CN102292113B - 通过辐射融合技术制造的用于生物组织工程的β-葡聚糖基支架及其制造方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种通过使用辐射融合技术制造用于生物组织工程的β-葡聚糖基支架，并涉及其制造方法。根据本发明对β-葡聚糖基支架的制造方法，辐射融合组织工程，将β-葡聚糖水溶性溶液进行灌注，然后对其辐射引发交联反应，以形成凝胶形或固体形的支架，从而促进细胞吸附并轻松地创造出一种对干细胞的生长和分化具有共诱导作用的仿生环境。因此，可以将根据本发明的β-葡聚糖基支架作为填充物用于组织再生、细胞培养和整形手术，作为填充物用于生物组织的排泄，作为支架用于重建和校正整形手术，并用于细胞移植和药物递送。

Description

通过辐射融合技术制造的用于生物组织工程的β-葡聚糖基支架及其制造方法

技术领域

本发明涉及一种使用辐射融合技术制造的用于组织工程的β-葡聚糖基支架，及其制备方法。

背景技术

组织工程是一种适用于在支架上培养细胞以形成细胞支架复合物并将该复合物应用于制造组织或器官供临床使用的技术。根据组织工程的原理，从取自患者的目的组织中分离细胞，并在支架中培养以形成细胞支架复合物，然后将其植入患者体内。组织工程的大多数定义涵盖了修复或替换几乎任何人体器官的广泛应用，这些人体器官包括，尤其是，人工皮肤、人工骨、人工软骨、人工角膜、人工血管、人工肌肉等。为了优化组织或器官的再生，最优选的方式可能是提供与机体组织类似的支架。就其在组织工程中的用途来说，支架从根本上允许细胞粘附其上，并作为能够支撑三维组织形成的框架而发挥作用。同样，要求支架是无毒的并且是生物相容的，以使其不会诱发血液凝固或炎症反应。即，优选地，用于组织工程的支架可以是生物相容性聚合物，其与机体内临近的组织相亲近，并且进行生物粘附而不发生移植排斥的现象。生物相容性聚合物大体上分为天然聚合物和人工聚合物，或可生物降解的聚合物和不可生物降解的聚合物。天然聚合物的实例包括基于蛋白的聚合物，比如骨胶原、白蛋白和氨基酸；以及多糖及其衍生物，比如纤维素、琼脂糖、藻酸盐、肝素、透明质酸、壳聚糖等等。

通常用以下几种之一来替换受损的热组织，特别是严重烧伤的皮肤：1）自体移植物，其来自将被移植的同一个体；2）异体移植物，其来自同种供体的机体；3）异种移植物，其从其他种类的个体中分离。尽管自体移植物是理想的，但当大面积的皮肤被受损时其操作会有困难，因此可使用的自体移植物是有限的。此外，获取热自体移植物对皮肤产生另一种损害。就自体移植物来说，它们作为辅助创伤周围细胞的迁移和增殖的一种支持，而不是作为永久移植的目的使用。典型的自体移植物是尸体的组织或皮肤。尽管其可能避免了免疫反应，但还是存在自体移植物供体短缺的问题。为了解决这样的问题，已经进行了积极的研究，旨在开发具有高生物相容性的天然的或人工的聚合物，其适合作为支架用于人工皮肤的重建。

迄今为止，已经有很多交联技术广泛地应用于天然的聚合物以制造生物材料。然而，通过化学试剂的反应来制备生物材料可能花费很高，因为可能必须在特定条件下在催化剂存在时才发生反应，而且催化剂可能有毒。此外，在最终产物中总是有可能会存在杂质，其可能，甚至使用了非常少量的化学试剂，这也会导致无法预料的副作用。

作为解决该问题的一个办法，已经研究了用于开发生物材料的辐射交联。在辐射交联中，因为不存在包括交联剂、引发剂等的有害化学制剂，其从根本上省略了去除比如残积物交联剂或引发剂的后辐射程序。另外，辐射交联可以同时保证消毒和交联。此外，该程序的优点是交联不需要额外的热量，使得即使对冷冻状态下的材料也为可能进行交联，并且只用辐射剂量就能轻易控制材料的物理性能，不必改变其成分。

