CN107474145A - Rgd肽‑血清蛋白结合片段偶联物及其制备方法、放射性核素标记物及应用 - Google Patents

Rgd肽‑血清蛋白结合片段偶联物及其制备方法、放射性核素标记物及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN107474145A
CN107474145A CN201710834197.2A CN201710834197A CN107474145A CN 107474145 A CN107474145 A CN 107474145A CN 201710834197 A CN201710834197 A CN 201710834197A CN 107474145 A CN107474145 A CN 107474145A
Authority
CN
China
Prior art keywords
haemocyanin
binding fragment
rgd peptide
iii
fragment conjugate
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201710834197.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107474145B (zh
Inventor
卓连刚
赵鹏
杨夏
廖伟
王静
王关全
魏洪源
杨宇川
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Nuclear Physics and Chemistry China Academy of Engineering Physics
Original Assignee
Institute of Nuclear Physics and Chemistry China Academy of Engineering Physics
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Nuclear Physics and Chemistry China Academy of Engineering Physics filed Critical Institute of Nuclear Physics and Chemistry China Academy of Engineering Physics
Priority to CN201710834197.2A priority Critical patent/CN107474145B/zh
Publication of CN107474145A publication Critical patent/CN107474145A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107474145B publication Critical patent/CN107474145B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0815—Tripeptides with the first amino acid being basic
    • C07K5/0817—Tripeptides with the first amino acid being basic the first amino acid being Arg
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/082—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins the peptide being a RGD-containing peptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/76—Albumins
    • C07K14/765—Serum albumin, e.g. HSA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明提供一种RGD肽‑血清蛋白结合片段偶联物及其制备方法，将c(RGDyKRGDyK)赖氨酸侧链部分末端用水溶性链接子(R1对应的化合物)修饰，得到结构R1‑c(RGDyK)，用血清蛋白结合片段对c(RGDyK)进行修饰，即使用三功能链接子(R2对应的化合物)将R1‑c(RGDyK)与血清蛋白结合片段进行连接，得到一种新型整合素受体靶向靶向结构，命名为RGD肽‑血清蛋白结合片段偶联物。血清蛋白结合片段在血液中可以与血清蛋白结合，从而降低其修饰药物结构被肾脏代谢的速度，延长药物在体内的半衰期。RGD肽‑血清蛋白结合片段偶联物，结构式如下：

