CN105085627A - 一种制备恩拉霉素对照品的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种制备恩拉霉素(Enramycin)对照品的方法，所述方法包括：提供恩拉霉素在pH值为6.0-7.5，醇的体积百分含量在30-40％的醇-水混合溶剂中的溶液，然后将所述溶液连续上样至装填了非极性大孔吸附树脂的树脂柱中，直到流出液中恩拉霉素A：恩拉霉素B＝1：2～2.5时停止上样，然后用pH值为2.0-4.0，40％-80％(v/v)的醇溶液进行洗脱，得到高纯度的恩拉霉素对照品。该方法工艺简单，可操作性强，得到产品的纯度高，收率高，非常适于工业化生产。

Description

一种制备恩拉霉素对照品的方法

技术领域

本发明属于制药工程领域，具体涉及一种制备恩拉霉素对照品的方法。

背景技术

恩拉霉素(Enramycin)是由土壤中分离出来的放线菌StreptomycesfungicidiousNO.B5477发酵产生的一种由不饱和脂肪酸和十几种氨基酸结合成的多肽类抗生素。其中氨基酸分子构成环状多肽结构，脂肪酸位于多肽结构末端，据其末端脂肪酸种类不同，分为恩拉霉素A(C₁₀₇H₁₃₈Cl₂N₂₆O₃₁)和恩拉霉素B(C₁₀₈H₁₄₀Cl₂N₂₆O₃₁)。恩拉霉素则是主要由这两种成分组成的混合物(结构见图1)。该药于1966年由日本武田药品工业株式会社研发，1974年在日本正式注册，其后在许多国家被注册和广泛使用。其中，该药于1993年在我国成功注册，用于药物饲料添加剂。恩拉霉素对革兰氏阳性菌有很强的抑制作用，长期使用后不易产生抗药性，而且恩拉霉素内服极不易被吸收，药物主要通过粪便排出体外，残留畜禽体内较少。除此之外，它还能改变肠道内的细菌群落分布，有利于饲料营养成份的消化吸收，促进动物增重和提高饲料利用率，因此被世界上许多国家推荐作为抗生素促生长剂，是一种不错的饲料添加剂。

目前，市场上使用的恩拉霉素都是恩拉霉素预混剂，其中恩拉霉素都未经过纯化。如专利ZL201010198230.5和CN201210120843.6公开的方法，其都是直接通过含有恩拉霉素的发酵液直接进行预混剂的制备。随着生产技术的不断发展，科研工作者正在不断的对恩拉霉素的产品质量进行提高。如专利CN201210433028.5公开了一种恩拉霉素粗品的制备方法，其产品纯度可达到70％左右；CN201210153458.1公开了一种通过大孔吸附树脂纯化得到90％以上纯度恩拉霉素的方法；专利ZL201010213986.2涉及一种利用大孔弱酸性阳离子交换树脂分离提取恩拉霉素的方法，该方法可以使得恩拉霉素的纯度达到95％以上；专利ZL201110344875.X涉及一种从恩拉霉素发酵液种提取、分离和纯化恩拉霉素的方法，该方法的流程为将恩拉霉素发酵液进过热处理后，过滤，离心，收集菌体；向菌体加入甲醇溶液后，超声，过滤；滤液先酸化后碱化，然后脱色，脱色液过大孔吸附树脂进行吸附，用甲醇洗脱，收集洗脱液，经浓缩结晶后，冷冻干燥得到恩拉霉素，该方法得到的恩拉霉素的纯度达到95％左右；CN201310730536.4公开了一种通过弱酸性和弱碱性大孔吸附树脂联用的方法纯化得到99％以上的恩拉霉素的方法。除此之外，ZL201210433029.X涉及一种反相层析制备高纯度恩拉霉素A和B的方法，ZL201210159394.6涉及一种高压液相制备恩拉霉素标准品的方法。

