CN102268061A

CN102268061A - 一种具有抗肿瘤活性的3-酰基-2-烯-甘草次酸及其合成方法

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Publication number: CN102268061A
Application number: CN2011101531926A
Authority: CN
Inventors: 许传莲; 巨勇; 高振北; 胡君; 康潇
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2011-04-14
Filing date: 2011-05-27
Publication date: 2011-12-07
Anticipated expiration: 2031-05-27
Also published as: CN102268061B

Abstract

本发明涉及一种具有抗肿瘤活性的3-酰基-2-烯-甘草次酸及其合成方法，将10.0g甘草次酸溶于35mL四氢呋喃，冰浴上滴加15mL琼斯试剂，溶液搅拌1h后加入100mL水；过滤烘干后得9.85g3-氧-甘草次酸；将500mg 3-氧-甘草次酸和81mg对甲苯磺酸溶于25mL异丙烯基乙酯中，回流5h；反应液去二氯甲烷溶解，有机相分别用水、饱和食盐水洗涤，有机相用无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩；粗品进行柱层析分离，得棕色固体3-乙酰基-2-烯-甘草次酸，340mg。本发明有益的效果是：对修饰后的衍生物进行了人白血病细胞HL60和K562、肝癌细胞BEL-7404、乳腺癌细胞MDA-MB-231的体外抗肿瘤活性的测试。结果显示，受试化合物对四种肿瘤细胞均有不同程度的抑制活性，并且活性均强于母核化合物。

Description

一种具有抗肿瘤活性的3-酰基-2-烯-甘草次酸及其合成方法

技术领域

本发明涉及天然产物化学修饰及其活性研究领域，主要是一种具有抗肿瘤活性的3-酰基-2-烯-甘草次酸及其合成方法。

背景技术

18β-甘草次酸(18β-Glycyrrhetinic acid，GA)是中药甘草(glycyrrhiza glabra)的主要活性成分之一，除以游离态存在外，还常与两分子葡萄糖醛酸结合成甘草酸(glycyrrhizin)而存在。研究表明，18β-甘草次酸具有抗肿瘤、抗炎、抗过敏、抗病毒、抗溃疡等多种生物活性。研究发现，18β-甘草次酸可以选择性的抑制肿瘤细胞生长，而对正常细胞毒性较小，是一种有开发前景的抗肿瘤先导化合物。有文献报道18β-甘草次酸对人肺癌细胞PGCL3和髓系白血病细胞系K562的IC50值分别为145.3μmol/L和93.1μmol/L。为了进一步寻找活性强的18β-甘草次酸衍生物，目前对18β-甘草次酸A环的修饰主要集中在2位取代，3位羟基氧化、酯化、糖苷化和A环的开环等。

因此，我们充分考虑主要活性功能团的关键结构部分以及可能的构效关系，利用18β-甘草次酸作为母核化合物，通过化学方法，进行结构修饰及改造和衍生物制备，通过生物活性筛选和构效关系研究，开发结构骨架更为简单、活性更好且易于制备的新型抗肿瘤活性化合物。

发明内容

本发明要解决上述现有技术的缺点，提供一种具有抗肿瘤活性的3-酰基-2-烯-甘草次酸及其合成方法。

本发明的目的是为了进一步提高18β-甘草次酸的生理活性，对18β-甘草次酸的A环作进一步的结构改造，从而寻找新的抗肿瘤活性更显著的候选化合物。

本发明解决其技术问题采用的技术方案：本发明所述的具有抗肿瘤活性的3-酰基-2-烯-甘草次酸，该五环三萜类化合物具有以下化学结构：

其中R选自CH₃CO-，CH₃CH₂CO-，PhCO-，PhCH₂CO-，PhCH＝CHCO-，HO₂CCH₂CH₂CO-。

本发明对18β-甘草次酸进行改造的步骤如下：

MTT法对目标化合物进行抗肿瘤活性测试，运用Hoechst33258染色，AO/EB染色，DNAladder试验，Caspase活性检测，Bcl-2家族蛋白活性检测及流式细胞术进行目标化合物诱导肿瘤细胞凋亡的分析。

本发明所述的这种具有抗肿瘤活性的3-酰基-2-烯-甘草次酸合成方法，将10.0g(21.2mmol)甘草次酸溶于35mL四氢呋喃，冰浴上滴加15mL琼斯试剂，溶液搅拌1h后加入100mL水；过滤烘干后得9.85g3-氧-甘草次酸；将500mg(1.1mmol)3-氧-甘草次酸和81mg对甲苯磺酸溶于25mL异丙烯基乙酯中，回流5h；反应液去二氯甲烷溶解，有机相分别用水、饱和食盐水洗涤，有机相用无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩；粗品进行柱层析分离，得棕色固体3-乙酰基-2-烯-甘草次酸，340mg。

