CN101509027A - 半滑舌鳎抗鳗弧菌特异cDNA-AFLP片段的获取方法 - Google Patents
半滑舌鳎抗鳗弧菌特异cDNA-AFLP片段的获取方法 Download PDFInfo
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Abstract
一种半滑舌鳎抗鳗弧菌特异cDNA－AFLP片段的获取方法，包括抗鳗弧菌特异cDNA－AFLP片段的回收、cDNA－AFLP片段的克隆与序列分析；建立了分离和克隆半滑舌鳎抗鳗弧菌特异cDNA－AFLP片段的技术，获得了抗鳗弧菌特异cDNA－AFLP片段。本发明系首次分离到半滑舌鳎抗鳗弧菌特异cDNA－AFLP片段。本发明的特点是可快捷的获得半滑舌鳎抗鳗弧菌特异片段，方法简便；所得结果可应用于半滑舌鳎抗病基因的定位克隆。
Description
技术领域
本发明属于半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)DNA分子遗传标记技术，涉及一种抗鳗弧菌特异cDNA-AFLP片段的获取方法。
背景技术
半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)属鲽形目、舌鳎科、舌鳎属，是一种暖温性近海大型底层鱼类，终年生活栖息在我国近海海区，已经成为我国最具有发展潜力的海水养殖新品种之一。半滑舌鳎是一种生长快速、抗病力强、肉味鲜美的优良海水养殖鱼类。半滑舌鳎的这种优良性状是有其遗传学基础的。探索半滑舌鳎生长快和抗病力强的分子基础，筛选和克隆出与抗病性状相关的特殊功能基因和标记，开发其在海水鱼类抗病育种与防病、治病中的应用潜力，对于海水鱼类养殖业具有重要的现实意义及应用价值。cDNA-AFLP是一种应用于基因组DNA的选择性扩增限制性片段即AFLP(Amplifiedfragment length polymorphi sm)的基础上发明出来的用于RNA指纹分析的方法。它将RT-PCR和AFLP结合起来，由于在PCR中使用较高的退火温度和应用特定引物对包含信息较多的内部特异片段进行选择性扩增，增加了反应条件的严谨度。利用cDNA-AFLP技术分离、克隆半滑舌鳎抗病相关片段，为半滑舌鳎抗病基因的克隆提供序列信息，进而培育出天然抗病力增强的海水鱼类新品种，或生产出抗病的功能基因药物，在水产养殖中推广应用就显得尤为重要和迫切。
发明内容：
本发明的目的是为了克隆出半滑舌鳎抗鳗弧菌特异cDNA-AFLP片段，分析其序列，建立半滑舌鳎抗鳗弧菌特异cDNA-AFLP片段的获取方法，为半滑舌鳎抗病基因的克隆提供序列信息支持。
本发明其技术内容如下：
包括两个方面：
一、注射鳗弧菌和未注射鳗弧菌两种半滑舌鳎的cDNA-AFLP差异显示。
二、半滑舌鳎抗鳗弧菌特异cDNA-AFLP片段的克隆与序列分析。
一、注射鳗弧菌和未注射鳗弧菌两种半滑舌鳎cDNA-AFLP差异显示。
半滑舌鳎腹腔注射鳗弧菌，注射鳗弧菌可以启动或增强抗病相关基因的表达。以未经鳗弧菌注射的半滑舌鳎作对照，提取免疫器官脾藏组织中的总RNA，并反转录成cDNA。以cDNA作为模板进行注射鳗弧菌和未注射鳗弧菌两种鱼的AFLP差异显示，获得差异显示的片段。
二、半滑舌鳎抗鳗弧菌特异cDNA-AFLP片段的克隆与序列分析：它的技术内容包括：1)半滑舌鳎抗鳗弧菌特异cDNA-AFLP片段的回收；2)抗鳗弧菌特异cDNA-AFLP片段的克隆；3)抗鳗弧菌特异cDNA-AFLP片段的序列分析：
1)、抗鳗弧菌特异cDNA-AFLP片段的回收：
选取能扩增出496bp抗鳗弧菌特异cDNA-AFLP条带的引物组合，进行AFLP扩增，扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，用刀片切下含有496bp抗鳗弧菌特异DNA条带的聚丙烯酰胺凝胶，溶解后回收目的片段备用。
2)、cDNA-AFLP片段的克隆：
将回收的抗鳗弧菌特异cDNA-AFLP片段，克隆到pMD18-T载体中，连接和转化后，采用常规PCR法筛选含有目的片段的克隆，用琼脂糖凝胶电泳检测产物的长度，符合预期长度的样品可以视为阳性克隆。3)、序列分析：选取阳性克隆，测序后进行序列分析。将来自6个阳性克隆的抗鳗弧菌特异cDNA-AFLP片段的核苷酸序列，进行多序列比对，其同源性为99.21％，表明各个个体得到的条带是同一个序列。共有序列同源性比对和相似性搜索用BLAST软件进行，在GenBank中没有找到任何同源的序列。
