CN102344432A

CN102344432A - 一种egcg甲基化衍生物的制备方法

Info

Publication number: CN102344432A
Application number: CN2011102102453A
Authority: CN
Inventors: 吕海鹏; 林�智; 孙业良; 谭俊峰; 郭丽
Original assignee: Tea Research Institute Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Tea Research Institute Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2011-07-26
Filing date: 2011-07-26
Publication date: 2012-02-08

Abstract

本发明提供一种EGCG甲基化衍生物的制备方法，是在碳酸钠或者强碱的催化下，碘甲烷作为甲基供体，使EGCG甲基化，制备得到甲基化EGCG衍生物。本发明制备出的三种EGCG甲基化物的成分其纯度在95%以上。本发明方法设计合理，操作简便易行，制备成本较低，适用于制备儿茶素甲基化衍生物单体成分，本发明制备的化合物的结构式为：

Description

一种EGCG甲基化衍生物的制备方法

技术领域

本发明涉及茶叶深加工技术领域，尤其涉及一种EGCG甲基化衍生物的制备方法。

背景技术

表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)具有多种保健功能，是茶叶中公认的核心功能活性成分之一，在医药和食品研究领域倍受关注；但由于儿茶素成分脂溶性差、体内不稳定以及生物利用度低等原因使其应用受到了限制。近年来，随着研究的不断深入，人们发现EGCG经分子修饰后形成的一些衍生物，生物利用度明显提高，并且在某些方面表现出了比EGCG更强的生理活性。因此，EGCG的分子修饰及其衍生产物的研究展现出了很大的研究开发价值。EGCG的分子修饰已经成为了当前茶叶天然产物研究领域的热点之一。

甲基化儿茶素具有明显的抗过敏作用。在EGCG的分子修饰研究方面，甲基化分子修饰备受关注。甲基化儿茶素成分在抗过敏等方面比EGCG更强。例如，EGCG3″Me在动物血液中的稳定性明显高于EGCG，并且口服吸收率比EGCG高9倍，因而具有较大的药学价值和开发应用前景；然而，茶叶中甲基化儿茶素成分的含量普遍偏低，只有在少数特异茶树种质中EGCG3″Me的含量在1％以上，这使甲基化儿茶素成分的提取、利用以及药学价值的开发面临材料来源困难等问题。采用EGCG为原料，实现EGCG的甲基化修饰，从而大量制备甲基化儿茶素成分，具有重要的理论意义和应用价值。

签于茶叶中甲基化儿茶素成分具有很强的抗过敏以及消炎等保健功能，而目前尚无系统的甲基化儿茶素成分的制备方法，因此研究化学合成技术来制备生产甲基化儿茶素成分，符合当前功能性成分开发的要求，市场前景广阔，能产生一定的经济效益以及社会效益。

发明内容

本发明的目的是提供一种EGCG甲基化衍生物的制备方法，通过以下步骤实现步骤：

(1)将茶多酚提取物(EGCG含量≥80％)加入丙酮溶液中，继而加入碳酸盐或者强碱作为催化剂，氮气作为保护气体，构成反应体系；(2)将反应体系在65-75℃磁力搅拌回流，同时在回流过程中缓慢滴加碘甲烷，直至EGCG与碘甲烷的物质的量之比达到1∶2-1∶6；反应2-4小时后终止反应；过滤后将滤液低温旋转浓缩干燥，得到固体产物；(3)将上述固体产物用水溶解后，通过装有葡聚糖凝胶材料的层析柱；采用10％-80％的醇溶液作为洗脱溶剂进行梯度洗脱，依次收集分别含有4′，4″-二甲基EGCG、4′，3″，4″-三甲基EGCG以及4′，3″，4″，5″-四甲基EGCG的洗脱液；(4)将三种洗脱液体分别进行干燥，得到4′，4″-二甲基EGCG、4′，3″，4″-三甲基EGCG以及4′，3″，4″，5″-四甲基EGCG三种甲基化的EGCG化合物。

所述步骤(1)中茶多酚提取物(EGCG含量≥80％)可以是市场上的高EGCG茶多酚提取物，包括80％-98％EGCG含量的茶多酚产品。

步骤(1)中优选碳酸钠或氢氧化钠作为反应体系的催化剂，氮气作为保护气体。

步骤(2)中优选在65-70℃磁力搅拌回流，同时在回流过程中缓慢滴加碘甲烷，优选直至EGCG与碘甲烷的物质的量之比达到1∶4；反应时间优选为2-3小时后终止反应。

步骤(3)中葡聚糖凝胶材料优选为Sephadex LH-20；步骤(3)中醇为甲醇；步骤(3)中层析处理的流速为1-4柱床体积/小时，洗脱溶剂的流速为2-6柱床体积/小时。