作为优选，粗品进行柱层析分离时，石油醚∶乙酸乙酯的重量比为2∶1。

作为优选，本发明的3-酰基-2-烯-甘草次酸类化合物与药学上可接受的载体构成药物组合物，该药物组合物可应用在制备治疗肿瘤相关的疾病的药物中。

本发明有益的效果是：对修饰后的衍生物进行了人白血病细胞HL60和K562、肝癌细胞BEL-7404、乳腺癌细胞MDA-MB-231的体外抗肿瘤活性的测试。结果显示，受试化合物对四种肿瘤细胞均有不同程度的抑制活性，并且活性强于母核化合物。其中化合物AEGA具有显著抑制人白血病细胞K562增值的活性，机制是激活信号通路中Caspase家族下游成员Caspase的表达从而诱导了肿瘤细胞的凋亡，化合物AEGA有望成为治疗白血病的先导化合物。

附图说明

图1是AEGA处理48小时K562细胞Hoechst33258染色结果图(200×).A：Control.对照组；B：AEGA处理组.

图2是AEGA处理48小时K562细胞AO/EB染色结果图(200×).A：Control.对照组；B：AEGA.处理组.

图3是AEGA处理48小时K562细胞DNA Ladder结果图；

图4是不同浓度AEGA处理24小时K562细胞中Casepase-3活性分光光度法测定结果。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明：

本发明选择甘草次酸为母核，对其A环进行一系列结构改造，并对衍生物进行抗肿瘤活性筛选。

实施例1：

1、3-乙酰基-2-烯-甘草次酸(AEGA)的合成：将10.0g(21.2mmol)甘草次酸溶于35mL四氢呋喃，冰浴上滴加15mL琼斯试剂。溶液搅拌1h后加入100mL水。过滤烘干后得9.85g3-氧-甘草次酸。

将500mg(1.1mmol)3-氧-甘草次酸和81mg对甲苯磺酸溶于25mL异丙烯基乙酯中，回流5h.反应液用二氯甲烷溶解，有机相分别用水，饱和食盐水洗涤，有机相用无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩.粗品进行柱层析分离(石油醚∶乙酸乙酯＝2∶1)，得棕色固体3-乙酰基-2-烯-甘草次酸，340mg，产率68％.

ESI-MS(+)：m/z：511.2[M+H]⁺.

ESI-MS(-)：m/z：509.0[M-H]^-.

¹H NMR(300MHz，CDCl₃)，δ：5.74(s，1H，12-H)，5.15(q，1H，J₁＝6.2Hz，J₂＝6.2Hz，2-H)，3.19(q，1H，J₁＝16.0Hz，J₂＝6.2Hz，1-H)，2.15(s，3H，OAc)，0.86，0.95，1.00，1.15，1.22，1.24，1.41(7×s，7×3H，23，24，25，26，27，28，29-CH₃).

¹³C NMR(75MHz，CDCl₃)，δ：199.97(11-C)，182.12(30-C)，170.64(13-C)，169.87(31-C)，151.37(3-C)，128.62(12-C)，112.57(2-C)，60.35(9-C).

R＝CH₃CO，CH₃CH₂CO，PhCO，PhCH₂CO，PhCH＝CHCO，HO₂CH₂CH₂CO

2.生物活性测试

采用MTT法，对目标化合物进行了人白血病细胞HL60和K562、肝癌细胞BEL-7404、乳腺癌细胞MDA-MB-231的体外抗肿瘤活性的测试。取四种肿瘤细胞系均培养于含胎牛血清体积分数为10％的DMEM培养液中，在37℃、5％CO₂条件下常规传代培养。取对数增殖期的肿瘤细胞，加适量Typsin液消化，使贴壁细胞脱落，计数后用完全培养液稀释成1.5×10⁵个/mL细胞悬液接种于96孔板，培养12h后加入各浓度梯度的目标化合物的DMSO溶液或乙醇溶液，每孔培养液总体积为200μL。药物处理72h后，每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL)，继续培养4h。对于HL60和K562悬浮细胞组，向每孔中加入100μL三联液(10％SDS-5％异丁醇-0.012mol/L HCl)，静置12h，使结晶物甲瓒充分溶解。对于BEL-7404和MDA-MB-231贴壁细胞组，弃上清液，加入100μLDMSO，摇匀。用酶标仪测定波长570nm处各孔的吸光度，以空白对照组调零。试验平行重复三次，采用Bliss法求出IC₅₀值。测试结果见表1。结果表明，受试化合物对四种肿瘤细胞均有不同程度的抑制活性。

表1 3-乙酰基-2-烯-甘草次酸(AEGA)对四种肿瘤细胞的IC50值

3.诱导肿瘤细胞凋亡的分析

3.1 Hoechst33258染色

Hoechst33258是一种双苯咪唑类化合物，可作为荧光探针与DNA分子结合。在凋亡细胞中，细胞膜对Hoechst33258的摄取增高，并且由于染色体高度浓缩，Hoechst33258与之结合增强，染色呈强蓝色荧光，而正常细胞只呈微弱荧光。Hoechst33258染色步骤按凯基公司试剂盒说明书进行。在6孔板中，AEGA以60终浓度处理K562细胞48h。用冷PBS洗涤细胞两次，离心收集细胞于1.5ml离心管中，加入1ml的4％甲醛溶液，4℃固定10min。离心去固定液，用PBS洗两遍，用100微升PBS重悬细胞。取50微升悬液涂片，自然晾干。滴加100微升Hoechst33258工作液，室温染色10分钟，水冲洗晾干。以紫外光340nm波长激发，荧光显微镜下观察。AEGA处理组细胞呈现强蓝色荧光，表明K562细胞在AEGA作用下发生了凋亡。结果见图1。