恩拉霉素对照品除了对纯度有要求，其对恩拉霉素A和B的比例也有一定的要求，其最佳比例在1：1.1-1.8。就目前已有的技术来看，较高纯度的恩拉霉素的制备方法虽然有很多，但是并没有文献公开恩拉霉素A和B在最佳比例范围的高纯度的恩拉霉素对照品的制备方法。本发明提供的方法不仅能够很好地纯化恩拉霉素，使恩拉霉素的纯度达到95.0％以上，而且恩拉霉素A和B的比例不需要通过额外控制就能达到最佳。

发明内容

本发明的目的在于提供一种制备高纯度的恩拉霉素对照品的方法。

本发明涉及一种制备恩拉霉素对照品的方法，所述方法包括：

(1)提供恩拉霉素在pH值为6.0-7.5，醇的体积百分含量为30-40％的醇-水混合溶剂中的溶液；

(2)将步骤(1)所述溶液连续上样至装填了非极性大孔吸附树脂的树脂柱中，直到流出液中恩拉霉素A：恩拉霉素B＝1：2-2.5，停止上样；

(3)用pH值为2.0-4.0，醇的体积百分比为40％-80％的醇-水溶液洗脱步骤(2)所得树脂柱，得到含有恩拉霉素对照品的洗脱液；

(4)从步骤(3)所得洗脱液中分离得到恩拉霉素对照品。

其中，步骤(1)所述的pH值为6.5-7.0。

其中，步骤(1)所述溶液中醇的体积百分含量为35％，所述醇优选为甲醇或乙醇。

其中，步骤(1)所述恩拉霉素中恩拉霉素A：恩拉霉素B＝1：1.5-4，优选为1：2-3。

其中，步骤(2)所述非极性大孔吸附树脂选自H60，HB60，H41或HP20ss，优选H60。

其中，步骤(3)所述的醇-水溶液中醇的体积百分含量为40-70％，所述的醇优选为甲醇或乙醇。

其中，步骤(3)所述的pH值为3.0。

其中，步骤(4)所述恩拉霉素对照品中恩拉霉素A：恩拉霉素B＝1：1.1～1.8。

可以采用本领域技术人员公知的技术从步骤(3)所得洗脱液中分离得到恩拉霉素对照品，包括但不限于溶剂蒸发法，结晶等等。

在一个优选的技术方案中，步骤(4)包括以下步骤：

(i)收集并合并HPLC纯度在90％以上的含有恩拉霉素对照品的洗脱液；

(ii)将步骤(i)所得洗脱液浓缩至干，得到恩拉霉素对照品。

在另一个优选的技术方案中，步骤(4)包括以下步骤：

(i)收集并合并HPLC纯度在90％以上的含有恩拉霉素对照品的洗脱液；

(ii)超滤步骤(i)所得洗脱液；

(iii)将步骤(ii)所得滤液pH值调至2.0-4.0，加入活性炭脱色并过滤；

(iv)纳滤步骤(iii)所得溶液；

(v)将步骤(iv)所得滤液pH值调至6.0-8.0，得到恩拉霉素对照品的沉淀物；

(vi)分离并干燥步骤(v)所得恩拉霉素对照品的沉淀物。

其中，步骤(ii)所述超滤的截留分子量范围为5000-20000D，优选10000D；步骤(iv)所述纳滤的截留分子量范围为200-1000D，优选200-500D。

如无特别说明，本发明所述的恩拉霉素A与恩拉霉素B的比值指的是恩拉霉素A与恩拉霉素B的HPLC色谱含量比。

本发明的优势在于：

本发明所述方法制备得到的恩拉霉素对照品纯度可以达到95.0％以上，而且所得对照品中恩拉霉素A和B的比值不需要通过额外控制就能达到1：1.1-1.8的最佳比值范围，操作非常简单方便，另外本发明的方法收率高，非常适于工业化生产。

附图说明

图1恩拉霉素A和B的结构式

具体实施方式

以下通过实施例对本发明进行详细说明。必须指出，这些实施例是用于说明本发明，而不应理解为对本发明的限制。

以下实施例中所述的恩拉霉素发酵液可以采用本领域常用的产恩拉霉素的菌株进行发酵后得到。比如通过发酵杀真菌素链霉菌(Streptomycesfungicidicus)得到含有恩拉霉素的发酵液。(HigashideE,HatanoK,ShibataM,NakazawaK.Enduracidin,anewantibiotic.I.StreptomycesfungicidicusNo.B5477,anenduracidinproducingorganism.JAntibiot(Tokyo).1968,21(2):126-37.)

