CN102382781B

CN102382781B - 一株抑制芸苔根肿菌的解淀粉芽胞杆菌及其活性物质的分离与应用

Info

Publication number: CN102382781B
Application number: CN201110284741.3A
Authority: CN
Inventors: 刘晓艳; 杨自文; 王开梅; 万中义; 闵勇; 江爱兵; 曹春霞; 张志刚; 周荣华
Original assignee: Hubei Biopesticide Engineering Research Center
Current assignee: Hubei Biopesticide Engineering Research Center
Priority date: 2011-09-23
Filing date: 2011-09-23
Publication date: 2014-03-19
Anticipated expiration: 2031-09-23
Also published as: CN102382781A

Abstract

本发明涉及一种抑制芸苔根肿菌的解淀粉芽胞杆菌及其活性物质的分离与应用，活性物质的用途。解淀粉芽胞杆菌HB-26，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2011259。培养方法是沼液分离菌接种LB液体培养基，30℃培养过夜，发酵液对白菜灌根，找出对根肿菌有抑菌活性的菌株。分离活性物质是LB液体培养基中接种HB-26，发酵液冻干，冻干菌粉加乙酸乙酯提取，振荡旋转蒸发，用甲醇溶解后，进行HPLC分离，收集组分，质谱鉴定，根据白菜根肿病发作的情况，来判断活性物质为哪一个组分。抑菌活性物质BA20，分子量大小为1494.0，核磁共振氢谱显示其化学本质是糖类细菌素。活性物质用作制备防治白菜根肿病的微生物制剂。

Description

一株抑制芸苔根肿菌的解淀粉芽胞杆菌及其活性物质的分离与应用

技术领域

本发明涉及一株解淀粉芽胞杆菌，解淀粉芽胞杆菌的培养方法及从其分离对芸苔根肿菌具有抑菌作用的活性物质的方法，活性物质的用途，与微生物农药技术领域有关。

背景技术

芽胞杆菌是自然界中广泛存在的一种非致病性细菌，能产生多种抗菌物质，其中大部分是多肽，主要抑制革兰氏阳性菌；有些还能抑制革兰氏阴性菌、霉菌和酵母(刘静等，枯草芽孢杆菌J A抗菌物特性的研究及抗菌肽的分离纯化，微生物学报，2004，44(4)：511-513)。它们易于繁殖，适应环境能力强，具有很大的开发利用价值。解淀粉芽胞杆菌能产生多种抑制植物病原真菌的抗菌物质，因而在生物防治中起着重要的作用(Chen XH et al.，Comparative analysis of the complete genome sequence of the plant growth-promoting bacterium Bacillus amyloliquefaciens FZB42，2007，Nat Biotechnol，25：1007-1014)。这些抗菌物质主要分为两大类，一类是低分子量抗菌肽，包括环状肽或环状脂肽，也有些为线状肽，另有少量为蛋白类抑菌物质，这一类占解淀粉芽胞杆菌抑菌物质的绝大部分；另一类主要包括聚酮类、氨基糖类以及脂肽类等的抗生素。迄今为止国内外多个实验室通过分离其发酵产物，得到了一些低分子量的抗菌物质，并进行了深入研究(Arguelles-Arias A et al.，Bacillus amyloliquefaciens GA1 as a source of potent antibiotics and other secondary metabolites for biocontrol of plant pathogens，2009，Microb Cell Fact，8：63)。

解淀粉芽胞杆菌通过成功定殖至植物根际、体表或体内，同病原菌竞争植物周围的营养、分泌抗菌物质抑制病原菌生长，同时诱导植物防御系统抵御病原菌入侵，从而达到生防目的。其主要防治对象大部分为丝状真菌所引起的植物病害，如水稻纹枯病、番茄叶霉病、大豆根腐病、苹果霉心病、棉花立枯病、棉花枯萎病等(程洪斌等，枯草芽胞杆菌防治植物真菌病害研究进展，上海农业学报，2006，22(1)： 109-112)。对于芸苔根肿菌具有抑制作用的解淀粉芽胞杆菌菌株的报道还比较少。此外，解淀粉芽胞杆菌能够产生耐热、耐干旱的芽胞，具有极强的抗逆能力，作为生防菌剂具有良好的应用前景。目前商品化的解淀粉芽胞杆菌制剂种类较少，如有获得有限商品化生产应用许可的解淀粉枯草芽胞杆菌变种(Bacillus subtilisvar.amyloliquefaciens)FZB24。

