CN102286466A

CN102286466A - cDNA-AFLP法分离苏太猪肌内脂肪含量差异表达基因的方法

Info

Publication number: CN102286466A
Application number: CN 201110197190
Authority: CN
Inventors: 徐银学; 李纪委; 张子敬; 张宝乐
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2011-07-14
Filing date: 2011-07-14
Publication date: 2011-12-21

Abstract

本发明公开了cDNA-AFLP法分离苏太猪肌内脂肪含量差异表达基因的方法。苏太商品猪屠宰后采取背最长肌，根据肌内脂肪的含量从中选取最高和最低各5头以上构建RNA池，提取肌内脂肪部位的总RNA，以总RNA为模板合成双链cDNA，用识别序列分别为6bp和4bp的两种限制性内切酶酶切双链cDNA，酶切片段两端与相应的限制性内切酶人工接头序列连接后，利用与所述的限制性内切酶人工接头序列互补的预扩增引物进行预扩增，再以预扩增产物为模板进行选择性扩增，选择性扩增产物通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，获得脂肪含量差异表达基因的差异片段，回收差异片段，进行克隆及测序，从而获得苏太猪肌内脂肪含量差异表达基因。

Description

cDNA-AFLP法分离苏太猪肌内脂肪含量差异表达基因的方法

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及cDNA-AFLP法分离苏太猪肌内脂肪含量差异表达基因的方法。

背景技术

从生物个体的生长、发育、衰老、死亡，到组织的分化、凋亡以及细胞对各种生物、理化因子的应答，本质上都涉及到基因的选择性表达。不同细胞间或同一细胞不同时间与空间，基因表达的差异决定着生命活动的多样性。基因在时间和空间上的有序表达贯穿和调控了个体的整个生命过程。高等生物大约有几万个不同的基因，在一定时间、空间中，任何一个细胞中仅有10％～15％的基因表达，并受到严格调控。这种在不同细胞间或同一细胞中，基因按时间和空间顺序选择性地、有序地进行表达，称为基因的差别性表达。基因的差别性表达有两种方式，分别为新出现的基因表达与表达量差异的基因表达。基因表达的变化是调控细胞生命活动过程的核心机制。由于细胞的各种生理过程或病理改变在本质上都是由基因表达的改变所决定的。因此，通过比较不同细胞或同一类细胞不同生理条件下、不同生长发育阶段的基因表达的差异，将为分析整个细胞的生命过程提供有用的信息。一旦获取差异表达的基因将有助于了解正常生理变化和病理改变的分子机制，为基因诊断、基因治疗和发现新的药物靶点提供新的视角。因此，分离和克隆差异表达基因成为分子生物学研究的一个努力方向。近年来，分离差异表达基因的技术不断发展与完善，目前这些方法已得到广泛应用，并已成功分离了许多差异表达的基因。

肌内脂肪的形成是一个渐进的过程，在个体发育的不同时期其性状的表现也会有所不同。从根本上讲，在日龄和环境条件基本一致的情况下，肌内脂肪的沉积的变化是由控制肌内脂肪沉积的基因在不同的表达所决定的。Anderson等(1973)认为，猪脂肪组织的增长在前1～2个月主要是脂肪细胞数目的增加，在2-5月龄是脂肪细胞数目增加和脂肪细胞体积增大共存，5～6月龄以后的发育主要为脂肪细胞体积的增大。在不同类型的猪肌肉中的研究发现，脂肪型猪和瘦肉型猪脂肪细胞的增殖和肥大能力均存在显著差异，前者脂肪细胞成熟的速度较慢而后者脂肪细胞成熟的速度较快，表明脂肪细胞在不同品种间的成熟速度有明显的差异，这种差异也可能是导致肌内脂肪沉积速度差异的一个重要原因。

在动物细胞里，80％以上的能量是在线粒体中合成的。糖和脂肪等营养物质经酵解和三羧酸循环后脱下的氢经线粒体内膜上的电子传递系统即呼吸链，最后传递给氧。呼吸链中的复合物I即NADH脱氢酶是最复杂的酶系，其作用是催化NADH的2个电子传递至辅酶Q。