以下实施例选用的HPLC分析检测方法为：

色谱柱：AgilentHC-C₁₈4.6×250mm，5μm；

流动相：缓冲液(3.0ml磷酸+500ml水，用NaOH调节pH＝3.8)/甲醇/乙腈＝500/300/200(v/v/v)；

检测波长：232nm；

流速：1.0ml/min；

柱温：35℃。

实施例1恩拉霉素对照品的制备

(a)将100克恩拉霉素粗品(恩拉霉素A：恩拉霉素B＝1:1.5)溶于4000ml30％(v/v)的乙醇-水溶液中，然后用盐酸调节所得溶液的pH值至6.0，过滤，得一滤液。

(b)将步骤(a)所得滤液连续上样至装填了H60大孔吸附树脂的树脂柱中，同时检测流出液中恩拉霉素A与恩拉霉素B的比例，直到流出液中恩拉霉素A：恩拉霉素B＝1：2.0，停止上样。

(c)用pH值为2.0，40％(v/v)的乙醇-水溶液洗脱步骤(b)所得H60大孔吸附树脂柱。

(d)收集并合并HPLC纯度在90％以上的含有恩拉霉素的洗脱液，将HPLC纯度低于90％的恩拉霉素洗脱液回收再用。

(e)将步骤(d)收集到的HPLC纯度在90％以上的恩拉霉素洗脱液浓缩至干，得到78.7克HPLC纯度为95.6％的恩拉霉素对照品，其中恩拉霉素A：恩拉霉素B＝1：1.22。

实施例2恩拉霉素对照品的制备

(a)将100克恩拉霉素粗品(恩拉霉素A：恩拉霉素B＝1:4.0)溶于4000ml40％(v/v)的甲醇-水溶液中，然后用盐酸调节所得溶液的pH值至7.5。

(b)将步骤(a)所得溶液连续上样至装填了HP20ss大孔吸附树脂的树脂柱中，同时检测流出液中恩拉霉素A与恩拉霉素B的比例，直到流出液中恩拉霉素A：恩拉霉素B＝1：2.5，停止上样。

(c)用pH值为4.0，80％(v/v)的甲醇-水溶液洗脱步骤(b)所得HP20ss大孔吸附树脂柱。

(d)收集并合并HPLC纯度在90％以上的含有恩拉霉素的洗脱液，将HPLC纯度低于90％的恩拉霉素洗脱液回收再用。

(e)将步骤(d)收集到的HPLC纯度在90％以上的恩拉霉素洗脱液浓缩至干，得到62.5克HPLC纯度为96.2％的恩拉霉素对照品，其中恩拉霉素A：恩拉霉素B＝1：1.67。

实施例3恩拉霉素对照品的制备

(a)将10L含恩拉霉素的发酵液过滤，将所得滤饼干燥后得到852g含有恩拉霉素的菌丝体。

(b)用3.5LpH值为2.0，体积百分比为80％的甲醇-水溶液浸泡步骤(a)所得菌丝体。

(c)过滤步骤(b)所得甲醇浸泡液。

(d)用纯化水将步骤(c)所得恩拉霉素滤液中的甲醇含量调至35％(v/v)，接着用盐酸调节所得溶液的pH值至7.0，过滤，得一滤液，滤液经HPLC检测，恩拉霉素A；恩拉霉素B＝1：2。