步骤(4)干燥方法分为冷冻干燥、旋转蒸发或者喷雾干燥。

本发明主要是在碳酸钠或者氢氧化钠的催化下，碘甲烷作为甲基供体，使EGCG甲基化，制备得到甲基化EGCG单成分。本发明制备出的三种EGCG甲基化衍生物成分纯度在95％以上。该制备方法简便易行，成本较低，适用于制备儿茶素甲基化衍生物单体成分。

EGCG三种甲基化衍生物的化学分子式：

附图说明

图1是EGCG甲基化衍生物制备方法的工艺流程示意图。

图2是EGCG甲基化衍生物的HPLC色谱分析图。

具体实施方式

本发明结合附图和实施例作进一步的说明。

实施例1

参见图1，本发明的制备方法如下：

(1)将EGCG含量为98％的茶多酚提取物10克加入100ml丙酮溶液中，继而加入5克碳酸钠作为催化剂，氮气作为保护气体，构成反应体系；

(2)将反应体系在70℃磁力搅拌回流，同时在回流过程中缓慢滴加碘甲烷，直至EGCG与碘甲烷的物质的量之比达到1∶2；反应3小时后终止反应；过滤后将滤液低温旋转浓缩干燥，得到固体产物；

(3)将上述固体产物用水溶解后，通过装有Sephadex LH-20材料的层析柱，层析处理的流速为3柱床体积/小时；采用体积百分比为10％-80％的甲醇溶液作为洗脱溶剂进行梯度洗脱，洗脱溶剂的流速为4柱床体积/小时；分步收集洗脱液体后，根据HPLC分析结果，可将洗脱液选择性合并为三部分，分别含有4′，4″-二甲基EGCG、4′，3″，4″-三甲基EGCG以及4′，3″，4″，5″-四甲基EGCG三种洗脱液体，结果参见图2，其中图2a是4′，4″-二甲基EGCG，图2b是4′，3″，4″-三甲基EGCG，图2c是4′，3″，4″，5″-四甲基EGCG；

(4)将三种洗脱液体分别进行冷冻干燥，得到三种甲基EGCG化合物，其中4′，4″-二甲基EGCG纯度为98％、4′，3″，4″-三甲基EGCG纯度为95％，4′，3″，4″，5″-四甲基EGCG纯度为96％。

步骤(3)采用分步收集仪收集洗脱液，设定15ml/管，收集80-100管，然后每管都用HPLC检测，参考标准品进行对比，在根据检测结果合并相同成分的洗脱液。

实施例2

参见图1，本发明的制备方法如下：

(1)将EGCG含量为80％的茶多酚提取物8克加入100ml丙酮溶液中，继而加入4克氢氧化钠作为催化剂，氮气作为保护气体，构成反应体系；

(2)将反应体系在75℃磁力搅拌回流，同时在回流过程中缓慢滴加碘甲烷，直至EGCG与碘甲烷的物质的量之比达到1∶4；反应4小时后终止反应；过滤后将滤液低温旋转浓缩干燥，得到固体产物；

(3)将上述固体产物用水溶解后，通过装有Sephadex LH-20材料的层析柱，层析处理的流速为4柱床体积/小时；采用体积百分比为10％-80％的甲醇溶液作为洗脱溶剂进行梯度洗脱，洗脱溶剂的流速为5柱床体积/小时；分步收集洗脱液体后，根据HPLC分析结果，可将洗脱液选择性合并为三部分，分别含有4′，4″-二甲基EGCG、4′，3″，4″-三甲基EGCG以及4′，3″，4″，5″-四甲基EGCG三种洗脱液体，结果参见图2，其中图2a是4′，4″-二甲基EGCG，图2b是4′，3″，4″-三甲基EGCG，图2c是4′，3″，4″，5″-四甲基EGCG；

(4)将三种洗脱液体分别进行冷冻干燥，得到三种甲基EGCG化合物，其中4′，4″-二甲基EGCG纯度为97％、4′，3″，4″-三甲基EGCG纯度为94％，4′，3″，4″，5″-四甲基EGCG纯度为95％。

实施例3

参见图1，本发明的制备方法如下：

(1)将EGCG含量为90％的茶多酚提取物15克加入200ml丙酮溶液中，继而加入7克碳酸钠作为催化剂，氮气作为保护气体，构成反应体系；

(2)将反应体系在70℃磁力搅拌回流，同时在回流过程中缓慢滴加碘甲烷，直至EGCG与碘甲烷的物质的量之比达到1∶6；反应2小时后终止反应；过滤后将滤液低温旋转浓缩干燥，得到固体产物；

