WO2010085119A2 - 방사선 융합 기술을 이용한 생체조직공학용 베타-글루칸 기반 지지체 및 이의 제조방법 - Google Patents

방사선 융합 기술을 이용한 생체조직공학용 베타-글루칸 기반 지지체 및 이의 제조방법 Download PDF

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장용만
전인호
고상진
전정란
전계택
임윤목
권희정
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/20—Polysaccharides

Definitions

  • the present invention relates to a beta-glucan-based support for biotissue engineering using a radiation fusion technology and a method for preparing the same.
  • Tissue engineering technology is a technique for culturing cells in a support to prepare a cell-support complex, using them to regenerate living tissue and organs.
  • the basic principle of the tissue engineering technique is to collect the necessary tissue from the patient's body, isolate the cells from the tissue, and then culture the separated cells in a support to prepare a cell-support complex, and then the cell-support complex prepared in the human body To transplant.
  • Tissue engineering technology is applied to the regeneration of almost all organs of the human body such as artificial skin, artificial bones, artificial cartilage, artificial cornea, artificial blood vessels, artificial muscles. In order to optimize the regeneration of biological tissues and organs in the tissue engineering technology, it is basically the first to prepare a support similar to the biological tissue.
  • the basic requirement of the tissue engineering scaffold is that the tissue cells should adhere to the scaffold and serve as a framework for forming a tissue having a three-dimensional structure, and the blood coagulation or inflammatory reaction does not occur after being implanted in a living body.
  • the support for tissue engineering is a biocompatible polymer and should have bio-adhesive properties that have affinity with surrounding tissues in the human body and do not exhibit rejection.
  • Biocompatible polymers can be broadly classified into natural polymers and synthetic polymers, or non-degradable polymers and degradable polymers.
  • Natural polymers include polymers based on proteins such as collagen, albumin and amino acids; And polysaccharides and derivatives thereof such as cellulose, agarose, alginate, heparin, hyaluronic acid, chitosan and the like.
  • Methods for regenerating damaged skin tissues include: 1) autografts for transplanting the patient's own skin, 2) allografts for transplanting the skin of others, and 3) animal skins.
  • Autograft is the most ideal of the above methods, but when the wound is extensive, there is a limitation in the area where tissue can be secured, and another wound occurs due to skin collection.
  • allograft it serves as a supporter to help the movement, proliferation, and healing of the cells around the wound rather than permanent engraftment, and it is also used by the epidermis collected from the dead body or after removing the immune response from the dead skin.
  • active research is being conducted on the development of a scaffold for artificial skin regeneration using a natural or synthetic polymer having excellent biocompatibility.
  • the radiation crosslinking method does not use harmful chemical crosslinking agents or initiators, there is no need to remove residual crosslinking agents or initiators harmful to the human body after crosslinking, and there is an advantage in that crosslinking and sterilization can be simultaneously processed.
  • there is no need to apply heat in the cross-linking process there is a feature that can be cross-linked even in the cooling state, by adjusting only the radiation dose can be freely adjusted physical properties without having to change the composition.
  • beta-glucan ( ⁇ -1,6-branched- ⁇ -1,3-glucan) has almost no calories and was recognized as a safe substance by the US FDA in 1983, and has anticancer effects, wound healing effects, and immunity. It has various physiological activities such as activity enhancing effect, collagen synthesis promoting effect, cell regeneration effect, and water retention effect. Basidiomycete-derived beta-glucan has been proven to be stable through many years of research. Therefore, beta-glucan has been developed in various fields such as pharmaceuticals, cosmetics, health foods, animal feed additives. However, in spite of the biocompatibility and various physiological activities of beta-glucan, there is almost no case in which a support for biotissue engineering has been developed or studied using beta-glucan.
  • beta-glucan is a support for biotissue engineering through radiation fusion technology that can simultaneously process crosslinking and sterilization. It is thought that development as a biomimetic environment that facilitates cell adhesion and is effective for growth and differentiation of stem cells can be easily realized. Accordingly, there is a need for the development of beta-glucan based supports for biotissue engineering.
  • the present inventors are studying to develop a beta-glucan-based support for biotissue engineering, adding aqueous solution of beta-glucan on a petri-dish or flat plate, casting, and irradiating with radiation to perform a crosslinking reaction to form a gel or solid form.
  • aqueous solution of beta-glucan on a petri-dish or flat plate
  • casting and irradiating with radiation to perform a crosslinking reaction to form a gel or solid form.