(e)将步骤(d)所得滤液连续上样至装填了H41大孔吸附树脂的树脂柱中，同时检测流出液中恩拉霉素A与恩拉霉素B的比例，直到流出液中恩拉霉素A：恩拉霉素B＝1：2-2.5，停止上样。

(f)用pH值为3.0，70％(v/v)的甲醇-水溶液洗脱步骤(e)所得H41大孔吸附树脂柱。

(g)收集并合并HPLC纯度在90％以上的含有恩拉霉素的洗脱液，将HPLC纯度低于90％的恩拉霉素洗脱液回收再用。

(h)用HY-MU1002型号的板式超滤膜(膜芯选择截留分子量为10000D，密理博第三代膜)过滤步骤(g)收集到的HPLC纯度在90％以上的含有恩拉霉素的洗脱液。

(i)用盐酸将步骤(h)所得滤液的pH值调至2.0，然后加入活性炭脱色并过滤。

(j)用1.4平方卷式纳滤膜(膜芯选择截留分子量为200D，久吾高科)纳滤步骤(i)所得滤液。

(k)用氢氧化钠溶液将步骤(j)所得滤液的pH值调至6.0，得到恩拉霉素的沉淀物。

(l)将步骤(k)所得沉淀物过滤，干燥，得到12.1gHPLC纯度为95.8％的恩拉霉素对照品，其中恩拉霉素A：恩拉霉素＝1：1.52。

等同方案和范围

上面已经描述了本发明的一些非限制性优选实施方案。本领域技术人员，可以在不背离有权利要求书界定的本发明实质或范围的情况下对该描述作出多种不同改变和修饰。这些改变和修饰也应视为本发明保护的范围。

Claims (10)

1.一种制备恩拉霉素对照品的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)提供恩拉霉素在pH值为6.0-7.5，醇的体积百分含量为30-40％的醇-水混合溶剂中的溶液；

(2)将步骤(1)所述溶液连续上样至装填了非极性大孔吸附树脂的树脂柱中，直到流出液中恩拉霉素A：恩拉霉素B＝1：2-2.5，停止上样；

(3)用pH值为2.0-4.0，醇的体积百分含量为40％-80％的醇-水溶液洗脱步骤(2)所得树脂柱，得到含有恩拉霉素对照品的洗脱液；

(4)从步骤(3)所得洗脱液中分离得到恩拉霉素对照品。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的pH值为6.5-7.0。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述溶液中醇的体积百分含量为35％，所述醇优选为甲醇或乙醇。

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述非极性大孔吸附树脂选自H60，HB60，H41或HP20ss，优选H60。

5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述的醇-水溶液中醇的体积百分含量为40-70％，所述的醇优选为甲醇或乙醇。

6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述的pH值为3.0。

7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，步骤(4)包括以下步骤：

(i)收集并合并HPLC纯度在90％以上的含有恩拉霉素对照品的洗脱液；

(ii)将步骤(i)所得洗脱液浓缩至干，得到恩拉霉素对照品。

8.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，步骤(4)包括以下步骤：

(i)收集并合并HPLC纯度在90％以上的含有恩拉霉素对照品的洗脱液；

(ii)超滤步骤(i)所得洗脱液；

(iii)将步骤(ii)所得滤液pH值调至2.0-4.0，加入活性炭脱色并过滤；

(iv)纳滤步骤(iii)所得溶液；

(v)将步骤(iv)所得滤液pH值调至6.0-8.0，得到恩拉霉素对照品的沉淀物；

(vi)分离并干燥步骤(v)所得恩拉霉素对照品的沉淀物。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(ii)所述超滤的截留分子量范围为5000-20000D，优选10000D；步骤(iv)所述纳滤的截留分子量范围为200-1000D，优选200-500D。

10.根据权利要求1-9任一项所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述恩拉霉素中恩拉霉素A：恩拉霉素B＝1：1.5-4，优选为1：2-3，步骤(4)所述恩拉霉素对照品中恩拉霉素A：恩拉霉素B＝1：1.1～1.8。