甲氧基也可被烷基或芳香基取代。其合成路线如下。
合成路线1化合物(I)的合成。
①以化合物Fmoc-beta-Glu(OtBu)-OH为原料，经TFA(三氟乙酸)水解脱去叔丁基(tBu)后得化合物Fmoc-beta-Glu(OH)-OH。
Figure BDA0000091901780000071
②Fmoc-beta-Glu(OH)-OH在DCC(二环己基碳二亚胺)作用下与HOSu(N-羟基丁二酰亚胺)反应生成对称性双功能偶联剂Fmoc-beta-Glu(OSu)-OSu(I)。
Figure BDA0000091901780000072
2、含对称性beta-谷氨酸链基(beta-Glu)的偶合二配基分子化合物，可作为PET显像剂，其一般结构式如下：
beta-Glu基结构式：
含beta-Glu基的杂交二配基分子显像剂一般结构式：
Figure BDA0000091901780000081
其中，M1为靶分子T1的含-NH2配基，M2为靶分子T2的含-NH2配基，T1和T2可均选自整合素αvβ3受体、胃泌素释放肽受体GRPR、端粒酶、表皮生长因子受体EGFR、磷脂酰丝氨酸PS、生长抑素受体、基因、抗原、核酸靶分子。若M1和M2相同，即II为二价配基分子显像剂；若M1和M2不相同，即II为杂交二配基分子显像剂。L为联结基，可采用-COCH2CH2(OCH2CH2)nOCH2CH2NH-，(n≤5)，或不用联结基即L＝0。S为报告信号基团，可采用核素标记辅基、顺磁性物质、荧光素、微泡等。
含beta-Glu基的杂交二配基分子显像剂(II)的一般合成路线和方法如下。
合成路线2化合物(II)的一般合成方法
①L-beta-谷氨酸-二-N-琥珀酰亚胺衍生物(1)分别连接配体M1-NH2和M2-NH2，得到含保护基的双配基化合物(2)。
Figure BDA0000091901780000082
R＝9-芴甲氧基，烷基，芳香基
②化合物(2)经三氟乙酸TFA水解去保护基后得化合物(3)。
③化合物(3)中游离-NH2经叔丁氧碳基(Boc)保护的酰氯联结基L(Boc-L-Cl)修饰后，得化合物(4)；
Figure BDA0000091901780000092
L＝-COCH2CH2(OCH2CH2)nOCH2CH2NH-(n≤5)
④化合物(4)联结基(L)上游离-NH2经报告基团修饰后，得偶合分子显像剂(II)。
Figure BDA0000091901780000093
[化合物II：L＝-COCH2CH2(OCH2CH2)nOCH2CH2NH-，n≤5；S为报告基团(来自于核素标记辅基、顺磁性物质、荧光素或微泡等)；M1和M2为含-NH2配基。]
本发明的S为报告信号基团，可采用核素标记辅基，核素标记辅基可用18F-SFB(N-琥珀酰亚胺-4-18F-氟苯甲酸酯)，18F-NFP(2-18F-氟代丙酸-4-硝基苯酯)，-11CH3，18F-AlF-NOTA(三氮杂环九烷基二乙酸基乙酰基)，99mTc-巯基乙酰三甘氨酸(MAG3)(99mTc-MAG3)，188Re-巯基乙酰三甘氨酸(MAG3)(188Re-MAG3)。
M1为靶分子T1的含-NH2配基，M2为靶分子T2的含-NH2配基，T1和T2可以都是整合素αvβ3受体，靶向整合素αvβ3受体的二价配体为RGD2，RGD为环状精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸。
3、具体化合物实例
(1)偶合多肽分子显像剂，包括多价多肽分子显像剂和杂交多肽分子显像剂。
A.二价多肽分子PET显像剂：M1＝M2＝RGD。L＝无联结基(0)。18F-FB-beta-Glu-E(RGDyk)2：S＝18F-FB(4-18F-氟代苯甲酰基)核素标记辅基；18F-FP-beta-Glu-E(RGDyk)2：S＝18F-FP(2-18F-氟代丙酰基)核素标记辅基；11C-beta-Glu-E(RGDyk)2：S＝-11CH3核素标记辅基。RGD为环状精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸，RGD2为靶向整合素αvβ3受体的二价配体，即二价环状精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸，RGD2也可用E(RGDyk)2表示。动物实验表明，这三种二价多肽化合物可用于肿瘤整合素αvβ3受体PET显像。
Figure BDA0000091901780000101
Figure BDA0000091901780000111
系列化合物A
B.二价多肽分子PET显像剂：M1＝M2＝RGD。18F-FB-PEG5-beta-Glu-E(RGDyk)2：L＝PEG5＝-COCH2CH2(OCH2CH2)nNH-(n＝5)，S＝18F-FB(4-18F-氟苯甲酰基)；18F-FB-PEG3-beta-Glu-RGD2：L＝PEG3＝-COCH2(OCH2CH2)nNH-(n＝3)，S＝18F-FB(4-18F-氟苯甲酰基)；18F-FP-PEG3-beta-Glu-RGD2：L＝PEG3＝-COCH2(OCH2CH2)nNH-(n＝3)，S＝18F-FP(2-18F-氟代丙酰基)。E(RGDyk)2为靶向整合素αvβ3受体的二价配体：二价环状精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD2)。实验表明，这三种修饰联结基的二价多肽化合物，能进一步提高放射化学产率，改善药代动力学特性，提高肿瘤整合素αvβ3受体PET显像效果。
系列化合物B
C.二价多肽分子PET显像剂：M1＝M2＝RGD，S＝18F-AlF-NOTA(三氮杂环九烷基二乙酸基乙酰基)。18F-AlF-NOTA-beta-Glu-RGD2：L＝无联结基(0)；18F-AlF-NOTA-PEG3-beta-Glu-RGD2：L＝PEG3＝-COCH2(OCH2CH2)nNH-(n＝3)。E(RGDyk)2为靶向整合素αvβ3受体的二价配体：二价环状精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD2)。试验表明，这两种修饰联结基的二价多肽化合物，能用一步法实现放射合成，显著提高放射化学产率；其中18F-AlF-NOTA-PEG3-beta-Glu-RGD2可改善其药代动力学特性，提高靶向肿瘤整合素αvβ3受体PET显像效果。