  • the total DNA content and ALP activity after the differentiation into osteoblasts were similar to the TCPS level. It confirmed that the degree of differentiation was excellent and completed this invention.
  • the present invention is to provide a beta-glucan-based support for biotissue engineering using a radiation fusion technology and a method for preparing the same.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the manufacturing process of a beta-glucan-based support for biotissue engineering using a radiation fusion technology according to the present invention.
  • Figure 2 is a diagram showing a beta-glucan-based support for biotissue engineering prepared by the manufacturing process of FIG.
  • Figure 3 is a diagram showing the results of measuring the total DNA content after proliferation of human mesenchymal stem cells for 2 days and differentiation for 14 days in the beta-glucan-based support according to the present invention.
  • FIG. 4 is a diagram showing ALP activity per total DNA content of FIG. 3.
  • Figure 5 is a beta-glucan-based support according to the invention, PLGA (poly lactic-co-glycolic acid), PLLA (poly lactic acid), PLS (poly lactic acid) in human proliferation of mesenchymal stem cells for 2 days and differentiated for 14 days ALP activity It is a measured figure.
  • PLGA poly lactic-co-glycolic acid
  • PLLA poly lactic acid
  • PLS poly lactic acid
  • the present invention is a.
  • beta-glucan in powder form to distilled water, dissolving at 30-100 ° C. for 30-200 minutes to prepare 0.1-50% by weight of beta-glucan aqueous solution
  • the method for preparing the beta-glucan-based support is to rapidly freeze the crosslinked reactant at -50 to -100 ° C. after step 3), and to immediately induce pore formation in the crosslinked reactant after thawing. It may further comprise a step.
  • the present invention also provides a beta-glucan based support prepared for the biotissue engineering.
  • a beta-glucan aqueous solution is added to a Petri-dish or flat plate, cast, and irradiated with radiation to perform a cross-linking reaction. It is characterized by forming a support in solid form.
  • the beta-glucan is beta-glucan extracted from one or more selected from the group consisting of chia mushroom, ganoderma lucidum mushroom, mushroom, chaga, matsutake mushroom, spiritual mushroom, leaf mushroom, shiitake mushroom, mycobacterium fungus, yeast, barley and oats Is preferred, but is not limited thereto.
  • schizophyllan a beta-glucan extracted from the blotch, was used.
  • the aqueous beta-glucan solution is preferably 0.1 to 50% by weight, preferably 4 to 15% by weight, and most preferably 8% by weight of beta-glucan. If the concentration of the aqueous solution of beta-glucan exceeds 50% by weight, the viscosity becomes so strong that it cannot be added to the casting vessel. If the concentration of the aqueous solution of beta-glucan is less than 0.1% by weight, the viscosity becomes too weak to cause crosslinking reaction. There is a problem.
  • the casting amount of the beta-glucan aqueous solution is preferably added in 5-20% volume, preferably 10% volume of the casting vessel.
  • the casting vessel is preferably of various sizes of Petri-Dish or flat plate.
  • the radiation is preferably one selected from the group consisting of electron beams, gamma rays and ultraviolet rays.
  • the cast beta-glucan aqueous solution is irradiated with radiation of 5 to 50 kGy, preferably 15 to 30 kGy to perform a crosslinking reaction to form a gel or solid support.
  • the crosslinked reactant can be rapidly frozen at -50 to -100 ° C and immediately defrosted to induce pore formation in the crosslinked reactant.
  • the total DNA content is about 380 ng per support, and the ALP amount is about 0.7 nmole / DNA / 30 minutes.
  • the total DNA of human mesenchymal stem cells derived from TCPS into bone cells is about 500ng per support, and the amount of ALP after differentiation experiment using conventional nanofiber support is about 0.5-0.6nmole. Therefore, it can be seen that the beta-glucan-based support according to the present invention is normally grown in cells, and it is judged that there is little cytotoxicity at a level similar to that of TCPS, and has a relatively higher differentiation capacity than the conventional nanofiber support.
  • Beta-glucan-based scaffolds are expected to provide a biomimetic environment that is more effective for the growth and differentiation of stem cells than conventional biomaterials PLGA or PLLA.
  • a gel or solid support is formed by casting a beta-glucan aqueous solution and then irradiating with radiation to perform a crosslinking reaction.
  • the beta-glucan based support according to the present invention can be usefully used for tissue regeneration, cell culture, cell transplantation and drug delivery.