还原型辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH是细胞能量代谢所必需的辅酶，其分子量为770.8kDa，等电点为3.0。NADH在生化过程中起电子传递作用，能量反应中的电子，通常都先被传递至NAD，再还原成NADH，经过传递链传递电子至氧，并释放能量，氧化磷酸化作用便利用这些能量制造ATP，1分子NADH还原产生3分子ATP。它在生物体内的糖酵解、柠檬酸循环和光合作用等过程中，起着电子传递的重要作用。NADH对活化生物体内多酶系统，促进核酸、蛋白、多糖的合成和代谢，增加物质转运和调控，改善代谢功能等具有重要的作用，同时NADH在维持细胞生长、分化和能量代谢中也起重要作用。细胞内NADH含量的升高，使脂肪酸氧化减弱。同时NADH含量升高又促进脂肪酸的合成。

随着年龄的增长，组织器官日趋老化，从能量供应充足的状态到能量供应不足，组织器官出现其功能异常，特别是大脑中枢神经系统中神经细胞功能退化，如帕金森氏综合征，阿尔海姆茨病等，并导致全身性疾病发生，如疲劳综合征。研究表明NADH能增加内源性多巴胺合成和改善帕金森氏综合征症状，预防帕金森氏综合征黑质变性过程和促进神经细胞存活分化。NADH不仅是一种重要的生化试剂，同时也可能作为一种生化药物发挥细胞保护作用。

cDNA-AFLP技术是Bachem等发明的。该技术是将AFLP技术应用于mRNA表达差异分析基础上发展的一种mRNA指纹图谱技术。该技术保留了AFLP技术的可靠性与高效性，可广泛地应用于动植物差异基因的分离及鉴定。cDNA-AFLP在cDNA酶切片段两端加上统一的接头作为PCR扩增的模板，使经典PCR反应的可靠性大为提高。Habu等比较了DDRT-PCR和cDNA-AFLP技术扩增结果，重复性可达100％。Fukuda等的试验也证实cDNA-AFLP分析再现性达95％以上。本试验研究中发现由引物扩增出的差异表达片断均可重复出现，即使是不同个体的材料也能扩增得到相同的差异片段，从而也证实该试验方法的重复性好及可靠性高的特点。

cDNA-AFLP技术程序多且复杂，从RNA的提取到电泳银染每个环节要求都必须严格，只有这样才能获得最佳效果。高质量的模板是AFLP标记顺利完成的关键基础。所以在很长一段时间里，人们大多使用AFLP试剂盒来完成各项研究(有些直接让公司来做)。因为它用起来方便，不会产生因体系不佳带来的问题，但使用试剂盒的费用非常昂贵。目前还未报道cDNA-AFLP技术在猪肌内脂肪上的研究。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种cDNA-AFLP法分离苏太猪肌内脂肪含量差异表达基因的方法。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

利用cDNA-AFLP法分离苏太猪肌内脂肪含量差异表达基因的方法，苏太商品猪屠宰后采取背最长肌，根据肌内脂肪的含量从中选取最高和最低各5头以上构建RNA池，提取肌内脂肪部位的总RNA，以总RNA为模板合成双链cDNA，用识别序列分别为6bp和4bp的两种限制性内切酶酶切双链cDNA，酶切片段两端与相应的限制性内切酶人工接头序列连接后，利用与所述的限制性内切酶人工接头序列互补的预扩增引物进行预扩增，再以预扩增产物为模板进行选择性扩增，选择性扩增产物通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，获得脂肪含量差异表达基因的差异片段，回收差异片段，进行克隆及测序，从而获得苏太猪肌内脂肪含量差异表达基因。

其中，所述的识别序列为6bp的限制性内切酶优选EcoR I限制性内切酶，所述的识别序列为6bp的限制性内切酶优选Taq I限制性内切酶。

所述的EcoR I接头序列为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2，Taq I接头序列为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4。

所述的与EcoR I限制性内切酶人工接头序列互补的预扩增引物序列为SEQ ID No.5，与Taq I限制性内切酶人工接头序列互补的预扩增引物序列为SEQ ID No.6。