系列化合物C
D.二价多肽分子单光子发射计算机断层(SPECT)显像剂99mTc-MAG3-beta-Glu-E(RGDyk)2：M1＝M2＝RGD，L＝0，S＝99mTc-巯基乙酰三甘氨酸(MAG3)(99mTc-MAG3)；二价多肽分子核医学治疗剂188Re-MAG3-beta-Glu-E(RGDyk)2：M1＝M2＝RGD，L＝0，S＝188Re-巯基乙酰三甘氨酸(MAG3)(188Re-MAG3)。E(RGDyk)2为靶向整合素αvβ3受体的二价配体：环状二价精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD2)。实验表明，99mTc-MAG3-beta-Glu-E(RGDyk)2可用于肿瘤整合素αvβ3受体SPECT显像，188Re-MAG3-beta-Glu-E(RGDyk)2可用于靶向肿瘤整合素αvβ3受体核素治疗。
系列化合物D
E.二价多肽分子磁共振(MRI)显像剂：Gd(III)-DOTA-beta-Glu-E(RGDyk)2：M1＝M2＝RGD，L＝0，S＝Gd(III)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-14710-三乙酸-N-甲酰基(Gd(III)-DOTA)顺磁性物质。E(RGDyk)2为靶向整合素αvβ3受体的二价配体RGD2。实验表明，这种二价多肽化合物可用于肿瘤整合素αvβ3受体MRI显像。
Figure BDA0000091901780000142
化合物E
F.杂交多肽分子显像剂：M1＝RGD，M2＝BBN。18F-FB-beta-Glu-RGD-BBN：L＝0，S＝18F-FB；11C-beta-Glu-RGD-BBN：L＝0，S＝11CH3；18F-AlF-NOTA-beta-Glu-RGD-BBN：L＝0，S＝18F-AlF-NOTA(三氮杂环九烷基二乙酸基乙酰基)；18F-FB-PEG3-beta-Glu-RGD-BBN：L＝PEG3＝-COCH2(OCH2CH2)nNH-(n＝3)，S＝18F-FB；18F-FP-PEG3-beta-Glu-RGD-BBN：L＝PEG3＝-COCH2(OCH2CH2)nNH-(n＝3)，S＝18F-FP。RGD为整合素αvβ3受体配体，蛙皮素(BBN)为胃泌素释放肽受体(GRPR)配体。动物实验表明，这五种杂交分子化合物用于双靶向肿瘤整合素αvβ3受体和胃泌素释放肽受体GRPR PET显像。
系列化合物F
G.多功能纳米多肽分子显像剂：M2＝QD-PEG，其中QD为量子斑点，PEG＝-COCH2CH2(OCH2CH2)nOCH2CH2-(n＝5)。18F-FB-beta-Glu-PEG-QD-RGD：M1＝RGD，L＝0，S＝18F-FB；18F-FB-PEG3-QD-beta-Glu-RGD-BBN：M1＝RGD-beta-Glu-BBN，L＝PEG3＝-COCH2(OCH2CH2)nNH-(n＝3)，S＝18F-FB；18F-FP-PEG3-QD-beta-Glu-RGD-BBN：M1＝RGD-beta-Glu-BBN，L＝PEG3＝-COCH2(OCH2CH2)nNH-(n＝3)，S＝18F-FP；RGD为整合素αvβ3受体配体。动物实验表明，这些化合物可用于靶向肿瘤整合素αvβ3受体PET和光学双模式分子显像。
Figure BDA0000091901780000171
系列化合物G
(2)偶合杂交二配基小分子显像剂
H.杂交二配基小分子显像剂18F-FB-beta-Glu-BIBR-SB：M1＝BIBR1532配基，M2＝SB-273005配基，S＝18F-FB核素标记辅基。其中，2-[[(2E)-3-(2-萘基)-1-氧-2-丁烯基]氨基]苯甲酸(BIBR1532)为端粒酶抑制剂，2，4，9-三取代-2-苯并氮杂-3-酮衍生物(SB-273005)为整合素αvβ3受体抑制剂。实验表明，本化合物可用于靶向肿瘤端粒酶和整合素αvβ3受体双靶小分子PET显像。
化合物H
I.杂交二配基小分子显像剂18F-FB-beta-Glu-BIBR-PD：M1＝BIBR1532配基，M2＝PD-153035配基，S＝18F-FB。BIBR1532为端粒酶抑制剂，4-[(溴代苯基)氨基]-6，7-二甲氧基喹唑啉(PD-153035)为表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂。实验表明，本化合物可用于靶向肿瘤端粒酶和表皮生长因子受体EGFR双靶PET显像。
Figure BDA0000091901780000182
化合物I
J.杂交二配基小分子显像剂18F-FB-beta-Glu-PD-SB：M1＝SB-273005配基，M2＝PD-153035配基，S＝18F-FB。PD-153035为表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂，SB-273005为整合素αvβ3受体抑制剂。实验表明，本化合物可用于靶向表皮生长因子受体EGFR和整合素αvβ3受体双靶PET显像。
Figure BDA0000091901780000183
化合物J
(3)偶合杂交三配基小分子显像剂。
K.靶向整合素αvβ3受体、端粒酶和表皮生长因子受体(EGFR)杂交三配基小分子显像剂18F-FB-beta-Glu-BIBR-SB-PD：M1＝BIBR1532配基，M2＝SB-273005配基，M3＝PD-153035配基，S＝18F-FB核素标记辅基。BIBR1532为端粒酶抑制剂，SB-273005为整合素αvβ3受体抑制剂，PD-153035为表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂。实验表明，其可用于靶向整合素αvβ3受体、表皮生长因子受体EGFR和端粒酶三靶PET显像。其结构式如下。
Figure BDA0000091901780000191
化合物K