  • beta-glucan powdered beta-glucan (schizophyllan) derived from Schizophyllum mushrooms was added to 1000 ml of distilled water, and dissolved at 90 ° C. for 1 hour to prepare an 8% by weight aqueous solution of beta-glucan.
  • the 8 wt% aqueous solution of beta-glucan was added onto the Petri-Dish (90 ⁇ 15 mm) and cast. At this time, the amount of beta-glucan aqueous solution of 8% by weight was added to 10% volume of the casting vessel.
  • the cast beta-glucan solution was irradiated with gamma rays at 15 to 30 kGy to perform a crosslinking reaction.
  • the crosslinked reactant was rapidly frozen at ⁇ 80 ° C. and immediately thawed to induce pore formation in the crosslinked reactant to form a gel or solid support.
  • FIG. 1 The manufacturing process of the beta-glucan-based support for biotissue engineering using the radiation fusion technology according to the present invention is shown in FIG. 1, and the beta-glucan-based support for biotissue engineering prepared by the manufacturing process of FIG. 1 is shown in FIG. 2.
  • the beta-glucan-based support according to the present invention As shown in Figure 3, in the beta-glucan-based support according to the present invention, after human mesenchymal stem cells differentiate into osteocytes, the total DNA content was about 380 ng per support, and in TCPS the total DNA content was about 500 ng per support. Therefore, it can be seen that the beta-glucan-based support according to the present invention normally grows cells, and it is judged that there is little cytotoxicity at a level similar to that of TCPS.
  • ALP activity per total DNA content measured after proliferation of human mesenchymal stem cells for 2 days and differentiation for 14 days in the beta-glucan based support according to the present invention is shown in FIG. 4, and the beta-glucan based support according to the present invention, PLGA
  • the results of measuring ALP activity after proliferating 2 days and differentiating human mesenchymal stem cells in PLLA, TCPS for 2 days are shown in FIG. 5.
  • the amount of ALP after differentiation of human mesenchymal stem cells into bone cells was about 0.7 nmole / DNA / 30 minutes. Therefore, it can be seen that the beta-glucan-based support according to the present invention shows a relatively higher differentiation capacity than the results of differentiation experiments using the conventional nanofiber support (maximum value 0.5-0.6 nmole). Since the result is in an environment where the probability of intercellular contact is relatively small, higher levels of differentiation can be expected in the future.
  • ALP activity of human mesenchymal stem cells grown in PLGA or PLLA, which is a biomaterial used for conventional tissue regeneration is about 20-25% compared to TCPS
  • the beta-glucan-based support of the present invention The ALP activity of human mesenchymal stem cells grown at was about 70% compared to TCPS. Therefore, it is believed that the beta-glucan based support of the present invention can provide a biomimetic environment more effective for the growth and differentiation of stem cells than PLGA or PLLA, which is a conventional biomaterial.