β-葡聚糖（β-1,6-支-β-1,3-葡聚糖）几乎没有卡路里，并且在1983年获得食品药品监督管理局（FDA）的认可之后，β-葡聚糖在美国具有公认的安全性。β-葡聚糖显示出多种生理活性，其包括抗癌作用、伤口愈合、免疫增强、促进骨胶原的生物合成、细胞再生、高保水性等等。由于多年的广泛研究证实了其安全性，源自担子菌类的β-葡聚糖应用于很多领域，其包括医药、化妆品、健康食品、动物食品添加剂等等。尽管其具有生物相容性和多种生理活性，迄今为止还没有将β-葡聚糖作为用于组织工程的支架进行开发或研究。

据了解，具有高生物相容性和多种生理活性的β-葡聚糖在机体内显示出无毒性。当对其应用辐射融合技术时，可以将β-葡聚糖开发成用于组织工程的支架，其使细胞轻易粘附其上并提供有效用于干细胞生长和分化的仿生环境。因此，有必要在组织工程中开发β-葡聚糖基支架。

发明内容

技术问题

在本发明中，发明人对用于组织工程的β-葡聚糖基支架的开发进行了细致而全面的研究，结果发现当人类间质干细胞在其上生长并分化成骨细胞时，通过对灌注到培养皿或平板上的水溶性β-葡聚糖基支架使用辐射交联所得到的凝胶形或固体形的该支架，使这些细胞具有与其在TCPS上相似水平的总DNA含量和ALP活性，从而提供了比传统的纳米纤维支架更高的分化效力。

技术方案

为了达到以上目的，本发明提供了一种应用辐射的β-葡聚糖基支架及其制造方法。

附图说明

图1是描述了通过使用辐射融合技术制造用于组织工程的β-葡聚糖基支架的过程的原理图。

图2示出了通过使用图1的过程制造的用于组织工程的β-葡聚糖基支架。

图3示出了使人类间质干细胞在本发明的β-葡聚糖基支架上生长2天后再分化14天后的总DNA含量的图示。

图4示出了图3的基于每DNA含量的ALP活性的图表。

图5示出了使人类间质干细胞在本发明的β-葡聚糖基支架、PLGA（聚乳酸-乙醇酸共聚物）、PLLA（聚乳酸）和TCPS上生长2天后再分化14天后的ALP活性的图示。

具体实施方式

根据本发明的一方面，提供了一种制造用于组织工程的β-葡聚糖基支架的方法，其包括：

1)       在30oC至100oC的温度下，在蒸馏水中溶解β-葡聚糖粉末30至200分钟，以形成0.1至50 wt%水溶性β-葡聚糖溶液；

2)       将水溶性β-葡聚糖溶液灌注到培养皿或平板上；和

3)       对β-葡聚糖灌注物使用5至50kGy剂量的辐射交联以制造凝胶形或固体形的支架。

可选择地，根据本发明的β-葡聚糖基支架的制造方法还可以包括在步骤3之后将交联的β-葡聚糖灌注物在-50oC至-100oC的温度下快速冷冻，并立刻解冻以使在该支架内形成气孔。

此外，本发明提供了通过该方法制造的用于组织工程的β-葡聚糖基支架。

下文中将对本发明进行详细描述。

根据本发明，通过使用辐射融合技术制造用于组织工程的β-葡聚糖基支架的方法，其特征在于，通过将水溶性β-葡聚糖溶液灌注到培养皿或平板上，对该灌注物使用辐射照射以进行交联反应，从而制造凝胶形或固体形的支架。

本发明中使用的β-葡聚糖可以优选地选自裂褶菌、灵芝、桑黄、白桦茸、荷仙菇、姬松茸、灰树花、香菇、核盘菌、酵母、大麦、燕麦及其组合物所组成的组中，但并不限于此。在本发明中，使用了从裂褶菌中提取的β-葡聚糖，并且被称为裂褶多糖。

在水溶性β-葡聚糖溶液中，含有β-葡聚糖的量为0.1至50wt%，优选为4至15wt%，最优选地为8wt%。例如，如果β-葡聚糖的浓度超过50wt%，其水溶性溶液会太粘而不能灌注到容器上。另一方面，当β-葡聚糖的浓度低于0.1wt%时，其水溶性溶液会太稀而不能在其中诱发交联反应。

