CN102335426A - 一种用于牛口蹄疫的中药动物保健品 - Google Patents

一种用于牛口蹄疫的中药动物保健品 Download PDF

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本发明属于动物保健药物的制备技术，特别涉及栀子总皂苷和黄芪总皂苷在制备抗牛口蹄疫的中药动物保健品的佐剂上的应用。

Description

一种用于牛口蹄疫的中药动物保健品
技术领域
本发明属于动物保健药物的制备技术，特别涉及一种栀子总皂苷和黄芪总皂苷在制备中药动物保健品的佐剂方法上的应用。 
背景技术
随着养殖规模的扩大，环境污染的加重，各养殖场经常出现严重的疾病，例如，口蹄疫，这给养殖业造成了巨大的经济损失。有效预防和治疗口蹄疫，是该技术领域科研人员急需开发的新课题之一。
动物疫苗是由免疫原性较好的病原微生物, 经过繁殖和处理后制成的剂品, 用于动物机体后, 刺激机体产生特异性抗体, 当体内的抗体程度达到一定数值时,就可抵抗这种病原微生物的侵袭、感染, 可以预防动物疫病的发生。
佐剂是指与抗原同时或预先使用,能增强机体针对抗原的免疫应答能力或改变免疫反应类型的一类物质。
传统兽用疫苗中常用的佐剂有铝盐佐剂和油佐剂。目前，还出现了细胞因子、脂质体、CpG单磷酰基脂质A、皂苷等多种新型佐剂
铝盐佐剂应用已有七十多年历史,安全性较其他佐剂高而且生产工艺也较为成熟,因此其成为全世界应用最广泛的一类佐剂。但铝盐佐剂也有一些缺陷,例如其在诱导细胞毒性T细胞及Th1型反应中作用很有限,在同高纯度的小分子蛋白抗原共同使用时不能引起足够的抗体应答,因此铝盐在新型疫苗中的佐剂效果较差。油佐剂疫苗在抗体效价和免疫持久性方面都优于铝盐佐剂疫苗,但油佐剂不良反应严重,皮下注射会引起炎症、溃疡和肉芽肿，油类物质长期潴留于组织中不易代谢。虽然用中药皂苷做佐剂是一种刚刚发展的技术,但是, 本发明在此领域一直进行研究开发.
技术方案
    本发明涉及一种用于牛口蹄疫的中药动物保健品.
    本发明涉及一种用栀子总皂苷和黄芪总皂苷在制备抗牛口蹄疫的动物保健品的佐剂上的应用。
 