所述的选择性扩增引物一条为EcoRI选择性引物，另一条为TaqI选择性引物。

所述的EcoRI选择性引物选自E1：SEQ ID No.7，E2：SEQ ID No.8，E3：SEQ ID No.9，E4：SEQ ID No.10，E5：SEQ ID No.11，E6：SEQ ID No.12，E7：SEQ ID No.13，E8：SEQ IDNo.14，E9：SEQ ID No.15中的任意一条；所述的TaqI选择性引物选自T1：SEQ ID No.16，T2：SEQ ID No.17，T3：SEQ ID No.18，T4：SEQ ID No.19，T5：SEQ ID No.20，T6：SEQ IDNo.21，T7：SEQ ID No.22，T8：SEQ ID No.23；共形成72种选择性扩增引物对组合。

所述的选择性扩增PCR反应程序如下：94℃ 4min；[94℃ 30s，65℃ 1min(每个循环降低0.7℃)，72℃ 1min]×12；(94℃ 30s，56℃ 1min，72℃ 1min)×25；72℃ 7min。

有益效果：本发明将cDNA-AFLP应用于分离苏太猪肌内脂肪含量差异表达基因，经过大量试验优化了AFLP体系，发现了调节肌内脂肪沉积的相关候选基因。较之于现今流行的芯片技术筛选差异表达基因的方法，本发明具有重复性好，假阳性率低，试验成本少的特点。

附图说明

图1琼脂糖变性胶RNA完整性检测，其中1：肌内脂肪高组；2：肌内脂肪低组。

图2预扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测，M：DNA Marker；1：肌内脂肪含量高组；2：肌内脂肪含量低组。

图3cDNA-AFLP选择性扩增电泳图，1：肌内脂肪含量高组；0：肌内脂肪含量低组。

图4菌落阳性克隆的PCR检测结果，M：DNA Ladder Marker；A1-A4指示192bp片断；B1-B4指示310bp片断。

图5NADH4基因扩增结果，1-6为肌内脂肪含量低组个体，7-12为肌内脂肪含量高组个体。

图6EcoRI内切酶酶切NAHD4，M：DNA Marker；1-6为肌内脂肪含量低组个体，7-12为肌内脂肪含量高组个体。

图7用于实时荧光定量分析的两组个体背最长肌肌内脂肪含量，H和L分别代表肌内脂肪最高和最低组；^*表示差异显著^*(P＜0.05)。

图8苏太猪NADH4基因在不同肌内脂肪含量中的相对表达水平，L：表示肌内脂肪含量低组NADH4基因的相对表达量；H：表示肌内脂肪含量高组NADH4基因的相对表达量。^**表示差异极显著(P＜0.01)。

具体实施方式

1.1实验动物

背最长肌来自90头180日龄的苏太商品猪，来自苏州苏太猪育种中心。屠宰后采取背最长肌，一部分保存于-20℃，用于IMF含量的测定；一部分立即置于液氮中速冻，-70℃保存，根据IMF的含量从中选取最高和最低各6头构建RNA池，分别记为脂肪含量最高组和脂肪含量最低组，用于cDNA-AFLP分析。

1.2主要试剂及试剂盒

M-MLV Reverse Transcriptase，RNase抑制剂：Promega公司；Trizol试剂盒：Invitrogen公司；rTaq DNA Polymerase，dNTP：上海皓嘉科技发展有限公司；M-MLV RTase cDNA SynthesisKit、Taq I限制性内切核酸酶、T4 DNA连接酶、DNA Ladder Marker：TaKaRa公司；EcoR I限制性核酸内切酶：Fermentas公司；insT/Aclone^TMPCR Product Cloning Kit：MBI公司；TOPO TA Cloning Kit for Sequencing：Invitrogen公司；丙烯酰胺、N-N’亚甲基双丙烯酰胺：南京基天生物技术有限责任公司；凝胶回收试剂盒：天为时代公司。

