CN102357117A - 广藿香挥发油及制备方法及在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了广藿香挥发油及制备方法及在制备抗肿瘤药物中的应用，广藿香挥发油用下述方法制成：以广藿香药材为原料粉碎，过40～80目筛，加入原料质量0.5％～4％的半纤维素酶或纤维素酶、加入相当原料质量10～14倍的蒸馏水，在pH3.5～5.5的缓冲溶液中、于25～45℃条件下酶解0.5～5小时后，采用蒸馏法提取2～5小时，得到广藿香挥发油，所述广藿香挥发油中广藿香醇的相对百分含量不低于26.0％，所述广藿香酮的相对百分含量不低于30.0％。本发明的提取方法简单易行，不需要大量的有机溶剂，安全无毒，适合于工业生产。实验表明，广藿香挥发油对5种不同组织来源的人体肿瘤细胞均有良好的抑制作用。

Description

广藿香挥发油及制备方法及在制备抗肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明涉及广藿香有效成分挥发油及提取分离方法及用途，属于中药有效成分提取分离与应用技术。

背景技术

肿瘤现已成为严重威胁人类生命健康的疾病，从有癌症记录以来，肿瘤发病率一直呈上升的趋势，特别是过去二、三十年以来，肿瘤发病以每年以3％～5％的速度在提高，而且在其过程中，80％新发肿瘤发生在中国、印度、巴西这样的发展中国家。2002年世界新发肿瘤为1100万，当年死亡病例达到约700万，2002年世界上初步估计，现存肿瘤患者，也就是治愈和带瘤生存的为2500万，肿瘤的死亡率已经成为世界第一。卫生部日前公布了2006年中国城乡居民主要死亡原因，恶性肿瘤成为威胁城市居民的第一“杀手”。肺癌、肝癌、胃癌、食管癌、结(直)肠癌、宫颈癌、乳腺癌和鼻咽癌8种癌症死亡人数约占全国癌症总死亡人数的80％以上。中药是长期以来治疗疾病的重要手段，具有丰富的资源，悠久的历史，是我国人民与疾病做斗争的智慧结晶，用现代的科学方法研究中药在抗肿瘤方面的应用是一项前景广阔的事业。

广藿香[Pogostemon cablin(Blanco)]Benth为唇形科刺蕊草属植物干燥地上部分，以全草入药。广藿香用于治疗湿浊中阻、脘痞呕吐、暑湿倦怠、胸闷不舒、寒湿闭暑、腹痛吐泻、鼻渊头痛。广藿香是30余种中成药如“藿香正气丸(水)”和“藿胆丸”等配方的重要组成药物。现分布于广东、海南、广西、台湾和云南等省区，均为栽培。

迄今为止，尚未有酶解法提取广藿香挥发油以及用于其抗肿瘤的报道和用于治疗癌症的记载。

发明内容

本发明的目的是提供一种广藿香挥发油。

本发明的第二个目的是提供一种广藿香挥发油的制备方法。

本发明的第三个目的是提供一种广藿香挥发油的用途。

本发明的技术方案概述如下：

广藿香挥发油，用下述方法制成：

以广藿香药材为原料粉碎，过40～80目筛，加入原料质量0.5％～4％的半纤维素酶或纤维素酶、加入相当原料质量10～14倍的蒸馏水，在pH＝3.5～5.5的缓冲溶液中、于25～45℃条件下酶解0.5～5小时后，采用蒸馏法提取2～5小时，得到广藿香挥发油，所述广藿香挥发油中广藿香醇的相对百分含量为不低于26.0％，所述广藿香酮的相对百分含量为不低于30.0％。

优选的是所述半纤维素酶或纤维素酶的加入量为所述原料质量的1％～3％。

最好是缓冲溶液的pH＝4.5。

温度优选30～35℃，酶解时间优选2～4小时。

广藿香挥发油的制备方法，包括如下步骤：

以广藿香药材为原料粉碎，过40～80目筛，加入原料质量0.5％～4％的半纤维素酶或纤维素酶、加入相当原料质量10～14倍的蒸馏水，在pH＝3.5～5.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液中、于25～45℃条件下酶解0.5～5小时，采用蒸馏法提取2～5小时，即得到广藿香挥发油。