本发明涉及新型对称性双功能偶联剂化合物(I)，用其能合成一系列具有beta-Glu结构的偶联分子显像剂，包括偶合多肽分子显像剂和偶合杂交小分子显像剂。其中，二价多肽化合物18F-FB-beta-Glu-E(RGDyk)2、18F-FP-PEG3-beta-Glu-RGD2、18F-AlF-NOTA-PEG3-beta-Glu-RGD2和11C-beta-Glu-E(RGDyk)2，以及杂交多肽化合物18F-FB-beta-Glu-RGD-BBN、18F-FB-PEG3-beta-Glu-RGD-BBN和11C-beta-Glu-RGD-BBN，已完成其放射合成，并对其进行了药理活性评估。药理活性实验结果发现，这些偶合二价多肽化合物和偶合杂交多肽化合物，在肿瘤组织中均具有高摄取，而炎症组织几乎无摄取，它们可用于肿瘤早期诊断和疗效监测。本发明的其他系列化合物C、D、E、F、G、H、I、J、K，也已完成其放射合成，并对其进行了初步药理活性评估。初步药理活性实验结果发现，这些偶合二价多肽化合物、偶合杂交多肽化合物和偶合杂交小分子化合物，与前述偶合化合物具有相类似的生物活性。
由于本发明的二价多肽PET显像剂、二价多肽SPECT显像剂99mTc-MAG3-beta-Glu-E(RGDyk)2、二价多肽治疗剂188Re-MAG3-beta-Glu-E(RGDyk)2、二价多肽MRI显像剂Gd(III)-DOTA-beta-Glu-E(RGDyk)2、以及多功能纳米分子显像剂18F-FB-beta-Glu-PEG-QD-RGD，均具有相同的靶向整合素αvβ3受体的配体药效基团RGD或RGD2，尽管修饰了不同报告信号基团，但不影响这些显像剂与其靶点结合，因而可作为靶向整合素αvβ3受体的分子显像剂。本发明的杂交多肽分子显像剂双靶向肿瘤整合素αvβ3受体和胃泌素释放肽受体GRPR，可作为双靶向整合素αvβ3受体和GRPR的分子显像剂。偶合杂交小分子显像剂骨架结构与杂交多肽分子显像剂(18F-FB-beta-Glu-RGD-BBN和11C-beta-Glu-RGD-BBN)相类似，偶合杂交小分子显像剂中的小分子配基取代杂交多肽分子显像剂中多肽配基，没有影响其各小分子配基与其相应靶点结合，因而也可作为多靶点杂交分子显像剂，能用于肿瘤的早期诊断和疗效评估。
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步说明。
【图面说明】
图1为本发明Fmoc-beta-Glu(OSu)-OSu的1H-NMR图谱。
图2为本发明beta-E(RGDyk)2MS分析图谱的电喷雾质谱ESI-MS分析图谱。
图3为本发明Cyclo(RGDyK)3MS分析图谱的电喷雾质谱ESI-MS分析图谱。
图4为beta-E(RGDyk)2高效液相HPLC分析图谱。
图5为RGD-beta-Glu-BBN高效液相HPLC分析图谱。
图6为PET-MF-2V-IT-1合成仪自动化合成示意图。
图7为纯化后的18F-SFB HPLC分析图谱。
图8为纯化后的18F-FB-beta-Glu-E(RGDyk)2的HPLC分析图谱。
图9为纯化后的18F-FB-beta-Glu-RGD-BBN  的HPLC分析图谱。
图10为炎症模型18F-FB-beta-Glu-E(RGDyk)2的PET显像图像。
图11为抗肿瘤治疗模型18F-FB-beta-Glu-E(RGDyk)2的PET显像图像。
图12为炎症模型18F-FDG的PET显像图像。
图13为肿瘤模型18F-FDG的PET显像图像。
【具体实施方式】
【实施例1】对称性双功能偶联剂N-芴甲氧羰酰基-L-beta-谷氨酸-二-N-琥珀酰亚胺(Fmoc-beta-Glu(OSu)-OSu，I)的合成
合成路线1对称性双功能偶联剂N-(9-芴甲氧羰酰基)-L-beta-谷氨酸-二-N-琥珀酰亚胺(Fmoc-beta-Glu(OSu)-OSu，I)的合成。
①以化合物Fmoc-beta-Glu(OtBu)-OH为原料，经TFA(三氟乙酸)水解脱去叔丁基(tBu)后得化合物Fmoc-beta-Glu(OH)-OH。
Figure BDA0000091901780000211
②Fmoc-beta-Glu(OH)-OH在DCC(二环己基碳二亚胺)作用下与HOSu(N-羟基丁二酰亚胺)反应生成对称性双功能偶联剂Fmoc-beta-Glu(OSu)-OSu(I)。
Figure BDA0000091901780000221
具体步骤如下：
偶联基N-(9-芴甲氧羰酰基)-L-beta-谷氨酸-二-N-琥珀酰亚胺(Fmoc-beta-Glu(OSu)-OSu，I)的有机合成。
按合成路线1制备Fmoc-beta-Glu(OSu)-OSu(I)。取Fmoc-beta-Glu(OtBu)-OH(100.00mg，0.235mmol，Fluka公司产品)，加入无水三氟乙酸(TFA)，高效液相色谱(HPLC)分离纯化，梯度淋洗：95％溶剂A(0.1％TFA水溶液)和5％溶剂B(0.1％TFA乙腈溶液)。收集Fmoc-beta-Glu(OH)-OH组分，蒸干，溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF，2.00mL)中。加入N-羟基丁二酰亚胺(HOSu)(0.126mg，1.1mmol)和二环己基碳二亚胺(DCC，0.226mg，1.1mmol)。反应混合物在室温搅拌10小时(h)，过滤除去副产物二环己基脲。减压蒸干滤液得粗产品，然后溶于二氯甲烷中，滤去不溶物。滤液浓缩，加乙醚沉淀，沉淀物真空干燥，得产品Fmoc-beta-Glu(OSu)-OSu(79.4mg，0.141mmol，分子量MW 563，60％)。其结构经1H-NMR(CDCl3)鉴定，1H-NMR图谱如图1。
【实施例2】前体偶合二价肽分子beta-Glu-E(RGDyk)2及偶合杂交分子RGD-beta-Glu-BBN的合成
合成路线3前体二价肽分子beta-Glu-E(RGDyk)2的固相合成。
①在wang resin(王氏树脂)上连接9-芴甲氧羰酰基-天冬氨酸-烯丙基(Fmoc-Asp-Oall)，生成树脂化产物(5)。
Figure BDA0000091901780000231
②在树脂化产物(5)上依次连接甘氨酸(Gly)、2，2，4，6，7-五甲基苯并呋喃-5-磺酰基(pbf)保护的精氨酸(Arg)、1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代环己基-1-亚基)乙烷(Dde)保护的赖氨酸(Lys)、以及叔丁基(tBu)保护的D-酪氨酸(Tyr)，除去烯丙基(Oall)，
环化，得树脂环化产物(6)。cyclic(RGDyk(Dde))为Dde基保护的环状单体RGD。
Figure BDA0000091901780000232
③树脂环化产物(6)经肼还原后除去Dde基，得环化RGD产物(7)。.