  • the beta-glucan based support according to the present invention can be usefully used for tissue regeneration, cell culture, molding filler, biotissue void filler, molding prosthesis, molding correction, cell transplantation and drug delivery. .

Abstract

본 발명은 방사선 융합 기술을 이용한 생체조직공학용 베타-글루칸 기반 지지체 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 방사선 융합 기술을 이용한 생체조직공학용 베타-글루칸 기반 지지체의 제조방법은, 베타-글루칸 수용액을 캐스팅한 후 방사선을 조사하여 가교반응을 수행하여 겔 또는 고체 형태의 지지체를 형성함으로써, 세포부착을 용이하게 하고, 줄기세포의 성장 및 분화에 효과적인 생체모방형 환경을 용이하게 구현할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 베타-글루칸 기반 지지체는 조직 재생용, 세포 배양용, 성형용 충전제, 생체조직 빈공간용 충전제, 성형 보형물, 성형 보정물, 세포 이식용 및 약물전달용으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

방사선 융합 기술을 이용한 생체조직공학용 베타-글루칸 기반 지지체 및 이의 제조방법
본 발명은 방사선 융합 기술을 이용한 생체조직공학용 베타-글루칸 기반 지지체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
조직공학 기술이란 세포를 지지체에 배양하여 세포-지지체 복합체를 제조하고, 이를 이용하여 생체조직 및 장기를 재생하는 기술이다. 조직공학 기술의 기본적인 원리는 환자의 몸에서 필요한 조직을 채취하고 그 조직으로부터 세포를 분리한 다음 분리된 세포를 지지체에 배양하여 세포-지지체 복합체를 제조한 후 제조된 세포-지지체 복합체를 다시 인체 내에 이식하는 것이다. 조직공학 기술은 인공피부, 인공뼈, 인공연골, 인공각막, 인공혈관, 인공근육 등 인체의 거의 모든 장기의 재생에 적용되고 있다. 이와 같은 조직공학 기술에서 생체조직 및 장기의 재생을 최적화하기 위해서는 기본적으로 생체조직과 유사한 지지체를 제조하는 것이 가장 우선적이다. 따라서, 조직공학용 지지체의 기본적인 요건으로는 조직세포가 지지체에 유착하여 3차원적 구조를 가진 조직을 형성할 수 있는 틀의 역할을 충분히 해야 하며, 생체에 이식된 후 혈액응고나 염증반응이 일어나지 않는 무독성의 생체적합성 등이 있어야 한다. 즉, 조직공학용 지지체는 생체적합성 고분자로서 인체 내에서 주변조직과 친화성을 가지며 거부반응을 나타내지 않는 생접착성(bio-adhesive) 특성을 지녀야 한다. 생체적합성 고분자는 크게 천연 고분자와 합성 고분자, 또는 비분해성 고분자와 분해성 고분자로 나눌 수 있다. 천연 고분자로는 콜라겐, 알부민, 아미노산 등 단백질을 기초로 하는 고분자; 그리고 셀룰로오스, 아가로오스, 알기네이트, 헤파린, 히알루론산, 키토산 등과 같은 다당류 및 그 유도체가 포함된다.
손상된 피부 조직, 특히 심한 화상을 입은 피부 조직을 재생하기 위한 방법으로는, 1) 환자 자신의 피부를 이식하는 자가이식, 2) 다른 사람의 피부를 이식하는 동종이식, 및 3) 동물의 피부를 이식하는 이종이식의 세 가지 방법이 있다. 상기 방법들 중 자가이식이 가장 이상적이지만, 상처 부위가 광범위한 경우 조직을 확보할 수 있는 부위에 제한이 따르며, 피부 채취로 인한 또 다른 상처가 발생하는 단점이 존재한다. 동종이식의 경우, 영구적인 생착보다는 상처 주변부의 세포의 이동과 증식 및 치유를 돕는 지지체로서의 역할을 하며, 사체에서 채취한 표피를 이용하거나 사체 피부에서 면역반응을 제거한 후 사용하기도 하지만, 피부의 공급적인 문제가 존재한다. 이러한 문제를 해결하기 위하여, 생체적합성이 우수한 천연 고분자 또는 합성 고분자를 이용한 인공피부 재생용 지지체의 개발에 관하여 활발한 연구가 진행되고 있다.
현재 여러 가지 가교법을 이용하여 천연 고분자의 다양한 가교를 통해 생체재료를 개발하고자 하는 연구가 활발히 진행되고 있다. 그러나 일반 화학 첨가제에 의한 반응을 통해 생체재료를 생산할 경우 유해한 촉매가 사용되고, 특정 조건에서 반응이 일어나 부가적인 비용이 소요될 뿐만 아니라 소량이라고 할지라도 불순물이 최종 제품에 존재하게 되어 예측할 수 없는 부작용을 일으킬 소지가 많다.
이를 해결하기 위하여, 방사선 가교법을 이용하여 생체재료를 개발하려는 연구가 꾸준히 진행되어 왔다. 방사선 가교법은 유해한 화학 가교제나 개시제를 사용하지 않기 때문에 가교 후 인체에 유해한 잔류 가교제나 개시제를 제거할 필요가 없고, 가교와 멸균을 동시에 처리할 수 있는 장점이 있다. 또한 가교 과정에서 열을 가하지 않아도 되고, 냉각 상태에서도 가교가 가능한 특징이 있으며, 방사선 조사량만 조절하면 조성물을 변화시킬 필요 없이 물리적 특성을 자유롭게 조절할 수 있다.
한편, 베타-글루칸(β-1,6-분지-β-1,3-글루칸)은 칼로리가 거의 없으며, 1983년 미국 FDA에 의해 안전한 물질로 인정된 물질로서, 항암효과, 상처치유효과, 면역활성 증강효과, 콜라겐 합성 촉진효과, 세포재생효과, 수분보유력 증가효과와 같은 다양한 생리활성을 지니고 있다. 담자균류 유래 베타-글루칸은 수년간 많은 연구를 통해 그 안정성이 입증된 바 있다. 따라서, 베타-글루칸은 의약품, 화장품, 건강식품, 동물사료 첨가제 등 여러 분야에서 다양하게 개발되어 왔다. 그러나, 이러한 베타-글루칸의 생체적합성과 다양한 생리활성에도 불구하고, 베타-글루칸을 이용하여 생체조직공학용 지지체를 개발하거나 연구된 경우는 거의 전무한 상태이다.