1.3主要溶液及其配制

1.3.1RNA提取试剂配制

(1)0.1％的DEPC(焦磷酸二乙酯)处理水：1mL DEPC加至999mL去离子水，37℃过夜(大于12h)，然后高压灭菌。

(2)异戊醇/氯仿：取1∶49的体积比即可，放于棕色瓶中。

(3)2M醋酸钠(pH4.0)：加16.42g无水醋酸钠于40mL DEPC水和35mL冰醋酸中，用冰醋酸调pH4.0，加水至100mL后，然后高压灭菌。

(4)苯酚/异戊醇/氯仿：取25∶24∶1的体积比混合即可，放于棕色瓶中。

(5)75％乙醇500mL：DEPC水125mL加100％乙醇375mL即可。配试剂时器皿均要高压灭菌，器皿要高压30min或干烤2h，并戴手套操作。

(6)水饱和酚(pH4.5)。

1.3.2双链cDNA的合成及酶切所需溶液的配制

(1)10％SDS(无须灭菌)：SDS 10g溶于100mL双蒸水中，30℃以上贮存。

(2)0.25M EDTA(pH 8.0)(高压灭菌)(NaOH调pH值)EDTA 9.325g；加双蒸水定容至100mL。

(3)10moL/L乙酸铵：用70mL室温的ddH₂O溶解77g乙酸铵，定容至100mL，用0.22μm滤器过滤除菌。

(4)10mM ATP：27.5g ATP(disodium salt)，加入4mL ddH₂O调节pH至7.0后加ddH₂O补足5mL，-20℃保存。

1.3.3电泳试剂配制

(1)10×TBE缓冲液：称取108g Tris、7.44g Na₂EDTA·2H₂O、55g硼酸，溶入800mL水，定容至1L。

(2)溴乙锭(10mg/mL)储存液：称取1g溴乙锭，加100mL去离子水，搅拌至溶解，置于棕色瓶避光保存。工作液浓度为0.5μg/mL。

(3)1％的琼脂糖胶：称取1g琼脂糖，置于250mL锥形瓶，加入10mL 10×TBE和90mL去离子水混匀，放入微波炉加热融化，冷却至55℃再加入5μL 0.5μg/mL的溴乙锭，摇匀灌胶。

(4)30％丙烯酰胺：取290g丙烯酰胺、10g N，N-甲叉双丙烯酰胺加水溶解过滤定容至1000mL。

(5)10％APS：取1g过硫酸铵加水溶解定容100mL即可。

(6)6×上样缓冲液(Loading Buffer)溴酚蓝，0.25％；二甲苯青，0.25％；甘油，30％；加蒸馏水定容至5mL。

1.3.4染色溶液的配制

(1)固定液 1L 10％的冰乙酸：取100mL冰乙酸加900mL混合即可。

(2)染色液 1g硝酸银加1.5mL37％的甲醛溶于1L水中。

(3)显色液在2L蒸馏水中加入60g Na₂CO₃，3mL37％甲醛和400uL硫代硫酸钠(10mg/mL)。

(4)固定液 1L 10％的冰乙酸：取100mL冰乙酸加900mL混合即可。

实施例1

1.1总RNA提取

分别提取脂肪含量最高组和脂肪含量最低组的背最长肌，用Trizol一步法提取的肌内脂肪部位的总RNA，用分光光度计测定RNA的浓度，其OD₂₆₀/OD₂₈₀比值为1.8～2.0之间，说明样品的纯度较高，符合实验要求。总RNA经甲醛和甲酰胺变性处理后，经1.2％甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量，结果见图1。

1.2双链cDNA的合成及其精制

根据cDNA合成试剂盒(M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit)要求进行操作，以1.1中得到的RNA为模板合成cDNA第一链，再以在第一条cDNA链为基础合成cDNA第二条链，并对合成的cDNA进行精制。

1.3酶切和接头的连接

(1)第一步Taq I酶酶切(体系为30μL)

65℃酶切2h，80℃失活20min。

(2)第二步EcoR I酶酶切

Taq I酶酶切产物 30μL

EcoR I酶(5U/μL) 2μL

10×Buffer 4μL

ddH₂O 4μL

37℃反应4h，70℃失活15min。

(3)接头的连接

16℃连接过夜，65℃失活15min。1∶15稀释作为预扩增的模板。

Taq I接头序列：5’-GACGATGAGTCCTGAC-3’(SEQ ID No.3)

3’-TACTCAGGACTGGC-5’(SEQ ID No.4)

EcoR I接头序列：5’-CTCGTAGACTGCGTACC-3’(SEQ ID No.1)

3’-CATCTGACGCATGGTTAA-5’(SEQ ID No.2)