半纤维素酶或纤维素酶的加入量为最好是原料质量的1％～3％。

所述缓冲溶液的pH＝4.5。

所述温度为30～35℃，所述酶解时间为2～4小时。

一种含有广藿香挥发油的药物组合物，是以广藿香挥发油为活性成分加上药学上可接受的辅料制成滴丸、软胶囊、微囊、脂肪乳剂、纳米粒、微球、脂质体、β-环糊精包合物、羟丙基-β-环糊精包合物或毫微囊冻干粉针。

广藿香挥发油在制备抗肺癌药物、抗肝癌药物、抗胃癌药物或抗黑色素瘤药物中的应用。

本发明的提取方法简单易行，不需要大量的有机溶剂，安全无毒，适合于工业生产。广藿香挥发油中广藿香醇的相对百分含量不低于26.0％，所述广藿香酮的相对百分含量不低于30.0％。

本发明对广藿香挥发油在体外、体内的抗肿瘤的实验表明，广藿香挥发油对5种不同组织来源的人体肿瘤细胞均有良好的抑制作用。

具体实施方式

下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1

取广藿香药材(包括茎、叶、花)粉碎过40目筛，加入原料质量1％半纤维素酶、加入相当原料质量12倍的蒸馏水，在pH＝4.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液中，于45℃条件下，酶解1小时后，采用蒸馏法提取3小时得广藿香挥发油。经过无水硫酸钠脱水，广藿香挥发油的得率为4.461mg·g^-1，较《中国药典》(2010版)的单纯蒸馏法，其广藿香挥发油的提取率提高了40.46％。

广藿香挥发油中广藿香醇的相对百分含量为26.13％，所述广藿香酮的相对百分含量为36.88％。

实施例2

取广藿香药材(包括茎、叶、花)粉碎过40目筛，加入原料质量0.5％半纤维素酶、加入相当原料质量10倍的蒸馏水，在pH＝3.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液中，于35℃条件下，酶解0.5小时后，采用蒸馏法提取2小时得广藿香挥发油。经过无水硫酸钠脱水，其广藿香挥发油的得率为3.396mg·g^-1，较《中国药典》(2010版)的单纯蒸馏法，其广藿香挥发油的提取率提高了6.927％。

广藿香挥发油中广藿香醇的相对百分含量为30.74％，所述广藿香酮的相对百分含量为32.97％。

实施例3

取广藿香药材(包括茎、叶、花)粉碎过80目筛，加入原料质量4％半纤维素酶、加入相当原料质量14倍的蒸馏水，在pH＝5.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液中，于45℃条件下，酶解2小时后，采用蒸馏法提取5小时得广藿香挥发油。经过无水硫酸钠脱水，其广藿香挥发油的得率为3.893mg·g^-1，较《中国药典》(2010版)的单纯蒸馏法，其广藿香挥发油的提取率提高了22.58％。

广藿香挥发油中广藿香醇的相对百分含量为31.08％，所述广藿香酮的质量含量为相对百分含量为33.70％。

实施例4

取广藿香药材(包括茎、叶、花)粉碎过40目筛，加入原料质量1％纤维素酶、加入相当原料质量12倍的蒸馏水，在pH＝4.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液中，于45℃条件下，酶解1小时后，采用蒸馏法提取3小时得广藿香挥发油。经过无水硫酸钠脱水，其广藿香挥发油的得率为4.381mg·g^-1，较《中国药典》(2010版)的单纯蒸馏法，其广藿香挥发油的提取率提高了37.94％。

广藿香挥发油中广藿香醇的相对百分含量为28.08％，所述广藿香酮的相对百分含量为36.01％。

实施例5

取广藿香药材(包括茎、叶、花)粉碎过40目筛，加入原料质量0.5％纤维素酶、加入相当原料质量10倍的蒸馏水，在pH＝3.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液中，于30℃条件下，酶解0.5小时后，采用蒸馏法提取2小时得广藿香挥发油。经过无水硫酸钠脱水。其广藿香挥发油的得率为3.301mg·g^-1，较《中国药典》(2010版)的单纯蒸馏法，其广藿香挥发油的提取率提高了4.79％。

广藿香挥发油中广藿香醇的相对百分含量为29.14％，所述广藿香酮的质量含量为相对百分含量为35.99％。

实施例6

取广藿香药材(包括茎、叶、花)粉碎过80目筛，加入原料质量3％纤维素酶、加入相当原料质量14倍的蒸馏水，在pH＝5.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液中，于45℃条件下，酶解4小时后，采用蒸馏法提取5小时得广藿香挥发油。经过无水硫酸钠脱水，其广藿香挥发油的得率为3.727mg·g^-1，较《中国药典》(2010版)的单纯蒸馏法，其广藿香挥发油的提取率提高了18.32％。

