KR20240009374A - 섬유연골 유래 바이오잉크 조성물, 이를 포함하는 골이식재 조성물 및 이의 제조방법 - Google Patents

섬유연골 유래 바이오잉크 조성물, 이를 포함하는 골이식재 조성물 및 이의 제조방법 Download PDF

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윤희웅
노수진
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아주대학교산학협력단
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Abstract

본 발명은 섬유연골 유래 바이오잉크 조성물, 이를 포함하는 골 이식재 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 해부학적 위치에 따라 구획된 반월상 연골 조직의 내측 (inner), 중간측 (mid), 및 외측 (outer)이 각각 상이한 물리화학적 성질을 가짐을 확인하여, 각 구획된 조직 유래 세포외기질을 이용하여 상이한 물리화학적 특성을 가지는 3D 프린팅용 바이오잉크 조성물, 골 이식재를 제공하고, 이들은 목적하는 바에 따라 물리화학적 특성을 조절하여 활용될 수 있다.

Description

섬유연골 유래 바이오잉크 조성물, 이를 포함하는 골 이식재 조성물 및 이의 제조방법{FIBROCARTILAGE-DERIVED BIOINK COMPOSITION, BONE GRAFT COMPOSITION COMPRISING THE SAME, AND MANUFACTURING METHOD THEREOF}
본 발명은 복합조직 유래 성분을 포함하는 조직 분화 기술에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 섬유연골 유래 바이오잉크 조성물, 이를 포함하는 골 이식재 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
반월상 연골 (Meniscus)의 파열은 가장 흔한 정형외과 질환 중 하나로, 일반 중년층 인구의 약 20%의 유병률을 보인다. 반월상 연골의 파열은 무릎 통증, 기능 상실, 그리고 가장 중요한 무릎 관절의 골관절염의 가속화를 유발한다. 관절 연골 결손과 마찬가지로, 반월상 연골의 손상은 특히 조직의 내부 2/3에서 제한된 혈액 공급으로 인해, 자발적으로 치유되지 않는다. 수술, 부분 반월판 절제술, 및 동종 이식과 같은 현재의 외과적 치료는 반월상 연골의 기능을 완전히 복원하고 골 관절염을 예방하기에 부족하다. 이에 따라, 줄기세포, 생체재료 및 조직 공학 기술을 활용하여 반월상 연골 공학에 대한 관심과 임상적 필요성이 증가하고 있다.
반월상 연골 공학과 관련된 과제는 반월상 연골의 복잡한 형태와 기능적 요구에 기인할 수 있다. 반월상 연골은 주로 반월상 조직의 이방성 및 복합 특성에 의해 무릎 관절 내 압축력 뿐만 아니라 인장력 및 전단력으로 인한 응력에 저항한다. 하지만, 현재의 반월상 연골 공학 결과는 고유 반월상 연골의 생체 모방성 및 기능성을 달성하는 데 부족하며, 각 영역의 타고난 특성을 반영하는 복합조직을 재생산하는 데 어려움이 있다.
탈세포화 조직 유래 세포외기질 (extracellular matrix, ECM) 기반 생체 재료의 사용은 반월상 연골 공학에 대한 유망한 전략이 될 수 있다. 탈세포화된 ECM은 기증자 부위 조직의 생화학적 특성을 유지할 뿐만 아니라, 기증자 부위 조직을 향해 세포 행동을 안내하는 조직 특이적 요소를 제공함으로써 증식 및 분화와 같은 특정 세포 메커니즘을 조절할 수 있다. 반월상 연골과 관련하여, 탈세포화된 반월상 연골 세포외기질 (decellularized meniscus extracellular matrix, DMECM)의 생체 적합성과 재생 가능성 등 다양한 연구가 활발히 이루어지고 있으나, 여전히 DMECM의 정확한 구성과 각각의 특성은 불분명한 실정이다.
대한민국 공개특허 제10-2016-0121727호 (2016.10.20. 공개)
본 발명의 목적은 구획화된 생체 조직 유래 물질을 이용하여 물리화학적 특성이 상이한 복합조직을 형성할 수 있는 3D 프린팅용 바이오잉크 및 이의 제조방법을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 바이오잉크를 골 지지체에 가교시킨 골 이식재 및 이의 제조방법을 제공하는 데에 있다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 섬유연골 복합조직 유래 세포외기질을 포함하며, 상기 섬유연골 복합조직은 해부학적 위치에 따라 반월상 연골 조직의 내측 (inner), 중간측 (mid), 및 외측 (outer)으로 구획된 조직 중에서 선택되는 하나 이상으로, 상기 내측은 연골적 특성, 상기 외측은 섬유적 특성, 상기 중간측은 연골과 섬유적 특성이 전환되는 특성을 가져 구획된 조직에 따라 물리화학적 성질이 달라지는 것을 특징으로 하는, 3D 프린팅용 바이오잉크 조성물을 제공한다.
본 발명은 탈회골기질 지지체를 포함하며, 상기의 바이오잉크 조성물이 상기 지지체 내에 함유되어 가교된 것을 특징으로 하는, 골 이식재 조성물을 제공한다.
본 발명은 섬유연골 복합조직을 수득하여 분말화하는 단계; 상기 분말화된 조직을 탈세포화하여 세포외기질을 수득하고 분말화하는 단계; 및 상기 분말화된 세포외기질에 효소 처리하여 수용화하는 단계를 포함하며, 상기 섬유연골 복합조직은 해부학적 위치에 따라 반월상 연골 조직의 내측 (inner), 중간측 (mid), 및 외측 (outer)으로 구획된 조직 중에서 선택되는 하나 이상으로, 상기 내측은 연골적 특성, 상기 외측은 섬유적 특성, 상기 중간측은 연골과 섬유적 특성이 전환되는 특성을 가져 구획된 조직에 따라 물리화학적 성질이 달라지는 것을 특징으로 하는, 3D 프린팅용 바이오잉크의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 탈회골기질 지지체를 제조하는 단계; 상기의 제조방법에 따라 섬유연골 복합조직 유래 세포외기질을 포함하는 바이오잉크를 제조하는 단계; 및 상기 제조된 바이오잉크를 상기 제조된 탈회골기질 지지체에 주입하여 가교시키는 단계를 포함하는, 골 이식재의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기의 바이오잉크 조성물을 3차원 프린팅하는 단계를 포함하는, 인공조직의 제조방법 및 이에 따라 제조된 인공조직을 제공한다.
본 발명에 따른 바이오잉크 조성물은 해부학적 위치에 따라 구획된 반월상 연골 조직의 내측 (inner), 중간측 (mid), 및 외측 (outer)이 각각 상이한 물리화학적 성질을 가짐을 확인함으로써, 각 구획된 조직 유래 세포외기질을 이용하여 상이한 물리화학적 특성을 가지는 3D 프린팅용 바이오잉크 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 골 이식재 조성물은 탈회골기질 지지체에 상기의 바이오잉크를 가교시킴으로써, 각 구획에 따른 물리화학적 특성을 가진 골 이식재를 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 바이오잉크 조성물 및 골 이식재는 연골 조직, 섬유 조직, 혈관 신생, 항혈관 특성 등 구획별 상이한 특성을 가지는 바, 목적하는 바에 따라 물리화학적 특성을 조절하여 활용될 수 있다.
도 1(A)는 구획에 따른 반월상 연골 조직의 분석 및 전자현미경 이미지로, 내측 (inner), 중간측 (mid) 및 외측 (outer) 구획에 따라 반월상 연골 조직의 해부학적 차이를 확인할 수 있으며, 도 1(B)는 구획특이적 온도감응성 반월상 연골 유래 세포외기질 (Decellularized meniscus extracellular matrix, DMECM) 바이오잉크의 제조 공정 모식도이다.
도 2는 도 1에 따라 제조된 구획특이적 온도감응성 바이오잉크 (DMECM-bioink)의 생화학적 특성 분석 결과로, (A)는 dsDNA 함량, (B)는 콜라겐 함량, (C)는 황산화 글리코사미노글리칸 (sulfated glycosaminoglycan, sGAG), 및 (D)는 엘라스틴 함량을 나타내고, (E)는 SDS-PAGE 분석 결과, 및 (F)는 웨스턴 블롯 분석 결과이다.
도 3은 DMECM-bioink의 온도 변화에 따른 유동학적 특성을 분석한 것으로, (A)는 온도 변화에 따른 탄성률 (elastic modulus) 변화, (B)는 온도 변화에 따른 형태 변화, 및 (C)는 3D 프린팅 전후를 나타낸 것이다.
도 4는 DMECM-bioink의 세포에 미치는 영향을 확인한 것으로, (A) 세포 이동능, (B) 세포 부착능, (C) 세포 증식능, 및 (D) 세포 친화성을 분석한 것이다.
도 5는 DMECM-bioink가 인간 활막 유래 중간엽 줄기세포 (hMSC)의 분화에 미치는 영향을 확인한 것으로, (A) 제1형 콜라겐 (COL1), (B) 제2형 콜라겐 (COL2), (C) 아그레칸 (ACAN), 및 (D) SOX9의 발현 변화를 나타낸 것이다.
도 6은 DMECM-bioink의 체내 섬유연골 분화능을 평가한 것으로, (A)는 체내 형성된 인공 조직의 조직학적 평가를, 및 (b)는 체내 형성된 인공조직의 성분 함량을 확인한 것이다.