白菜根肿病(clubroot)又称根瘤病，1978年由俄国学者Worolin发现其病原，并命名为芸苔根肿菌(plasmodiophora brassica)，属真菌之鞭毛菌亚门，根肿菌纲。此病为世界性病害，多发生于温带地区而造成极大的经济损失，至今仍是一大难题。根肿病主要发生在植株根部，促使根部形成肿瘤。肿瘤一般为纺缍形、平指形或不规则形，大的如鸡蛋或更大些，小的只有小米粒大小。主根上的肿瘤一般大而少，侧根上的则小而多。肿瘤初期表面光滑，后期常发生龟裂，变得十分粗糙，常因杂菌的浸染而腐烂，病株的地上部表现为生长缓慢，植株矮小如缺水症状。发病后期萎蔫低垂更甚，而且叶片黄，严重的可以引起植株死亡。根肿病病原菌可危害十字花科多种作物，其严重性因生理小种不同而异。病菌孢子囊在6-30℃均可发芽，但以18-25℃为最适宜，此适温也是发病的最适温度条件，当温度低于或高于此范围时不发病或发病轻，发病最适土温为21-22℃。土壤条件以pH值最具影响力，pH值4.0-7.0均可以发病，但以5.4-6.5为最适发病pH值，一般pH值7.0或7.2以上不发病，土中可交换性钙离子浓度达到1200mg/kg时也不发病(杨莲等，白菜根肿病田间发生消长规律研究，植保技术与推广，2003，23(7)：17-18)。

发明内容

本发明的目的是针对上述现状，旨在提供一种解淀粉芽胞杆菌，解淀粉芽胞杆菌的培养方法及从其分离对芸苔根肿菌具有抑菌作用的活性物质的方法，活性物质的用途。

本发明目的的实现方式为，一种解淀粉芽胞杆菌命名解淀粉芽胞杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)HB-26，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏日2011年7月18日，保藏中心编号CCTCC NO.M2011259。

菌株的菌体大小为(0.4～1.0)umx(1.0～1.5)um，细胞呈短杆状，芽胞中生，革兰氏染色呈阳性反应，能运动。在LB琼脂糖平板上形成的菌落呈乳白色、菌落椭圆形、表面隆起有皱褶。最适生长温度为30℃，pH6-8均生长良好，最适生长pH为7.0-7.2。

一种解淀粉芽胞杆菌的培养方法，具体步骤如下：

1)将沼液进行分离培养与保存

称取0.1g土样及1ml沼液，分别加入灭菌去离子水至总体积为10ml，混匀后再依次取1ml，继续稀释10倍、100倍、1000倍、10000倍，取稀释后的菌液200μl涂布LB平板，30℃培养过夜，分别挑取单菌落，转接入5ml LB液体培养基中，200rpm 30℃活化8-10h，用25％甘油保存在-80℃，

LB平板配方：蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCl 10g、琼脂粉20g；补充水分至1L，pH 7.2，121℃灭菌30min；

2)细菌的小量发酵

将活化过夜的细菌单菌落按1％的接种量转接于100ml LB液体培养基中，200rpm30℃振荡培养24-36h，

LB液体培养基配方：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，补充水分1L，pH 7.2，121℃灭菌30min；