Description

RGD肽-血清蛋白结合片段偶联物及其制备方法、放射性核素 标记物及应用
技术领域
本发明属于肿瘤治疗药物领域，具体涉及一种与整合素结合的RGD肽-血清蛋白结合片段偶联物及其应用。
背景技术
整合素αⅤβ3在在肿瘤新生血管内皮细胞中高表达，以及在许多肿瘤(如黑色素瘤、神经胶质瘤、乳腺癌、肺癌)有表达，而在正常组织及成熟的血管内皮中不表达，故而其成为重要的肿瘤探针结合靶点。RGD(Arg-Gly-Asp)可以与整合素αⅤβ3特异性结合，并表现出良好的渗透性、低毒性、低免疫反应，且易于化学修饰，是目前最广泛使用的整合素受体放射性显像多肽片段。由于RGD分子结构及其环状衍生物(c(RGDfK)和c(RGDyK))结构过小，作为放射性药物在体内会被肾脏快速代谢，且放射性核素及其螯合剂对其靶向能力有明显影响。特别当其被用与治疗型放射性核素(如177Lu)结合时，其体内快速代谢和靶向能力不足的缺点，将无法实现肿瘤治疗且对肾脏等代谢器官带来极大的副作用。发展新的策略以提高RGD肽在体内的稳定性和靶向能力，特别是提高治疗型核素在肿瘤的滞留和聚集尤为重要。
177Lu是理想的靶向内放射治疗性核素，其具有适宜的半衰期(6.7d)，发射的β-和γ射线。β-组织平均射程<200μm，适合肿瘤治疗，γ射线可用于SPECT显像，以监测和指导治疗过程。另外177Lu与68Ga有类似的配位性质，可以配对使用，利用68Ga对肿瘤进行诊断和治疗监测，使用177Lu对肿瘤进行治疗，是优秀的诊疗一体化核素对。然而，由于缺少可以在肿瘤位置长时间聚集和滞留的放射性探针药物，177Lu在进行治疗的同时对正常组织和代谢器官造成了极高的副作用，严重影响肿瘤治疗效果。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种RGD肽-血清蛋白结合片段偶联物及其制备方法，以及其放射性标记物，以降低RGD肽(RGD衍生物)作为放射性药被肾脏代谢的速度，提高其体内的稳定性和靶向能力，从而提高与其结合的治疗型核素在肿瘤部位的滞留和聚集，提高肿瘤治疗效果。
本发明的构思是：将c(RGDyKRGDyK)赖氨酸侧链部分末端用水溶性链接子(R1对应的化合物)修饰，得到结构R1-c(RGDyK)，用血清蛋白结合片段对c(RGDyK)进行修饰，即使用三功能链接子(R2对应的化合物)将R1-c(RGDyK)与血清蛋白结合片段进行连接，得到一种新型整合素受体靶向靶向结构，命名为RGD肽-血清蛋白结合片段偶联物。血清蛋白结合片段在血液中可以与血清蛋白结合，从而降低其修饰药物结构被肾脏代谢的速度，延长药物在体内的半衰期。
c(RGDyK)的结构式为:
血清蛋白结合片段学名为(R)-2-氨基-5-(4-(碘苯基)丁基酰胺)戊酸，结构式为：
水溶性链接子可以是PEG，PEG2，PEG3，Gly2或Gly3。
三功能链接子(R2)可以是Glu,Asp,b-Glu或NH2(CH2)2-N(CH2CH2COOH)2。
本发明提供的RGD肽-血清蛋白结合片段偶联物，记为III，结构式如下：
结构各部分可划分如下：
结构式中，R1为-PEG-、-PEG2-、-PEG3-、-Gly2-、-Gly3-中的一种；R2为-Glu(NH2)-、-Asp(NH2)-、-β-Glu(NH2)-、-NH2(CH2)2-N(CH2CH2CO-)2中的一种。R1和II分别与R2的两个羧酸基团连接。各基团结构式如下：
本发明提供的RGD肽-血清蛋白结合片段偶联物的制备方法，艺步骤如下：
(1)芴甲氧羰酰基(Fmoc)保护的R2前体化合物(即上述R2基团对应的完整化合物，酰基部分为完整羧酸，同时氨基被Boc保护，此处记做FmocR2)、二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺基1:(2～2.5):(2～2.5)溶于N，N-二甲基甲酰胺中，室温搅拌1～2h，离心，取上清液备用；
(2)向步骤(1)所得以上清液中加入摩尔量为FmocR2的1～1.2倍的R1-c(RGDyK)、摩尔量为FmocR2的3～10倍的二异丙基乙胺，室温搅拌1～2h，再加入摩尔量为FmocR2的1～3倍的血清蛋白结合片段，室温搅拌1～2h，再加入六氢吡啶室温搅拌10～60min，得反应液；
(3)步骤(2)所得反应液分离纯化，冻干得到RGD肽-血清蛋白结合片段偶联物。
上述方法中，步骤(1)中N，N-二甲基甲酰胺的加入量为20～100μL/μmolFmocR2。
上述方法中，步骤(1)中所述六氢吡啶的加入量为N，N-二甲基甲酰胺体积的1/5～1/10。
上述方法中，所述R1-c(RGDyK)的制备方法：
将c(RGDyK)、R1、2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯和二异丙基乙胺按照摩尔比1:(2～5):(1.3～3):(5～10)溶于N，N-二甲基甲酰胺(20～100μL/μmol R1)中，室温搅拌1～2h，所得反应液通过制备高效液相(Pre-HPLC)分离纯化，冻干得到R1-c(RGDyK)。