3.2 AO/EB染色

吖啶橙(AO)能透过胞膜完整的细胞，嵌入细胞核DNA，使之发出明亮的绿色荧光。溴乙锭(EB)仅能透过胞膜受损的细胞，嵌入核DNA，发橘红色荧光。AO/EB染色步骤按凯基公司检测试剂盒说明书进行。在6孔板中，AEGA以60终浓度处理K562细胞48h。用冷PBS洗涤细胞两次，离心收集细胞于1.5ml离心管中，用PBS重悬细胞。将Dye Reagent 1和Dye Reagent2等体积混合形成Mixed Dyes Reagent；吸取25μL的细胞悬液同1μL的Mixed DyesReagent轻轻混匀，吸取10μL的混合液置于一洁净的载玻片，并用盖玻片盖上细胞。荧光显微镜510nm激发波长观察。未处理组K562细胞呈圆形，核质体被均匀染成绿色，大小形状较单一，AEGA处理组细胞呈现染色质浓缩，细胞核碎裂成点状，表明K562细胞在AEGA作用下发生了凋亡。结果见图2。

3.3 DNA ladder试验

DNA ladder电泳是鉴定细胞凋亡的重要方法之一。凋亡细胞由于DNA断裂成为180-200bp大小的片段，琼脂糖凝胶电泳时可观察到“DNA梯子”。用琼脂糖凝胶电泳法来检测凋亡细胞的DNA片段(DNA ladder)。收集约100万个细胞，离心沉淀，弃上清。加入200微升PBS，轻轻吹散细胞，使细胞重悬于PBS中。加入4微升RNaseA，Vortex混匀。室温放置2分钟。加入20微升蛋白酶K，Vortex混匀。加入200微升样品裂解液B，Vortex混匀。70℃孵育10分钟。加入200微升无水乙醇，Vortex混匀。把上述混合物加入到DNA纯化柱内。6000g离心1分钟。倒弃废液收集管内液体。加入500微升洗涤液I，6000g离心1分钟。倒弃废液收集管内液体。加入600微升洗涤液II，18000g离心1分钟。倒弃废液收集管内液体。再18000g离心1分钟，以去除残留的乙醇。将DNA纯化柱置于一洁净的1.5ml离心管上，加入100微升洗脱液。室温放置3分钟。18000g离心1分钟。所得液体即为纯化得到的总DNA。将DNA样品点到预先制备好的琼脂糖凝胶上样孔中(浓度为2％)，每孔20微升。90V下进行电泳，紫外灯下观察，拍照。结果呈现出凋亡特异的DNA ladder。结果见图3。

3.4 Caspase3活性检测

Caspase3可以催化底物Ac-DEVD-pNA产生黄色的pNA，pNA在405nm处有强吸收，可以通过测定pNA吸光度来检测Caspase3的活性。Caspase3酶活性检测采用碧云天公司Caspase3酶活性检测试剂盒检测，试验步骤按照试剂盒提供的说明书进行。

AEGA处理K562细胞24h后，在4℃下，600g离心5min收集细胞，小心吸除上清，用PBS洗涤一次。同前，吸除上清后，加入50微升裂解液，冰浴裂解15分钟。在4℃下，18000g离心15分钟，把上清液转移到冰浴预冷的离心管中，-80℃保存。取出10μl加入反应体系37℃温育出现变色后，于405nm测吸光度。对照标准曲线确定pNA量。AEGA处理K562细胞组的Caspase3活性高于对照组，并且呈现一定的剂量依赖性，结果见图4。

除上述实施例外，凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。

Claims

1.一种具有抗肿瘤活性的3-酰基-2-烯-甘草次酸，其特征在于：该化合物具有以下化学结构：

2.一种合成如权利要求1所述的具有抗肿瘤活性的3-酰基-2-烯-甘草次酸的方法，其特征在于：将10.0g甘草次酸溶于35mL四氢呋喃，冰浴上滴加15mL琼斯试剂，溶液搅拌1h后加入100mL水；过滤烘干后得9.85g3-氧-甘草次酸；将500mg 3-氧-甘草次酸和81mg对甲苯磺酸溶于25mL异丙烯基乙酯中，回流5h；反应液去二氯甲烷溶解，有机相分别用水、饱和食盐水洗涤，有机相用无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩；粗品进行柱层析分离，得棕色固体3-乙酰基-2-烯-甘草次酸，340mg。

3.根据权利要求2所述的具有抗肿瘤活性的3-酰基-2-烯-甘草次酸合成方法，其特征在于：粗品进行柱层析分离时，石油醚∶乙酸乙酯的重量比为2∶1。