至于水溶性β-葡聚糖溶液的灌注，其量为基于灌注容器的总容积的5至20vol%，优选为10vol%。该灌注容器优选为不同尺寸的培养皿或平板。

本发明中使用的辐射线可以优选地选自电子束、γ射线束和紫外线束所组成的组中。使用该辐射线对灌注的β-葡聚糖溶液进行照射，其剂量为5至50kGy，优选的剂量为15至30kGy，以制造凝胶形或固体形的支架。

可选择地，可以将交联的β-葡聚糖灌注物在-50oC至-100oC的温度下快速冷冻，并立刻解冻以使在其中形成气孔。

将人类间质干细胞在根据上述方式制备出的β-葡聚糖基支架上培养2天，并使其分化14天。测量出这些细胞在每个支架上具有大约380ng的总DNA含量，并具有0.7nmol/DNA/30分钟的ALP含量。通常，将人类间质干细胞在TCPS上分化成骨细胞后，其在每个支架上具有大约500ng的总DNA含量，而该人类间质干细胞在传统的纳米纤维支架上分化后具有大约0.5至0.6nmol的ALP含量。因此，可以理解为，根据本发明的β-葡聚糖基支架使细胞在其上正常生长。此外，其总DNA含量与在TCPS上细胞的总DNA含量相似，这表明了本发明的支架几乎没有细胞毒性。本发明的支架还保证了比传统的纳米纤维支架更高的细胞分化效力。另外，据发现，人类间质干细胞在本发明的β-葡聚糖基支架上生长时，具有比其在PLGA或PLLA，即用于组织再生的传统的生物材料上更高的ALP活性，因此，本发明的β-葡聚糖基支架可以提供比传统的生物材料PLGA或PLLA更有效的提供干细胞生长和分化的仿生环境。

如上所述，通过使用辐射融合技术制造用于组织工程的根据本发明的β-葡聚糖基支架的方法，其中通过灌注水溶性β-葡聚糖溶液并对其辐射交联以制造凝胶形或固体形的支架。该方法能够很大程度地改善细胞附着，其提供了有效用于干细胞生长和分化的仿生环境。因此，可以将根据本发明的β-葡聚糖基支架有效应用于组织再生、细胞培养、细胞移植和药物递送。

实施例

可以通过以下实施例更好地理解本发明，该实施例仅用于说明作用，而不用于限制本发明。

实施例1：使用辐射融合技术制备β-葡聚糖基支架

在90oC的温度下用100mL蒸馏水溶解80g源自裂褶菌的β-葡聚糖(裂褶多糖，Schizophyllan)粉末1小时以得到8wt%的水溶性β-葡聚糖溶液。将该8wt%的β-葡聚糖溶液灌注到培养皿(90x15mm）中，以达到该培养皿容积的10%。使用剂量为15至30kGy的γ射线对该β-葡聚糖灌注物进行照射以引发交联反应。将该交联的β-葡聚糖灌注物在-80oC的温度下快速冷冻，并立刻解冻以使在灌注物内形成气孔，从而提供凝胶形或固体形的支架。

图1示意性地描述了制造用于组织工程的β-葡聚糖基支架的过程，而图2示出了通过该过程制造的β-葡聚糖基支架。

实验实施例1：本发明的β-葡聚糖基支架将人类间质干细胞(hMSC）分化成骨细胞的效力的检验

在本发明的β-葡聚糖基支架上将人类间质干细胞分化成骨细胞的程度评定如下。

1. 在支架上分化hMSC后测量总DNA的含量

将人类间质干细胞以1×10⁵细胞/支架的密度分别接种在实施例1中制造的β-葡聚糖基支架上和TCPS（细胞培养聚苯乙烯）支架上，接着在完全生长培养基[LG-DMEM(GIBCO) + 1%PS(GIBCO) + 10%FBS(GIBCO 16000)]中增殖2天，然后分化14天。使用PBS清洗两次后，将每个支架分开，置于EP管内，在-70oC的温度下储存直到用于分析。向每个包含支架的EP管内加入300μL的RIPA缓冲液[150mM氯化钠、1%曲拉通X-100、1%脱氧胆酸钠、0.1%SDS、150mM三氨基甲烷盐酸缓冲液（pH7.2）]，将支架用剪刀细切并在冰上均化。在测量DNA前将支架除去。

上述结果在图3中示出。

如图3所示，分化成骨细胞的该人类间质干细胞在β-葡聚糖基支架上具有大约380ng的总DNA量，而在TCPS上具有大约500ng的总DNA量。因此，根据本发明的β-葡聚糖基支架使细胞正常生长，并且具有与TCPS相似的水平，因此几乎没有细胞毒性。