(4)将三种洗脱液体分别进行冷冻干燥，得到三种甲基EGCG化合物，其中4′，4″-二甲基EGCG纯度为95％、4′，3″，4″-三甲基EGCG纯度为95％，4′，3″，4″，5″-四甲基EGCG纯度为97％。

实施例4

参见图1，本发明的制备方法如下：

(1)将EGCG含量为85％的茶多酚提取物5克加入100ml丙酮溶液中，继而加入3克氢氧化钠作为催化剂，氮气作为保护气体，构成反应体系；

(2)将反应体系在65℃磁力搅拌回流，同时在回流过程中缓慢滴加碘甲烷，直至EGCG与碘甲烷的物质的量之比达到1∶5；反应3小时后终止反应；过滤后将滤液低温旋转浓缩干燥，得到固体产物；

(3)将上述固体产物用水溶解后，通过装有Sephadex LH-20材料的层析柱，层析处理的流速为4柱床体积/小时；采用体积百分比为10％-80％的甲醇溶液作为洗脱溶剂进行梯度洗脱，洗脱溶剂的流速为4柱床体积/小时；分步收集洗脱液体后，根据HPLC分析结果，可将洗脱液选择性合并为三部分，分别含有4′，4″-二甲基EGCG、4′，3″，4″-三甲基EGCG以及4′，3″，4″，5″-四甲基EGCG三种洗脱液体，结果参见图2，其中图2a是4′，4″-二甲基EGCG，图2b是4′，3″，4″-三甲基EGCG，图2c是4′，3″，4″，5″-四甲基EGCG；

(4)将三种洗脱液体分别进行冷冻干燥，得到三种甲基EGCG化合物，其中4′，4″-二甲基EGCG纯度为98％、4′，3″，4″-三甲基EGCG纯度为97％，4′，3″，4″，5″-四甲基EGCG纯度为95％。

实施例5，采用LC/MS和NMR进行结构鉴定

将实施例1-4步骤(3)获得的化合物，进行采用LC/MS和NMR进行结构鉴定，化合物4′，4″-二甲基EGCG，ESI-MS m/z：487.1[M+H]⁺、995.2[2M+Na]⁺、971.1[2M-H]^-；化合物4′，3″，4″-三甲基EGCG，ESI-MS m/z：499.1[M+H]⁺；化合物4′，3″，4″，5″-四甲基EGCG，ESI-MS m/z：5142[M+H]⁺。具体氢谱和碳谱的信号归属分别参见表1和表2。

表1氢谱的信号归属

表2碳谱的信号归属

。

Claims

1.一种表没食子儿茶素没食子酸酯甲基化衍生物的制备方法，其特征在于，通过以下步骤实现：

（1）将茶多酚提取物加入丙酮溶液中，其中表没食子儿茶素没食子酸酯含量≥80%，再加入碳酸盐或强碱作为催化剂，氮气作为保护气体，构成反应体系；

（2）将反应体系在65-75℃磁力搅拌回流，同时在回流过程中缓慢滴加碘甲烷，直至表没食子儿茶素没食子酸酯与碘甲烷的物质的量之比达到1:2-1:6；反应2-4小时后终止反应；过滤后将滤液低温旋转浓缩干燥，得到固体产物；

（3）将上述固体产物用水溶解后，通过装有葡聚糖凝胶材料的层析柱；采用体积百分比为10%-80%的醇溶液作为洗脱溶剂进行梯度洗脱，依次收集分别含有4′,4″-二甲基EGCG、4′,3″,4″-三甲基EGCG以及4′,3″,4″, 5″-四甲基EGCG的洗脱液；

（4）将三种洗脱液体分别进行干燥，得到4′,4″-二甲基表没食子儿茶素没食子酸酯、4′,3″,4″-三甲基表没食子儿茶素没食子酸酯以及4′,3″,4″, 5″-四甲基表没食子儿茶素没食子酸酯三种化合物。

2.根据权利要求1所述的一种表没食子儿茶素没食子酸酯甲基化衍生物的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中葡聚糖凝胶材料为Sephadex LH-20或者Sephadex LH-60；所述步骤（3）中的醇为甲醇。

3.根据权利要求1所述的一种表没食子儿茶素没食子酸酯甲基化衍生物的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中层析处理的流速为1-4柱床体积/小时，洗脱溶剂的流速为2-6柱床体积/小时。

4.根据权利要求1所述的一种表没食子儿茶素没食子酸酯甲基化衍生物的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）采用分步收集仪收集洗脱液，设定10-20ml/管，收集50-100管，然后全部用HPLC检测，参考标准品进行对比，再根据检测结果合并相同成分的洗脱液。

5.根据权利要求1所述的一种表没食子儿茶素没食子酸酯甲基化衍生物的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）干燥方法分为冷冻干燥、旋转蒸发或者喷雾干燥。