上述方法中，芴甲氧羰酰基保护的R2从市场购买可得，c(RGDyK)为商业购得标准化合物，从“安徽国肽公司”购入。
将本发明提供的RGD肽-血清蛋白结合片段偶联物用放射性核素标记制备成放射性核素分子探针，以在整合素受体高表达肿瘤诊断及治疗中的应用，用于标记的核素分为两类，一类为131I或125I放射性核素，所得标记后的化合物结构式如下：
结构式中131Ior125I表示此位点接131I或125I。
使用131I或125I放射性核素标记的方法为：
(1)配制III的溶液10～100μg/mL；将Na131I或Na125I配制成10～1000mCi/mL的溶液；
(2)将上述配制的两种溶液按照0.5～40mCi/1μg III加入到含有1,3,4,6-四氯-3α,6α-二苯基甘脲(Iodogen)涂层的离心管中，于振荡器上反应(1～3h)，然后通过HPLC对反应液进行纯化，纯化后达到放化纯度>95％，化学纯度>95％。
另一类为用于标记的核素为金属放射性核素，如111In、或90Y、或177Lu、或188Re、或18F[AlF]、或68Ga、或99mTc，所得标记后的化合物结构式如下：
结构式中，R1为-PEG-、-PEG2-、-PEG3-、-Gly2-、-Gly3-中的一种；R2为-Glu(NH2)-、-Asp(NH2)-、-β-Glu(NH2)-、-NH2(CH2)2-N(CH2CH2CO-)2中的一种(R1和II与分别与R2的两个酰基连接，X与R2的胺基相连)；X为-C(＝N)S-Bz-NOTA、-C(＝N)S-Bz-DOTA、-C(＝N)S-Bz-DTPA、-OC-Hynic中的一种；M为111In、90Y、177Lu、188Re、18F[AlF]、68Ga、99mTc中的一种。
使用金属放射性核素标记方法如下：
(1)标记前应先将III与双功能螯合基团(X)偶联得到偶联产物X-III。III与双功能螯合基团偶联的制备方法如下：
取III、活化双功能螯合剂(X的前体结构)，即NCS-Bz-NOTA、NCS-Bz-DOTA、NCS-Bz-DTPA、NHSOC-Hynic)和二异丙基乙胺按照摩尔比1:(1.2～2):(5～10)溶于N,N-二甲基甲酰胺(20～100μL/μmol III)中，室温搅拌1～2h。Pre-HPLC对目标化合物进行分离纯化，冻干得到X-III，HPLC检定所得目标产物X-III化学纯度>95％。
对应于各个双功能螯合剂，得到的III与双功能螯合基团偶联得到偶联产物X-III分别记为NOTA-III，DOTA-III，DTPA-III、Hynic-III。
(2)将上述偶联结构X-III制备成放射性核素分子探针的方法：
配制X-III的溶液10～100μg/mL；将金属放射性核素的水溶性盐配制成浓度为10～1000mCi/mL的溶液；将以上两种溶液按照0.5～40mCi/1μg X-III加入到离心管中，按照10～100μL/1μg X-III加入HEPES(N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-2-乙烷磺酸，浓度1mol/L，PH为7)，置于室温～95℃的水浴锅中加热，反应结束后，通过HPLC对反应进行纯化，纯化后放化纯度>95％，化学纯度>95％。
所述金属放射性核素选自111In、或90Y、或177Lu、或188Re、或18F[AlF]、或68Ga、或99mTc。
根据标记的放射性核素的不同，本发明提供的RGD肽-血清蛋白结合片段偶联物的放射性核素标记物可作为分子探针在整合素受体高表达肿瘤显像中应用，也可作为生物靶向治疗整合素受体高表达肿瘤的药物应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明提供的RGD肽-血清蛋白结合片段偶联物，是一种新型的整合素特异性受体结合的分子探针结构，通过放射性核素标记后，可以在体内准确定位整合素受体，通过核医学显像，实现肿瘤分子影像目的。
2、本发明提供的RGD肽-血清蛋白结合片段偶联物(III)，由于血清蛋白结合片段的引入，使得偶联结构作为靶向结构的探针分子在体内被肾脏快速代谢速度显著降低，延长放射性治疗药物的体内半衰期，在生物体内表现出良好的体内滞留能力和优秀的肿瘤/肾比例，可以作为放射性治疗核素的载体，准确定位整合素受体肿瘤，提高放射性治疗核素在肿瘤的聚集，提高肿瘤治疗效果。
3、131I-III的体外稳定性显示，其在胎牛血清中2h内均能保持良好的稳定性，ITLC检测其放化纯度保持在95％以上。8h检测其放化纯度保持在90％以上。
177Lu-NOTA-III的体外稳定性显示，其在胎牛血清中72h内均能保持良好的稳定性，ITLC检测其放化纯度保持在90％以上。