따라서, 생체적합성과 다양한 생리활성이 있는 베타-글루칸을 인체에 적용 시 독성 문제가 발생되지 않을 것으로 생각되므로, 가교와 멸균을 동시에 처리할 수 있는 방사선 융합 기술을 통해 베타-글루칸을 생체조직공학용 지지체로서 개발하면 세포부착을 용이하게 하고, 줄기세포의 성장 및 분화에 효과적인 생체모방형 환경을 용이하게 구현할 수 있을 것으로 생각된다. 따라서, 생체조직공학용 베타-글루칸 기반 지지체의 개발의 필요성이 요구되고 있다.
본 발명자들은 생체조직공학용 베타-글루칸 기반 지지체를 개발하기 위하여 연구하던 중, 베타-글루칸 수용액을 페트리-디쉬 또는 평평한 판 위에 첨가하고 캐스팅한 후, 방사선을 조사하여 가교반응을 수행하여 겔 또는 고체 형태의 지지체를 형성한 다음, 상기 베타-글루칸 지지체에 인간 유래 간엽줄기세포를 배양한 후 골세포로의 분화 후 DNA 총 함량 및 ALP 활성이 TCPS 수준과 유사하게 나타나 기존의 나노섬유 지지체보다 골세포로의 분화도가 우수함을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 방사선 융합 기술을 이용한 생체조직공학용 베타-글루칸 기반 지지체 및 이의 제조방법을 제공하고자 한다.
도 1은 본 발명에 따른 방사선 융합 기술을 이용한 생체조직공학용 베타-글루칸 기반 지지체의 제조과정을 간략히 나타낸 모식도이다.
도 2는 도 1의 제조과정으로 제조된 생체조직공학용 베타-글루칸 기반 지지체를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명에 따른 베타-글루칸 기반 지지체에서 인간 간엽줄기세포를 2일간 증식시키고 14일간 분화한 후 DNA 총 함량을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 도 3의 DNA 총 함량 당 ALP 활성을 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명에 따른 베타-글루칸 기반 지지체, PLGA(poly lactic-co-glycolic acid), PLLA(poly lactic acid), TCPS에서 인간 간엽줄기세포를 2일간 증식시키고 14일간 분화한 후 ALP 활성을 측정한 도이다.
본 발명은
1) 분말 형태의 베타-글루칸을 증류수에 가하고, 30~100℃에서 30~200분 동안 용해하여 0.1~50 중량%의 베타-글루칸 수용액을 제조하는 단계,
2) 상기 제조된 베타-글루칸 수용액을 페트리-디쉬 또는 평평한 판 위에 첨가하고 캐스팅하는 단계,
3) 상기 캐스팅된 베타-글루칸 수용액에 방사선을 5~50kGy로 조사하여 가교반응을 수행하여 겔 또는 고체 형태의 지지체를 형성하는 단계를 포함하는, 방사선 융합 기술을 이용한 생체조직공학용 베타-글루칸 기반 지지체의 제조방법을 제공한다.
상기 베타-글루칸 기반 지지체의 제조방법은, 필요에 따라 3)단계 이후에 상기 가교된 반응체를 -50 ~ -100℃에서 급속 냉동하고 곧바로 해동과정을 거쳐 가교 반응체 내부에 공극생성을 유도하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 생체조직공학용 베타-글루칸 기반 지지체를 제공한다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명에 따른 방사선 융합 기술을 이용한 생체조직공학용 베타-글루칸 기반 지지체의 제조방법은, 베타-글루칸 수용액을 페트리-디쉬 또는 평평한 판 위에 첨가하고 캐스팅한 후 방사선을 조사하여 가교반응을 수행하여 겔 또는 고체 형태의 지지체를 형성하는 것을 특징으로 한다.
상기 베타-글루칸은 치마버섯, 영지버섯, 상황버섯, 차가버섯, 꽃송이버섯, 신령버섯, 잎새버섯, 표고버섯, 균핵균, 효모, 보리 및 귀리로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상으로부터 추출된 베타-글루칸이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명에서는 치마버섯에서 추출된 베타-글루칸인 시조필란(schizophyllan)을 사용하였다.
