CN102229645B - 免疫七肽的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于多肽的制备领域，具体而言，本发明涉及免疫七肽GQTYTSG的制备方法。
Description
技术领域
本发明属于多肽的制备领域，具体而言，本发明涉及免疫七肽的制备方法。
背景技术
序列为GQTYTSG的肽（本文中简称为“免疫七肽”或7P）是一种最初根据丙型肝炎病毒而设计的免疫原性肽，本发明人在中国专利CN1194986C和CN1216075C中披露了用作丙型肝炎病毒免疫原性肽的7P及其衍生物。另外，在PCT申请WO/2007/137456中，本发明人也发现了7P及其衍生物还能用于预防和治疗肝损伤的应用，尤其能预防或治疗免疫性肝损伤和肝毒性化学物质引起的肝损伤。另外，近年来也发现可以治疗肾炎和肺炎。
多肽的固相合成是建立较长时间的技术，通常其以三苯氯甲基树脂、4-甲基-三苯氯甲基树脂、4-甲氧基-三苯氯甲基树脂、2-氯-三苯氯甲基树脂或王树脂其中的任何一种为起始原料，按照固相合成的方法依次连接具有芴甲氧羰酰基保护的氨基酸，获的保护的七肽树脂，其间依次脱去芴甲氧羰酰基保护基团，用N,N-二异丙基碳化二亚胺／1-羟基-苯并-三氮唑、N,N—二异丙基碳化二亚胺／N-羟基-7-偶氮苯并三氮唑、7-氮杂苯并唑-1-基-氧-(三-(二甲胺基)膦)六氟磷酸盐／1-羟基-苯并-三氮唑、7-氮杂苯并唑-1-基-氧-(三-(二甲胺基)膦)六氟磷酸盐／1-羟基-苯并-三氮唑／N—羟基-7-偶氮苯并三氮唑、苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯／1-羟基-苯并-三氮唑、苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯／N-羟基-7-偶氮苯并三氮唑、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯／1-羟基-苯并-三氮唑、2-(7-偶氮苯并三氮唑)—N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯／N-羟基-7-偶氮苯并三氮唑或6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯八-羟基-苯并-三氮唑/1-氧-双二甲胺羰基苯骈三氮唑四氟化硼盐其中的一种为缩合剂进行接肽反应。
这种过程在实验室的小规模生产中通常不必优化，尽管单位成本较高，但是由于所需的产量很小，因此总成本并不高。所以，现有技术中很少有为多肽固相合成优化的说明，大量的条件选择也限制了优化的进程，尤其是多数优化只是实验室优化，一旦放大，产率就会急剧下降。
本发明人经过长期艰苦摸索，针对现有技术所没有提示要优化（尤其是规模化优化）的免疫七肽进行了多肽合成优化，获得了优化的制备方法，令人意想不到的是，这种方法在将实验室规模生产放大到产业规模化生产中，产量和纯度没有下降，相反产量还有所提高。
发明内容
本发明的目的是提供优化的免疫七肽制备方法，以克服现有技术的盲点和缺陷。
具体而言，在第一方面，本发明提供了制备免疫七肽的方法，其依次包括以下步骤：
(1)制备Fmoc-Gly-树脂
称取2-氯-三苯氯甲基树脂N克加注入反应柱中，加入10Nml DCM，室温浸泡30分钟后用真空泵抽干，加入Fmoc-Gly-OH 0.3Ng、DIEA 0.8Nml、和DCM 10Nml，室温反应1.5小时，再加入封闭试剂甲醇3Nml室温反应0.5小时，树脂依次用DMF洗涤3次，异丙醇洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Gly-树脂；
(2)制备Fmoc-Ser（tBu）-Gly-树脂
在步骤(1)的Fmoc-Gly-树脂中，加入8Nml脱帽试剂，室温反应5分钟，抽干，重新加入8Nml该脱帽试剂室温反应20分钟，依次用DMF洗涤3次，异丙醇洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，加入Fmoc-Ser(tBu)-OH 0.64Ng、DIEA0.4Nml、TBTU 0.56Ng、HoBT 0.94Ng、和DMF10Nml于室温反应1.5小时，用真空泵抽干，依次用DMF洗涤3次，异丙醇洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Ser(tBu)-Gly-树脂；所述脱帽试剂为20%哌啶的DMF溶液（v/v）；
(3)制备Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂
在步骤(2)的Fmoc-Ser（tBu）-Gly-树脂中，加入8Nml上述脱帽试剂，室温反应5分钟，抽干，重新加入8Nml该脱帽试剂室温反应20分钟，依次用DMF洗涤3次，异丙醇洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，加入Fmoc- Thr(tBu)-OH 0.7Ng、DIEA 0.4Nml、TBTU 0.56Ng、HoBT 0.94Ng、、和DMF10Nml反应1.5小时，用真空泵抽干，依次用DMF洗涤3次，异丙醇洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂；
(4)制备Fmoc-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂
在步骤(3)的Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂中，加入8Nml上述脱帽试剂，室温反应5分钟，抽干，重新加入8Nml该脱帽试剂室温反应20分钟，依次用DMF洗涤3次，异丙醇洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，加入Fmoc- Tyr(tBu)-OH 0.8Ng、DIEA0.4Nml、TBTU 0.56Ng、HoBT 0.94Ng、和DMF10Nml反应1.5小时，用真空泵抽干，依次用DMF洗涤3次，异丙醇洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂；