Figure BDA0000091901780000233
④环化产物(7)修饰对称性beta-Glu，并偶联环状单体RGD(c(RGDyk)或cyclic(RGDyk))，得树脂化二价环化RGD产物(8)。
Figure BDA0000091901780000234
⑤树脂化二价环化RGD产物(8)经三氟乙酸(TFA)水解后，得二价肽分子beta-Glu-E(RGDyk)2。
合成路线4前体杂交分子RGD-beta-Glu-BBN的合成。
杂交肽分子RGD-beta-Glu-BBN的制备：Fmoc-beta-Glu(OSu)-OSu(I)依次与整合素αvβ3受体配体(RGD-NH2)和表皮生长因子受体(EGFR)配体(BBN-NH2)反应经TFA(三氟乙酸)水解后生成杂交多肽分子RGD-beta-Glu-BBN。
Figure BDA0000091901780000241
具体合成步骤如下：
固相肽合成(Solid-phase peptide synthesis，SPPS)法制备beta-Glu-E(RGDyk)2以及杂交肽RGD-beta-Glu-BBN的合成。
前体beta-Glu-E(RGDyk)2按合成路线3进行制备。
①称取2.0g Wang树脂于洁净干燥的反应管中，加入适量DMF(N，N-二甲基甲酰胺)，活化30min左右，然后称取Fmoc-Asp-Oall 1mmol，4-二甲氨基吡啶(DMAP)150mg，N，N’-二异丙基碳酰亚胺(DIC)1加入到反应管中，DMF做溶剂反应3h。反应完毕用DMF洗4～6次，加入适量吡啶和乙酸酐，体积比为1∶1，反应30min。反应完毕用DMF洗4～6次。然后用哌啶溶液脱掉氨基酸的Fmoc，脱两次共15min(10min，5min)。再用DMF洗4次，甲醇洗2次，取出少量树脂用茚三酮检测试剂检测，检测为蓝色，即可进行下一步反应。
②称取甘氨酸(Gly)3mmol，苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)3mmol于反应管中，加入N，N-二异丙基乙胺(DIEA)0.5mL，反应40min，用DMF洗4～6次，取少量树脂用茚三酮检测试剂检测，显无色，然后加入哌啶溶液脱Fmoc，脱两次，两次分别为10min、5min，然后用DMF洗4次，甲醇洗两次，取出少量树脂用茚三酮检测试剂检测，检测为蓝色，即可进行下一步反应。
③重复方法②连接其它氨基酸。
④最后一个氨基酸接上后脱掉Asp侧链保护基，脱掉Fmoc保护基团。加入6倍的HBTU，1-羟基苯并三唑(HOBT)环合。
⑤脱掉Lys上的Dde保护基团，然后加入Fmoc-beta-glu(Osu)-Osu，与Lys中-NH2发生缩合反应4个小时。抽干，加入三氟乙酸脱掉Fmoc，并切割2h，反应液抽滤，得多肽的三氟乙酸溶液。用乙醚沉淀，离心，然后再用乙醚洗3～5次，得白色固体。经HPLC脱盐，冻干，取少量进行MS分析。beta-Glu-(RGDyK)2电喷雾质谱ESI-MS：1350.47(M+)(图2)。
前体RGD-beta-Glu-BBN按合成路线4进行合成。
在偶联剂Fmoc-beta-glu(Osu)-Osu的碱性溶液中，依次加入BBN-NH2和RGD-NH2，缩合反应4h后，加入TFA，水解脱Fmoc。经HPLC分离纯化后得RGD-beta-Glu-BBN，取少量进行MS分析。RGD-beta-Glu-BBN电喷雾质谱ESI-MS：1784.9(M+)(图3)。
⑥分析结果。高效液相HPLC分析条件：分析柱，Kromasil 100-5C18，4.6mm×250mm，5μm(瑞典AKZO NOBEL公司生产)；梯度淋洗，缓冲液A：0.1％三氟乙酸水溶液，缓冲液B：0.1％三氟乙酸乙腈溶液，20min-10％缓冲液A/75％缓冲液B；流速，1mL/min；波长，220nm。beta-Glu-(RGDyK)2和RGD-beta-Glu-BBNHPLC分析结果见图4和图5。
【实施例3】18F标记辅基N-琥珀酰亚胺-4-18F-氟苯甲酸酯(18F-SFB)的放射合成及其用于标记beta-Glu偶合分子。
合成路线5报告信号基团核素标记辅基(S)：N-琥珀酰亚胺-4-18F-氟苯甲酸酯(18F-SFB)的放射合成。
①以4-(三氟甲磺酸三甲基铵盐)苯甲酸乙酯(9)为原料，经氟化反应得化合物(10)。
Figure BDA0000091901780000261
②化合物10与氢氧化四丙基铵盐作用生成4-18F-苯甲酸铵盐(11)。
Figure BDA0000091901780000262
③化合物11在氢氧化四丙基铵盐作用下与N，N，N’，N’-四甲基-0-(N-丁二酰亚胺)六氟磷酸脲盐(HSTU)反应，生成18F-SFB。
Figure BDA0000091901780000263
合成路线6二价多肽分子显像剂18F-FB-beta-Glu-E(RGDyk)2的放射合成。beta-Glu-(RGDyK)2溶于Na2HPO4或硼酸缓冲液中，加入含少量乙腈的18F-SFB溶液中，于30～70℃反应5′～30′，即得。
Figure BDA0000091901780000264
合成路线7杂交多肽分子显像剂18F-FB-beta-Glu-RGD-BBN的放射合成。RGD-beta-Glu-BBN溶于DMF(或二甲基亚砜，DMSO)和二异丙基乙胺(DIPEA，体积比5∶1)中，加入含少量乙腈的18F-SFB溶液中，于30～70℃反应5′～30′，即得。
Figure BDA0000091901780000271