상기 베타-글루칸 수용액은 0.1~50 중량%, 바람직하게는 4~15 중량%, 가장 바람직하게는 8 중량%의 베타-글루칸 수용액을 사용하는 것이 좋다. 만일 베타-글루칸 수용액의 농도가 50 중량%를 초과하면 점성이 너무 강해져서 캐스팅 용기에 첨가할 수 없게되는 문제점이 생기고, 베타-글루칸 수용액의 농도가 0.1 중량% 미만이면 점성이 너무 약해져서 가교반응이 잘 안되는 문제점이 생긴다.
또한, 베타-글루칸 수용액의 캐스팅 양은 캐스팅 용기의 5~20% 부피, 바람직하게는 10% 부피로 첨가하는 것이 바람직하다. 캐스팅 용기는 다양한 크기의 페트리-디쉬 또는 평평한 판을 이용하는 것이 바람직하다.
상기 방사선은 전자선, 감마선 및 자외선으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종이 바람직하다. 상기 캐스팅된 베타-글루칸 수용액에 방사선을 5~50kGy, 바람직하게는 15~30kGy로 조사하여 가교반응을 수행하여 겔 또는 고체 형태의 지지체를 형성한다.
또한 필요에 따라, 상기 가교된 반응체를 -50 ~ -100℃에서 급속 냉동하고 곧바로 해동과정을 거쳐 가교 반응체 내부에 공극생성을 유도할 수 있다.
상기 방법으로 제조된 베타-글루칸 기반 지지체에 인간 유래 간엽줄기세포를 2일간 증식시키고 14일간 분화한 후 DNA 총 함량은 지지체 당 약 380ng이고, ALP 양은 약 0.7nmole/DNA/30분 이다. 일반적으로 TCPS에서 인간 유래 간엽줄기세포가 골세포로 분화한 후 DNA 총 함량은 지지체 당 약 500ng이고, 기존의 나노섬유 지지체를 이용한 분화실험 후 ALP 양은 약 0.5~0.6nmole이다. 따라서, 본 발명에 따른 베타-글루칸 기반 지지체는 정상적으로 세포가 자라고 있음을 알 수 있고, TCPS와 유사한 수준으로 세포독성이 거의 없는 것으로 판단되며, 기존의 나노섬유 지지체를 이용한 경우 보다 상대적으로 높은 분화능을 나타냄을 알 수 있다. 또한, 본 발명의 베타-글루칸 기반 지지체에서 자란 인간 간엽줄기세포의 ALP 활성치는 기존의 조직 재생에 사용되는 생체재료인 PLGA 또는 PLLA에서 자란 인간 간엽줄기세포의 ALP 활성치 보다 높게 나타남으로, 본 발명의 베타-글루칸 기반 지지체는 기존의 생체재료인 PLGA 또는 PLLA 보다 줄기세포의 성장 및 분화에 효과적인 생체모방형 환경을 제공할 수 있을 것으로 생각된다.
상기한 바와 같이, 본 발명에 따른 방사선 융합 기술을 이용한 생체조직공학용 베타-글루칸 기반 지지체의 제조방법은, 베타-글루칸 수용액을 캐스팅한 후 방사선을 조사하여 가교반응을 수행하여 겔 또는 고체 형태의 지지체를 형성함으로써, 세포부착을 용이하게 하고, 줄기세포의 성장 및 분화에 효과적인 생체모방형 환경을 용이하게 구현할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 베타-글루칸 기반 지지체는 조직 재생용, 세포 배양용, 세포 이식용 및 약물전달용으로 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 방사선 융합 기술을 이용한 생체조직공학용 베타-글루칸 기반 지지체의 제조
분말 형태의 치마버섯 유래 베타-글루칸[시조필란(schizophyllan)] 80g을 증류수 1000㎖에 가하고, 90℃에서 1시간 동안 용해하여 8 중량%의 베타-글루칸 수용액을 제조하였다. 상기 8 중량%의 베타-글루칸 수용액을 페트리-디쉬(90×15㎜) 위에 첨가하고 캐스팅하였다. 이때, 8 중량%의 베타-글루칸 수용액의 양은 캐스팅 용기의 10% 부피로 첨가하였다. 상기 캐스팅된 베타-글루칸 수용액에 감마선을 15~30kGy로 조사하여 가교반응을 수행하였다. 상기 가교된 반응체를 -80℃에서 급속 냉동하고 곧바로 해동과정을 거쳐 가교반응체 내부에 공극생성을 유도하여 겔 또는 고체 형태의 지지체를 형성하였다.