177Lu-NOTA-III的体内分布实验考察其体内生物学分布，177Lu-NOTA-III可以准确定位整合素受体阳性肿瘤，4d后在肿瘤仍有较高摄取，同时在肾脏表现出低聚集。
附图说明
图1是III的UPLC紫外检测图；
图2是III的UPLC-MS的4.4min～4.7min MS分析；
图3是NOTA-III的UPLC紫外检测图；
图4是NOTA-III的UPLC-MS的4.6min～4.9min MS分析；
图5是131I标记反应中III的HPLC紫外检测图。
图6是177Lu标记反应中NOTA-III的HPLC紫外检测图。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明内容，并参考附图和所列举数据表格更详细地描述本发明优选的实施方案。以下优选的实施方案不应理解为对本发明的限制，在不背离发明实质的情况下，对以下方法进行的修改和替代都应属于本发明的范围。
实施例1
PEG4-c(RGDyK)的制备：使用c(RGDyK)与PEG4进行连接，具体合成步骤如下：
(1)将c(RGDyK)0.10mmol、PEG4 0.20mmol、2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)0.13mmol和二异丙基乙胺0.50mmol溶于400μL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室温搅拌1h，所得反应液通过制备高效液相(Pre-H PLC)分离纯化。
(2)向以上反应液中加入乙腈/水(体积比1：1)3mL得到混合液，将混合液通过0.22μm针式过滤头过滤，得到清液。
(3)使用制备高效液相色谱仪(Pre-HPLC)目标化合物进行分离纯化。
液相参数：制备HPLC柱(XBridge BEH C18，21×250mm，粒径5μm)。溶剂A为含0.1％三氟醋酸的超纯水，溶剂B为含0.1％三氟醋酸的乙腈，流动相梯度如下：
流速mL/min A％ B％
0min 12.0 95 5
4min 12.0 95 5
20min 12.0 65 35
25min 12.0 10 90
紫外波长：254nm，手动进样器，定量环2mL，进样约1.3mL。
III的出峰时间为16.3min，收集16.3min峰冻干得到PEG4-c(RGDyK)。
III的制备：使用PEG4-c(RGDyK)与血清蛋白结合结构II进行连接，具体合成步骤如下：
(1)取碳酸叔丁酯保护的谷氨酸(Boc-Glu-OH)0.10mmol溶于0.5mL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，加入二环己基碳二亚胺(DCC)0.23mmol，N-羟基琥珀酰亚胺基(NHS)0.23mmol，室温搅拌12h。离心机3000rpm离心3min，取上清液备用。
(2)向所得上清液中加入c(RGDyK)0.10mmol的，二异丙基乙胺(DIPEA)0.5mmol，室温搅拌1h；再加入血清蛋白结合结构(II)0.16mmol，室温搅拌2h；再加入六氢吡啶(THP)50μL，室温搅拌15min，得到反应液；
(3)向以上反应液中加入乙腈/水(体积比1：1)3mL得到混合液，将混合液通过0.22μm针式过滤头过滤，得到清液。
(4)使用制备高效液相色谱仪(Pre-HPLC)目标化合物进行分离纯化。
液相参数：制备HPLC柱(XBridge BEH C18，21×250mm，粒径5μm)。溶剂A为含0.1％三氟醋酸的超纯水，溶剂B为含0.1％三氟醋酸的乙腈，流动相梯度如下：
流速mL/min A％ B％
0min 12.0 95 5
4min 12.0 95 5
30min 12.0 65 35
35min 12.0 10 90
紫外波长：254nm，手动进样器，定量环2mL，进样约1.3mL。
III的出峰时间为21.1min，收集21.1min峰冻干得到III。
(5)使用超高效液相色谱仪(UPLC)和质谱仪(MS)联用仪对目标化合物进行分子量和化学纯度进行质量分析。
UPLC分析参数：UPLC柱(Acquity UPLC BEH C18，5×50mm，粒径1.7μm)。溶剂A为含0.1％三氟醋酸的超纯水，溶剂B为含0.1％三氟醋酸的乙腈，流动相梯度如下：
流速mL/min A％ B％
0min 0.35 90 10
7min 0.35 55 45
8min 0.35 90 10
紫外波长：220～400nm，进样体积为10μl。
III的UPLC检查结果见图1；
III的出峰时间为4.6min；
III的化学纯度：>95％
MS分析参数：质谱扫描范围为300Da～1250Da，电压10V。
对4.4min～4.7min MS分析见图2；
分子量m/z＝698.31(M+2H+)
NOTA-III的制备：使用NCS-NOTA为双功能螯合剂与III进行偶联，具体合成步骤如下：