将人工合成等量的两条TaqI(EcoRI)单链寡核苷酸于95℃加热5min，冷却至室温。-20℃保存备用。

1.4预扩增

cDNA酶切片断加上接头后，进行一次PCR扩增，使用预扩增引物，预扩增的目的是使目的数量增加，以保证在选择性扩增中尽量覆盖各种丰度的差异表达基因。

预扩增体系及反应条件如下：

EcoR I预扩增引物：5’-GACTGCGTACCAATTCA-3’(SEQ ID No.5)；

Taq I预扩增引物：5’-GATGAGTCCTGACCGAA-3’(SEQ ID No.6)；

反应程序：94℃ 4min；(94℃ 30s，56℃ 1min，72℃ 1min)×23；72℃ 10min。扩增结束后，取10μL样品琼脂糖凝胶电泳检测，在50～700bp区域应该有弥散，不应该有大于2Kb的片段，点样孔也不该有残留，本实验中对预扩产物的检测表明，产物集中在1Kb以内(如图2)，在AFLP扩增的正常范围内，表明cDNA酶切充分、连接及预扩增效果较好，为选择性扩增提供了理想的模板。

1.5选择性扩增

将预扩增产物稀释15倍作为选择性扩增的模板。

选择性扩增的体系：

表1 AFLP选择性扩增引物序列

上表中一条EcoR I选择性引物与一条Taq I选择性引物组合，共72对引物组合。

选择性扩增是在极为复杂的模板中进行相对特异的扩增，所以在初期的几个循环中对退火温度要求十分严格。这里采用了退火温度递减的策略，即第一个热循环的退火温度设置为65℃，此后每个循环递减0.7℃。具体PCR反应程序如下：

94℃ 4min；[94℃ 30s，65℃ 1min(每个循环降低0.7℃)，72℃ 1min]×12；(94℃30s，56℃ 1min，72℃ 1min)×25；72℃ 7min。PCR反应完成后，取5μL的产物与5μL的上样缓冲液混合，95℃变性10min，立即放置冰上。

1.6聚丙烯酰胺凝胶电泳

我们用72对引物组合进行了选择性扩增，扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，几乎所有引物组合均存在差异条带，说明cDNA-AFLP分析适合用在猪肌内脂肪上(图4)。

1.7差异条带的回收及二次PCR

按照王关林等的方法(王关林，方宏箔.植物基因工程原理与技术〔M〕.北京科学出版社，1998.)对获得的差异表达序列片段中的30片段进行回收。具体方法是：先用少量ddH₂O浸润差异表达的条带，然后用灭菌的手术刀沿条带边缘小心切下条带，注意不要掺杂进非回收条带，置于1.5mL离心管中，加入30mL ddH₂O，用灭菌的玻璃棒小心捣碎凝胶室温放置3h，12000r/min离心10min，取上清液做为二次扩增的模板。

反应程序：94℃ 4min；(94℃ 30s，56℃ 1min，72℃ 1min)×36；72℃ 10min。用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，选择只有一条DNA带的二次扩增产物进行进一步回收纯化。

1.8扩增产物的纯化：使用DNA凝胶回收试剂盒(DNA Gel Extraction Kit)从琼脂糖凝胶中回收纯化扩增产物。

1.9纯化PCR产物的克隆(按TOPO TA Cloning Kit for Sequencing试剂盒操作步骤进行)

(1)制备感受态细胞(JM109)采用氯化钙法。用划线法将JM109(冻存于-80℃)接种于不含抗生素的LB培养板中，24h后挑选单个菌落至5mL不含抗生素的LB培养基中，37℃振荡过夜。取1mL菌液接种于100mL LB培养基中，37C振荡至OD 600为0.4左右，至冰浴中10min，离心(6000r/min，4℃，10min)，弃上清。菌体悬浮于5mL预冷的CaCl2(50mmoL/L CaCl2，10moL/L Tris-Cl pH8.0)中，冰浴5min。弃上清，细菌悬于1mLCaCl2中，4℃，12～24h.200μL分装保存于-80℃备用。