具体实施方式：
采用分子克隆技术，克隆出半滑舌鳎抗鳗弧菌特异的cDNA-AFLP片段，建立半滑舌鳎抗鳗弧菌特异cDNA-AFLP片段的获取技术，进而获取半滑舌鳎抗病相关基因，具有重要的现实意义。下面通过‘半滑舌鳎抗鳗弧菌特异cDNA-AFLP片段的获取方法’的实施例，结合附图对本发明的技术内容进行详细说明：
一、注射鳗弧菌和未注射鳗弧菌两种半滑舌鳎的cDNA-AFLP差异显示。
1、鳗弧菌注射
采用腹腔注射法对半滑舌鳎注射0.5mL 1OD的鳗弧菌悬液，注射鳗弧菌可以启动或增强抗病相关基因的表达。以未经鳗弧菌注射的半滑舌鳎作对照。
2、RNA的提取
采用Trizol法提取脾藏组织中的总RNA：取适量的组织匀浆悬液，加入5mL Trizol，充分吹打混匀，室温放置5min。加1.2mL CHCl3(4℃)，涡流混匀3次，每次10s，室温放置5min。11000g，4℃，离心10min。小心吸取上清，加入等体积的异丙醇(-20℃)，上下颠倒混匀，室温放置15min，11000g，4℃，离心10min。弃上清，沉淀中加入75％(4℃)的乙醇洗涤，11000g，4℃，离心10min。弃上清，倒置于吸水纸上，尽量吸干液体。3000g，4℃，离心10s。，将管壁上的残余液体甩到管底，用微量加样器尽量将其吸干，冰上干燥10min。用50μL无RNase的水溶解RNA。
3、PCR反转录
采用AMV反转录酶法：选用50μL反应体系进行反转录反应。反应体系包含10×Buffer，dNTP，MgCl2，混合引物，RNA酶抑制剂，AMV反转录酶及RNA模板。反应条件为42℃，60min。然后立即进行PCR反应或于-20℃保存备用。
4、cDNA-AFLP
各取10条注射鳗弧菌和未注射鳗弧菌两种鱼的cDNA模板组成基因池，进行AFLP差异显示，获得差异显示的片段。采用标准的AFLP程序：首先对cDNA进行限制性酶切，然后分别进行预扩增和选择性扩增，变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离扩增片段，最后银染显色。
二、半滑舌鳎抗鳗弧菌特异cDNA-AFLP片段的克隆与序列分析，包括：1、抗鳗弧菌特异cDNA-AFLP片段的回收；2、cDNA-AFLP片段的克隆；3、序列分析。
1、抗鳗弧菌特异cDNA-AFLP片段的回收
根据抗鳗弧菌特异cDNA-AFLP片段的筛选结果，选取能扩增出496bp抗鳗弧菌特异AFLP条带的引物组合，进行AFLP扩增，然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，获得496bp的抗鳗弧菌特异cDNA-AFLP条带，用刀片切下含有目的DNA片段的聚丙烯酰胺凝胶，加20μl超纯水，4℃过夜溶解，得到了微量的DNA，回收目的片段备用。
2、AFLP片段的克隆
采用商品化的pMD 18-T连接试剂盒将回收的抗鳗弧菌特异cDNA-AFLP片段，克隆到pMD 18-T载体中，采用标准的CaCl2转化方法将连接产物转化感受态细菌，将转化产物涂布LB培养皿，37℃过夜培养。次日，用灭菌的牙签挑取单菌落，投入3ml LB(含氨卞青霉素)液体培养基中，37℃、250r/min过夜培养。然后采用PCR法筛选目的克隆，从每个样品中取2μl菌液做为模板，用所对应的选择性扩增的引物和反应程序进行扩增，用琼脂糖凝胶电泳检测产物的长度，符合预期长度的样品可以视为阳性克隆。
3、序列分析
选取阳性克隆，用AB13730测序仪进行序列分析。将来自6个阳性克隆的抗鳗弧菌特异cDNA-AFLP片段的核苷酸序列，用DNAstar Version 7.1进行多序列比对，其同源性为99.21％，表明各个个体得到的条带是同一个序列。共有序列同源性比对和相似性搜索用BLAST软件进行，在GenBank中没有找到任何同源的序列。半滑舌鳎抗鳗弧菌特异cDNA-AFLP片段的核苷酸序列(示于图1)。
<110>中国海洋大学
<120>半滑舌鳎抗鳗弧菌特异cDNA-AFLP片段的获取方法
<160>1
<210>1
<211>496
<212>DNA