(1)取上述制备的III 10μmol溶于80μL NN-二甲基甲酰胺(DMF)中，加入双功能螯合剂NCS-NOTA 11μmol，二异丙基乙胺30μmol，室温搅拌1.5h；
(2)使用高效液相色谱仪(HPLC)目标化合物进行分离纯化；
液相参数：分析型HPLC柱(XDB C18，4.6×250mm，粒径5μm)。溶剂A为含0.1％三氟醋酸的超纯水，溶剂B为含0.1％三氟醋酸的乙腈，流动相梯度如下：
流速mL/min A％ B％
0min 1.0 95 5
4min 1.0 95 5
30min 1.0 38 62
35min 1.0 10 90
紫外波长：254nm，手动进样器，定量环50μL，进样40μL。
NOTA-III的出峰时间为27.8min。
收集27.8min峰，冻干得到NOTA-III。
(3)使用超高效液相色谱仪(UPLC)和质谱仪(MS)联用仪对目标化合物进行分子量和化学纯度进行质量分析。
UPLC分析参数：UPLC柱(XBridge BEH C18，5×50mm，粒径1.7μm)。溶剂A为含0.1％三氟醋酸的超纯水，溶剂B为含0.1％三氟醋酸的乙腈，流动相梯度如下：
流速mL/min A％ B％
0min 0.35 90 10
7min 0.35 55 45
8min 0.35 90 10
紫外波长：220～400nm，进样体积为10μl。
NOTA-III的UPLC检查结果见图3。
NOTA-III的出峰时间为4.8min；
NOTA-III的化学纯度：>95％
MS分析参数：质谱扫描范围为300Da～1250Da，电压10V。
对4.7min’～4.9min MS分析见图4；
分子量m/z＝924.78(M+2H)2+
实施例2
用放射性核素131I，标记III(实施例1制备所得)：
(1)配制III的水溶液100μg/mL；将Na131I用生理盐水配制成100mCi/mL的溶液；
(2)100μL 131I和100μL III加入到含有1,3,4,6-四氯-3α,6α-二苯基甘脲(Iodogen)涂层的离心管中，于振荡器上反应，即得到131I-III放射性核素粗产物溶液。
(3)通过HPLC对反应产物进行纯化，纯化参数如下：
HPLC纯化参数：HPLC柱(XDB C18，4.6×250mm，粒径5μm)。溶剂A为含0.1％三氟醋酸的超纯水，溶剂B为含0.1％三氟醋酸的乙腈，流动相梯度如下：
流速mL/min A％ B％
0min 1.0 95 5
4min 1.0 95 5
30min 1.0 42 58
35min 1.0 10 90
紫外波长：254nm，使用100μL定量环，进样5μL。
131I-III的HPLC检查结果见图5。
III的出峰时间为27.5min；
131I-III的出峰时间为28.5min；
收集参数：15～30min，收集间隔0.5min。
通过对收集到的溶液逐管进行活度分析，分析结果如下：
放射性-紫外对比分析认为放射性和紫外出峰时间相同，说明所获得放射性标记产物和主要多肽结构为同一化合物，为131I–III。
实施例3
131I-III的体外稳定性测试
131I–III合成后，取0.5mL(约1.3mCi)纯化后溶液，加入到3mL胎牛血清中，37℃温育放置2h，8h，24h，48h，72h，120h后，进行ITLC分析，放化纯检测结果如下：
时间/h 2 8 24 48 72 120
放化纯/％ >95 >91 87 82 73 60
测试结果：在72h内，131I-III有良好的稳定性。TLC检测其放化纯度保持在95％以上。8h检测其放化纯度保持在90％以上。
实施例4
用放射性核素177Lu，标记NOTA-III：
(1)配制III-NOTA的溶液100μg/mL；HEPES为1M，PH为7；用生理盐水或PBS缓冲液配制放射性核素的水溶性盐溶液177LuCl3 1000mCi/mL，其中使用177Lu为含有176Lu(约75％)和(约15％)载体的177LuCl3溶液。
(2)1.5mL塑料离心管，依次加入100μL NOTA-III的溶液，10μL177LuCl3溶液溶液，40μl的HEPES液，置于95℃的水浴锅中反应20min，即得到177LuCl3-NOTA-III粗产物溶液。
(3)通过HPLC对反应产物进行纯化，纯化参数如下：
HPLC纯化参数：HPLC柱(XDB C18，4.6×250mm，粒径5μm)。溶剂A为含0.1％三氟醋酸的超纯水，溶剂B为含0.1％三氟醋酸的乙腈，流动相梯度如下：
流速mL/min A％ B％
0min 1.0 95 5
4min 1.0 95 5
30min 1.0 38 62
35min 1.0 10 90
紫外波长：254nm，使用100μL定量环，将3μL反应液稀释至50μ后注入。
177Lu-NOTA-III的HPLC检查结果见图6。
NOTA-III的出峰时间为27.8min；
177Lu-NOTA-III的出峰时间为26.1min；