2. 在支架上分化hMSC后测量ALP的活性

将人类间质干细胞以1×10⁵细胞/支架的密度分别接种在实施例1中制造的β-葡聚糖基支架和PLGA、PLLA、TCPS上，接着在完全生长培养基[LG-DMEM(GIBCO) + 1%PS(GIBCO) + 10%FBS(GIBCO 16000)]中增殖2天，然后分化14天。使用PBS清洗两次后，将每个支架分开，置于EP管内，在-70oC的温度下储存直到对其用于分析。

向每个包含支架的EP管内加入300μL的RIPA缓冲液[150mM氯化钠、1%曲拉通X-100、1%脱氧胆酸钠、0.1%SDS、150mM三氨基甲烷盐酸缓冲液（pH7.2）]，将支架用剪刀细切并在冰上均化。将其上清液（细胞裂解液）涂覆在96孔的平板上使每个孔具有10 μL的量，并将其与每个孔200μL的pNPP（碱性磷酸酶黄色）基质混合，然后在37oC的温度下培养30分钟。之后，将50μL的3N NaOH加入到每个孔中，然后测量在405nm处的吸光度。ALP活性与TCPS的吸光度的标准值进行比较。

图4示出了使人类间质干细胞在本发明的β-葡聚糖基支架上生长2天并分化14天后测量的每DNA含量的ALP活性。图5示出了在本发明的β-葡聚糖基支架和PLGA、PLLA、TCPS上生长2天并分化14天后的人类间质干细胞的ALP活性的测量值。

如图4所示，人类间质干细胞在本发明的β-葡聚糖基支架上分化成骨细胞后，其ALP水平达到大约0.7nmol/DNA/30分钟。因此，与传统的纳米纤维支架（最多0.5至0.6nmol）相比，本发明的β-葡聚糖基支架确保了更高的分化效力。由于这些结果来自细胞对细胞接触的可能性低的环境中，预计支架具有高水平的分化效力。

从图5中可以看出，人类间质干细胞在本发明的β-葡聚糖基支架上和传统生物材料PLGA或PLLA上生长并分化后，该细胞的ALP活性分别达到大约20至25%，并且在TCPS上该细胞的ALP活性为大约70%。因此，根据本发明的该β-葡聚糖基支架可以提供比传统生物材料PLGA或PLLA更有效的干细胞生长和分化的仿生环境。

工业实用性

如到目前为止所述，根据本发明使用辐射融合技术制造β-葡聚糖基支架的方法，其中对水溶性β-葡聚糖溶液进行灌注并使用辐射交联以制造凝胶形或固体形的支架，该方法能够很大程度的改善细胞吸附，其提供了有效用于干细胞生长和分化的仿生环境。因此，可以将根据本发明的β-葡聚糖基支架有效应用于组织再生、细胞培养、细胞移植和药物递送，并将其作为填充剂用于整形或重建手术、移植和用于整形手术的修复术。

Claims (6)

1.一种使用辐射融合技术制造用于组织工程的β-葡聚糖基支架的方法，其包括：

（1）在30oC至100oC的温度下，在蒸馏水中溶解β-葡聚糖粉末30至200分钟，以形成0.1至50wt%水溶性β-葡聚糖溶液；

（2）将该水溶性β-葡聚糖溶液灌注到培养皿或平板上；

（3）对该β-葡聚糖灌注物使用5至50kGy剂量的辐射交联；

（4）使交联的β-葡聚糖在-50oC至-100oC的温度下快速冷冻，并立刻解冻以使该支架内形成气孔，以制造凝胶形或固体形的支架。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，从以下组合的至少一种中提取β-葡聚糖，该组合包括裂褶菌、灵芝、桑黄、白桦茸、荷仙菇、姬松茸、灰树花、香菇、核盘菌、酵母、大麦和燕麦。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述β-葡聚糖为提取自裂褶菌的裂褶多糖。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述水溶性β-葡聚糖溶液的灌注量为基于步骤（2）中的培养皿或平板的总容积的5至20vol%。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）的辐射线选自由电子束、γ射线束和紫外线束所组成的组中。

6.一种用于组织工程的β-葡聚糖基支架，其通过权利要求1到5中任一项所述的方法进行制造。

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