标准品19F-FB-beta-Glu-RGD-BBN和19F-FB-beta-Glu-E(RGDyk)2的合成。按合成路线6和合成路线7相类似方法制备标准品。二价肽beta-Glu-(RGDyK)2或杂交肽RGD-beta-Glu-BBN(0.2-0.5mg)溶于0.1MNa2HPO4(或硼酸缓冲液1mL)中，加入含少量乙腈的N-琥珀酰亚胺-4-19F-氟苯甲酸酯(19F-SFB)溶液中，70℃反应30min。加入2mL流动相，过HPLC分离柱：C18柱，流动相为0.01M H3PO4/CH3CN(60/40，v/v))，UV 254nm，流速1mL/min，收集产品成分，蒸干，即得标准品。19F-FB-beta-Glu-E(RGDyk)2电喷雾质谱ESI-MS：1472.47(M+)；19F-FB-beta-Glu-RGD-BBN  电喷雾质谱ESI-MS：1906.9(M+)。
一般来说，PET药物的表证是通过制备其标准品的HPLC分析来确定的。实施例中，PET药物18F-FB-beta-Glu-RGD-BBN和18F-FB-beta-Glu-E(RGDyk)2的标准品分别为19F-FB-beta-Glu-RGD-BBN和19F-FB-beta-Glu-E(RGDyk)2。
N-琥珀酰亚胺-4-18F-氟苯甲酸酯(18F-SFB)的-锅法自动化合成及其标记应用
(1)用PET-MF-2V-IT-1合成仪(北京PET科技有限公司)，按合成路线5自动化合成18F-SFB(如图6所示)。
A.[K/K222]+18F-的生产。采用回旋加速器Cyclone 10/5 cyclotron(IRATechnolo-gies公司，比利时生产)，通过核反应18O(p，n)18F，用10.5MeV、25μA的质子束流连续轰击靶10-30min。生产的含18F-F-靶水经氦气加压传出后，缓慢通过SEP-PAK light QMA小柱，18F-F-被吸附在小柱上，18O-H2O回收再用。用含K2CO3的催化剂聚胺醚(K222)乙腈水溶液(1.5mL)将18F-F-洗脱入反应瓶中，加热混合溶液至110℃，减压蒸干，得到干燥的[K/K222]+18F-。
B.18F-SFB合成。4-(三氟甲磺酸三甲基铵盐)苯甲酸乙酯(9)(自制，5.0mg，20μmol)溶于乙腈(1mL)中，加入上述干燥的[K/K222]+18F-反应瓶中，90℃加热反应10min，生成4-18F-苯甲酸乙酯(10)。该产物不需分离，加1.0mol/L氢氧化四丙基铵盐甲醇溶液(30-50μL)，90℃水解3min，生成4-18F-苯甲酸铵盐(11)。然后，加N，N，N’，N’-四甲基-0-(N-丁二酰亚胺)六氟磷酸脲盐(HSTU)(12mg，33μmol)乙腈溶液(1mL)，90℃加热反应5min。冷却，依次加5％乙酸(9mL)和10％乙腈水(12mL)，混合物依此通过SEP-PAK SCX小柱、SEP-PAK Al2O3小柱和SEP-PAK plus C18小柱，并用He气吹干小柱。最后，用乙腈(2mL)洗脱产品，收集在另一个干燥的反应瓶中，在He气作用下60℃加热减压蒸干溶剂，得干燥的产物18F-SFB。18F-SFB未校正放化产率为20-35％。
C.18F-SFB纯度的测定。用放射性TLC和放射性HPLC系统测定18F-SFB的化学纯度和放射化学纯度，放射化学纯度大于95％(图7)。HPLC分析条件：C18反相分析柱，流速为1mL/min，紫外(UV)检测波长为254nm，梯度淋洗条件(A：0.01M H3PO4水溶液；B：MeCN)：0.5min-95％A/5％B；8min-90％A/10％B；16min-10％A/90％B；1min-95％A/5％B(指的是1min内，A和B溶液浓度分别达到95％和5％)。薄板层析(TLC)法：硅胶铝板，展开剂为90％乙腈水溶液。K222采用TLC层析和碘蒸气显色法测定，展开剂为甲醇∶氨水＝9∶1(体积比)，没检出K222。
(2)18F-SFB标记偶合多肽分子配基。按合成路线6和7制备18F标记偶合肽分子。beta-Glu偶合多肽分子RGD配体或beta-Glu偶合杂交多肽分子配体RGD-beta-Glu-BBN(0.2-0.5mg)溶于0.1M Na2HPO4(或硼酸缓冲液1mL)中；也可溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)(或二甲基亚砜，DMSO)(200μL)和二异丙基乙胺(DIPEA，40μL)中。加入上述含少量乙腈的18F-NFP溶液中，30-70℃反应5-30min。加入2mL流动相，过HPLC分离柱：C18柱，流动相为0.01M H3PO4/CH3CN(60/40，v/v)，UV 254nm，流速5mL/min。或梯度淋洗：A液为0.01M H3PO4，B液为MeCN，0min-100％A/0％B，5min-80％A/20％B，10min-50％A/50％B。收集产品成分，蒸干，用生理盐水稀释，即得产品注射液。该产品未校正放化产率一般为10-25％，放化纯度大于95％。分别与标准品19F-FB-beta-Glu-E(RGDyk)2和19F-FB-beta-Glu-RGD-BBN对照，放射合成的18F-FB-beta-Glu-E(RGDyk)2(梯度淋洗，图8)和18F-FB-beta-Glu-RGD-BBN得到证实(流动相为60％0.01MH3PO4/40％CH3CN，图9)。
【实施例4】18F标记辅基2-18F-氟代丙酸-4-硝基苯酯(18F-NFP)的放射合成及其用于标记beta-Glu偶合分子。
合成路线8报告信号基团核素标记辅基(S)：2-18F-氟代丙酸-4-硝基苯酯(18F-NFP)的放射合成。
①以2-溴丙酸甲酯(12)为原料，经氟化反应得2-18F-氟代丙酸甲酯(13)。
Figure BDA0000091901780000291
②化合物(13)与氢氧化叔丁基铵盐发生水解作用生成2-18F-氟代丙酸叔丁基铵盐(14)。
Figure BDA0000091901780000292