收集参数：15～30min，收集间隔0.5min。
通过对收集到的溶液逐管分析活度，分析结果如下：
时间/min 15.5 16.0 16.5 17.0 17.5 18.0 18.5 19.0 19.5 20.0
活度/μCi 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
时间/min 20.5 21.0 21.5 22.0 22.5 23.0 23.5 24.0 24.5 25.0
活度/μCi 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
时间/min 25.5 26.0 26.5 27.0 27.5 28.0 28.5 29.0 29.5 30.0
活度/μCi 32 591 210 80 32 3 0.0 0.0 0.0 0.0
放射性-紫外对比分析认为放射性和紫外出峰时间相同，说明所获得放射性标记产物和主要多肽结构为同一化合物，为177Lu-NOTA-III。
实施例5
177Lu-NOTA-III的体外稳定性测试
177Lu-NOTA-III合成后，取0.5mL(约2.5mCi)纯化后溶液，加入到3mL胎牛血清中，37℃温育放置2h，8h，24h，48h，72h，120h后，进行ITLC分析，放化纯检测结果如下：
时间/h 2 8 24 48 72 120
放化纯/％ >95 >95 >95 93 93 89
测试结果：在120h内，177Lu-NOTA-III有良好的稳定性。177Lu-NOTA-III的体外稳定性显示，其在胎牛血清中72h内均能保持良好的稳定性，ITLC检测其放化纯度保持在90％以上。
实施例6
177Lu-NOTA-III的体内分布
生理盐水稀释纯化后的177Lu-NOTA-III溶液至约20μCi/mL。选取荷M21黑色素荷瘤鼠裸鼠16只(雄性)，分4组，每组4只，分别在静脉注射以上177Lu-NOTA-III溶液0.1mL。饲养4h，2d，4d和7d，处死后解剖，取血液，脾，膀胱，肾，肝，胃，肠，肌肉，肿瘤。生理盐水清洗、滤纸吸干表面水分，称湿重，γ计数仪测定。放射性计数并记录时间，并计算注射净放射性活度，经放射性衰减校正后计算各时间点主要脏器的放射性占注入总放射性每分钟计数的百分率(ID％)和单位质量脏器的放射性占注入总放射性每分钟闪烁数的百分率(％ID/g)。
M21黑色素荷瘤鼠注射177Lu-NOTA-III后不同时间点各脏器放射性摄取(％ID/g，n＝4)
177Lu-NOTA-III的体内分布实验考察其体内生物学分布，177Lu-NOTA-III可以准确定位整合素受体阳性肿瘤，4天后在肿瘤仍有较高摄取，同时在肾脏表现出低聚集。

Claims (8)

1.RGD肽-血清蛋白结合片段偶联物，其特征在于结构式如下：
结构式中，R1为-PEG-、-PEG2-、-PEG3-、-Gly2-、-Gly3-中的一种；R2为-Glu(NH2)-、-Asp(NH2)-、-β-Glu(NH2)-、-NH2(CH2)2-N(CH2CH2CO-)2中的一种，各基团结构式如下：
2.根据权利要求1所述RGD肽-血清蛋白结合片段偶联物的制备方法，其特征在于工艺步骤如下：
(1)芴甲氧羰酰基保护的R2前体化合物FmocR2、二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺基1:(2～2.5):(2～2.5)溶于N，N-二甲基甲酰胺中，室温搅拌1～2h，离心，取上清液备用；
(2)向步骤(1)所得以上清液中加入摩尔量为FmocR2的1～1.2倍的R1-c(RGDyK)、摩尔量为FmocR2的3～10倍的二异丙基乙胺，室温搅拌1～2h，再加入摩尔量为FmocR2的1～3倍的血清蛋白结合片段，室温搅拌1～2h，再加入六氢吡啶室温搅拌10～60min，得反应液；
(3)步骤(2)所得反应液分离纯化，冻干得到RGD肽-血清蛋白结合片段偶联物。
3.根据权利要求2所述RGD肽-血清蛋白结合片段偶联物的制备方法，其特征在于步骤(1)中N，N-二甲基甲酰胺的加入量为20～100μL/μmol FmocR2。
4.根据权利要求2所述RGD肽-血清蛋白结合片段偶联物的制备方法，其特征在于步骤(1)中所述六氢吡啶的加入量为N，N-二甲基甲酰胺体积的1/5～1/10。
5.权利要求1所述RGD肽-血清蛋白结合片段偶联物的131I或125I放射性核素标记物，其特征在于结构式如下：
6.权利要求1所述RGD肽-血清蛋白结合片段偶联物的放射性金属核素标记物，其特征在于结构式如下：
结构式中，R1为-PEG-、-PEG2-、-PEG3-、-Gly2-、-Gly3-中的一种；R2为-Glu(NH2)-、-Asp(NH2)-、-β-Glu(NH2)-、-NH2(CH2)2-N(CH2CH2CO-)2中的一种；X为-C(＝N)S-Bz-NOTA、-C(＝N)S-Bz-DOTA、-C(＝N)S-Bz-DTPA、-OC-Hynic中的一种；M为111In、90Y、177Lu、188Re、18F[AlF]、68Ga、99mTc中的一种。