도 7은 DMECM-bioink의 혈관내피세포에 대한 체외 혈관신생 유도능을 평가한 것으로, (A-B)는 세포 이동능, (C-D) 세포 부착능, (E-F) 세포 증식능, 및 (G-I) 튜브 형성능을 분석한 것이다.
도 8은 탈회 골기질 (Demineralized bone matrix, DBM) 지지체의 제조 공정을 나타낸 모식도이다.
도 9는 DBM 지지체에 온도감응성 DMECM-bioink를 3D 프린팅하여 반월상 연골의 구획특이성이 모사된 인공 반월상 연골 지지체의 제조방법에 대한 모식도이다.
도 10(A)는 구획특이적 DMECM-bioink 프린팅 탑재에 따른 DBM 지지체의 외형 및 SEM 분석을 통한 내부 구조를 확인한 것이고, 도 10(B) 내지 (D)는 상기 DBM 지지체의 성분 함량을 분석한 것이다.
도 11은 DMECM-bioink가 탑재된 DBM 지지체의 가교 조건에 따른 물리화학적 특성을 분석한 것으로, (A) 및 (B)는 가교에 따른 압축 강도의 변화, (C)는 DMECM-bioink 농도에 따른 지지체의 다공도, (D)는 기공의 크기, (E)는 함수율, 및 (F)는 세포 접종효율을 나타낸 것이다.
도 12는 DBM 지지체의 치밀골 함유에 따른 물리학적 특성을 나타낸 것으로, (A)는 표면 구조, (B)는 압축강도 및 (C)는 인장강도를 비교한 것이다.
도 13은 각각 동일량의 5% Inner, Mid 및 Outer DMECM-bioink로 프린팅된 DBM 지지체의 압축강도에 대한 분석 결과이다.
도 14는 구획특이적 DMECM-DBM 지지체가 세포 행동 영향에 미치는 영향을 확인한 것으로, (A) 세포 이동능, (B) 세포 접종율, (C) 세포 증식능, 및 (D) 세포 친화성을 분석한 것이다.
도 15는 구획특이적 DMECM-DBM 지지체가 인간 활막 유래 중간엽 줄기세포 (hMSC)의 분화에 미치는 영향을 확인한 것으로, (A) 제1형 콜라겐 (COL1), (B) 제2형 콜라겐 (COL2), (C) 아그레칸 (ACAN), 및 (D) SOX9의 발현 변화를 나타낸 것이다.
도 16은 구획특이적 온도감응성 DMECM 바이오잉크가 탑재된 DBM 지지체의 체내 섬유연골 분화능을 평가한 것으로, (A)는 체내 형성된 인공 조직의 조직학적 평가를, 및 (b)는 체내 형성된 인공조직의 성분 함량을 확인한 것이다.
도 17은 구획특이적 온도감응성 DMECM 바이오잉크가 탑재된 DBM 지지체 제조 기술을 이용한 인공 반월상 연골 지지체의 제조 공정을 나타낸 모식도이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명하기로 한다.
본 발명자는 반월상 연골의 해부학적 위치에 따라 구획된 내측, 중간측 및 외측 조직이 각기 유의적으로 상이한 물리화학적 특성을 가짐을 발견하고, 상기 구획된 조직 유래 세포외기질을 바이오잉크 및 이를 포함하는 골 이식재로 제조하였을 때 목적하는 기계적 특성 및 생화학적 특성에 따라 조절하여 이용할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 섬유연골 복합조직 유래 세포외기질을 포함하는, 3차원 (3D) 프린팅용 바이오잉크 조성물을 제공한다.
본 명세서에서, "3D 프린팅" 또는 "3D 바이오 프린팅 (Three-Dimensional Printing)"이란, 조직과 비슷한 복잡성으로 해부학적 형태의 기질을 설계하여 정교하게 제어되는 3D 세포 모델 또는 조직 구조물을 생성할 수 있는 기술을 의미한다.
본 명세서에서, "바이오잉크 (Bio-ink)"란, 세포와 생체재료를 사용해 3차원의 인공조직 구조를 구현하는 3D 바이오 프린팅 기술에서 사용되는 것으로, 미세 3D 구조를 유지할 수 있는 물리화학적 특성과 살아있는 세포와 함께 사용할 수 있는 수준의 생물학적 안전에 관한 특성을 모두 가지고 있어야 한다.
바람직하게는, 상기 섬유연골 복합조직은 반월상 연골 (meniscus) 조직일 수 있고, 상기 반월상 연골 조직은 해부학적 위치에 따라 내측 (inner), 중간측 (mid), 및 외측 (outer)으로 구획된 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 돼지 반월상 연골 조직은 내부 쪽에서부터 2 - 3 mm 너비의 조직을 내측, 외부 쪽으로부터 4 - 6 mm 너비의 조직을 외측, 그리고 내측과 외측 사이 7 - 9 mm 너비를 갖는 중간 부위를 중간측으로 정의하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 반월상 연골 조직은 해부학적 위치 외에도 조직의 물성, 혈관의 침투 정도, 미세 구조의 차이, 생화학적 성분 함량의 차이, 세포의 분포 및 종류에 의한 차이에 따라 구획할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 반월상 연골 조직은 내측에서 외측으로 갈수록 연골적 특성에서 섬유적 특성을 가질 수 있고, 유의적인 차이의 생화학적 특성을 가질 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 내측은 연골적 특성, 상기 외측은 섬유적 특성, 상기 중간측은 연골과 섬유적 특성이 전환되는 특성을 가지는 바, 상기 구획된 조직 유래 세포외기질을 포함하는 바이오잉크 조성물은 구획된 조직에 따라 물리화학적 성질이 달라질 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 반월상 연골 조직의 내측 조직 유래 세포외기질을 포함하는 바이오잉크는 연골 유래 세포외기질의 대표적 마커인 제2형 콜라겐과 아그레칸의 발현이 중간측 및 외측과 비교하여 상대적으로 강하게 나타났으나, 중간측 및 외측 조직 유래 세포외기질을 포함하는 바이오잉크는 섬유 조직의 대표적 마커인 제1형 콜라겐의 발현이 내측에 비해 강하게 나타남을 확인할 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 실시예에 따르면, 상기 반월상 연골 조직의 내측 조직은 황산화 글리코사미노글리칸 (sulfated glycosaminoglycan, sGAG) 함량이 가장 높고, 중간측 조직은 총 콜라겐 함량이 높으며, 외측 조직은 엘라스틴 함량이 가장 높은 것을 확인할 수 있다.
즉, 목적하는 바에 따라 상기 구획된 조직을 다르게 선택하여 물리화학적 특성을 조절할 수 있는 바, 본 발명에 따른 바이오잉크 조성물은 내측 조직, 중간측 조직, 외측 조직 또는 이들의 조합에서 선택된 조직 유래 세포외기질을 포함하여 구획특이적 특성을 가질 수 있다.
본 발명에 따른 바이오잉크 조성물은 섬유연골 세포의 이동, 부착, 및 증식을 촉진할 수 있고, 체외 (in vitro) 또는 체내 (in vivo)에서 섬유연골 복합조직으로 분화되어 인공조직 형성을 유도할 수 있다.
더불어, 본 발명에 따른 바이오잉크 조성물은 혈관 신생 유도 또는 항혈관 특성을 가질 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 내측 또는 중간측 조직 유래 바이오잉크 조성물은 혈관내피세포의 세포 이동 및 세포 부착을 억제하는 등 항혈관 특성 (anti-angiogneic property)을 보임을 확인하였고, 외측 조직 유래 바이오잉크 조성물은 혈관내피세포에 대해 화주기성을 가지고, 세포 부착을 유의적으로 촉진하며, 모세혈관 네트워크와 유사한 망상구조로 세포 증식이 일어나, 혈관 신생 유도 특성 (pro-angiogneic property)을 가짐을 확인할 수 있다.
혈관 신생을 통한 영양분 공급 및 줄기세포의 이동 유도는 반월상 연골 재건에 매우 중요하다. 특히, 반월상 연골의 외측 부분과 인접하고 있는 활막(synovial membrane)은 풍부한 혈액, 영양분 및 줄기세포 공급원이 될 수 있으며, 상기 인접 부위에서 반월상 연골조직 내부로의 혈관 신생 유도는 전체 반월상 연골 조직 재생에 중요한 역할을 할 수 있는 바, 본 발명에 따른 바이오잉크 조성물은 이러한 특성에 부합할 수 있어, 바람직하다.
즉, 본 발명에 따른 바이오잉크 조성물은 구획별로, 섬유 조직, 연골 조직, 혈관 신생 유도 또는 항혈관 특성을 가지는 바, 이러한 구획별 특성을 이용하여 섬유연골 복합조직 재생에 유용할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 바이오잉크 조성물은 상온에서 액상으로 존재하다가 37℃ 이상의 온도, 바람직하게는 37℃ 내지 45℃ 온도에서 겔화되어 특정 모양을 유지할 수 있는 온도감응성을 가질 수 있다.
상술한 바와 같이, 3D 프린팅용 바이오잉크는 3D 프린터에서 압출될 수 있는 인쇄능, 프린팅 후에도 3D 구조를 유지할 수 있는 유변학적 특성 등의 물리화학적 특성을 가져야 하고, 세포의 생장 및 분화에 대한 지지체 (scaffold) 역할을 수행해야 하기 때문에 세포 친화성 및 생체 적합성을 가져야하며, 더불어 체외 배양 또는 체내 이식 환경에서 세포의 생장과 분화를 조절할 수 있는 특성을 가져야 하는 바, 본 발명에 따른 바이오잉크 조성물은 이러한 특성에 부합할 수 있어, 바람직하다.