③化合物(14)在氢氧化叔丁基铵盐作用下与碳酸二(4-硝基苯基)酯反应，生成18F标记辅基18F-NFP。
Figure BDA0000091901780000301
18F-NFP的放射合成及其标记偶合多肽分子配基。
18F-NFP的放射合成。按合成路线8制备18F-NFP。采用回旋加速器Cyclone10/5cyclotron(IRA Technolo-gies，Belgium)，通过核反应18O(p，n)18F，用10.5MeV、25μA的质子束流连续轰击靶10-30min。生产的含18F-F-靶水经氦气加压传出后，缓慢通过SEP-PAK light QMA小柱，18F-F-被吸附在小柱上，18O-H2O回收再用。用含K2CO3的催化剂聚胺醚(K222)乙腈水溶液(1.5mL)将18F-F-洗脱入反应瓶中，加热混合溶液至110℃，减压蒸干，得到干燥的复合物[K/K222]+18F-。2-溴丙酸甲酯(12)(5.0mg)溶于乙腈(1mL)中，加入上述干燥的[K/K222]+18F-反应瓶中，90℃加热反应10min，生成2-18F-氟代丙酸甲酯(13)。该产物不需分离，加1.0mol/L氢氧化叔丁基铵盐甲醇溶液(30-50μL)，110℃水解3min，生成2-18F-氟代丙酸叔丁基铵盐(14)。加热蒸干后，加碳酸二(4-硝基苯基)酯(20mg)乙腈溶液(2mL)，90℃加热反应5min。冷却，加5％乙酸(9mL)和水(11mL)，混合物依此通过SEP-PAK SCX小柱、SEP-PAK  Al2O3小柱和SEP-PAKplus C18小柱，并用He气吹干小柱。最后，用乙腈(2mL)从SEP-PAK plus C18小柱中洗脱产品，收集在另一个干燥的反应瓶中，在He气作用下60℃加热减压蒸干溶剂，得干燥的产物18F-NFP。18F-NFP未校正放化产率约为35％。用放射性TLC和放射性HPLC系统测定18F-NFP的化学纯度和放射化学纯度，放射化学纯度大于95％。HPLC分析条件：C18反相分析柱，流速为1mL/min，紫外(UV)检测波长为254nm，梯度淋洗条件(A：0.01M H3PO4；B：MeCN)：0.5min-95％A/5％B；8min-90％A/10％B；16min-10％A/90％B；1min-95％A/5％B。薄板层析(TLC)法：硅胶铝板，展开剂为90％乙腈水溶液。K222采用TLC层析和碘蒸气显色法测定，展开剂为甲醇∶氨水＝9∶1(体积比)，没检出K222。
18F-NFP标记偶合多肽分子配基。beta-Glu偶合多肽分子RGD配体或beta-Glu偶合杂交多肽分子配体RGD-beta-Glu-BBN(0.2-0.5mg)溶于0.1MNa2HPO4(或硼酸缓冲液1mL)中；也可溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)(或二甲基亚砜，DMSO)(200μL)和二异丙基乙胺(DIPEA，40μL)中。加入上述含少量乙腈的18F-NFP溶液中，30-70℃反应5-30min。加入2mL流动相，过HPLC分离柱：C18柱，流动相为0.01M H3PO4/CH3CN(60/40，v/v)，UV 254nm，流速5mL/min。或梯度淋洗：A液为0.01M H3PO4，B液为MeCN，0min-100％A/0％B，5min-80％A/20％B，10min-50％A/50％B。收集产品成分，蒸干，用生理盐水稀释，即得产品注射液。该产品未校正放化产率一般为10-35％，放化纯度大于95％。
【实施例5】18F标记beta-Glu偶合分子化合物一步法放射合成。
合成路线918F-AlF-NOTA-PEG3-beta-Glu-RGD2的一步放射合成。
前体NOTA-PEG3-beta-Glu-RGD2在醋酸钠缓冲液中与18F-AlF反应生成18F-AlF-NOTA-PEG3-beta-Glu-RGD2。
按合成路线9制备18F-AlF-NOTA-PEG3-beta-Glu-RGD2。回旋加速器生产的含18F-F-靶水经氦气加压传出后，缓慢通过SEP-PAK light QMA小柱，18F-F-被吸附在小柱上，18O-H2O回收再用。18F-F-用0.4M KHCO3溶液(0.4mL)从小柱中洗脱下来，吸取0.2mL，加入反应瓶中，用冰醋酸调制至pH＝4。将溶于0.1M醋酸钠缓冲液(pH 4)的AlCl3溶液(2mM，3μL)加入上述反应瓶后，再加入0.200-0.500mg的前体NOTA-PEG3-beta-Glu-RGD2。反应混合物在100℃反应15min后，加入2mL流动相，用HPLC系统进行分离纯化。HPLC分离条件：C18柱，流动相为0.01M H3PO4/CH3CN(60/40，v/v)，UV 254nm，流速5mL/min。或梯度淋洗：A液为0.01M H3PO4，B液为MeCN，0min-100％A/0％B，5min-80％A/20％B，10min-50％A/50％B。收集产品成分，蒸干，用生理盐水稀释，即得产品注射液。该产品未校正放化产率一般为20％，放化纯度大于95％。
【实施例6】多功能纳米多肽分子显像剂18F-FP-PEG3-QD-beta-Glu-RGD-BBN的放射合成。
回旋加速器生产的含18F-F-靶水经氦气加压传出后，缓慢通过SEP-PAK lightQMA小柱，18F-F-被吸附在小柱上，18O-H2O回收再用。用含K2CO3的催化剂聚胺醚(K222)乙腈水溶液(1.5mL)将18F-F-洗脱入反应瓶中，加热混合溶液至110℃，减压蒸干，得到干燥的复合物[K/K222]+18F-。以2-溴丙酸甲酯(12)(5.0mg)为原料，按合成路线7制备的18F-NFP，用乙腈(2mL)从SEP-PAK plus C18小柱中洗脱，收集在干燥的反应瓶中，在He气作用下60℃加热减压蒸干溶剂，得干燥的产物18F-NFP。