3)抑菌活性检测的白菜根肿病盆栽实验

(1)将大白菜种子用温水浸泡过夜，用70％酒精洗一遍，点播在装有培养土的培养钵中，每钵放2颗种子，在20℃温室中避光培养14d，每天浇水一次，模拟自然条件培育；

(2)将生长至3-4叶片的白菜幼苗移栽至花盆中，土壤分为混入芸苔根肿菌的病土及没有病原菌的健康土两种，每个处理设置5次重复，20℃培养，每天浇水一次；

(3)每2个星期灌根一次，共灌根3次，每次用100ml步骤2)的菌液灌根，傍晚灌根；

(4)2个月后，将白菜根部拔出，根据没有根肿的植株找出对应灌根所用的菌株，即为对根肿菌有抑菌活性的菌株。

一种从解淀粉芽胞杆菌分离对芸苔根肿菌具有抑菌作用的活性物质的方法，具体步骤如下：

1)HB-26菌株的发酵与活性物质提取

LB液体培养基中接种HB-26，过夜培养，第二天转接至20L发酵罐中，进行12L LB培养液的小量发酵，30℃培养，溶氧量20％-30％，通气量1∶0.3-1∶0.5，转速从200rpm-300rpm，pH 6.5-7.0，发酵24h后，取出发酵液，倒入冻干槽中，每槽状菌液量为100ml，冻干机中冻干2-3天后，将冻干粉从冻干槽中取出装入三角瓶中，每6个冻干槽的菌粉装入1个三角瓶，每个三角瓶中加入100ml乙酸乙酯，混匀后室温180rpm振荡1h，取上清液加入旋转蒸发仪中进行旋转蒸发，得到干粉，加入100％甲醇溶解；

2)HB-26菌株活性物质的分离

取5ml甲醇溶解的样品进行HPLC分离，所用色谱柱为反相柱，10μm，10×250mm，进样体积800μl，柱温为25℃，流速7.5ml/min，流动相为乙腈和水，采用梯度洗脱，乙腈的浓度在25min内5％变至100％，每分钟收集一个组分，共收集到36个组分；

MS鉴定分离组分的分子量，质谱检测条件：电喷雾电离，毛细管电压为3.5KV，锥孔电压为45V，离子源温度为100℃，干燥温度为300℃，脱溶剂气体流速500L/h，锥孔气体流速为50L/h；

3)用盆栽实验验证活性成分，

盆栽实验依然采用上述条件，每个处理设置两棵植株，根据白菜根肿发作的情况，来判断活性物质为哪一个组分，结果显示对白菜根肿病具有抑制效果的是组分17、20、30分钟收集的组分。

一种从解淀粉芽胞杆菌分离出的对芸苔根肿菌具有抑菌作用的活性物质的用途，用作制备防治白菜根肿病的微生物制剂。

本发明的菌株具有下列明显特征：

(1)对芸苔根肿菌具有抑菌活性；

(2)能够产生大小为1494.0的糖类活性物质，该物质被命名为BA20；

(3)BA20对芸苔根肿菌具有抑菌活性。

本发明制备的菌株按照常规甘油管保藏方法保藏。

附图说明

图1是本发明的解淀粉芽胞杆菌HB-26菌株的白菜根肿病盆栽实验，

图2是本发明解淀粉芽胞杆菌HB-26的菌落形态图及镜检图，

图3是本发明的解淀粉芽胞杆菌HB-26的16s rDNA系统发生树，

图4是本发明的HB-26菌株代谢物HPLC图，

图5是本发明的HB-26菌株代谢物经过HPLC分离后得到的36份组分物质做的白菜根肿病盆栽实验，

图6是本发明的HB-26菌株中BA20的LC-MS鉴定及核磁共振氢谱图。

具体实施方式

本发明的解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)HB-26，由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏日2011年7月18日，保藏中心编号CCTCC NO.M2011259。菌株的菌体大小为(0.4～1.0)umx(1.0～1.5)um，细胞呈短杆状，芽胞中生，革兰氏染色呈阳性反应，能运动。在LB琼脂糖平板上形成的菌落呈乳白色、菌落椭圆形、表面隆起有皱褶。最适生长温度为30℃，pH6-8均生长良好，最适生长pH为7.0-7.2。