본 발명은 탈회골기질 지지체를 포함하는 골 이식재 조성물을 제공한다.
본 명세서에서, "탈회골기질 (Demineralized bone matrix, DBM)"이란, 무기질이 제거된 동종골 이식재로, 이를 단독으로 이식하는 경우, 형태 유지가 어렵고 내구성 및 압축 강도가 충분하지 못한 문제가 있다.
상기 탈회골기질 지지체는 해면골, 치밀골 또는 이들의 조합으로 이루어진 것일 수 있고, 바람직하게는 해면골 및 치밀골을 모두 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 탈회골기질 지지체는 치밀골 및 해면골이 층상 구조로 결합된 형태일 수 있고, 상기 치밀골 및 해면골은 1 : (2 내지 5)의 평균 두께 비율로 결합될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 해면골만을 함유한 탈회골기질 지지체보다 해면골 및 치밀골을 모두 함유한 탈회골기질 지지체가 유의적으로 압축강도 및 인장강도가 증가함을 확인할 수 있다.
바람직하게는, 상기 골 이식재 조성물은 탈회골기질 지지체에 상기의 바이오잉크 조성물이 함유된 것일 수 있다.
상기 바이오잉크 조성물은 0.1 내지 10 질량-부피(w/v) 퍼센트 농도일 수 있고, 바람직하게는 2 내지 5 질량-부피(w/v) 퍼센트 농도일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 탈회골기질 지지체는 다공성 구조로 형성된 것일 수 있고, 상기 바이오잉크 조성물은 상기 지지체의 다공성 구조에 함유될 수 있고, 온도 변화에 따라 수화젤 상태로 가교된 것일 수 있다.
바람직하게는, 상기 탈회골기질 지지체에 상기 바이오잉크 조성물이 3D 프린팅된 것일 수 있다.
상기 바이오잉크 조성물은 반월상 연골 조직의 구획 조직에 따라 생화학적 특성이 상이하고 기계적 물성을 조절할 수 있는 바, 목적에 따라 구획 조직을 선택적으로 조절하여 상기 탈회골기질 지지체 내에 함유되고 가교될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 내측 조직 유래 바이오잉크 조성물은 다른 구획에 비해 우수한 압축 강도를 가지는 바, 이는 생체 역학적으로 물리적 압축 강도를 유지해야하는 조직 재생에서 선택적으로 사용될 수 있다.
또한, 상기 골 이식재 조성물은 3D 바이오 프린팅용으로 활용할 수 있고, 물리적 또는 화학적 가교를 통해 물리화학적 특성을 보다 향상시킬 수 있다.
본 발명은 섬유연골 복합조직 유래 세포외기질을 포함하는 3차원 (3D) 프린팅용 바이오잉크의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 바이오잉크의 제조방법은 섬유연골 복합조직을 수득하여 분말화하는 단계; 상기 분말화된 조직을 탈세포화하여 세포외기질을 수득하고 분말화하는 단계; 및 상기 분말화된 세포외기질에 효소 처리하여 수용화하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 섬유연골 복합조직을 수득하여 분말화하는 단계는, 반월상 연골 조직을 수득함으로써 수행될 수 있고, 바람직하게는 상기 반월상 연골 조직을 해부학적 위치에 따라 내측 (inner), 중간측 (mid), 및 외측 (outer) 으로 구획한 조직을 수득하여 분말화함으로써 수행될 수 있다.
상기 조직의 구획은 해부학적 위치 외에도 조직의 물성, 혈관의 침투 정도, 미세 구조의 차이, 생화학적 성분 함량의 차이, 세포의 분포 및 종류에 의한 차이에 따라 구획할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 분말화는 상기 수득한 각각의 조직 또는 이들의 혼합 조직을 증류수로 3회 이상 세척한 후, 동결 건조 및 동결 파쇄함으로써 수행될 수 있다.
상기 분말화된 조직을 탈세포화하여 세포외기질을 수득하고 분말화하는 단계에서, 탈세포화는 상기 조직에 존재하는 세포 및 유전물질을 제거하고 순수한 세포외기질을 수득하기 위한 과정으로, 먼저 분말화된 조직을 저장성 용액에 넣어 실온에서 3 내지 5 시간 처리한 후, 계면활성제 용액에 넣어 1 내지 3시간 처리함으로써 수행될 수 있다. 상기 계면활성제를 제거하기 위해 증류수로 세척한 후, 세포외기질에 존재하는 유전물질을 제거하기 위해 DNA 분해효소 용액으로 10 내지 15시간 처리하고 세척함으로써 탈세포화를 완료할 수 있다.
상기 분말화된 세포외기질에 효소 처리하여 수용화하는 단계는, 산성 용액에서 펩신 등의 효소 처리를 통해 분말화된 세포외기질을 수용화할 수 있고, 이를 다시 중성화한 후 완충용액으로 희석하여 생리학적 이온의 농도를 맞춤으로써 수행될 수 있다. 상기 수용화된 세포외기질은 0.1 내지 10 % (w/v)로 제조될 수 있고, 바람직하게는 2 내지 5 % (w/v)로 제조될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기의 제조방법에 따라 제조된 바이오잉크는 상온에서 액상으로 존재하다가 37℃ 이상의 온도에서 겔화되어 특정 모양을 유지할 수 있는 온도감응성을 가질 수 있다.
본 발명은 상기의 바이오잉크 조성물이 함유된 탈회골기질 지지체를 포함하는 골 이식재의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 골 이식재의 제조방법은, 탈회골기질 지지체를 제조하는 단계; 섬유연골 복합조직 유래 세포외기질을 포함하는 바이오잉크를 제조하는 단계; 및 상기 제조된 바이오잉크를 상기 제조된 탈회골기질 지지체에 주입하여 가교시키는 단계를 포함할 수 있다.
상기 탈회골기질 지지체를 제조하는 단계는 골-연골 복합조직을 수득하고 상기 복합조직에서 무기질을 제거하는 단계; 및 상기 무기질이 제거된 복합조직에서 연골 조직을 제거하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 무기질을 제거하는 단계는 산성 용액으로 처리하여 미네랄 또는 칼슘 등을 제거함으로써 수행될 수 있다.
상기 연골 조직을 제거한 후, 세포 및 이물질 제거를 위해 세척하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기의 방법에 따라 제조된 탈회골기질 지지체는 해면골, 치밀골 또는 이들의 조합으로 이루어진 것일 수 있고, 바람직하게는 해면골 및 치밀골을 모두 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 바이오잉크를 제조하는 단계는 상술한 3D 프린팅용 바이오잉크 제조방법에서 대신할 수 있다.
상기 제조된 바이오잉크를 상기 제조된 탈회골기질 지지체에 주입하여 가교시키는 단계는, 상기 바이오잉크가 탈회골기질 지지체 내부 다공성 구조로 주입된 후, 온도 변화에 따라, 바람직하게는 37℃ 이상의 온도에서 수화젤 상태로 가교됨으로써 수행될 수 있다. 또는 상기 바이오잉크를 상기 제조된 탈회골기질 지지체에 3D 프린팅함으로써 수행될 수 있다.
상기 골 이식재의 제조방법은 상기 탈회골기질 지지체 내부 다공성 구조에 가교된 바이오잉크를 하나 또는 둘 이상의 물리 또는 화학적 가교 방법으로 추가 가교시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 물리적 가교방법은 감마선을 조사함으로써 수행될 수 있고, 상기 화학적 가교방법은 글루타알데히드와 같은 가교제를 사용함으로써 수행될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 가교제의 농도가 증가함에 따라 또는 감마선의 조사선량이 증가함에 따라, 상기 바이오잉크가 가교된 탈회골기질 지지체의 압축 강도가 유의적으로 증가함을 확인할 수 있다.
더불어, 상기 탈회골기질 지지체 내부에 주입된 바이오잉크의 농도가 증가함에 따라, 상기 지지체의 압축 강도가 유의적으로 증가함을 확인할 수 있었으며, 다공도 (porosity) 와 기공의 크기 (pore size)는 감소하는 것으로 나타났다.
즉, 본 발명에 따른 제조방법으로 목적하는 바에 따라 기계적 물성, 다공성, 함수성 등 물리화학적 특성의 조절이 가능하며, 이러한 특성 조절에 따라 세포의 접종 효율 또한 조절 가능한 골 이식재를 제조할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기의 섬유연골 복합조직 유래 세포외기질을 포함하는 3D 프린팅용 바이오잉크 조성물을 3차원 프린팅하여 인공조직을 제조하는 방법을 제공한다.
보다 구체적으로, 상기 3차원 프린팅은 평균 직경이 300 내지 600 μm인 노즐을 이용하여, 80 kPa 미만의 공압 및 37℃ 온도에서 1 내지 2 mm/sec의 속도로 프린팅될 수 있다.
본 발명은 상기의 바이오잉크 조성물을 3차원 프린팅하여 수득한 인공조직을 제공한다.
상기의 인공조직은 상기의 섬유연골 복합조직의 특성을 가질 수 있다.
상기 인공조직은 인공 반월상 연골조직일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<실시예 1> 구획특이적 온도감응성 반월상 연골 유래 세포외기질 (Decellularized meniscus extracellular matrix, DMECM) 바이오잉크의 제조
돼지 반월상 연골 (Meniscus) 조직은 섬유-연골 복합 결합 조직으로서 내측 (inner), 중간측 (mid) 및 외측 (outer)의 조직 특성이 다르다 (도 1A).