본 발명에 따른 방사선 융합 기술을 이용한 생체조직공학용 베타-글루칸 기반 지지체의 제조과정은 도 1에 나타내었으며, 도 1의 제조과정으로 제조된 생체조직공학용 베타-글루칸 기반 지지체는 도 2에 나타내었다.
실험예 1 : 본 발명의 베타-글루칸 기반 지지체의 인간 유래 간엽줄기세포 (hMSC)의 골세포 분화도 평가
본 발명에 따른 베타-글루칸 기반 지지체에서 인간 유래 간엽줄기세포로부터 골세포로의 분화도를 알아보기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
1. 인간 유래 간엽줄기세포의 DNA 총 함량 측정
상기 실시예 1에서 제조한 베타-글루칸 기반 지지체와 TCPS(tissue culture polystyrene)에 인간 유래 간엽줄기세포를 각각 1×105 농도로 접종하고, 완전성장배지[LG-DMEM(GIBCO) + 1% PS(GIBCO) + 10% FBS(GIBCO 16000)]에서 2일간 증식시키고 14일간 분화시켰다. 배양 후 PBS로 2번 세척하였다. 그 다음 지지체를 떼어내어 각각 EP-튜브에 담아 분석할 때까지 -70℃에서 보관하였다. 상기 지지체가 각각 담겨있는 EP-튜브에 RIPA 완충액[150mM NaCl, 1% 트리톤 X-100, 1% 데옥시콜레이트 나트륨(sodium deoxycholate), 0.1% SDS, 150mM 트리스(pH 7.2)] 300㎕를 넣고 가위로 잘게 부순 후, 얼음 위에서 균질화시켰다. 그 다음 지지체를 분리하고, DNA 양을 측정하였다.
결과는 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 베타-글루칸 기반 지지체에서 인간 간엽줄기세포가 골세포로 분화한 후 DNA 총 함량은 지지체 당 약 380ng 이었고, TCPS에서는 DNA 총 함량이 지지체 당 약 500ng 이었다. 따라서, 본 발명에 따른 베타-글루칸 기반 지지체는 정상적으로 세포가 자라고 있음을 알 수 있고, TCPS와 유사한 수준으로 세포독성이 거의 없는 것으로 판단된다.
2. 인간 유래 간엽줄기세포의 ALP 활성 측정
상기 실시예 1에서 제조한 베타-글루칸 기반 지지체, PLGA, PLLA, TCPS에 인간 유래 간엽줄기세포를 각각 1×105 농도로 접종하고, 완전성장배지[LG-DMEM (GIBCO) + 1% PS(GIBCO) + 10% FBS(GIBCO 16000)]에서 2일간 증식시키고 14일간 분화시켰다. 배양 후 PBS로 2번 세척하였다. 그 다음 지지체를 떼어내어 각각 EP-튜브에 담아 분석할 때까지 -70℃에서 보관하였다. 상기 지지체가 각각 담겨있는 EP-튜브에 RIPA 완충액[150mM NaCl, 1% 트리톤 X-100, 1% 데옥시콜레이트 나트륨 (sodium deoxycholate), 0.1% SDS, 150mM 트리스(pH 7.2)] 300㎕를 넣고 가위로 잘게 부순 후, 얼음 위에서 균질화시켰다. 그 다음 상등액(cell lysate) 10㎕를 96 웰 플레이트에 넣고 pNPP (alkaline phosphatase yellow) 액체 기질 200㎕를 첨가한 후, 37℃에서 30분 동안 방치하였다. 반응이 끝난 후, 각 웰에 50㎕의 3N NaOH를 첨가한 다음, 405㎚에서 흡광도를 측정하였다. TCPS에서의 ALP 활성값을 표준으로하여 비교하였다.