7.权利要求5或6所述RGD肽-血清蛋白结合片段偶联物的放射性核素标记物作为分子探针在整合素受体高表达肿瘤显像中的应用。
8.权利要求5或6所述RGD肽-血清蛋白结合片段偶联物的放射性核素标记物作为生物靶向治疗整合素受体高表达肿瘤的药物的应用。
CN201710834197.2A 2017-09-15 2017-09-15 Rgd肽-血清蛋白结合片段偶联物及其制备方法、放射性核素标记物及应用 Expired - Fee Related CN107474145B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710834197.2A CN107474145B (zh) 2017-09-15 2017-09-15 Rgd肽-血清蛋白结合片段偶联物及其制备方法、放射性核素标记物及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710834197.2A CN107474145B (zh) 2017-09-15 2017-09-15 Rgd肽-血清蛋白结合片段偶联物及其制备方法、放射性核素标记物及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107474145A true CN107474145A (zh) 2017-12-15
CN107474145B CN107474145B (zh) 2020-09-15

Family

ID=60585009

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710834197.2A Expired - Fee Related CN107474145B (zh) 2017-09-15 2017-09-15 Rgd肽-血清蛋白结合片段偶联物及其制备方法、放射性核素标记物及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107474145B (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101474415A (zh) * 2009-01-16 2009-07-08 北京大学 用于integrinαvβ3阳性肿瘤的RGD多肽放射性药物及其制备方法
CN102391168A (zh) * 2011-09-16 2012-03-28 中山大学附属第一医院 对称性双功能偶联剂及其偶合分子显像剂
CN102911256A (zh) * 2012-11-02 2013-02-06 厦门大学 一种放射性标记的多肽配合物及其制备方法和应用
CN107137716A (zh) * 2017-05-10 2017-09-08 北京林业大学 一种聚乙二醇偶联环形多肽iRGD和薯蓣皂苷元载药纳米粒子的制备

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101474415A (zh) * 2009-01-16 2009-07-08 北京大学 用于integrinαvβ3阳性肿瘤的RGD多肽放射性药物及其制备方法
CN102391168A (zh) * 2011-09-16 2012-03-28 中山大学附属第一医院 对称性双功能偶联剂及其偶合分子显像剂
CN102911256A (zh) * 2012-11-02 2013-02-06 厦门大学 一种放射性标记的多肽配合物及其制备方法和应用
CN107137716A (zh) * 2017-05-10 2017-09-08 北京林业大学 一种聚乙二醇偶联环形多肽iRGD和薯蓣皂苷元载药纳米粒子的制备

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
刘敏: "RGD 肽探针的制备及其对肿瘤显像的研究进展", 《生物医学工程与临床》 *
庞小溪: "核素标记小分子多肽靶向诊治肿瘤新生血管的应用研究进展", 《中国肿瘤临床》 *
李前伟: "环形精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸多肽的核素标记及在健康动物体内的实验", 《中国临床康复》 *
邵武国: "放射性核素标记RGD肽及衍生物的研究进展", 《中国高新技术企业》 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN107474145B (zh) 2020-09-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0284071B1 (en) Metal-radionuclide-labeled proteins and glycoproteins for diagnosis and therapy