    本发明涉及一种用栀子总皂苷和黄芪总皂苷在制备抗牛口蹄疫的疫苗的佐剂上的应用。
   本发明的制备方法包括如下步骤：
   栀子总皂苷和黄芪总皂苷与牛口蹄疫疫苗，溶解在缓冲溶液中，混合。
    本发明的制备方法包括如下步骤：
    A将一定量的栀子总皂苷和黄芪总皂苷、牛口蹄疫疫苗、乙二胺四乙酸钠、阿拉伯糖、甘露醇、溶解在磷酸盐缓冲溶液，制成内水相溶液，
     栀子总皂苷的含量为0.1—0.5毫克/毫升，黄芪总皂苷0.1—0.5毫克/毫升, 牛口蹄疫疫苗0.1—0.5毫克/毫升，乙二胺四乙酸钠0.1—2毫克/毫升、阿拉伯糖1—8毫克/毫升、甘露醇0.5—5毫克/毫升； 
      B将聚乙交酯- 丙交酯的聚合物用花生油溶解制成油相溶液，聚乙交酯- 丙交酯的聚合物的含量为0.1—0.5克/毫升；
C将上述含栀子总皂苷和黄芪总皂苷、牛口蹄疫疫苗的内水相溶液加入到油相溶液中，油相溶液与内水相溶液的比例为20∶1至2∶1，加入聚氧乙烯氢化蓖麻油0.1—1毫克/毫升，使这两种溶液在温度5—30℃下搅拌混合均匀，制成初乳，在4—10℃下保存； 
      D将海藻酸钠和蛋氨酸锌充分溶解于水制成外水相溶液，海藻酸钠的重量浓度为0.5-50毫克/毫升，蛋氨酸锌的重量浓度为0.1-2毫克/毫升；
E将上述初乳加入到外水相溶液搅拌均匀，初乳与外水相溶液的比例为1∶50至1∶200，制成复乳 W内/0/W外，在4—10℃下保存； 
      F将复乳 W内/0/W外，转移到1-2毫克/毫升KCl和1-2毫克/毫升MgCl2的水溶液中，搅拌均匀，
     G使有机溶剂在低压中挥发，过滤，滤掉大颗粒，抽滤、洗涤、真空冻干，得微球。 
本发明的制备方法
      所述步骤C中的搅拌温度为5—30℃，搅拌速度为500—8000 转/分，搅拌时间为0. 2—0.5小时； 
      所述步骤E中的搅拌温度为5—30℃，搅拌速度为100—3000 转/分，搅拌时间为0.2—0.5小时； 
所述步骤F中的搅拌温度为5—30℃，搅拌速度为500—3000 转/分，搅拌时间为0.2—0.5小时。
本发明的动物保健品用于治疗口蹄疫：
本发明的有益效果
本发明的以栀子总皂苷和黄芪总皂苷为佐剂的口蹄疫疫苗，能够减少动物疫苗用药次数，是一种理想的动物保健品药物，具有制备工艺简单，应用方便，成本低等特点。本发明使栀子总皂苷和黄芪总皂苷和口蹄疫疫苗均匀的分散，得到长效剂型。
体外实验表明，以栀子总皂苷和黄芪总皂苷和动物疫苗为包裹对象，电镜扫描结果显示，所制得的微球形态圆整，粒度分布均匀，粒径分布在40微米以下，包封率在78.0％以上，体外缓释可以达4周释药，符合长效制剂特征。一次注射后能够在较长时间内发挥药效。将口蹄疫疫苗做成微球制剂，可以延长药物作用时间，大大提高药 物疗效和经济效益。 
稳定性试验结论：影响因素试验结果表明，本发明的制剂在光照、在高温35℃—45℃条件下放置12个月后、含量不下降、有关物质没有增加；在加速试验条件(25℃±2℃，RH 60±10％)放置18个月后，PH值下降、含量下降、有关物质增加；在长期试验条件 (2℃-10℃)放置12个月，各项指标均无明显改变。
     本发明实施例1-2制备的药物组合物在水中扩散良好，在4℃冰箱中保存6个月、25℃室温 中保存6个月、37℃中保存30天均不分层，疫苗经过5000转/分钟离心15分钟不分层。疫苗在1ml吸管中垂直自然流出。光镜下可见疫苗乳化粒子呈1-6μm的均匀颗粒。 
本发明的保护范围包括而不限于本文本所描述的范围。
具体实施方式：
实施例1  
     A将一定量的栀子总皂苷和黄芪总皂苷、牛口蹄疫O型灭活疫苗、乙二胺四乙酸钠、阿拉伯糖、甘露醇、溶解在磷酸盐缓冲溶液，制成内水相溶液，
     栀子总皂苷的含量为0.1毫克/毫升，黄芪总皂苷0.1毫克/毫升, 牛口蹄疫疫苗0.1毫克/毫升，乙二胺四乙酸钠0.1毫克/毫升、阿拉伯糖1毫克/毫升、甘露醇0.5毫克/毫升； 
     B将聚乙交酯- 丙交酯的聚合物用花生油溶解制成油相溶液，聚乙交酯- 丙交酯的聚合物的含量为0.1克/毫升；
     C将上述含栀子总皂苷和黄芪总皂苷、牛口蹄疫疫苗的内水相溶液加入到油相溶液中，油相溶液与内水相溶液的比例为20∶1，加入聚氧乙烯氢化蓖麻油0.1毫克/毫升，使这两种溶液在温度15℃下搅拌混合均匀，搅拌速度为500转/分，搅拌时间为0.2—0.5小时； 制成初乳，在4℃下保存； 
      D将海藻酸钠和蛋氨酸锌充分溶解于水制成外水相溶液，海藻酸钠的重量浓度为0.5毫克/毫升，蛋氨酸锌的重量浓度为0.1毫克/毫升；
E将上述初乳加入到外水相溶液搅拌均匀，搅拌温度为15℃，搅拌速度为1000 转/分，搅拌时间为0.2小时,初乳与外水相溶液的比例为1∶50，制成复乳 W内/0/W外，在4℃下保存； 
      F将复乳 W内/0/W外，转移到1毫克/毫升KCl和1毫克/毫升MgCl2的水溶液中，搅拌均匀，搅拌温度为10℃，搅拌速度为500 转/分，搅拌时间为0.5小时
     G使有机溶剂在低压中挥发，过滤，滤掉大颗粒，抽滤、洗涤、真空冻干，得微球。 
     牛口蹄疫O型灭活疫苗：来自中国农业科学院兰州兽医研究所。
实施例2  
      A将一定量的栀子总皂苷和黄芪总皂苷、牛口蹄疫疫苗、乙二胺四乙酸钠、阿拉伯糖、甘露醇、溶解在磷酸盐缓冲溶液，制成内水相溶液，
     栀子总皂苷的含量为0.5毫克/毫升，黄芪总皂苷0.5毫克/毫升, 牛口蹄疫疫苗0.5毫克/毫升，乙二胺四乙酸钠2毫克/毫升、阿拉伯糖8毫克/毫升、甘露醇5毫克/毫升； 
      B将聚乙交酯- 丙交酯的聚合物用花生油溶解制成油相溶液，聚乙交酯- 丙交酯的聚合物的含量为0.5克/毫升；
      C将上述含栀子总皂苷和黄芪总皂苷、牛口蹄疫疫苗的内水相溶液加入到油相溶液中，油相溶液与内水相溶液的比例为20∶1，加入聚氧乙烯氢化蓖麻油1毫克/毫升，使这两种溶液在温度20℃下搅拌混合均匀，搅拌速度为3000 转/分，搅拌时间为0.2小时； 制成初乳，在10℃下保存； 
      D将海藻酸钠和蛋氨酸锌充分溶解于水制成外水相溶液，海藻酸钠的重量浓度为50毫克/毫升，蛋氨酸锌的重量浓度为2毫克/毫升；
E将上述初乳加入到外水相溶液搅拌均匀，搅拌温度为20℃，搅拌速度为3000 转/分，搅拌时间为0.2小时；初乳与外水相溶液的比例为1∶200，制成复乳 W内/0/W外，在10℃下保存； 
      F将复乳 W内/0/W外，转移到2毫克/毫升KCl和2毫克/毫升MgCl2的水溶液中，搅拌均匀，搅拌温度为20℃，搅拌速度为3000 转/分，搅拌时间为0.2小时；
     G使有机溶剂在低压中挥发，过滤，滤掉大颗粒，抽滤、洗涤、真空冻干，得微球。     
    实施例3
    本发明 实施例1-2制备的药物组合物的安全性检验： 
  用本发明 实施例1-2的药物接种4头6个月-2岁健康无口蹄疫抗体的黄牛。每头牛颈部肌肉注射疫苗10ml，隔离观察10天，同时设空白对照4头，颈部肌肉生理盐水，每天测温3次，注意临床症状，牙龈、口腔、 四蹄、乳头是否有病变。 
  小白鼠  用本发明实施例1-2的药物皮下接种10只健康成年小白鼠，每只注射1ml，同时设10只空白对照。连续隔离观察7天，密切注意是否出现临床症状及其它异常变化。 
结果：大剂量接种的牛、成年小白鼠后，未有异常情况。 
 