广藿香挥发油中广藿香醇的相对百分含量为28.04％，所述广藿香酮的质量含量为相对百分含量为35.95％。

用实施例1-6制备的各个广藿香挥发油分别加入聚乙二醇和羧甲基纤维素等辅料，广藿香挥发油组分所占的重量比例为10％～95％，辅料聚乙二醇和羧甲基纤维素各自占辅料总量的20％～60％，将广藿香挥发油与辅料混合均匀，按照常规工艺做成缓释制剂，包装，得到产品。

用实施例1-6制备的各个广藿香挥发油分别与植物油，充分混合，胶体磨匀，置于全自动软胶囊机填充，干燥。即得软胶囊制剂。

用实施例1-6制备的各个广藿香挥发油与基质加热熔融混匀后，滴入不相混溶的冷凝剂中，收缩冷凝制成球形或类球形的滴丸制剂，分装即得。基质为聚乙二醇类、泊洛沙姆、硬脂酸聚烃氧(40)酯、明胶、硬脂酸、单硬脂酸甘油酯或氢化植物油等。冷凝剂为液体石蜡、植物油、甲基硅油和水等。

分别取实施例1-6制备的各个广藿香挥发油，加入注射用油5％～30％、乳化剂1％～10％、稳定剂0.1％～3％、等渗调节剂1％～5％、抗氧剂0.01％～0.05％，其余为注射用水，调节pH＝5～7，得脂肪乳剂。

实施例7

MTT法测定广藿香挥发油对人肝癌细胞株BEL7404、宫颈癌细胞株Hela、人胃癌细胞株SGC7901、黑色素瘤细胞株B16等4种人体来源不同的肿瘤细胞的抑制作用。

1实验材料

1.1广藿香挥发油：实施例1和实施例2制备的广藿香挥发油，临床前用二甲基亚砜溶解后无菌过滤备用。

1.2肿瘤细胞株：人肝癌细胞株BEL7404、宫颈癌细胞株Hela、人胃癌细胞株SGC7901、黑色素瘤细胞株B16均购自上海艾研生物科技有限公司。

1.3试剂

FBS(胚胎牛血清)为美国Hyclone公司产品，批号：1115

MTT(四甲基噻唑蓝)为德国Sigma公司产品，批号：100705

RPMI1640(二甲基亚砜)购自天津汇英化学试剂有限公司，批号：20100621

1.4实验仪器

酶标仪(宝特)，美国产，型号：ELX800

CO₂培养箱(Shellab)美国产，型号：3517-2

倒置荧光显微镜(明美)，中国产，型号：MF51

取对数生长期的人肝癌细胞株BEL7404、宫颈癌细胞株Hela、人胃癌细胞株SGC7901、黑色素瘤细胞株B16以及阳性对照药足叶乙甙(鬼臼乙叉甙，依托泊甙，VP-16)分别接种于96孔培养板内，每孔约含4000个细胞，置37℃，5％CO₂温箱中培养。培养24h后给药组加入含有不同浓度的测试物，每个浓度至少设三个平行孔，阴性对照组加入与给药组等体积的溶剂，仅加培养基的为空白对照组，置37℃，5％CO₂温箱中培养48小时后弃培养液，每孔加1mg/mL MTT溶液(PBS配制)50μL，37℃孵育4小时，弃上清液，每孔加入DMSO 150μL溶解甲臜颗粒，轻度振荡溶解。在酶标仪波长490nm条件下测定光密度值(OD)，用下面公式计算化合物对细胞的抑制率，并计算IC₅₀值，试验平行三次结果见表1。

表1广藿香挥发油对BEL7404、Hela、SGC7901、B16细胞抑制作用

结果表明：广藿香挥发油对BEL7404、Hela、SGC7901、B16细胞有较好的抑制作用。

实施例8

广藿香挥发油的体内抗肿瘤实验

1.1材料

11.1实验动物：昆明种小鼠100只，雌雄各半，20～22g，均由北京阜康生物科技股份有限公司提供，实验动物使用许可证号：SCXK(京)2010-0004。实验动物饲养于SPF条件下，自由饮食。