(2)连接用电泳检测回收产物的量，在0.2mL Ep管中加入PTZ57R/T Vector 0.5μL，粗略根据插入片段的电泳亮度，加入DNA(2～4.5μL)，然后加灭菌去离子水至5μL，再加等量的Ligation Solution I进行粘端连接(TA克隆)，以上均在冰上操作，最后16℃水浴反应1～3h。同时，仅加入载体，连接酶作为对照连接反应，检查载体连接效率。

(3)转化从-80℃冰箱中取出JM109感受态细胞100μL，冰上迅速使其融化，与体积不超过其10％的连接产物混匀，冰浴30min；于42℃，热激90s后，迅速置于冰中3～5min，严禁振荡；将900μL LB培养基缓慢加于菌液中，37℃恒温培养箱中培养15min，然后于37℃全温振荡培养箱中45min，复苏细菌，振速不要超过200r/min，以防连接产物从菌体中逸出。

(4)质粒筛选采用蓝白筛选法将15mL LB培养基和30μL氨节青霉素Amp(50mg/mL)倒入一培养皿中，室温自然冷却干燥；将7μL异丙基硫代-13-D-半乳糖苷(IPTG)溶液(1moL/L)和70μL 5-溴-4-氯-3吲跺-13-D-半乳糖苷(X-GaI)溶液(20mg/mL)均匀涂布于平板表面，待室温干燥后，将400μL复苏后的菌液轻涂到平板上，于37℃恒温培养箱中12～14h，于4℃环境中1h，使充分显色。插入片段破坏了质粒LacZ基因，菌株不能产生活性β-半乳糖苷酶，菌落为白色；而未插入连接产物的质粒，可以产生有活性的β-半乳糖苷酶，菌落中心呈现淡蓝色，外周为深蓝色。挑选单个白色菌落，接种于含氨节青霉素(50mg/mL，6μL)的LB液体培养基(3mL)中，37℃以120r/min速度振荡培养10～12h。

(5)质粒的提取采用碱性裂解法将1～1.5mL培养菌液在无菌操作台里，置于一Ep管中，4℃，12000r/min离心30s，剩余培养菌液储存于4℃。弃去上层培养液，将细菌沉淀重悬于100μL冰预冷的的碱性裂解液I(50mmoL/L葡萄糖，25mmol/L Tris-Cl(pH8.0)，10mmoL/L EDTA，pH8.0)中，剧烈振荡，加200μL的碱性裂解液II(0.2moL/L NaOH，1％SDS)，操作中应先加入100μL 0.4M NaOH，后加入100μL 2％SDS，切勿剧振，轻轻颠倒离心管数次，置于冰上，加入150μL预冷的碱性裂解液III(3moL/L NaCl，5moL/LHAc，pH4.8)，轻振荡数次，置于冰上5～8min，12000r/min离心5min，将上清液转移到另一离心管中，加入等量体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，其中酚200μL，氯仿∶异戊醇200μL，剧烈振荡混匀，将上清液转移到另一干净离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，剧振，-20℃沉淀质粒DNA 5～10min，4℃，12000r/min离心10min，弃上清，加入1mL 70％乙醇清洗DNA沉淀，离心(4℃，12000r/min)5min，弃上清，室温自然干燥10min。用15μL含0.1μL胰RNA酶(无DNA酶)的无菌去离子水重新溶解DNA沉淀，37℃水浴30min，使所含RNA充分降解。-20℃保存。

1.10 菌落PCR鉴定

取上述第4步中以37℃120r/min速度振荡培养6h的菌液2μL作模板，按如下程序扩增：

在PCR仪上，94℃，4min，然后进入PCR循环，94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 30s 30个循环；最后72℃延伸5min。最后取所有反应产物进行琼脂糖凝胶电泳。在反应管中加入4μLLoading buffer，在1％的琼脂糖胶上电泳，80v，1h，将胶进行EB染色，紫外灯下观察，把与PCR产物的大小+200bp的总的片段长度，确定为阳性克隆(图4)。