实施例4
本实施例1制备的药物组合物对牛口蹄疫的免疫保护作用
实验动物 
同品种、来源的6-18月健康牛，血清中亚洲I型、O型口蹄疫病毒抗体均为阴性。 
实验分组 
实施例1产品：按照2mg/ml的比例，1 ml /只/次，臀部肌肉注射，0.2mg/kg体重，2日1次，连用5天。
牛口蹄疫灭活苗阳性对照组：商品化牛亚洲O型口蹄疫病毒灭活苗，600μg/ml ，2 毫升/只/次，臀部肌肉注射。 
PBS阴性对照组：PBS，1 ml /只/次，臀部肌肉注射。 
于各组给药后的第30天，在牛耳皮下注射O型口蹄疫病毒佳木斯毒株， 10000ID 50/0.1ml。于注射病毒后第5天判断发病情况。
除注射病毒的舌面外，牙龈、口腔、 四蹄、乳头任何部位出现水泡，即可判断为发病。
阴性对照组的牛至两个蹄子出现水泡，方可判定攻毒实验成立。结果见表。实验结果表明，本实施例产品具有预防牛O型口蹄疫病毒感染的作用。
 
实验分组 牛(只) 未发病牛(只) 发病牛(只)
本实施例产品 8 8 0
商品化牛亚洲O型口蹄疫病毒灭活苗 8 5 3
PBS阴性对照组 8 0 0
实施例1产品效检检测  由O型LPB-ELISA剂盒测定。O型LPB-ELISA抗体滴度均≥7986。  
实施例1的被动免疫有效持续期，从4h～8周，被动免疫起效快，有效持续期56天。 
商品化牛亚洲O型口蹄疫病毒灭活苗效检检测  由O型LPB-ELISA剂盒测定。O型LPB-ELISA抗体滴度均≥4536。  
商品化牛亚洲O型口蹄疫病毒灭活苗的被动免疫有效持续期，从4h～2周，被动免疫起效快，有效持续期14天。 
 