도 1(B)를 참조하면, 구획특이적 온도감응성 반월상 연골 유래 세포외기질 (DMECM) 바이오잉크를 제조하기 위하여, 먼저 수술용 블레이드 및 톱을 사용하여 돼지의 무릎에서 반월상 연골 조직을 수확하였다. 이어서, 반월상 연골의 해부학적 특성을 기반으로, 반월상 연골 내측으로부터 2 - 3 mm 너비의 조직을 내측 영역 (inner zone), 외측으로부터 4 - 6 mm 너비의 조직을 외측 영역 (outer zone), 그리고 내측과 외측 영역 사이 7 - 9 mm 너비를 갖는 중간 부위를 중간측 영역 (mid zone)으로 정의하였다.
구획특이적 반월상 연골 조직은 증류수로 3회 세척한 뒤 동결 건조 및 동결 파쇄를 통해 분말 (powder) 형태로 수득하였다. 수득한 반월상 연골 조직 분말은 저장성 용액 (hypotonic solution)을 넣고 실온에서 4시간 처리한 후, SDS (sodium dodecyl sulfate)를 포함한 계면활성제 용액에 2시간 처리하여 탈세포를 진행하였다. 이후 SDS를 제거하기 위하여 증류수로 6회 세척하였다. 마지막으로 조직 세포외기질 분말에 존재하는 유전물질을 제거하기 위하여, DNA 분해효소 (DNAase)를 포함한 용액을 12시간 처리하였다. 이후 추가적으로 6회 증류수로 세척하여 탈세포 과정을 완료하였다. 이어서, 0.1M HCl 용액에서의 펩신 (pepsin) 처리를 통해 분말 형태의 세포외기질을 수용화시킨 후, NaOH로 pH를 중성화 시키고, 고농축 인산완충생리식염수 (phosphate buffered saline, PBS)를 적절하게 희석하여 생리학적 이온의 농도를 맞춰주었다.
최종적으로 제작된 반월상 연골 유래 세포외기질 바이오잉크 (DMECM-bioink)는 도 1(B)와 같이 상온 (25℃도 이하) 에서는 액체의 성질을 보이다가 37℃ 이상 45℃의 온도에서 겔 (gel)화 되는 온도감응성 수화젤의 특성을 보였다.
<실시예 2> 구획특이적 온도감응성 DMECM 바이오잉크의 생화학적 특성 분석
2-1. 구획특이적 DMECM-bioink의 dsDNA, 콜라겐, sGAG, 엘라스틴 함량 분석
Picogreen assay를 통하여 내측, 중간측 및 외측 DMECM-bioink의 dsDNA 함량을 분석하였다. 그 결과, 도 2(A)와 같이, 모든 바이오잉크에서 mg 당 50 ng 이하의 dsDNA 수치를 보였다. 이를 통해, 위 3 가지 조직에서 성공적으로 탈세포가 진행되었음을 확인할 수 있다.
도 2(B) 내지 도 2(D)는 구획특이적 DMECM-bioink의 토탈 콜라겐 (total collagen), 황산화 글리코사미노글리칸 (sulfated glycosaminoglycan, sGAG), 엘라스틴 (elastin)의 함량을 생화학적 분석 (biochemical analysis)을 통해 정량한 결과로, 이를 참조하면, 콜라겐 함량은 Inner 및 Outer 그룹에 비해 Mid 그룹에서 유의하게 높은 것으로 나타났다 (Mid: 935.02 ± 21.3 μg/mg, Inner: 821.01 ± 23.8 μg/mg, Outer: 786.05 ± 26 μg/mg). sGAG 함량은 Inner 그룹이 다른 그룹에 비해 sGAG 함량이 가장 높았으며, 다음으로 Mid 와 Outer 그룹 DMECM-bioink 순서로 sGAG 정량값이 감소하였다 (Inner: 33.4 ± 4 μg/mg, Mid: 20.9 ± 1.3 μg/mg, Outer: 15.9 ± 1.2 μg/mg). 엘라스틴 (elastin)의 경우, 내측 조직에서 외측 조직으로 갈수록 ?t량이 높아지는 양상을 확인할 수 있었다 (Inner: 19.1 ± 0.8 μg/mg, Mid: 24.2 ± 1.01 μg/mg, Outer: 27.7 ± 1.5 μg/mg).
2-2. 구획특이적 DMECM-bioink의 단백질 분석
구획별 DMECM-bioink의 단백질 카고 프로파일 (protein cargo profile)의 차이를 분석하기 위하여 SDS-PAGE 분석을 진행하였다. 그 결과, 도 2(E)에 나타난 바와 같이, inner 그룹의 콜라겐 사슬 밴드의 위치가 다른 그룹에 비해 높은 것으로 확인되었다.
이어서, 구획특이적 DMECM-bioink에 포함된 제1형 콜라겐, 제2형 콜라겐, 아그레칸 (aggrecan)의 상대적 발현 양상을 웨스턴 블롯 (western blot)을 통해 비교 분석한 결과, 도 2(F)에 나타난 바와 같이, Inner DMECM-bioink는 연골 유래 세포외기질의 대표적 마커 (marker)인 제2형 콜라겐과 아그레칸의 발현이 Mid 와 Outer DMECM-bioink에 비해 상대적으로 강하게 발현하는 것을 확인할 수 있다. 반면에 Mid 및 Outer DMECM-bioink의 경우, 섬유 조직의 대표적인 마커인 제1형 콜라겐의 발현이 Inner DMECM-bioink에 비해 강하게 나타났다.
이를 통해, 반월상 연골의 해부학적인 위치에 따라 분리된 Inner, Mid, 및 Outer 그룹의 DMECM-bioink는 생화학적 특성에 유의적인 차이를 보이는 것을 확인할 수 있다.
<실시예 3> 구획특이적 온도감응성 DMECM 바이오잉크의 단백질체학 특성 분석
하기 표 1은 구획특이적 온도감응성 DMECM 바이오잉크의 단백질체학 (proteomics) 분석 결과로, 각각 Inner, Mid, 및 Outer DMECM-bioink 내 존재하는 단백질의 상대적 발현량을 수치로 나타내었다.
상기 표 1을 참조하면, Proteomics를 통한 단백질 분석에서, 연골 세포외기질 (ECM)을 대표하는 제2형 콜라겐 (COL2A1), 아그레칸 (aggrecan, ACAN), 테나신 (tenascin, TNC), Cartilage intermediate layer protein 1 (CLIP) 등의 발현이 Inner DMECM-bioink에서 Mid 및 Outer DMECM-bioink에 비하여 우세하게 발현하고 있음을 확인할 수 있다.
반면, 제1형 콜라겐 (COL1A2), 비멘틴 (vimentin, VIM), 아넥신 A2 (annexin A2, ANXA2), 튜블린 알파 체인 (tubulin alpha chain, TUBA1C) 등의 단백질은 Inner DMECM-bioink에 비하여 Mid 및 Outer DMECM-bioink에서 우세한 발현을 보였다.
<실시예 4> 온도감응성 DMECM 바이오잉크의 3D 프린팅
온도감응성 DMECM-bioink의 온도 변화에 따른 유동학적 특성을 알아보기 위하여 전단 속도 (shear rate)를 1 s-1 로 유지하고 분석 기기의 온도를 4℃에서 45℃까지 변화를 주며 겔화 유동학을 측정하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 콜라겐이 풍부한 DMECM-bioink의 열적 겔화에 따라 20℃ 이상의 온도에서 DMECM-bioink의 탄성률 (elastic modulus)이 현저히 증가하는 것으로 확인되었다 (도 3A). DMECM-bioink는 온도감응성을 지니고 있어 상온에서는 원하는 양을 자유롭게 투여할 수 있으며, 37℃에서는 특정 모양을 유지하는 것으로 확인되었다 (도 3B).
온도감응성 DMECM-bioink를 3D 프린터에 활용하여 원하는 모양의 구조체를 제작하기 위하여 프린팅 조건을 다음과 같이 설정하였다. DMECM-bioink의 온도 감응성, 점도 및 프린팅 적합성 (printability)를 고려하여, 노즐 (nozzle)의 크기는 300 μm 내지 600 μm 이하, 80 Kpa 미만의 공압 (air pressure) 과 1 mm/sec의 프린팅 속도를 사용하고, 3D 프린터 하부 플레이트의 온도는 37℃로 설정하였다.
그 결과, 도 3(C)의 우측 그림과 같이 500 μm 크기의 미세한 십자 구조 (cross-shaped structure) 뿐 아니라 1 cm 이상의 크기가 큰 구조체 및 복잡한 연골 형상의 구조를 제작할 수 있음을 확인하였다.
<실시예 5> 구획특이적 온도감응성 DMECM 바이오잉크의 세포 친화성
구획특이적 온도감응성 DMECM-bioink가 세포 행동 영향에 미치는 차이를 평가하기 위하여 세포 증식 및 생존 이동 부착에 관한 분석을 수행하였다.
5-1. 구획특이적 온도감응성 DMECM-bioink의 섬유-연골 세포 이동능 분석
구획특이적 온도감응성 DMECM-bioink가 생화학적으로 화주기성 (chemotaxis)을 갖고 반월상 연골 유래 세포 (반월세포)의 이동을 촉진시킬 수 있는지를 확인하기 위해 보이든 챔버 분석 (Boyden chamber assay)을 수행하였다.