下面详述本发明：

一、解淀粉芽胞杆菌的培养方法，具体步骤如下：

1、细菌的分离与保存

将采自全国各地的土壤样品及液体样品(如采自湖北荆州的沼液)，分别进行分离培养与保存。

具体方法是：称取0.1g土样及1ml沼液，分别加入灭菌去离子水至总体积为10ml，混匀后再依次取1ml，继续稀释10倍、100倍、1000倍、10000倍，取稀释后的菌液200μl涂布LB(配方：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，琼脂粉20g，补充水分1L，pH 7.2，121℃灭菌30min)平板，30℃培养过夜。

分别挑取单菌落，转接入5ml LB液体培养基中，200rpm 30℃活化8-10h，用25％甘油保存在-80℃。

2、细菌的小量发酵

将活化过夜的细菌单菌落按1％的接种量转接于100ml LB液体培养基(配方：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，补充水分1L，pH 7.2，121℃灭菌30min)中，200rpm 30℃振荡培养24-36h。

3、抑菌活性检测的白菜根肿病盆栽实验

由于白菜根肿病原菌芸苔根肿菌目前还无法在实验室条件下离体培养，因此要检测其拮抗菌活性，只能通过盆栽实验。具体方法如下：

(1)白菜幼苗的培育：将大白菜种子用温水浸泡过夜，用70％酒精洗一遍，点播在装有培养土的培养钵中，每钵放2颗种子。在20℃温室中避光培养14d，每天浇水一次。苗子长出后，打开植物生长灯，模拟自然条件，早开灯，晚关灯。

(2)白菜幼苗的移栽：将生长至3-4叶片的白菜幼苗移栽至花盆中，土壤分为混入芸苔根肿菌的病土及没有病原菌的健康土两种，每个处理设置5次重复。秋冬季在室外环境下培养，春夏季在20℃温室中培养，每天浇水一次，植物生长灯设置为早8:00开灯，晚20:00关灯。

(3)细菌菌液灌根：每2个星期进行灌根一次，共灌根3次。每次菌液灌根量为100ml，傍晚灌根。

(4)拔根验证抑菌效果：2个月后，将白菜根拔出，根据与对照(病土，没有施药的白菜及健康土)相比较，选出根部根系发达，主根与侧根数量多，且根肿少或没有的植株，对号入座，找出灌根所用的菌株，即为对根肿菌有抑菌活性的菌株。根据根肿数量的多少，获得菌株HB-26(来源于沼液)，即为对根肿菌具有抑菌活性的菌株(见图1)。

图1中的A：含有芸苔根肿菌的病土栽培的白菜植株，只加水浇灌；B：含有芸苔根肿菌的病土栽培的白菜植株，用HB-26菌液灌根处理3次；C：不含有芸苔根肿菌的健康土栽培的白菜植株，用培养基灌根处理3次；D：以上三种处理的白菜植株对比。从D的对比可看出，用HB-26菌液灌根的白菜植株，根系健壮发达，没有根瘤。

4、细菌的菌种鉴定

细菌的显微镜观察

(1)挑取对芸苔根肿菌有抑菌活性的单菌落，用蕃红染色液(配置方法：2.5％蕃红的乙醇溶液10ml，加蒸馏水稀释至100ml，过滤)简单染色后置普通光学显微镜下观察，均为产芽胞的杆状细菌(见图2)。

图2中的A：HB-26的菌落形态图；B：显微镜下的HB-26杆状芽胞。

(2)细菌总DNA的抽提

从显微观察的菌落中，挑取一个单菌落，用接种环通过无菌操作接种于5mL的LB液体培养基中，置于30℃、200rpm的摇床中培养过夜；然后通过无菌操作将50μL的培养物转移至5mL的LB液体培养基中，同样条件培养3-4小时；然后以12000rpm，0.5min离心收集菌体，用1mL STE[配方：0.1mol/L NaCl，10mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，1mmol/L EDTA(pH8.0)]洗涤一次，加100μL溶液I[配方：1mol/LTris-HCl(pH8.0)，0.5mol/L EDTA(pH8)，50mmol/L葡萄糖]和10μL溶菌酶(浓度：50mg/mL)，在37℃作用30min以上；加入200μL 2％的十二烷基磺酸钠(SDS)于55℃水浴30min；加入200μL 5mol/L NaCl混和，再加入500μL 苯酚/氯仿/异戊醇(按体积比：25∶24∶1)，离心12000rpm，5min，吸取上清液，重复抽提1-2次；将上层DNA溶液转移至1.5ml离心管，加入等体积95％乙醇，室温静置5min后以12000rpm离心5min，沉淀用200μL 70％乙醇洗涤一次，冷冻抽干后溶于50μL TE溶液中。

(3)PCR扩增细菌的16S rDNA

根据真细菌16S rDNA保守区设计通用引物CW34667和CW34668(BW Eckloff，et al，A comparison of 16S ribosomal DNA sequences from five isolates ofHelicobacter pylori，International Journal of Systematic Bacteriology，1994，44：320-323)进行PCR扩增。

通用引物序列如下：

CW34667：5’-CTCTCAAACTAGGACCGAGTC-3’

CW34668：5’-TTCCTCCACTAGGTRGGCGT-3’

PCR反应体系为：10×buffer 2μl，2mmol/L dNTP 1.5μl，10μmol/L通用引物各0.4μl，Taq酶1U，拮抗细菌总DNA 1μl，补加灭菌去离子H₂O至20μl。

PCR扩增反应程序为：第1步94℃预变性5min；第2步94℃变性1min，第3步58℃复性1min，第4步72℃延伸1.5min；第5步转到第2步继续运行28个重复；第6步72℃延伸5min。

(4)PCR产物的序列测定及分析

将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳后，切下需要的DNA片段所在的琼脂糖块，使用X-gene公司DNA片段回收试剂盒回收DNA片段。将回收产物连接到大连宝生物公司的T-载体连接试剂盒所提供的pMD19-T载体上，利用CaCl₂转化法(SambrookJ.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual[M].3rd ed.New York：Cold SpringHarbor Laboratory Press，2001.)将连接产物转化到大肠杆菌DH5α中。筛选阳性克隆，送至华大生物有限公司测序。通过两个测序反应获得PCR扩增产物的全长1416bp，测序结果输入NCBI，用Blastn程序交送GenBank数据库进行比较分析，表明该序列与GenBank数据库中的解淀粉芽胞杆菌属的不同菌株的16S rDNA同源性较高，相似性达到99％，鉴定该菌株属于芽胞杆菌科(Bacillaceae)芽胞杆菌属(Bacillus)，申请人将其命名为HB-26，16S rDNA序列已登录至NCBI(GenBankaccession no.HM138476)。

根据多序列比对结果绘制成系统发生树(见图3)，图中线段的长度不同表示同源性的差异。本发明分离鉴定的HB-26菌株与已报道的解淀粉芽胞杆菌菌株(FJ889054.1)处于同一进化分支，且与枯草芽胞杆菌(EU567068.1)和海洋细菌Bacillus velezensis(EU852930.1)在进化分支上相距较远。因此进一步确证HB-26为一株解淀粉芽胞杆菌。

二、从HB-26中分离、提取抑菌活性物质的方法

1、HB-26菌株的发酵与活性物质提取

LB液体培养基中接种HB-26，过夜培养。第二天转接至20L发酵罐中，进行12L LB培养液的小量发酵，30℃培养，溶氧量20％-30％，通气量1∶0.3-1∶0.5，转速从200rpm-300rpm，pH 6.5-7.0。发酵24h后，取出发酵液，倒入冻干槽中，每槽状菌液量为100ml，冻干机中进行冻干。2-3天后将冻干粉从冻干槽中取出装入三角瓶中，每6个冻干槽的菌粉装入1个三角瓶。

每个装有冻干粉的三角瓶中加入100ml乙酸乙酯，混匀后室温180rpm振荡1h，取上清液加入旋转蒸发仪中进行旋转蒸发，得到干粉，加入100％甲醇溶解。

2、HB-26菌株活性物质的分离与初步鉴定

取5ml甲醇溶解的样品进行HPLC分离，所用色谱柱为美国Sunfire C18反相柱(10μm，10×250mm)，进样体积800μl，柱温为25℃，流速7.5ml/min，流动相为乙腈和水，采用梯度洗脱，乙腈的浓度在25min内5％变至100％，每分钟收集一个组分，共收集到36个组分(见图4)。