beta-Glu偶合多肽分子QD配体PEG3-QD-beta-Glu-RGD-BBN(0.2-0.5mg)溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)(或二甲基亚砜，DMSO)(200μL)和二异丙基乙胺(DIPEA，40μL)中。加入上述含少量乙腈的18F-NFP溶液中，30-70℃反应5-30min。加入2mL流动相，用HPLC系统进行分离纯化。HPLC分离条件：C18柱，流动相为0.01M H3PO4/CH3CN(60/40，v/v)，UV 254nm，流速5mL/min。或梯度淋洗：A液为0.01M H3PO4，B液为MeCN，0min-100％A/0％B，5min-80％A/20％B，10min-50％A/50％B。收集产品成分，蒸干，用生理盐水稀释，即得产品注射液。该产品未校正放化产率一般为10-25％，放化纯度大于95％。
【实施例7】杂交二配基小分子显像剂18F-FB-beta-Glu-BIBR-SB的放射合成。
合成路线1018F-FB-beta-Glu-BIBR-SB的放射合成。
杂交小分子前体beta-Glu-BIBR-SB在碱性溶液中与18F-NFP反应生成18F-FB-beta-Glu-BIBR-SB。
Figure BDA0000091901780000341
回旋加速器生产的含18F-F-靶水经氦气加压传出后，缓慢通过SEP-PAK lightQMA小柱，18F-F-被吸附在小柱上。用含K2CO3的催化剂聚胺醚(K222)乙腈水溶液(1.5mL)将18F-F-洗脱入反应瓶中，加热混合溶液至110℃，减压蒸干，得到干燥的复合物[K/K222]+18F-。以2-溴丙酸甲酯(12)(5.0mg)为原料，按合成路线7制备的18F-NFP，用乙腈(2mL)从SEP-PAK plus C18小柱中洗脱，收集在干燥的反应瓶中，在He气作用下60℃加热减压蒸干溶剂，得干燥的产物18F-NFP。
杂交小分子前体beta-Glu-BIBR-SB(0.500-1.000mg)溶于DMF(或DMSO)(200μL)和二异丙基乙胺(DIPEA，40μL)中。将其加入至上述含少量乙腈的18F-NFP溶液中，30-90℃反应5-30min。加入2mL流动相，用HPLC系统进行分离纯化。HPLC分离条件：C18柱，流动相为0.01M H3PO4/CH3CN(60/40，v/v)，UV 254nm，流速5mL/min。或梯度淋洗：A液为0.01M H3PO4，B液为MeCN，0min-100％A/0％B，5min-80％A/20％B，10min-50％A/50％B。收集产品成分，蒸干，用生理盐水稀释，即得产品注射液。该产品未校正放化产率一般为15-35％，放化纯度大于95％。
为便于区分，本发明的二配基分子化合物或系列化合物按照其在说明书中出现的先后顺序依次用英文字母顺序编号，合成方法方程式按照先后顺序依次用阿拉伯数字顺序编号。
【实施例8】动物模型偶合多肽分子PET显像。
C57BL/6J小鼠10只，雌雄各半，5周龄，体质量20～25g。将5只小鼠在大腿肌肉处用松节油诱导炎症模型，炎症组织长至10～25mm时即可进行实验。另将S-180纤维肉瘤细胞株常规传代培养，收集对数生长期的细胞，用1×PBS溶液配成2×107个/mL的细胞悬液，在无菌条件下在小鼠右腋窝内注射0.1mL瘤细胞悬液。7d后可扪及皮下结节，待肿瘤长径长至15～25mm时进行实验。将炎症模型或荷肉瘤细胞模型小鼠随机分为两组，18F-FB-beta-Glu-E(RGDyk)2和18F-脱氧葡萄糖(18F-FDG)组。由尾静脉注射经生理盐水稀释的18F-FDG 3.7MBq(0.2mL)和18F-FB-beta-Glu-E(RGDyk)23.7MBq(0.2mL)。给药不同时间后将模型动物固定于小鼠架上，行全身PET/CT扫描，经衰减矫正后，迭代重建获得横断面、矢状面、冠状面断层图像及MIP(最大强度投影)图像。炎症模型摄取18F-FB-beta-Glu-E(RGDyk)2很低(图10)，但摄取18F-FDG较高(图12)；抗肿瘤治疗后肿瘤组织摄取18F-FB-beta-Glu-E(RGDyk)2较高(图11)，荷瘤模型肿瘤组织高度摄取18F-FDG(图13)。
本发明涉及新型对称性双功能偶联剂化合物(I)的制备，用其合成了一系列具有beta-Glu结构的偶联分子显像剂，包括偶合多肽分子显像剂和偶合杂交小分子显像剂。其中，二价多肽化合物18F-FB-beta-Glu-E(RGDyk)2、18F-FP-PEG3-beta-Glu-RGD2、18F-AlF-NOTA-PEG3-beta-Glu-RGD2和11C-beta-Glu-E(RGDyk)2，以及杂交多肽化合物18F-FB-beta-Glu-RGD-BBN、18F-FB-PEG3-beta-Glu-RGD-BBN和11C-beta-Glu-RGD-BBN，已完成其放射合成，并对其进行了药理活性评估。药理活性实验结果发现，偶合二价多肽化合物和偶合杂交多肽化合物，在肿瘤组织中均具有高摄取，而炎症组织几乎无摄取，它们可用于肿瘤早期诊断和疗效监测。预试验也表明，本发明的其他系列化合物C、D、E、F、G、H、I、J、K与前述偶合化合物具有类似的结果。本发明不限于上述实施例。

Claims (20)

1.一种化合物(I)，化学名称为：N-(9-芴甲氧羰酰基)-L-beta-谷氨酸-二-N-琥珀酰亚胺，其结构式为：
Figure FDA0000091901770000011
2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于9-芴甲氧基被烷基或芳香基取代。