그 결과, 도 4(A)와 같이 모든 DMECM-bioink는 대조군 (세포 배양액 : 100%)에 비해 유의적으로 반월세포의 이동을 촉진하는 것을 확인할 수 있었다. 특히 Inner DMECM-bioink는 모든 그룹 중 가장 유의적으로 반월 세포에 대한 화주기성을 보였고, 이어서 Mid 와 Outer DMECM-bioink 순서로 나타났다.
5-2. 구획특이적 온도감응성 DMECM-bioink의 섬유-연골 세포 부착능 분석
세포 부착 평가를 위하여 5% DMECM-bioink를 배양접시에 분주하고 37℃에서 30분간 인큐베이션하여 배양접시 표면에 코팅하였다. 이어서 반월세포를 접종하고 2시간 후에 배양 접시를 PBS로 두 번 세척하여 바이오잉크 표면에 부착된 세포를 Calcein-AM으로 염색하여 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 4(B)와 같이, 모든 DMECM-bioink 처리군은 대조군 (배양접시 : 100%)에 비해 유의적으로 세포 부착을 촉진하였고, 특히 Inner DMECM-bioink 그룹에서 가장 높은 세포 부착율을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
5-3. 구획특이적 온도감응성 DMECM-bioink의 섬유-연골 세포 증식능 분석
반월세포에 대한 구획특이적 DMECM-bioink의 세포 증식능을 확인하기 위해서, 5% DMECM-bioink 200 μl 당 1×104의 반월세포를 현탁한 후 96 well plate에 접종하여 37℃에서 세포배양액과 함께 배양하고 1, 4, 7, 및 10일째 세포의 증식을 WST assay로 분석하였다.
그 결과, 도 4(C)와 같이 아무것도 처리하지 않은 대조군에 비하여 모든 그룹의 DMECM-bioink 처리군에서 세포 증식이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
더불어, 반월 세포에 대한 구획특이적 DMECM-bioink의 장기간 세포 친화성을 분석하기 위하여, 세포 배양 4주 후 LIVE & DEAD assay를 수행하였다.
그 결과, 도 4(D)와 같이 반월 세포의 사멸 없이 (Red) 바이오잉크 내부 및 표면에서 세포가 생존 (Green) 하고 있음을 확인할 수 있었다.
<실시예 6> 구획특이적 온도감응성 DMECM 바이오잉크의 체외 섬유연골 분화 유도 특성
구획특이적 DMECM-bioink 처리가 인간 활막 유래 중간엽 줄기세포 (hMSC)의 분화에 어떤 영향을 미치는지를 평가하기 위하여 RT-PCR 분석을 수행하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 연골 조직의 대표적인 마커로 알려져 있는 제2형 콜라겐 (COL2), 아그레칸 (ACAN) 및 SOX9의 발현이 Mid 및 Outer DMECM-bioink 그룹에 비해 Inner DMECM-bioink 처리 그룹에서 상대적으로 높게 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 반면에, 제1형 콜라겐 (COL1)의 발현은 Inner DMECM-bioink 그룹에서 가장 낮게 발현하였으며, Mid에서 Outer DMECM-bioink 순서로 높아지는 것을 확인할 수 있었다.
<실시예 7> 구획특이적 온도감응성 DMECM 바이오잉크의 체내 섬유연골 분화능 평가
7-1. 누드마우스 피하에서 형성된 인공조직의 조직학적 평가
체내 인공조직 형성능을 평가하기 위해 hMSC와 2% 구획특이적 DMECM-bioink를 현탁하여 1×106 /100 μl씩 누드마우스 피하에 주입하였다. 피하 주입 4주 후 누드마우스를 희생시켜 조직 형성 및 분화 정도를 평가하기 위하여 육안 관찰과 조직학 평가를 수행하였다.
그 결과, 도 6(A)에 나타난 바와 같이, 세포-구획별 DMECM-bioink를 주입한 위치에는 하나의 균질한 인공 조직이 형성되었음을 확인하였다. 또한, H&E 염색 결과, 세포질이 균질하게 형성되었으며 세포의 분포 또한 균질하게 이루어져 있음을 확인할 수 있었다. 더불어 세포외기질이 기원한 섬유-연골의 해부학적 위치와 유사한 사프라닌-O 염색 양상과 콜라겐의 타입의 발현양상이 인공조직에서도 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
7-2. 누드마우스 피하에서 형성된 인공조직의 성분 함량 확인
hMSC 및 구획특이적 DMECM-bioink 주입에 따라 체내에서 형성된 인공조직의 성분 함량을 확인하기 위해, 콜라겐과 sGAG의 분석을 수행하였다.
그 결과, 도 6(B)에 나타난 바와 같이, 콜라겐의 함량은 Outer DMECM-bioink 그룹에서 가장 높게 측정되었으며 Inner DMECM-bioink 그룹에서 가장 낮았다 (Inner: 225.8 ± 17.4 μg/mg, Mid: 280.8 ± 20.6 μg/mg, Outer: 300.8 ± 12.2 μg/mg).
반면, sGAG의 경우 Inner DMECM-bioink 그룹에서 가장 높은 수치를 보였고, Mid 와 Outer DMECM-bioink는 유의적인 차이를 나타내지 못했다 (Inner: 12.5 ± 1.94 μg/mg, Mid: 7.6 ± 1.2 μg/mg, Outer: 7.8 ± 0.9 μg/mg).
<실시예 8> 구획특이적 온도감응성 DMECM 바이오잉크의 체외 혈관 신생 유도 평가
구획특이적 DMECM-bioink가 신생혈관 생성 유도에 미치는 차이를 평가하기 위하여 혈관내피세포 (Human umbilical vein endothelial cells: HUVEC)의 이동, 부착, 증식 및 혈관 생성에 관한 분석을 수행하였다.
8-1. 구획특이적 DMECM-bioink의 혈관내피세포 이동능 분석
구획특이적 DMECM-bioink가 생화학적으로 화주기성 (chemotaxis)을 갖고 혈관내피세포(HUVEC)의 이동을 촉진 또는 억제 시킬 수 있는지를 확인하기 위해, 보이든 챔버 분석 (Boyden chamber assay)을 수행하였다.
그 결과, 도 7(A) 및 (B)에 나타난 바와 같이, Inner 및 Mid DMECM-bioink는 대조군 (10% FBS가 함유된 세포배양액: 100%)에 비해 유의적으로 혈관내피세포의 이동을 억제하는 것을 확인할 수 있다 (대조군 대비, Inner: 약 39.2% 감소, Mid: 약 26% 감소).
반면에, Outer DMECM-bioink는 모든 그룹 중 가장 유의적으로 혈관내피세포에 대한 화주기성을 보였다 (대조군 대비, Outer: 39.3% 증가).
8-2. 구획특이적 DMECM-bioink의 혈관내피세포 부착능 분석
세포 부착 평가를 위하여 5% DMECM-bioink를 배양접시에 분주하고 37℃에서 30분간 인큐베이션하여 배양접시 표면에 코팅하였다. 이어서 혈관내피세포를 접종하고 2시간 후에 배양 접시를 PBS로 두 번 세척하여 바이오잉크 표면에 부착된 세포를 Calcein-AM으로 염색하여 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 7(C) 및 (D)에 나타난 바와 같이, Inner 및 Mid DMECM-bioink 처리군은 대조군 (배양접시 : 100%)에 비해 유의적으로 세포 부착을 억제하였고, Outer DMECM-bioink는 혈관내피세포의 부착을 유의적으로 촉진하는 것을 확인할 수 있었다 (Inner: 53.8 ± 7.02%, Mid: 74.8 ± 7.9%, Outer : 137.3 ± 12.9%).
8-3. 구획특이적 온도감응성 DMECM-bioink의 혈관내피세포 증식능 분석
혈관내피세포에 대한 구획특이적 DMECM-bioink의 세포 증식능을 확인하기 위해서, 5% DMECM-bioink 200μl를 96 well plate에 코팅하여 37℃에서 인큐베이션 시킨 후 웰당 1×104의 혈관내피세포를 세포배양액과 함께 접종하여 1, 3 및 7일째 세포의 증식을 WST assay로 분석하고, 7일째 세포형태를 Calcein-AM으로 염색하였다.
그 결과, 도 7(E)에 나타난 바와 같이 아무것도 처치하지 않은 대조군과 Inner 및 Mid DMECM-bioink 처치군은 세포 배양접시 및 각 DMECM-bioink 표면에 원형 또는 타원형의 형태로 부착되어 배양되고 있음을 관찰할 수 있었다. 반면에 Outer DMECM-bioink 처치군의 혈관내피세포 형태는 다른 그룹에 비해 상대적으로 길죽하게 신장되어 있는 것을 특징으로 하며, 모세혈관 네트워크와 유사한 망상구조로 배열되어있음을 관찰할 수 있었다.
WST assay를 통한 세포증식 분석에서는, 도 7(F)에 나타난 바와 같이 대조군과 Outer DMECM-bioink 처치군은 배양기간에 따라 유의적으로 혈과내피세포의 증식이 관찰되었다. 반면에 Inner 및 Mid DMECM-bioink 처치군의 경우 초기 혈관내피세포에 대한 WST 흡광도가 배양기간 동안 유지되며 세포 증식의 유의적인 변화는 관찰되지 않았다.