实施例4
实施例1制备的药物组合物对牛口蹄疫的治疗作用
2008年12月，某养牛场育牛500头， 32头牛出现了口蹄疫症状，后2头倒地突然死亡。 
将发病牛随机分为3组，每组10头，分为实施例1组、阳性对照组、空白对照组。
实施例1组：按照1mg/ml的比例，1 ml /只/次，臀部肌肉注射，0.02mg/kg体重，2日1次，连用6天。
牛口蹄疫灭活苗阳性对照组：商品化牛O型口蹄疫病毒灭活苗，500μg/ml ，2 毫升/只/次，臀部肌肉注射，2日1次，连用6天。
 PBS阴性对照组：PBS，1 ml /只/次，臀部肌肉注射，2日1次，连用6天。
 
组别 头数 无效 显效 治愈
实施例1组 10 1 4 5
阳性对照组 10 5 2 3
空白对照组 10 9 1 0

Claims (4)

1.一种用栀子总皂苷和黄芪总皂苷在制备抗牛口蹄疫的中药动物保健品的佐剂上的应用。
2.根据权利要求1的一种应用，其特征在于包括如下步骤：
栀子总皂苷和黄芪总皂苷与牛口蹄疫疫苗，溶解在缓冲溶液中，混合。
3.根据权利要求1的一种应用，其特征在于包括如下步骤： 
A将一定量的栀子总皂苷和黄芪总皂苷、牛口蹄疫疫苗、乙二胺四乙酸钠、阿拉伯糖、甘露醇、溶解在磷酸盐缓冲溶液，制成内水相溶液，
栀子总皂苷的含量为0.01—5毫克/毫升，黄芪总皂苷0.01—5毫克/毫升, 牛口蹄疫疫苗0.01—50毫克/毫升，乙二胺四乙酸钠0.1—2毫克/毫升、阿拉伯糖1—8毫克/毫升、甘露醇0.5—5毫克/毫升； 
B将聚乙交酯- 丙交酯的聚合物用花生油溶解制成油相溶液，聚乙交酯- 丙交酯的聚合物的含量为0.1—0.5克/毫升；
C将上述含栀子总皂苷和黄芪总皂苷、牛口蹄疫疫苗的内水相溶液加入到油相溶液中，油相溶液与内水相溶液的比例为20∶1至2∶1，加入聚氧乙烯氢化蓖麻油0.1—1毫克/毫升，使这两种溶液在温度5—30℃下搅拌混合均匀，制成初乳，在4—10℃下保存； 
D将海藻酸钠和蛋氨酸锌充分溶解于水制成外水相溶液，海藻酸钠的重量浓度为0.5-50毫克/毫升，蛋氨酸锌的重量浓度为0.1-2毫克/毫升；
E将上述初乳加入到外水相溶液搅拌均匀，初乳与外水相溶液的比例为1∶50至1∶200，制成复乳 W内/0/W外，在4—10℃下保存； 
F将复乳 W内/0/W外，转移到1-2毫克/毫升KCl和1-2毫克/毫升MgCl2的水溶液中，搅拌均匀，
G使有机溶剂在低压中挥发，过滤，滤掉大颗粒，抽滤、洗涤、真空冻干，得微球。
4.根据权利要求1-3所述的一种的制备方法，其特征在于:
所述步骤C中的搅拌温度为5—30℃，搅拌速度为500—8000 转/分，搅拌时间为0. 2—0.5小时； 
所述步骤E中的搅拌温度为5—30℃，搅拌速度为100—3000 转/分，搅拌时间为0.2—0.5小时； 
所述步骤F中的搅拌温度为5—30℃，搅拌速度为500—3000 转/分，搅拌时间为0.2—0.5小时。
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Effective date of registration: 20151231

Address after: 215228 Jiangsu City, Wujiang Province, Shengze Town, No. two West Ring Road, No. Shengze Textile Science and Technology Park, building 10, 1188

Patentee after: Wujiang Yisheng Textile Co., Ltd.

Address before: 215200, Jiangsu, Suzhou, Wujiang, Shengze No. 1188 West Ring Textile Technology Pioneer Park 10, 315

Patentee before: Suzhou Danfang Textile Research & Development Co., Ltd.

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Granted publication date: 20130710

Termination date: 20181030