1.1.2广藿香挥发油药液制备：将实施例1制备的广藿香挥发油与大豆磷脂(1∶3)及水混合制备成药液，广藿香挥发油的浓度为：25g/L。

1.2实验方法

1.2.1S180造模：取接种后7天S180肉瘤小鼠乳白色无血丝腹水，以无菌生理盐水稀释，皮下瘤调成大约浓度为1.6×106/mL、腹水瘤调成大约浓度为5.0×106/mL的细胞悬液，常规消毒，皮下瘤在小鼠右前腋窝皮肤，腹水瘤在小鼠腹腔分别注射0.2mL细胞悬液。

S180肉瘤造模24小时后，将小鼠随机分成模型对照组，广藿香挥发油药液高、中、低剂量组，阳性对照组(环磷酰胺，CTX)，总计5组。隔日观察各组小鼠的体重和耗食量变化。S180皮下瘤和S180腹水瘤处理3周，小鼠脱颈致死，称取瘤重，计算抑瘤率；腹水瘤记录各组小鼠存活时间，计算生命延长率。抑瘤率和生命延长率的计算方法如下：

1.3统计学处理：所有数据采用SPSS16.0软件处理，计量资料用表示，组间比较采用t检验，结果见表2～表4。

表2广藿香挥发油药液对荷瘤小鼠体重的影响

a.P＜0.05，vs.CTX组；b.P＜0.05，vs.CTX组

表3广藿香挥发油药液对S180皮下瘤小鼠瘤重的影响

a.P＜0.05，vs.NS组；b.P＜0.05，vs.CTX组

表4广藿香挥发油药液对S180腹水瘤小鼠生存期的影响

a.P＜0.05，vs.NS组；b.P＜0.05，vs.CTX组

经实验表明，实施例2-6制备的广藿香挥发油药液对荷瘤小鼠的体重、瘤重也均有不同程度减轻，同时也能明显地延长S180腹水瘤小鼠的生存期。说明广藿香挥发油对上述几种肿瘤有较好的抑制作用。

Claims (10)

1.广藿香挥发油，其特征是用下述方法制成：

以广藿香药材为原料粉碎，过40～80目筛，加入原料质量0.5％～4％的半纤维素酶或纤维素酶、加入相当原料质量10～14倍的蒸馏水，在pH＝3.5～5.5的缓冲溶液中、于25～45℃条件下酶解0.5～5小时后，采用蒸馏法提取2～5小时，得到广藿香挥发油，所述广藿香挥发油中广藿香醇的相对百分含量为不低于26.0％，所述广藿香酮的相对百分含量为不低于30.0％。

2.根据权利要求1所述的广藿香挥发油，其特征是所述半纤维素酶或纤维素酶的加入量为所述原料质量的1％～3％。

3.根据权利要求1所述的广藿香挥发油，其特征是所述缓冲溶液的pH＝4.5。

4.根据权利要求1所述的广藿香挥发油，其特征是所述温度为30～35℃，所述酶解时间为2～4小时。

5.权利要求1的广藿香挥发油的制备方法，其特征是包括如下步骤：

以广藿香药材为原料粉碎，过40～80目筛，加入原料质量0.5％～4％的半纤维素酶或纤维素酶、加入相当原料质量10～14倍的蒸馏水，在pH＝3.5～5.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液中、于25～45℃条件下酶解0.5～5小时，采用蒸馏法提取2～5小时，即得到广藿香挥发油。

6.根据权利要求5所述的广藿香挥发油的制备方法，其特征是所述半纤维素酶或纤维素酶的加入量为所述原料质量的1％～3％。

7.根据权利要求5所述的广藿香挥发油的制备方法，其特征是所述缓冲溶液的pH＝4.5。

8.根据权利要求5所述的广藿香挥发油的制备方法，其特征是所述温度为30～35℃，所述酶解时间为2～4小时。

9.一种含有权利要求1-4之一广藿香挥发油的药物组合物，其特征是以所述广藿香挥发油为活性成分加上药学上可接受的辅料制成滴丸、软胶囊、微囊、脂肪乳剂、纳米粒、微球、脂质体、β-环糊精包合物、羟丙基-β-环糊精包合物或毫微囊冻干粉针。

10.权利要求1-4之一广藿香挥发油在制备抗肺癌药物、抗肝癌药物、抗胃癌药物或抗黑色素瘤药物中的应用。