(5)制备Fmoc-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂
在步骤(4)的Fmoc-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂中，加入8Nml上述脱帽试剂，室温反应5分钟，抽干，重新加入8Nml该脱帽试剂室温反应20分钟，依次用DMF洗涤3次，异丙醇洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，加入Fmoc- Thr(tBu)-OH 0.7Ng、DIEA 0.4Nml、TBTU 0.56Ng、HoBT 0.94Ng、、和DMF10Nml反应1.5小时，用真空泵抽干，依次用DMF洗涤3次，异丙醇洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂；
(6)制备Fmoc-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂
在步骤(5)的Fmoc-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂中，加入8Nml上述脱帽试剂，室温反应5分钟，抽干，重新加入8Nml该脱帽试剂室温反应20分钟，依次用DMF洗涤3次，异丙醇洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，加入Fmoc-Gln(Trt)-OH 1.1Ng、DIEA 0.4Nml、TBTU 0.56Ng、HoBT 0.94Ng、和DMF10Nml反应1.5小时，用真空泵抽干，依次用DMF洗涤3次，异丙醇洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得
Fmoc-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂；
(7)制备Fmoc-Gly-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂
在步骤(6)的Fmoc-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂中，加入8Nml上述脱帽试剂，室温反应5分钟，抽干，重新加入8Nml该脱帽试剂室温反应20分钟，依次用DMF洗涤3次，异丙醇洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，加入Fmoc-Gly-OH 0.52Ng、DIEA 0.4Nml、TBTU 0.56Ng、HoBT 0.94Ng、和DMF10Nml反应1.5小时，用真空泵抽干，依次用DMF洗涤3次，异丙醇洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Gly-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂；
(8)制备Gly-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂
在步骤(7)的Fmoc-Gly -Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂中，加入8Nml上述脱帽试剂，室温反应5分钟，抽干，重新加入8Nml该脱帽试剂室温反应20分钟，依次用DMF洗涤3次，异丙醇洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，甲醇洗涤2次，用甲醇浸泡0.5~3小时，抽干，用氮气吹干树脂颗粒，所得到的树脂为Gly-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂；
(9)免疫七肽粗产品的获得
把吹干的Gly-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂倒入玻璃的切割瓶中，加入预冷至-20~10℃的切肽试剂，室温反应1.5小时，过滤除去树脂，加冰乙醚500ml沉淀，3500转3分钟离心收集沉淀物，用乙醚洗涤1~6次，用纯水溶解后，低温冷冻干燥24小时，获得免疫七肽粗品；所述切肽试剂由TFA 9.5Nml、EDT 0.25Nml、和H2O 0.25Nml组成。
优选在本发明的第一方面，该方法进一步包括：
（10）免疫七肽的纯化
将步骤（9）的免疫七肽粗品溶于水溶液中，过滤，滤液经C18色谱柱纯化，其色谱纯化条件是：流动相A：0.1%三氟乙酸加99.9%水（v/v）；流动相B：0.1%三氟乙酸加99.9%乙腈（v/v）；梯度洗脱；流速为10ml／min；检测波长为： 215；用液相色谱仪跟踪收集所需要的流出液，收集样品峰，冻干，获得免疫7肽纯品。若需制备醋酸盐免疫7肽，在收集样品峰（含乙腈）中加入醋酸转成醋酸盐形式或将收集的样品峰液体上阳离子树脂柱被吸附，再用醋酸将其洗脱下来，浓缩体积冷冻干燥，获得免疫七肽的醋酸盐成品。
优选在本发明的第一方面，该方法中，N大于0.5，优选为1至30，更优选为15至25，最优选为20。
优选在本发明的第一方面，该方法中，免疫七肽粗品的产量不小于0.53Ng，优选为0.53N至0.6Ng。
优选在本发明的第一方面，该方法中，免疫七肽粗品的纯度不小于70%。
在第二方面，本发明提供了本发明第一方面所述的方法在规模化生产免疫七肽中的应用。
优选在本发明的第二方面，该方法中，规模化生产是免疫七肽产量在10g以上的生产，优选是免疫七肽产量在10至15g的生产。
在第三方面，本发明提供了制备免疫七肽的方法，其依次包括以下步骤：
(1)制备Fmoc-Gly-树脂