본 발명에 따른 베타-글루칸 기반 지지체에서 인간 간엽줄기세포를 2일간 증식시키고 14일간 분화한 후 측정한 DNA 총 함량 당 ALP 활성은 도 4에 나타내었으며, 본 발명에 따른 베타-글루칸 기반 지지체, PLGA, PLLA, TCPS에서 인간 간엽줄기세포를 2일간 증식시키고 14일간 분화한 후 ALP 활성을 측정한 결과는 도 5에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 베타-글루칸 기반 지지체에서 인간 간엽줄기세포가 골세포로 분화한 후의 ALP 양은 약 0.7nmole/DNA/30분 이었다. 따라서, 본 발명에 따른 베타-글루칸 기반 지지체는 기존의 나노섬유 지지체를 이용한 분화실험 결과(최대 수치 0.5~0.6nmole) 보다 상대적으로 높은 분화능을 나타냄을 알 수 있다. 상기 결과는 세포간 접촉 확률이 비교적 적은 환경에서의 결과이기 때문에 차후 더욱 더 높은 수준의 분화능을 기대할 수 있다.
또한 도 5에 나타난 바와 같이, 기존의 조직 재생에 사용되는 생체재료인 PLGA 또는 PLLA에서 자란 인간 간엽줄기세포의 ALP 활성치는 TCPS에 비해 약 20~25% 정도이고, 본 발명의 베타-글루칸 기반 지지체에서 자란 인간 간엽줄기세포의 ALP 활성치는 TCPS에 비해 약 70% 정도 수준이었다. 따라서, 본 발명의 베타-글루칸 기반 지지체가 기존의 생체재료인 PLGA 또는 PLLA 보다 줄기세포의 성장 및 분화에 효과적인 생체모방형 환경을 제공할 수 있을 것으로 생각된다.
본 발명에 따른 방사선 융합 기술을 이용한 생체조직공학용 베타-글루칸 기반 지지체의 제조방법은, 베타-글루칸 수용액을 캐스팅한 후 방사선을 조사하여 가교반응을 수행하여 겔 또는 고체 형태의 지지체를 형성함으로써, 세포부착을 용이하게 하고, 줄기세포의 성장 및 분화에 효과적인 생체모방형 환경을 용이하게 구현할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 베타-글루칸 기반 지지체는 조직 재생용, 세포 배양용, 성형용 충전제, 생체조직 빈공간용 충전제, 성형 보형물, 성형 보정물, 세포 이식용 및 약물전달용으로 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (8)

1) 분말 형태의 베타-글루칸을 증류수에 가하고, 30~100℃에서 30~200분 동안 용해하여 0.1~50 중량%의 베타-글루칸 수용액을 제조하는 단계,
2) 상기 제조된 베타-글루칸 수용액을 페트리-디쉬 또는 평평한 판 위에 첨가하고 캐스팅하는 단계,
3) 상기 캐스팅된 베타-글루칸 수용액에 방사선을 5~50kGy로 조사하여 가교반응을 수행하여 겔 또는 고체 형태의 지지체를 형성하는 단계를 포함하는, 방사선 융합 기술을 이용한 생체조직공학용 베타-글루칸 기반 지지체의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 베타-글루칸은 치마버섯, 영지버섯, 상황버섯, 차가버섯, 꽃송이버섯, 신령버섯, 잎새버섯, 표고버섯, 균핵균, 효모, 보리 및 귀리로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상으로부터 추출된 것임을 특징으로 하는, 방사선 융합 기술을 이용한 생체조직공학용 베타-글루칸 기반 지지체의 제조방법.
제 2항에 있어서, 상기 베타-글루칸은 치마버섯에서 추출된 시조필란 (schizophyllan)인 것을 특징으로 하는, 방사선 융합 기술을 이용한 생체조직공학용 베타-글루칸 기반 지지체의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 베타-글루칸 수용액은 0.1~50 중량%의 베타-글루칸 수용액인 것을 특징으로 하는, 방사선 융합 기술을 이용한 생체조직공학용 베타-글루칸 기반 지지체의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 2)단계에서 베타-글루칸 수용액의 캐스팅 양은 캐스팅 용기의 5~20% 부피인 것을 특징으로 하는, 방사선 융합 기술을 이용한 생체조직공학용 베타-글루칸 기반 지지체의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 3)단계에서 방사선은 전자선, 감마선 및 자외선으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종인 것을 특징으로 하는, 방사선 융합 기술을 이용한 생체조직공학용 베타-글루칸 기반 지지체의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 3)단계 이후에 가교된 반응체를 -50 ~ -100℃에서 급속 냉동하고 곧바로 해동과정을 거쳐 가교 반응체 내부에 공극생성을 유도하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 방사선 융합 기술을 이용한 생체조직공학용 베타-글루칸 기반 지지체의 제조방법.
제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 생체조직공학용 베타-글루칸 기반 지지체.
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