8-4. 구획특이적 온도감응성 DMECM-bioink의 혈관내피세포의 체외 혈관신생 유도능 분석
혈관내피세포에 대한 구획특이적 DMECM-bioink의 체외 혈관신생 유도능을 확인하기 위해서, Matrigel 과 5% DMECM-bioink를 9:1의 비율로 현탁한 후 100μl씩 96 well plate에 코팅하여 37℃에서 인큐베이션 시켰다. 이후 웰당 4×104의 혈관내피세포를 세포배양액과 함께 접종하여 24시간 후 혈관내피세포의 튜브형성 (Tube formation)을 Calcein-AM으로 염색하여 현미경으로 관찰하였다. 체외에서 생성된 신생 혈관 네트워크는 이미지 분석 소프트웨어 (ImageJ)를 통해 신생된 혈관 튜브의 전체 길이 및 분기점 (Branch point)의 개수를 정략적으로 분석하여 신생혈관의 촉진 또는 억제 정도를 평가하였다.
그 결과, 도 7(G) 내지(I)에 나타난 바와 같이 Matrigel 만을 처치한 대조군에서 혈관 네트워크 구조와 유사한 튜브 구조가 형성되었음을 확인할 수 있었다. 한편, Outer DMECM-bioink 처치군의 경우 대조군에 비해 전체 튜브의 길이 및 분기점의 개수가 유의적으로 증가하였음을 확인할 수 있었다. 반면에, Inner 및 Mid DMECM-bioink의 경우 대조군에 비해 튜브의 구조가 제대로 형성되지 않았음을 관찰 할 수 있었으며 분기점 및 튜브의 길이가 대조군에 비해 유의적으로 감소되었음을 확인할 수 있었다.
따라서, Inner 와 Mid DMECM-bioink는 항혈관성 (anti-angiogenic) 특성을 보였고, Outer DMECM-bioink는 혈관성 (pro-angiogenic) 특성을 보이며, 상기 DMECM-bioink는 기원한 조직의 구획에 따라 목적하는 이식 부위의 혈관신생의 증진 또는 억제에 대한 조절 가능성을 확인하였다.
<실시예 9> 탈회 골기질 (DBM) 지지체의 제조
탈회 골기질 (Demineralized bone matrix, DBM) 조직은 사람을 포함하는 동물 조직으로부터 획득할 수 있으며, 바람직하게는 카데바, 인공관절 수술을 받은 환자 또는 돼지로부터 얻어진 골-연골 조직으로부터 분리될 수 있다. 얻어진 골-연골 조직은 미네랄 및 칼슘 제거를 위해서 5% 질산 (nitric acid) 용액으로 4℃에서 48시간 동안 처리되었다. 질산 용액은 24시간마다 교체하였다. 미네랄 및 칼슘 제거 후 수술용 블레이드를 이용하여 골-연골 조직으로부터 연골 조직 부분을 제거하였으며, 분리된 골 조직은 세포 제거 및 이물질 제거를 위해서 15% triton-x 100 용액으로 4℃에서 72시간 동안 세척하였다. Triton-x 100 용액은 24시간마다 교체하였다. 세척 후 잔존 Triton-x 100의 제거를 위하여 3차수로 24시간씩 2회, 48시간 교반하였다 (도 8).
탈미네랄화 및 탈세포가 완료된 DBM은 목적하는 형태와 크기에 맞게 재단 및 성형이 가능하다. 3차원 곡면의 DBM 지지체 (scaffold)를 제작할 경우, 습윤 상태의 DBM을 곡면 몰드에 고정한 후 동결건조 시켜 원하는 형태로 형상 제작이 가능하다.
또한, 상기 골기질은 해면골 (spongy bone)과 치밀골 (compact bone)이 결합되어 있는 구조인데, 해면골은 다공도가 높고 인장강도 및 신축성이 우수하여 지지체의 성형에 용이하고, 치밀골의 경우 상대적으로 다공성이 낮고 단단하여 물리적 강도가 좋다. 목적하는 지지체의 용도에 따라 해면골만 선택적으로 사용하거나 해면골과 치밀골 모두 사용할 수도 있다.
<실시예 10> 구획특이적 온도감응성 DMECM 바이오잉크가 탑재된 탈회 골기질 (DBM) 지지체의 제조
도 9를 참조하면, DBM 지지체 표면에 3D 프린팅된 DMECM-bioink는 DBM 지지체의 다공 구조 내부로 스며든 후 37℃로 설정된 하부 온도 조절 장치에 의해 수화젤 상태로 가교된다. 상기 바이오 프린팅에 사용되는 DMECM-bioink의 농도는 0.1 내지 10 % (w/v)가 사용되거나, 더욱 바람직하게는 2 내지 5 % 일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 상기 바이오 프린팅에 사용되는 DBM은 해면골 또는 치밀골 층을 포함하는 해면골일 수 있다. 상기 37℃ 이상의 온도에서 DBM 지지체 내부 다공 구조에 가교된 DMECM-bioink는 추가적인 물리 또는 화학적 가교 방법을 통해 지지체의 물리화학적 특성을 향상시킬 수 있다.
<실시예 11> 구획특이적 온도감응성 DMECM 바이오잉크가 탑재된 DBM 지지체의 미세구조 및 생화학적 특성
구획특이적 DMECM-bioink 프린팅 탑재에 따른 DBM 지지체의 구조를 분석하기 위해, DBM-DMECM 지지체는 직경 5 mm, 높이 2 mm로 제작된 원통형 DBM 지지체에 각 구획특이적 DMECM-bioink를 5 % (w/v)로 제조하여 프린팅하는 조건으로 제작하였다.
이미지 분석 결과, 도 10(A)에 나타난 바와 같이, 상기 공정기술에 의해 효과적으로 DBM 지지체의 다공성 구조에 구획특이적 DMECM-bioink가 탑재되어 있음을 확인하였다.
구획특이적 DMECM-bioink가 탑재된 DBM 지지체의 성분 함량의 차이를 분석하기 위하여 콜라겐, 황산화 글리코사미노글리칸, 및 엘라스틴의 함량 분석을 진행하였다. 콜라겐은 S1000 (Biocolor, UK), sGAG는 B1000 (Biocolor, UK), 엘라스틴은 Fastin assay (Biocolor, UK)를 이용하여 측정되었다.
그 결과, 도 10(B)에 나타난 바와 같이, 콜라겐의 경우 Mid DMECM-bioink를 탑재했을 때 가장 높은 비중을 보였고, sGAG는 Inner DMECM-bioink를 탑재했을 때 가장 높은 비중을 차지하였으며, 엘라스틴은 Outer DMECM-bioink를 탑재했을 때 가장 높은 비중을 나타내는 것을 확인함으로써, 선택하는 구획특이적 DMECM-bioink의 종류에 따라 최종 제작된 DBM 지지체의 생화학적 조성을 조절할 수 있음을 확인할 수 있었다.
<실시예 12> 구획특이적 온도감응성 DMECM 바이오잉크가 탑재된 DBM 지지체의 가교 조건에 따른 물리화학적 특성
본 발명의 일 실시예에 따라 제작한 구획특이적 DMECM-bioink가 프린팅 탑재된 DBM 지지체는 추가적인 물리 또는 화학적 가교방법을 통해 물리화학적 특성을 향상시킬 수 있다. 대표적인 물리적 가교방법으로서, 감마선 또는 전자선과 같은 이온화에너지의 조사가 있을 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 화학적 가교방법으로는 글루타알데하이드 또는 EDC/NHS 가 주요하게 사용될 수 있으나 이에 국한되지는 않는다.
본 실시예에서는 화학적 가교방법의 대표적인 예시로 글루타알데히드를 사용하여 상기에서 제작한 DMECM-DBM 지지체를 추가 가교하였다. 가교방법은 0.01 내지 1 % (w/v) 글루타알데히드 용액에 상기 DMECM-DBM 지지체를 첨가한 후 실온에서 약 1시간 동안 100 rpm으로 교반하였다. 화학 가교된 DMECM-DBM 지지체는 PBS 용액으로 30분씩 3회 반복하여 세척한 후 이어서 3차 증류수로 3회 반복하여 세척하였다.
한편, 물리적 가교방법의 대표적인 예시로 감마선 조사 방법을 사용하여 상기에서 제작한 DMECM-DBM 지지체를 추가 가교하였다. 가교방법은 상기 프린팅이 완료된 습윤 상태의 DMECM-DBM 지지체를 EP tube에 넣고 은박으로 포장한 뒤 각각 10, 25, 및 50 kGy의 강도로 감마선 조사를 시행하였다. 추가적인 가교 공정에 따른 DMECM-DBM 지지체의 물리화학적 특성의 변화를 분석하기 위해 만능 물성측정기를 통해 압축강도를 분석하였다. 분석 결과, 도 11(A)에 나타난 바와 같이, 가교제의 농도 및 감마선 조사 선량의 증가에 따라 압축강도가 유의적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
다음으로, 프린팅된 DMECM-bioink의 농도에 따라 DBM-지지체의 기계적 물성에 변화를 관찰하였다. 도 11(B)를 참조하면, 글루타알데히드 및 감마선 조사 가교방법 모두에서 DMECM-bioink의 농도가 증가할수록 DBM 지지체의 압축강도가 유의적으로 증가하는 것을 확인할 수 있다.
이어서, DMECM-bioink의 농도에 따라 DBM-지지체의 다공도와 다공의 크기 변화를 분석한 결과, 도 11(C) 및 (D)에 나타난 바와 같이, DMECM-bioink의 농도가 높아짐에 따라 다공도와 다공의 크기가 감소하는 것을 관찰할 수 있다. 따라서, 상기 제작 기술은 목적하는 기계적 물성 및 다공 특성에 따라 DBM 지지체 제작 조절이 가능함을 확인하였다.