AU688264B2 (en) Technetium-99m labeled peptides for imaging
KR100341014B1 (ko) 진단영상용의테크네튬-99m표지된펩티드
CN113372285B (zh) 前列腺特异性膜抗原抑制剂、其放射性核素标记物及制法和应用
US5616692A (en) Metal-radionuclide-labeled proteins and glycoproteins for diagnosis and therapy
US10646598B2 (en) Cage-like bifunctional chelators, copper-64 radiopharmaceuticals and PET imaging using the same
CN101863924B (zh) 99mTc标记肼基烟酰胺基-二氧辛酰-叶酸配合物及制备方法
CN107847618A (zh) Hbed‑二膦酸盐/酯、其放射金属轭合物和它们作为治疗诊断剂的用途
Kim et al. Synthesis and characterization of a 68Ga-labeled N-(2-diethylaminoethyl) benzamide derivative as potential PET probe for malignant melanoma
JP2023179429A (ja) キレート化ａａｚｔａコンジュゲートおよびその錯体
CN113583089A (zh) 靶向肿瘤pd-l1的pet显像剂、其标记前体、制法和应用
Liu et al. Synthesis and biodistribution of a novel 99m Tc complex of HYNIC-conjugated metronidazole as a potential tumor hypoxia imaging agent
CN115974962A (zh) 一种fap靶向的探针及其制备方法和应用
CN109045313A (zh) 一种靶向her2的d型多肽放射性药物及制备方法
Sanders et al. Synthesis, characterization and biological studies of rhenium, technetium-99m and rhenium-188 pentapeptides
Panwar et al. 99mTc-Tetraethylenepentamine-folate a new 99mTc based folate derivative for the detection of folate receptor positive tumors: synthesis and biological evaluation
CN107474145A (zh) Rgd肽‑血清蛋白结合片段偶联物及其制备方法、放射性核素标记物及应用
CN110305186A (zh) 前列腺癌PET诊断试剂68Ga-DOTA-ANCP-PSMA及其制备方法和应用
CN115286693A (zh) 针对癌胚抗原相关细胞黏附分子ceacam6的肿瘤靶向肽及其应用
Chakraborty et al. 177Lu labeled metronidazole for possible use in targeting tumor hypoxia
Jalilian et al. Preparation, quality control and biodistribution studies of [67Ga]-DOTA-anti-CD20
US20220072165A1 (en) Radiodrug for diagnostic/therapeutic use in nuclear medicine and radio-guided medicine
Rück Synthesis and evaluation of novel picolinic acid-based bispidine ligands and their metal complexes for the application in nuclear medicine
CN118307640A (zh) 一种pet显像剂前体、pet显像剂及其制备方法和应用
CN116554146A (zh) 一种FAP-α特异性放射性药物及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20200915

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee