CN102382177A - 恩拉霉素的提取分离和纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种从恩拉霉素发酵液中提取、分离和纯化恩拉霉素的方法，包括如下步骤：将恩拉霉素发酵液经过热处理后，过滤，离心，收集菌体；向菌体加入甲醇溶液后，超声，过滤；滤液先酸化后碱化，然后脱色，脱色液过大孔吸附树脂进行吸附，用甲醇洗脱，收集洗脱液，经浓缩结晶后，冷冻干燥，得到恩拉霉素。该方法提取恩拉霉素的优点在于：所需时间短，产品纯度高，工艺简单，操作费用低。

Description

恩拉霉素的提取分离和纯化方法
技术领域
本发明涉及一种从恩拉霉素发酵液中提取、纯化恩拉霉素的方法，属于生物化工领域。
背景技术
恩拉霉素是由包括13个不同种类的17个氨基酸分子和脂肪酸分子所组成的有机碱。其中氨基酸分子构成环状多肽结构，脂肪酸位于多肽结构末端。据其末端脂肪酸种类不同，分为恩拉霉素A和恩拉霉素B，恩拉霉素则是由这两种成分组成的混合物。恩拉霉素的盐酸盐为白色结晶性粉末，分子量约为2500，熔点为238～245℃，易溶于二甲亚砜，可溶于甲醇、含水乙醇，难溶于丙酮，不溶于苯、氯仿。恩拉霉素的盐酸盐对热、光照和潮湿有极好的稳定性。
恩拉霉素在饲料中具有很高的稳定性，在室温条件下长期储藏很少降解，在制成颗粒料过程中也非常稳定，与饲料混合后在室温下长期储藏效价下降甚微。在肠道内不被降解，能够保持原有的抗菌活性。其抗菌机理主要是抑制细菌细胞壁的合成。阻止粘肽的合成，使细胞壁缺损，导致细胞内渗透压升高，细胞外液渗入菌体，使细菌变形肿大，破裂而死亡。恩拉霉素主要作用于细菌的裂殖阶段，不仅杀菌，而且溶菌，最小抑菌浓度为0.05～3.13μg/ml。
恩拉霉素在饲料中的微量添加，就可起到良好的促进生长和显著提高饲料报酬的效果。无论在有氧和厌氧条件，恩拉霉素都能对革兰氏阳性菌显示良好的抗菌作用。
但是，现有技术中生产的恩拉霉素产品纯度较低、色泽深，产品收率较低，生产操作复杂，从而影响了经济效益。
发明内容
本发明要解决的技术问题是如何提取分离并纯化得到高纯度的恩拉霉素。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种从恩拉霉素发酵液中提取、分离和纯化恩拉霉素的方法。
本发明的恩拉霉素发酵液的来源可以为采用本领域常用菌种进行常规发酵后所得的发酵液，例如以链霉菌(Streptomyces)为生产菌种，诸如杀真菌素链霉菌(Streptomyces fungicidicus)，将其孢子液在液氮环境下保存；将冻存孢子液接种到种子培养基中进行种子培养得种子液；然后将种子液接种到发酵培养基中进行发酵培养，得到恩拉霉素发酵液。
本发明从恩拉霉素发酵液中提取、分离和纯化恩拉霉素的方法包括如下步骤：
将恩拉霉素发酵液经过热处理后，过滤，离心，收集菌体；向菌体加入甲醇溶液后，超声，过滤；所得甲醇提取液先酸化后碱化，然后脱色，脱色液过大孔吸附树脂柱进行吸附，用甲醇先冲洗后洗脱，收集洗脱液，经浓缩结晶后，冷冻干燥，得到恩拉霉素。
在本发明的一个实施方案中，所述热处理为将恩拉霉素发酵液加热至55～65℃，优选60℃，然后真空浓缩至恩拉霉素含量为10～100g/L。
在本发明的一个实施方案中，热处理后的恩拉霉素发酵液采用陶瓷膜过滤；优选地，采用截留分子量为10万～50万D的陶瓷膜过滤；更优选地，采用截留分子量为30万D的陶瓷膜过滤。
在本发明的一个实施方案中，所述甲醇溶液的加入量为所得菌体的2～5倍v/m；甲醇溶液的浓度为45～55％(体积比)，优选为50％；甲醇超声的时间为2～8h，优选3～4h。
在本发明的一个实施方案中，对所得甲醇提取液先酸化后碱化处理，其中，酸化的目的是保持恩拉霉素的稳定性，碱化的目的是较好地分离除去色素。
优选地，酸化后的pH值为1.0～5.0，碱化后的pH值为7.5～9.0。
进一步优选地，所述酸化为采用5％～30％盐酸将甲醇提取液的pH调至1.0～5.0，于20～40℃下保温1～4h，抽滤，得酸化滤液；所述碱化为采用1～10％氢氧化钠将酸化滤液的pH调至7.5～9.0，抽滤，得碱化滤液。
更优选地，采用10％～15％盐酸将甲醇提取液的pH调至2.0～3.0；更优选地，采用4～8％氢氧化钠将酸化滤液的pH调至7.5～8.5。
在本发明的一个实施方案中，过大孔吸附树脂柱时的流速均为2～4BV/h；所述大孔吸附树脂优选为HZ-816树脂或HZ-818树脂，其对恩拉霉素吸附量大，且对杂质吸附量较少。
在本发明的一个实施方案中，采用经预处理的活性炭柱脱色，脱色时的流速为2～4BV/h；其中，所述预处理的方法为：用3～4％盐酸以1.0～2.0BV/h的流速冲洗2～3BV柱体积后，浸泡1-2h，然后用水冲洗至流出液pH为4.0～7.0后，再用3～4％氢氧化钠溶液以1.0～2.0BV/h的流速冲洗2～3BV柱体积后，浸泡1-2h，然后用水冲洗至流出液pH为7.0～9.0。
优选地，对活性炭柱的预处理方法为：用4％盐酸以1.5BV/h的流速冲洗2BV柱体积后，浸泡1h，然后用水冲洗至流出液pH为5.0后，再用4％氢氧化钠溶液以1.5BV/h的流速冲洗2BV柱体积后，浸泡1h，然后用水冲洗至流出液pH为8.0。
在本发明的一个实施方案中，所述冲洗为采用pH 7.5～8.0的45～55％甲醇，以1～5BV/h的流速进行反向冲洗和正向冲洗；优选地，采用pH 8.0的50％甲醇进行冲洗；所述洗脱为采用pH 1.0～4.0的65～75％甲醇以1～4BV/h的流速进行洗脱；优选地，采用pH 2.5的70％甲醇进行洗脱。
在本发明的一个实施方案中，将所述洗脱液在30～50℃、优选45-50℃下减压浓缩至有结晶出现，然后以3～5℃/h的速度降温搅拌；降温至0～5℃、优选5℃时，停止搅拌。
在本发明的一个实施方案中，将所得结晶在3000～5000rpm下离心分离，在真空冷冻条件下干燥。
本发明针对现有生产中存在的恩拉霉素产品纯度低、色泽深，且产品收率低，操作复杂等不足之处，提供了一种提取、分离和纯化恩拉霉素的方法，该方法采用过柱吸附，洗脱相结合的方式，能较完全的除去恩拉霉素溶液的杂质，操作简单，发酵液处理所需时间短，符合大量生产要求，能低成本制得高纯度的恩拉霉素。
具体实施例
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
以杀真菌素链霉菌(Streptomyces fungicidicus)为生产菌种，将其孢子液在液氮环境下保存；将冻存孢子液接种到种子培养基中进行种子培养得种子液；然后将种子液接种到发酵培养基中进行发酵培养，得到棕黄色恩拉霉素发酵液(恩拉霉素含量5.54g/L，总糖含量0.98％，还原糖含量0.34％，蛋白含量0.39％，溶磷78mg/L)。
1)取10L棕黄色恩拉霉素发酵液，加热至60℃，真空浓缩至恩拉霉素含量为55.4g/L，经30万D陶瓷膜过滤后，用离心机以5000rpm的条件离心，得到菌丝体1000g，加入50％甲醇(体积比)4L，在超声波条件下搅拌、破碎3h，过滤，得到恩拉霉素甲醇提取液。
2)用10％的盐酸调节恩拉霉素甲醇提取液的pH至2.5，于30℃下保温2h，抽滤，滤液用4％NaOH溶液调节pH值至8.0，抽滤。
3)将所得滤液以2BV/h的流速过处理好的活性炭柱进行脱色，再以同样的流速过HZ-818树脂，以吸附恩拉霉素。吸附完成后，用pH8.0的50％甲醇(体积比)，以3.0BV/h的流速进行反向冲洗和正向冲洗。冲洗完毕后，用pH2.5的70％甲醇(体积比)，以1.5BV/h的流速进行洗脱，收集洗脱液。
活性炭柱的预处理方法为：用4％盐酸以1.5BV/h的流速冲洗2BV柱体积后，浸泡1h，然后用水冲洗至流出液pH为5.0后，再用4％氢氧化钠溶液以1.5BV/h的流速冲洗2BV柱体积后，浸泡1h，然后用水冲洗至流出液pH为8.0。
4)将洗脱液在50℃条件下，减压浓缩至有晶体出现后，将浓缩液以5℃/h的速度进行降温搅拌结晶，降至5℃时，停止搅拌。将结晶晶体于5000rpm条件下进行离心分离，晶体在真空冷冻条件下冻干10h，得白色恩拉霉素精品。
所得恩拉霉素产品49.8g，恩拉霉素含量为96.8％，收率为87％。
实施例2
以杀真菌素链霉菌(Streptomyces fungicidicus)为生产菌种，将其孢子液在液氮环境下保存；将冻存孢子液接种到种子培养基中进行种子培养得种子液；然后将种子液接种到发酵培养基中进行发酵培养，得到棕黄色恩拉霉素发酵液(恩拉霉素含量5.01g/L，总糖含量0.89％，还原糖含量0.51％，蛋白含量0.54％，溶磷103mg/L)。
1)取10L棕黄色恩拉霉素发酵液，加热至55℃，真空浓缩至恩拉霉素含量为50.1g/L，经50万D陶瓷膜过滤后，用离心机以4500rpm的条件离心，得到菌丝体1200g，加入55％甲醇(体积比)4L，在超声波条件下搅拌、破碎4h，过滤，得到恩拉霉素甲醇提取液。
2)用15％的盐酸调节恩拉霉素甲醇提取液的pH至2.0，于30℃下保温2h，抽滤，滤液用5％NaOH溶液调节pH至8.0，过滤。
3)将所得滤液以3BV/h的流速过处理好的活性炭柱进行脱色，再以同样的流速过HZ-816树脂，以吸附恩拉霉素。吸附完成后，用pH7.5的55％甲醇(体积比)，以4.0BV/h的流速进行反向冲洗和正向冲洗。冲洗完毕后，用pH3.0的70％甲醇(体积比)，以2.0BV/h的流速进行洗脱，收集洗脱液。
活性炭柱的预处理方法为：用3％盐酸以2BV/h的流速冲洗3BV柱体积后，浸泡1h，然后用水冲洗至流出液pH为5.0后，再用3％氢氧化钠溶液以2BV/h的流速冲洗3BV柱体积后，浸泡1h，然后用水冲洗至流出液pH为8.0。
4)将洗脱液在40℃条件下，减压浓缩至有晶体出现后，将浓缩液以4℃/h的速度进行降温搅拌结晶。降至3℃时，停止搅拌。将结晶晶体于5000rpm条件下进行离心分离，晶体在真空冷冻条件下冻干10h，得白色恩拉霉素精品。
所得恩拉霉素产品46.5g，恩拉霉素含量为95.9％，收率为89％。
实施例3
以杀真菌素链霉菌(Streptomyces fungicidicus)为生产菌种，将其孢子液在液氮环境下保存；将冻存孢子液接种到种子培养基中进行种子培养得种子液；然后将种子液接种到发酵培养基中进行发酵培养，得到棕黄色恩拉霉素发酵液(恩拉霉素含量4.92g/L，总糖含量0.93％，还原糖含量0.46％，蛋白含量0.43％，溶磷93mg/L)。
1)取10L棕黄色恩拉霉素发酵液，加热至65℃，真空浓缩至恩拉霉素含量为49.2g/L，经10万D陶瓷膜过滤后，用离心机以5000rpm的条件离心，得到菌丝体1000g，加入45％甲醇(体积比)5L，在超声波条件下搅拌、破碎6h，过滤，得到恩拉霉素甲醇提取液。
2)用20％的盐酸调节恩拉霉素甲醇提取液的pH至2.5，于40℃下保温1h，抽滤，滤液用8％NaOH溶液调节pH至8.0，过滤。
3)将所得滤液以2.5BV/h的流速过处理好的活性炭柱进行脱色，再以同样的流速过HZ-816树脂，以吸附恩拉霉素。吸附完成后，用pH8.0的50％甲醇(体积比)，以3.0V/h的流速进行反向冲洗和正向冲洗。冲洗完毕后，用pH2.0的70％甲醇(体积比)，以1.5BV/h的流速进行洗脱，收集洗脱液。
活性炭柱的预处理方法为：用4％盐酸以1.0BV/h的流速冲洗3BV柱体积后，浸泡1.5h，然后用水冲洗至流出液pH为5.0后，再用4％氢氧化钠溶液以1.0BV/h的流速冲洗3BV柱体积后，浸泡1.5h，然后用水冲洗至流出液pH为8.0。