구체적으로, 1, 2, 및 5 % (w/v)로 제조된 바이오잉크가 탈회골 지지체에 주입되었을 때, 다공도는 각각 93.7 ± 2.07 %, 90.1 ± 2.1 %, 84.6 ± 5.7 % 이며, 기공의 평균 직경은 각각 약 295.1 ± 97.7 μm, 약 137.9 ± 27.6 μm, 및 약 111.2 ± 18.5 μm 로 나타났다.
상기 다공도 및 기공의 크기는 지지체의 함수율 (Swelling ratio)과 세포의 접종 효율 (Cell seeding ratio)에 영향을 주는 것으로 나타났다 (도 11E 및 F).
구체적으로, 1, 2, 및 5 % (w/v)으로 제조된 바이오잉크가 탈회골 지지체에 주입되었을 때, 함수율은 각각 437.17 ± 65.8, 362.4 ± 59.7, 247.5 ± 44.1 이며, 지지체의 세포 접종 효율은 각각 약 74.9 ± 6.6, 86.3 ± 8.3, 80.9 ± 7.4 로 나타났다.
<실시예 13> DBM 지지체의 치밀골 함유에 따른 생체역학적 특성
본 발명의 일 실시예에 따른 DBM 지지체는 해면골 (spongy bone) 또는 치밀골 (compact bone)이 포함된 해면골을 사용할 수 있다. 해면골은 뼈의 중심부 또는 편평골 (Flat bone)에서 관찰되고, 치밀골에 비해 상대적으로 높은 다공성과 넓은 다공 크기를 갖으며, 신축성 및 복원력이 우수하여 생체 지지체로서 가공 및 성형에 용이하다. 반면에 치밀골은 해면골의 주위 표면에서 관찰되며 해면골보다 더 조밀해서 기계적으로 더 강하다. 상기에서 제작된 DMECM-DBM 지지체는 해면골 및 해면골 + 치밀골로 구성된 DBM에 모두 적용이 가능하다.
도 12를 참조하면, DBM 지지체의 구조에 따른 물리적인 특성의 차이를 확인할 수 있다. 치밀골과 해면골을 1:3의 비율로 함유한 DBM 지지체는 해면골만을 함유하는 DBM 지지체에 비해 유의적으로 압축강도 및 인장강도가 증가하였다 (도 12B 및 12C).
따라서, 본 발명에 따른 제작기술은 목적하는 기계적 물성 및 다공 특성에 따라 DBM의 해면골 또는 치밀골층의 유무를 선택적으로 사용하여 DMECM-DBM 지지체 제작 조절이 가능함을 확인할 수 있다.
<실시예 14> 구획특이적 온도감응성 DMECM 바이오잉크가 탑재된 DBM 지지체의 생체역학적 특성
본 발명의 일 실시예에 따른 DMECM-DBM 지지체는 구획특이적 DMECM-bioink의 종류에 따라 물리적 강도의 특성 조절이 가능하다.
도 13을 참조하면, 모든 DMECM-bioink 처리 그룹은 DBM only 지지체에 비해 압축강도가 증가하였으며, 특히 Inner DMECM-bioink를 탑재한 DBM 지지체는 모든 그룹 중 가장 우수한 압축강도를 보였다.
따라서, 본 발명에 따른 제작기술은 목적하는 기계적 물성에 따라 DMECM-bioink를 선택적으로 사용하여 DMECM-DBM 지지체 제작 조절이 가능함을 확인할 수 있다.
<실시예 15> 구획특이적 온도감응성 DMECM 바이오잉크가 탑재된 DBM 지지체의 세포 친화성
구획특이적 DMECM-DBM 지지체가 세포 행동 영향에 미치는 차이를 평가하기 위하여 세포 증식 및 생존 이동에 관한 분석을 수행하였다.
15-1. 구획특이적 DMECM-DBM 지지체의 섬유-연골 세포 이동능 분석
구획특이적 DMECM-DBM 지지체가 생화학적으로 화주기성 (chemotaxis)을 갖고 반월상 연골 유래 세포 (반월세포)의 이동을 촉진시킬 수 있는지를 확인하기 위해, 보이든 챔버 분석 (Boyden chamber assay)을 수행하였다.
그 결과, 도 14(A)에 나타난 바와 같이, 모든 DMECM-DBM 지지체는 대조군 (세포 배양액 : 100%)에 비해 유의적으로 반월세포의 이동을 촉진하는 것을 확인할 수 있다. 특히 Inner DMECM-DBM 지지체는 모든 그룹 중 가장 유의적으로 반월세포에 대한 화주기성을 보였고, 이어서 Mid 와 Outer DMECM-DBM 지지체 순서로 나타났다.
15-2. 구획특이적 DMECM-DBM 지지체의 섬유-연골 세포 접종율 분석
구획특이적 DMECM-DBM 지지체의 세포 부착 효율을 평가하기 위하여 세포 접종 효율 (seeding rate)을 분석하였다.
DMECM-DBM 지지체에에 1×106 세포를 접종한 후 배양접시 위에서 37℃에서 2시간 동안 배양한 후, 지지체 내부로 부착되지 못하고 배양접시로 빠져나온 세포의 수를 카운팅하여 전체세포 중 지지체에 부착된 세포의 수를 계산하였다.
그 결과, 도 14(B)에 나타난 바와 같이, 모든 DMECM-DBM 지지체 처리군은 대조군 (DBM only scaffold)에 비해 유의적으로 세포 부착을 촉진하였고, 특히 Inner DMECM-DBM 지지체 그룹에서 가장 높은 세포 접종율을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
15-3. 구획특이적 온도감응성 DMECM-bioink의 섬유-연골 세포 증식능 분석
반월세포에 대한 구획특이적 DMECM-DBM 지지체의 세포 증식능을 확인하기 위해서, 지지체당 1×106의 반월세포를 접종한 후 37℃에서 세포배양액과 함께 배양하고 1, 3, 7일째 세포의 증식을 WST assay로 분석하였다.
그 결과, 도 14(C)에 나타난 바와 같이 DBM only 그룹에 비하여 모든 그룹의 DMECM-DBM 지지체 그룹에서 세포 증식이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 특히 Outer DMECM-DBM 지지체 그룹은 모든 그룹 중 가장 유의적으로 세포 증식을 증가시키는 것을 관찰할 수 있었다.
더불어, 반월 세포에 대한 구획특이적 DMECM-DBM 지지체의 장기간 세포친화성을 분석하기 위하여, 세포 배양 4주 후 LIVE & DEAD assay를 수행하였다.
그 결과, 도 14(D)에 나타난 바와 같이 반월 세포의 사멸 없이 (Red) DBM scaffold 다공 내부에서 세포가 생존 (Green) 하고 있음을 확인할 수 있었다.
<실시예 16> 구획특이적 온도감응성 DMECM 바이오잉크가 탑재된 DBM 지지체의 체외 섬유연골 분화 유도 특성
구획특이적 DMECM-DBM scaffold 내 배양에 따른 인간 활막 유래 중간엽 줄기세포 (hMSC)의 분화에 어떤 영향을 미치는지를 평가하기 위하여 RT-PCR 분석을 수행하였다.
그 결과, 도 15에 나타난 바와 같이, 모든 그룹의 구획특이적 DMECM-DBM 지지체는 DBM only 지지체 그룹에 비해 유의적으로 연골 및 섬유분화 마커 유전자발현을 증가시키는 것을 관찰하였다. 특히 Inner DMECM-DBM 지지체는 연골 분화 마커인 제2형 콜라겐 (COL2), 아그레칸 (ACAN) 및 SOX9의 유전자 발현을 유의적으로 향상시키는 것을 확인할 수 있었다.
한편, 섬유 분화 마커인 제1형 콜라겐 (COL1)의 경우, Outer DMECM-DBM 지지체에서 가장 높은 유전자 발현이 관찰되었다. Mid DMECM-DBM 지지체의 경우, 섬유 및 연골 분화 마커 유전자의 발현 레벨이 Inner 와 Outer DMECM-DBM 지지체의 중간 수준으로 관찰되었다.
<실시예 17> 구획특이적 온도감응성 DMECM 바이오잉크가 탑재된 DBM 지지체의 체내 섬유연골 분화능 평가
17-1. 누드마우스 피하에 이식된 구획특이적 DMECM-DBM 지지체의 조직학적 평가
체내 인공조직 형성능을 평가하기 위해 hMSC를 구획특이적 DMECM-DBM 지지체에 접종하여 누드마우스 피하에 주입하였다 (1×106 /지지체). 피하 이식 4주 후 누드마우스를 희생시켜 조직 형성 및 분화 정도를 평가하기 위하여 Alcian blue 염색을 통한 조직학 평가를 수행하였다.
그 결과, 도 16(A)에 나타난 바와 같이, DBM 지지체 다공구조 내부에 세포질이 균질하게 형성되었으며 세포의 분포 또한 균질하게 이루어져 있음을 확인할 수 있었다. 특히, Inner DMECM-DBM 지지체 그룹에서 가장 강한 sGAG의 발현이 관찰됨에 따라 연골조직으로 분화된 것으로 판단된다.
17-2. 누드마우스 피하에 이식된 구획특이적 DMECM-DBM 지지체의 성분 함량 확인
hMSC 및 구획특이적 DMECM-DBM 지지체 이식에 따라 체내에서 형성된 인공조직의 성분 함량을 확인하기 위해, 콜라겐과 sGAG의 분석을 수행하였다.