3.一种化合物(II)，为含beta-Glu基的化合物，其结构式为：
Figure FDA0000091901770000012
其中：M1为靶分子T1的含-NH2配基，M2为靶分子T2的含-NH2配基，T1和T2均选自整合素αvβ3受体、胃泌素释放肽受体GRPR、端粒酶、表皮生长因子受体EGFR、磷脂酰丝氨酸PS、生长抑素受体、基因、抗原、核酸靶分子；L为联结基，采用-COCH2CH2(OCH2CH2)nOCH2CH2NH-，n≤5，或不用联结基即L＝0；S为报告信号基团，选自于核素标记辅基、顺磁性物质、荧光素、微泡之一。
4.根据权利要求3所述的化合物，其特征在于核素标记辅基选自18F-SFB，18F-NFP，-11CH3，18F-AlF-NOTA，99mTc-MAG3，188Re-MAG3。
5.根据权利要求3所述的化合物，其特征在于T1和T2相同的整合素αvβ3受体配体是RGD2，RGD2为靶向整合素αvβ3受体的二价配体，RGD为环状精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸。
6.根据权利要求3、4、5之一所述的化合物，其特征在于其结构式为：
Figure FDA0000091901770000021
7.根据权利要求3或4所述的化合物，其特征在于其结构式为：
Figure FDA0000091901770000022
8.根据权利要求3、4、5之一所述的化合物，其特征在于其结构式为：
Figure FDA0000091901770000023
9.根据权利要求3、4、5之一所述的化合物，其特征在于其结构式为：
10.根据权利要求3或4所述的化合物，其特征在于其结构式为：
Figure FDA0000091901770000032
11.根据权利要求3所述的化合物，其特征在于其结构式为：
Figure FDA0000091901770000033
12.权利要求1所述的化合物(I)的合成方法，包括如下步骤：
①以化合物Fmoc-beta-Glu(OtBu)-OH为原料，经三氟乙酸TFA水解脱去叔丁基tBu后得化合物Fmoc-beta-Glu(OH)-OH；
Figure FDA0000091901770000034
②Fmoc-beta-Glu(OH)-OH在DCC作用下与N-羟基丁二酰亚胺HOSu反应生成对称性双功能偶联剂Fmoc-beta-Glu(OSu)-OSu(I)；
Figure FDA0000091901770000041
13.权利要求3的化合物(II)的一般合成方法，包括如下步骤：
①L-beta-谷氨酸-二-N-琥珀酰亚胺衍生物(1)分别连接配体M1-NH2和M2-NH2，得到含保护基的双配基化合物(2)；
R＝9-芴甲氧基，烷基，芳香基；
②化合物(2)经TFA水解去保护基后得化合物(3)；
Figure FDA0000091901770000043
③化合物(3)中游离-NH2经叔丁氧碳基Boc保护的酰氯联结基L修饰后，得化合物(4)；
L＝-COCH2CH2(OCH2CH2)nOCH2CH2NH-(n≤5)
④化合物(4)联结基L上游离-NH2经报告基团S修饰后，得偶合分子显像剂(II)；
Figure FDA0000091901770000052
14.权利要求6的化合物(II)的合成方法，包括如下步骤：beta-Glu-(RGDyK)2溶于Na2HPO4或硼酸缓冲液中，加入含少量乙腈的18F-SFB溶液中，于30～70℃反应5′～30′，即得
Figure FDA0000091901770000053
15.权利要求7的化合物(II)的合成方法，包括如下步骤：RGD-beta-Glu-BBN溶于DMF或DMSO和DIPEA、体积比为5∶1的混合溶剂中，加入含少量乙腈的18F-SFB溶液中，于30～70℃反应5′～30′，即得
Figure FDA0000091901770000054
16.权利要求9的化合物(II)的合成方法，其特征在于18F-AlF-NOTA-PEG3-beta-Glu-RGD2的一步放射合成方法，包括如下步骤：前体NOTA-PEG3-beta-Glu-RGD2在醋酸钠缓冲液中与18F-AlF于100℃反应15min，生成复合物18F-AlF-NOTA-PEG3-beta-Glu-RGD2。
17.根据权利要求14或15所述的化合物(II)的合成方法，其特征在于18F-SFB的合成方法包括如下步骤：
①以4-(三氟甲磺酸三甲基铵盐)苯甲酸乙酯(9)为原料，经氟化反应得化合物(10)；
Figure FDA0000091901770000061
②化合物(10)与氢氧化四丙基铵盐作用生成4-18F-苯甲酸铵盐(11)；
③化合物(11)在氢氧化四丙基铵盐作用下与N，N，N’，N’-四甲基-0-(N-丁二酰亚胺)六氟磷酸脲盐反应，生成18F-SFB；
Figure FDA0000091901770000063
18.根据权利要求15所述的化合物(II)的合成方法，其特征在于杂交肽分子RGD-beta-Glu-BBN的制备方法为：Fmoc-beta-Glu(OSu)-OSu(I)依次与整合素αvβ3受体配体RGD-NH2和胃泌素释放肽受体GRPR配体BBN-NH2反应，经TFA水解去保护基后，生成杂交多肽分子RGD-beta-Glu-BBN：
Figure FDA0000091901770000071
19.权利要求3所述的化合物(II)在制备PET显像剂药物中的应用。
20.根据权利要求19所述的化合物(II)在制备PET显像剂药物中的应用，其特征在于：PET显像剂药物为肿瘤、心脑血管疾病早期诊断和疗效评估的多靶点偶合分子显像剂。
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