1.11 测序

对于用72对引物组合扩增出200多条特异性表达条带。我们选取30个条差异条带进行回收，克隆测序成功的有15个EST序列。DNA片段的测序及其核苷酸序列分析采用美国ABI公司生产的3730全自动DNA序列分析仪由上海英俊生物技术公司完成序列检测工作。通过国际互联网(PubMed/BLAST)，将获得的cDNA片段序列与Genbank中已知序列进行同源比对。测序表明各个序列都是由相应的引物扩增而来，测序结果与GenBank无冗余数据库进行比对，发现其中4条序列(SEQ ID No.28～SEQ ID No.31)与已知基因高度同源，而剩下11条序列(SEQ ID No.32～SEQ ID No.42)并无发现与之同源的序列。4条与已知基因高度同源的序列中，有一条差异片段(SEQ ID No.28)与NCBI发布猪的DNAH4基因序列同源性达99％，比对发现差异片段多了一个EcoR I内切酶酶切位点。

实施例2 NADH4基因的PCR-RFLP及实时定量-PCR分析

本实施例主要试剂如下：

M-MLV Reverse Transcriptase、RNase抑制剂：Promega公司。

Oligo dT18、扩增引物及real-time quantitative PCR引物由上海英骏生物技术有限公司合成。

SYBR Premix Ex TaqTM、DNA Mark均购自Takara公司。

硼酸、琼脂糖、甘油、丙稀酰胺、N，N`一甲叉双丙烯酰胺、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、过硫酸胺(APS)、四甲基乙二胺(TEMED)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)溴酚蓝均购自南京大治生物有限公司。

其余同实施例1.

2.1背最长肌肌内脂肪组织RNA的提取及检测同实施例1

2.2反转录

在25μL的反应体系中加入2μg总RNA，2μL(10μM)dT18，0.4mM dNTP，20U RNAseinhibitor，200U M-MLV反转录酶，5μL 5×RT Buffer(250mM Tris-HCl PH8.3，50mM MgCl₂，250mM KCl，50mM DTT，2.5mM Spermidine)。先加RNA模板，dNTP和锚定引物，70℃变性5min后立即放冰上冷却，再加其余试剂，混匀后37℃反应60min，95℃灭活5min。RT产物保存于-20℃备用。

2.3NADH4基因的扩增及PCR产物的酶切

2.3.1 NADH4基因的扩增

以NCBI上公布的NADH4基因(GenBank登陆号AJ002189)的序列设计引物。

引物序列为：上游引物：5’-TCCGACTCACTATCAGCAC-3’(SEQ ID No.24)

下游引物：5’-GTTTGGTTTCCTCAGCGT-3’(SEQ ID No.25)

NADH4基因扩增体系及反应条件如下：

反应程序：94℃ 4min；(94℃ 30s，62℃ 30s，72℃ 30s)×35；72℃ 10min。PCR产物保存于-20℃备用。

2.3.2 酶切

酶切体系及反应条件如下：

PCR产物 5uL

EcoRI酶(5U/μL) 1uL

10×Buffer 2μL

ddH₂O 12μL

37℃反应5h，70℃失活15min。酶切结束后在聚丙烯酰胺凝胶电泳上检测。

2.3.3 点样与电泳

将PCR产物和酶切产物分别点样于8％的聚丙烯酰胺凝胶的加样孔中，120v电泳，银染，拍照保存结果。

结果：在进行酶切之前，先检验所扩增的NADH4基因是否一致(如图5所示)。为了验证肌内脂肪含量高组是否存在EcoR1酶切位点，我们采用PCR-RFLP进行了检测。结果显示肌内脂肪含量低组没有被EcoR1酶切开只有一条342bp的条带，而肌内脂肪含量高组被EcoR1酶切开产生两条257bp和85bp条带(如图6所示)。

2.4 NADH4基因实时定量-PCR分析

为了进一步的验证NADH4基因与肌内脂肪之间的关系，从90个个体中选取肌内脂肪最高和最低的各15头组成肌内脂肪含量差异显著的两组(p＜0.05)(图7)。对这个基因进行实时定量-PCR分析。以持家基因3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)为内参。用Primer premier 5.0软件设计引物(表2)，由Invitrogen生物技术有限公司合成。