<213>半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)
<220>
<400>1
1 tgtgggagcc ctgggtggcc tcacaggtca cagtggtcac cttcatccac tggtcagcag
61 ggagcctcag cgtgctgctc cagctgtagt ggccgtcctt ctccatcagc ccacggctcc
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421 cactgcctgt aaaacgatct ggaattcctg attctcgagg gggggcccgg tacccaattc
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Claims (1)
1.一种半滑舌鳎抗鳗弧菌特异cDNA-AFLP片段的克隆与序列分析，其特征在它的技术内容包括如下三个方面：1)抗鳗弧菌特异cDNA-AFLP片段的回收；2)特异cDNA-AFLP片段的克隆；3)抗鳗弧菌特异cDNA-AFLP片段的序列分析：
1)、抗鳗弧菌特异cDNA-AFLP片段的回收
选取能扩增出496bp抗鳗弧菌特异cDNA-AFLP条带的引物组合，进行AFLP扩增，扩增产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，用刀片切下含有496bp抗鳗弧菌特异DNA条带的聚丙烯酰胺凝胶，溶解后回收目的片段备用；
2)、特异cDNA-AFLP片段的克隆
将回收的抗鳗弧菌特异cDNA-AFLP片段，克隆到pMD18-T载体中，采用标准的方法进行连接和转化，采用常规PCR法筛选含有目的片段的克隆，用琼脂糖凝胶电泳检测产物的长度，符合预期长度的样品可以视为阳性克隆；
3)、抗鳗弧菌特异cDNA-AFLP片段的序列分析
选取阳性克隆，测序后进行序列分析；将来自6个阳性克隆的抗鳗弧菌特异AFLP片段的核苷酸序列，用DNAstar进行多序列比对，其同源性为99.21％，表明各个个体得到的条带是同一个序列；半滑舌鳎抗鳗弧菌特异cDNA-AFLP片段的序列为：
tgtgggagccctgggtggcctcacaggtcacagtggtcaccttcatccactggtcagcagggagcctcagcgtgctgctccagctgtagtggccgtccttctccatcagcccacggctcctgctctcctcccagctgctgctgctgatgataccgcccaccttccaggacagagtccagtctgaggggaagcccttgttggccagacacgtgagcgtggccttaccctgctgcagctcctggctggagggaggcagcactgtcagggtggggggggcaaaaactccaacatcgagtctggttcctccaccaaaagtgtacagttcccatttgctagcatcaaattcacccagacagtagtaaactgcagcatcttcagcctggactccactgatggtcagagaaaagtcagagtttgatccactgcctgtaaaacgatctggaattcctgattctcgagggggggcccggtacccaattcgccctatagtgagtcg
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|---|---|---|---|---|
| CN102286466A (zh) * | 2011-07-14 | 2011-12-21 | 南京农业大学 | cDNA-AFLP法分离苏太猪肌内脂肪含量差异表达基因的方法 |
| CN114990243A (zh) * | 2022-06-21 | 2022-09-02 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 一种筛选抗哈维氏弧菌病半滑舌鳎的标记组合和筛选半滑舌鳎抗病个体的方法 |
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2009
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