그 결과, 도 16(B) 및 (C)와 같이 모든 DMECM-DBM 지지체 그룹은 DBM only 지지체에 비하여 콜라겐 및 sGAG 함량을 유의적으로 향상시켰음을 확인할 수 있었다. 콜라겐 함량은 Inner 그룹에 비해 Mid 와 Outer DMECM-DBM scaffold 그룹에서 높았다 (DBM only: 9.5 ± 2.7, Inner: 46.9 ± 9.3, Mid: 55.5 ± 12.5, Outer: 55.4 ± 8.3 μg/mg).
한편 sGAG의 경우, Inner 그룹이 가장 높은 sGAG 함량을 보였으며, 이어서 Mid 와 Outer 그룹 순서로 나타났다 (DBM only: 4.5 ± 1.8, Inner: 30.6 ± 5.8, Mid: 27.6 ± 4.6, Outer: 18.9 ± 3.9 μg//mg).
따라서, Inner DMECM-DBM 지지체는 연골성 조직 분화 특성을 보였고, Outer DMECM-DBM 지지체는 섬유성 조직의 분화 특성을 보였으며, Mid DMECM-DBM 지지체는 상기 두 가지 지지체의 섬유-연골 중간의 분화능을 나타내는 것으로 판단된다.
<실시예 18> 구획특이적 온도감응성 DMECM 바이오잉크가 탑재된 DBM 지지체 제조 기술을 이용한 인공 반월상 연골 지지체의 제조
상기 다공성 DBM 지지체 내부로의 온도감응성 DMECM-bioink 프린팅 기술은 반월상 연골의 구획특이성 모사를 가능하게 한다. 본 발명에서는 3가지 다른 형광염료를 각각 Inner (Blue), Mid (Red), Outer (Green) DMECM-bioink에 결합시킨 후, 반월상 연골 형태로 제작된 DBM 지지체 위에 3D 프린팅하고 형광 이미징 분석과 내부 미세구조를 분석을 수행하였다.
그 결과, 도 17에 나타난 바와 같이, 반월상 연골 형태의 DBM 지지체 내부에 구획특이적 DMECM-bioink가 잘 탑재되어 있음을 확인할 수 있었다.
종합적으로, 구획특이적 반월상 연골 유래 바이오잉크가 탑재된 DBM 지지체는 DBM 지지체의 구조 그리고 DMECM-bioink의 종류, 농도, 추가적인 가교 공정에 따라 물리화학적 특성의 조절이 가능하다. DMECM-DBM 지지체는 세포를 끌어들이는 화학유인물질 (Chemoattractant)로써 작용할 수 있을 뿐만 아니라, 세포의 부착 및 증식을 촉진하며, 구획특이적으로 섬유-연골 조직으로의 분화를 유도할 수 있음을 확인할 수 있었다. 상기 기술은 반월상 연골 조직이 보이는 구획특이적 생화학적 특성뿐 만 아니라 섬유-연골 분화 특이성을 모사할 수 있으며 반월상 연골을 포함하는 다양한 섬유-연골 조직 재건에 활용이 가능함을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 즉, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다.

Claims (20)

  1. 섬유연골 복합조직 유래 세포외기질을 포함하며,
    상기 섬유연골 복합조직은 해부학적 위치에 따라 반월상 연골 조직의 내측 (inner), 중간측 (mid), 및 외측 (outer)으로 구획된 조직 중에서 선택되는 하나 이상으로, 상기 내측은 연골적 특성, 상기 외측은 섬유적 특성, 상기 중간측은 연골과 섬유적 특성이 전환되는 특성을 가져 구획된 조직에 따라 물리화학적 성질이 달라지는 것을 특징으로 하는, 3D 프린팅용 바이오잉크 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 조성물은,
    섬유연골 세포의 이동, 부착, 및 증식을 촉진하는 것을 특징으로 하는, 3D 프린팅용 바이오잉크 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 조성물은,
    체외 (in vitro) 또는 체내 (in vivo)에서 섬유연골 복합조직으로 분화되어 인공조직 형성을 유도하는 것을 특징으로 하는, 3D 프린팅용 바이오잉크 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 외측으로 구획된 조직 유래 세포외기질을 포함하는 바이오잉크 조성물은,
    혈관 신생을 유도하는 것을 특징으로 하는, 3D 프린팅용 바이오잉크 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 내측 또는 중간측으로 구획된 조직 유래 세포외기질을 포함하는 바이오잉크 조성물은,
    혈관 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는, 3D 프린팅용 바이오잉크 조성물.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 조성물은,
    상온에서 액상으로 존재하다가 37℃ 이상의 온도에서 겔화되는 것을 특징으로 하는, 3D 프린팅용 바이오잉크 조성물.
  7. 탈회골기질 지지체를 포함하며,
    제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 바이오잉크 조성물이 상기 지지체 내에 함유되어 가교된 것을 특징으로 하는, 골 이식재 조성물.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 바이오잉크 조성물은,
    0.1 내지 10 질량-부피(w/v) 퍼센트 농도인 것을 특징으로 하는, 골 이식재 조성물.
  9. 제 7 항에 있어서,
    상기 탈회골기질 지지체는,
    해면골, 치밀골 또는 이들의 조합으로 이루어진 것을 특징으로 하는, 골 이식재 조성물.
  10. 섬유연골 복합조직을 수득하여 분말화하는 단계;
    상기 분말화된 조직을 탈세포화하여 세포외기질을 수득하고 분말화하는 단계; 및
    상기 분말화된 세포외기질에 효소 처리하여 수용화하는 단계를 포함하며,
    상기 섬유연골 복합조직은 해부학적 위치에 따라 반월상 연골 조직의 내측 (inner), 중간측 (mid), 및 외측 (outer)으로 구획된 조직 중에서 선택되는 하나 이상으로, 상기 내측은 연골적 특성, 상기 외측은 섬유적 특성, 상기 중간측은 연골과 섬유적 특성이 전환되는 특성을 가져 구획된 조직에 따라 물리화학적 성질이 달라지는 것을 특징으로 하는, 3D 프린팅용 바이오잉크의 제조방법.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 분말화된 세포외기질에 효소 처리하여 수용화하는 단계는,
    산성 용액에서 상기 세포외기질을 펩신 효소 처리하여 수행되는 것을 특징으로 하는, 3D 프린팅용 바이오잉크의 제조방법.
  12. 탈회골기질 지지체를 제조하는 단계;
    제 10 항 또는 제 11 항의 제조방법에 따라 섬유연골 복합조직 유래 세포외기질을 포함하는 바이오잉크를 제조하는 단계; 및
    상기 제조된 바이오잉크를 상기 제조된 탈회골기질 지지체에 주입하여 가교시키는 단계를 포함하는, 골 이식재의 제조방법.
  13. 제 12 항에 있어서,
    상기 탈회골기질 지지체를 제조하는 단계는,
    골-연골 복합조직을 수득하고 상기 복합조직에서 무기질을 제거하는 단계; 및
    상기 무기질이 제거된 복합조직에서 연골 조직을 제거하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 골 이식재의 제조방법.
  14. 제 12 항에 있어서,
    상기 제조된 바이오잉크를 상기 제조된 탈회골기질 지지체에 주입하여 가교시키는 단계는,
    상기 바이오잉크를 3D 프린팅으로 출력하여 탈회골기질 지지체 내부 다공성 구조에 주입한 후, 37℃ 이상의 온도에서 가교하여 수행되는 것을 특징으로 하는, 골 이식재의 제조방법.
  15. 제 12 항에 있어서,
    상기 골 이식재 제조방법은,
    상기 제조된 바이오잉크를 상기 제조된 탈회골기질 지지체에 주입하여 가교시키는 단계 이후, 하나 또는 둘 이상의 물리적 또는 화학적 방법으로 추가 가교시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 골 이식재의 제조방법.
  16. 제 15 항에 있어서,
    상기 물리적 방법은,
    감마선 또는 전자선에서 선택되는 이온화에너지를 조사하는 방법인 것을 특징으로 하는, 골 이식재의 제조방법.
  17. 제 15 항에 있어서,
    상기 화학적 방법은,
    글루타알데히드 (glutaraldehyde) 또는 EDC/NHS (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide/N-hydroxysuccinimide) 에서 선택되는 가교제를 사용하는 방법인 것을 특징으로 하는, 골 이식재의 제조방법.
  18. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 바이오잉크 조성물을 3차원 프린팅하는 단계를 포함하는, 인공조직의 제조방법.
  19. 제 18 항에 있어서,
    상기 3차원 프린팅하는 단계는,
    평균 직경이 300 내지 600 μm인 노즐을 이용하여, 80 kPa 미만의 공압 및 37℃ 이상의 온도에서 1 내지 2 mm/sec의 속도로 수행되는 것을 특징으로 하는, 인공조직의 제조방법.
  20. 제 18 항에 따른 제조방법으로 제조되며, 섬유연골 복합조직 특성을 가진 것을 특징으로 하는, 인공조직.
KR1020230090775A 2022-07-13 2023-07-13 섬유연골 유래 바이오잉크 조성물, 이를 포함하는 골이식재 조성물 및 이의 제조방법 KR20240009374A (ko)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR20160121727A (ko) 2015-04-10 2016-10-20 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단 골 유래 세포 외 기질이 코팅된 골 재생용 지지체

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