图4中的A：代谢物的半制备图，共分为36组分，每个组分为一分钟内收集的样品；图中的B：代谢物的HPLC全程图，共测定到40min。

MS鉴定分离组分的分子量，质谱检测条件：电喷雾电离(ESI)，毛细管电压为3.5KV，锥孔电压为45V，离子源温度为100℃，干燥温度为300℃，脱溶剂气体流速500L/h，锥孔气体流速为50L/h。用盆栽实验验证活性成分。盆栽实验依然采用上述条件，每个处理设置两棵植株。根据白菜根肿发作的情况，来判断活性物质为哪一个组分。结果显示对白菜根肿病具有抑制效果的是组分17、20、30，其中组分BA20效果最好(见图5)。

图5中的A：各个组分一棵植株；B：对照，含有芸苔根肿菌的病土栽培的白菜植株，只加水浇灌；C：含有芸苔根肿菌的病土栽培的白菜植株，用组分17灌根处理3次；D：含有芸苔根肿菌的病土栽培的白菜植株，用组分20即BA20灌根处理3次；E：含有芸苔根肿菌的病土栽培的白菜植株，用组分30灌根处理3次。其中各组分的使用浓度均为40μg/ml。

三、从HB-26中分离、提取出的抑菌活性物质BA20的结构鉴定

将HPLC半制备获得的活性组分20进行MS鉴定，结果显示其分子量为1494.0，命名为BA20。重新大量提纯BA20，并做核磁共振分析，氢谱结果显示该物质为一糖类衍生物，通过与已知糖类如葡萄糖、蔗糖等物质的氢谱图比较发现，BA20氢谱图均与其他糖类物质不同，所以推测可能为一新的糖类细菌素(见图6)。

图6中的A：BA20的HPLC分离纯化图；B：BA20的MS质谱图；C：BA20的核磁共振氢谱图。

四、从HB-26中分离、提取出的抑菌活性物质BA20的抑真菌活性测定

将提纯得到的BA20经过定量测定其初始浓度为40μg/ml，分别用甲醇稀释1倍、2倍、3倍后，得到稀释浓度为20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml，分别进行番茄早疫病菌、玉蜀黍赤霉、禾谷镰刀菌、水稻纹枯病菌及立枯丝核菌等病原真菌的抑菌实验，实验通过96孔板进行，将不同浓度的BA20混入培养真菌生长的PDA培养基(配方：马铃薯浸出汁200g，葡萄糖20g，琼脂粉20g，水1000ml，pH值7.0)中，设置没有放BA20的对照，25℃温箱中培养7d。根据病原真菌相对生长状况来判断抑菌效果。菌株相对生长情况对比如下：(-)对照，病原菌生长良好；(+)病原菌生长情况为100％-70％；(++)69％-30％；(+++)29％-1％；(++++)完全抑制病原菌生长。

结果显示，BA20在40μg/ml和20μg/ml浓度下，对番茄早疫病具有100％的抑菌性；当浓度下降到5μg/ml时，对立枯丝核菌没有抑菌效果。说明分离出的活性物质可用作制备防治白菜根肿病的微生物制剂。

Claims

1.一种解淀粉芽胞杆菌，其特征在于命名解淀粉芽胞杆菌HB-26，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏日2011年7月18日，保藏中心编号CCTCC NO.M2011259。

2.根据权利要求1所述的解淀粉芽胞杆菌，其特征在于菌体大小为0.4～1.0μm×1.0～1.5μm，细胞呈短杆状，芽胞中生，革兰氏染色呈阳性反应，能运动，在LB琼脂糖平板上形成的菌落呈乳白色、菌落椭圆形、表面隆起有皱褶，最适生长温度为30℃，pH6-8生长。

3.根据权利要求1所述的解淀粉芽胞杆菌，其特征在于菌体在pH7.0-7.2生长。