4)将洗脱液在30℃条件下，减压浓缩至有晶体出现后，将浓缩液以3℃/h的速度进行降温搅拌结晶。降至2℃时，停止搅拌。将结晶晶体于5000rpm条件下进行离心分离，晶体在真空冷冻条件下冻干10h，得白色恩拉霉素精品。
所得恩拉霉素产品47.2g，恩拉霉素含量为94.8％，收率为91％。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种从恩拉霉素发酵液中提取、分离和纯化恩拉霉素的方法，包括如下步骤：将恩拉霉素发酵液经过热处理后，过滤，离心，收集菌体；向菌体加入甲醇溶液后，超声，过滤；所得甲醇提取液先酸化后碱化，然后脱色，脱色液过大孔吸附树脂柱进行吸附，用甲醇先冲洗后洗脱，收集洗脱液，经浓缩结晶后，冷冻干燥，得到恩拉霉素。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述热处理为将恩拉霉素发酵液加热至55～65℃，优选60℃，然后真空浓缩至恩拉霉素含量为10～100g/L。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，热处理后的恩拉霉素发酵液采用陶瓷膜过滤；优选地，采用截留分子量为10万～50万D的陶瓷膜过滤；更优选地，采用截留分子量为30万D的陶瓷膜过滤。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述甲醇溶液的加入量为所得菌体的2～5倍v/m；甲醇溶液的浓度为45～55％，优选为50％；甲醇超声的时间为2～8h，优选3～4h。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，酸化后的pH值为1.0～5.0，碱化后的pH值为7.5～9.0；优选地，所述酸化为采用5％～30％盐酸将甲醇提取液的pH调至1.0～5.0，于20～40℃下保温1～4h，抽滤，得酸化滤液；所述碱化为采用1～10％氢氧化钠将酸化滤液的pH调至7.5～9.0，抽滤，得碱化滤液；
更优选地，采用10％～15％盐酸将甲醇提取液的pH调至2.0～3.0；更优选地，采用4～8％氢氧化钠将酸化滤液的pH调至7.5～8.5。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，过大孔吸附树脂柱时的流速为2～4BV/h；所述大孔吸附树脂为HZ-816树脂或HZ-818树脂。
7.根据权利要求1或6所述的方法，其特征在于，采用经预处理的活性炭柱脱色，脱色时的流速为2～4BV/h；其中，所述预处理的方法为：用3～4％盐酸以1.0～2.0BV/h的流速冲洗2～3BV柱体积后，浸泡1-2h，然后用水冲洗至流出液pH为4.0～7.0后，再用3～4％氢氧化钠溶液以1.0～2.0BV/h的流速冲洗2～3BV柱体积后，浸泡1-2h，然后用水冲洗至流出液pH为7.0～9.0。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述冲洗为采用pH 7.5～8.0的45～55％甲醇，以1～5BV/h的流速进行反向冲洗和正向冲洗；优选地，采用pH 8.0的50％甲醇进行冲洗；所述洗脱为采用pH 1.0～4.0的65～75％甲醇以1～4BV/h的流速进行洗脱；优选地，采用pH 2.5的70％甲醇进行洗脱。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述洗脱液在30～50℃、优选45-50℃下减压浓缩至有结晶出现，然后以3～5℃/h的速度降温搅拌；降温至0～5℃、优选5℃时，停止搅拌。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，将所得结晶在3000～5000rpm下离心分离，在真空冷冻条件下干燥。
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