表2 NADH4和GAPDH基因的引物参数

PCR反应体系如下

混匀离心后在real-time PCR仪上进行反应。反应条件如下：94℃，4min，然后进入PCR循环，94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 30s 43个循环；最后72℃延伸5min。绘制溶解曲线，65℃-95℃，每0.2℃读板一次，结束后将产物置于4℃保存。扩增产物经过8％PAGE胶电泳，银染，拍照。数据分析：每个样品做3个重复，并确定Ct值，Ct即threshold Cycle，C代表Cycle t代表threshold，为所测荧光强度(Rn)超过本底达到可测水平时的临界数值。Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。根据扩增曲线方程换算，摸板mRNA量的比较转变为循环数(时间)的比较。表达相对值的倍数由Rotor-Gene Real-Time AnalysisSoftware计算。实验结果表示为mean±s.e.m，用SPSS 11.5 For Windows软件对数据进行分析。

结果显示，NADH4基因的表达量与肌内脂肪含量呈负相关。肌内脂肪含量高组NADH4基因的表达量低，肌内脂肪含量低组NADH4基因的表达量反而高(如图8所示)。NADH4可能参与了肌内脂肪沉积的负调节。

Claims

1.利用cDNA-AFLP法分离苏太猪肌内脂肪含量差异表达基因的方法，其特征在于苏太商品猪屠宰后采取背最长肌，根据肌内脂肪的含量从中选取最高和最低各5头以上构建RNA池，提取肌内脂肪部位的总RNA，以总RNA为模板合成双链cDNA，用识别序列分别为6bp和4bp的两种限制性内切酶酶切双链cDNA，酶切片段两端与相应的限制性内切酶人工接头序列连接后，利用与所述的限制性内切酶人工接头序列互补的预扩增引物进行预扩增，再以预扩增产物为模板进行选择性扩增，选择性扩增产物通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，获得脂肪含量差异表达基因的差异片段。

2.根据权利要求1所述的利用cDNA-AFLP法分离苏太猪肌内脂肪含量差异表达基因的方法，其特征在于所述的识别序列为6bp的限制性内切酶为EcoR I限制性内切酶，所述的识别序列为6bp的限制性内切酶为Taq I限制性内切酶。

3.根据权利要求2所述的利用cDNA-AFLP法分离苏太猪肌内脂肪含量差异表达基因的方法，其特征在于所述的EcoR I接头序列为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2，Taq I接头序列接头序列为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4。

4.根据权利要求2所述的利用cDNA-AFLP法分离苏太猪肌内脂肪含量差异表达基因的方法，其特征在于所述的与EcoR I限制性内切酶人工接头序列互补的预扩增引物序列为SEQ IDNo.5，与Taq I限制性内切酶人工接头序列互补的预扩增引物序列为SEQ ID No.6。

5.根据权利要求2所述的利用cDNA-AFLP法分离苏太猪肌内脂肪含量差异表达基因的方法，其特征在于所述的选择性扩增引物一条为EcoRI选择性引物，另一条为TaqI选择性引物。

6.根据权利要求2所述的利用cDNA-AFLP法分离苏太猪肌内脂肪含量差异表达基因的方法，其特征在于所述的EcoRI选择性引物选自E1：SEQ ID No.7，E2：SEQ ID No.8，E3：SEQ ID No.9，E4：SEQ ID No.10，E5：SEQ ID No.11，E6：SEQ ID No.12，E7：SEQ ID No.13，E8：SEQ IDNo.14，E9：SEQ ID No.15中的任意一条；所述的TaqI选择性引物选自T1：SEQ ID No.16，T2：SEQ ID No.17，T3：SEQ ID No.18，T4：SEQ ID No.19，T5：SEQ ID No.20，T6：SEQ IDNo.21，T7：SEQ ID No.22，T8：SEQ ID No.23；共形成72种选择性扩增引物对组合。

7.根据权利要求2所述的利用cDNA-AFLP法分离苏太猪肌内脂肪含量差异表达基因的方法，其特征在于所述的选择性扩增PCR反应程序如下：94℃ 4min；[94℃ 30s，65℃ 1min(每个循环降低0.7℃)，72℃ 1min]×12；(94℃ 30s，56℃ 1min，72℃ 1min)×25；72℃ 7min。

8.根据权利要求1～7中任意一条所述的利用cDNA-AFLP法分离苏太猪肌内脂肪含量差异表达基因的方法，其特征在于所述的分离苏太猪肌内脂肪含量差异表达基因的方法还包括回收差异片段，进行克隆及测序。