称取2-氯-三苯氯甲基树脂N克加注入反应柱中，加入10Nml DCM，室温浸泡30分钟后用真空泵抽干，加入Fmoc-Gly-OH 0.3Ng、DIEA 0.8Nml、和DCM 10Nml，室温反应1.5小时，再加入封闭试剂甲醇3Nml室温反应0.5小时，树脂依次用DMF洗涤3次，异丙醇洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Gly-树脂；
(2)制备Fmoc-Ser（tBu）-Gly-树脂
在步骤(1)的Fmoc-Gly-树脂中，加入8Nml脱帽试剂，然后置于微波反应器中反应，所述微波反应条件是：温度为55℃，反应时间为5ｍｉｎ，反应完毕后，过滤抽掉溶液，依次用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷各洗涤树脂一次，加入Fmoc-Ser(tBu)-OH 0.64g、和DIEA0.4Nml，置于上述微波反应器中反应，微波反应条件是：温度为55℃，反应时间为5ｍｉｎ，反应完毕后，抽掉反应液，依次用3Nml二甲基甲酰胺、3Nml甲醇、3Nml二氯甲烷各洗涤树脂一次，干燥获得Fmoc-Ser(tBu)-Gly-树脂；所述脱帽试剂为20%哌啶的DMF溶液（v/v）；
(3)制备Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂
在步骤(2)的Fmoc-Ser（tBu）-Gly-树脂中，加入8Nml上述脱帽试剂，然后置于微波反应器中反应，所述微波反应条件是：温度为55℃，反应时间为5ｍｉｎ，反应完毕后，过滤抽掉溶液，依次用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷各洗涤树脂一次，加入Fmoc- Thr(tBu)-OH 0.7Ng、和DIEA 0.4Nml，置于上述微波反应器中反应，微波反应条件是：温度为55℃，反应时间为5ｍｉｎ，反应完毕后，抽掉反应液，依次用3Nml二甲基甲酰胺、3Nml甲醇、3Nml二氯甲烷各洗涤树脂一次，干燥获得Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂；
(4)制备Fmoc-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂
在步骤(3)的Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂中，加入8Nml上述脱帽试剂，然后置于微波反应器中反应，所述微波反应条件是：温度为55℃，反应时间为5ｍｉｎ，反应完毕后，过滤抽掉溶液，依次用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷各洗涤树脂一次，加入Fmoc- Tyr(tBu)-OH 0.8Ng、和DIEA0.4Nml，置于上述微波反应器中反应，微波反应条件是：温度为55℃，反应时间为5ｍｉｎ，反应完毕后，抽掉反应液，依次用3Nml二甲基甲酰胺、3Nml甲醇、3Nml二氯甲烷各洗涤树脂一次，干燥获得Fmoc-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂；
(5)制备Fmoc-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂
在步骤(4)的Fmoc-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂中，加入8Nml上述脱帽试剂，然后置于微波反应器中反应，所述微波反应条件是：温度为55℃，反应时间为5ｍｉｎ，反应完毕后，过滤抽掉溶液，依次用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷各洗涤树脂一次，加入Fmoc- Thr(tBu)-OH 0.7Ng、和DIEA 0.4Nml，置于上述微波反应器中反应，微波反应条件是：温度为55℃，反应时间为5ｍｉｎ，反应完毕后，抽掉反应液，依次用3Nml二甲基甲酰胺、3Nml甲醇、3Nml二氯甲烷各洗涤树脂一次，干燥获得Fmoc-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂；
(6)制备Fmoc-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂
在步骤(5)的Fmoc-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂中，加入8Nml上述脱帽试剂，然后置于微波反应器中反应，所述微波反应条件是：温度为55℃，反应时间为5ｍｉｎ，反应完毕后，过滤抽掉溶液，依次用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷各洗涤树脂一次，加入Fmoc-Gln(Trt)-OH 1.1Ng、和DIEA 0.4Nml，置于上述微波反应器中反应，微波反应条件是：温度为55℃，反应时间为5ｍｉｎ，反应完毕后，抽掉反应液，依次用3Nml二甲基甲酰胺、3Nml甲醇、3Nml二氯甲烷各洗涤树脂一次，干燥获得Fmoc-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂；
(7)制备Fmoc-Gly-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂
在步骤(6)的Fmoc-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂中，加入8Nml上述脱帽试剂，然后置于微波反应器中反应，所述微波反应条件是：温度为55℃，反应时间为5ｍｉｎ，反应完毕后，过滤抽掉溶液，依次用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷各洗涤树脂一次，加入Fmoc-Gly-OH 0.52Ng、和DIEA 0.4Nml，置于上述微波反应器中反应，微波反应条件是：温度为55℃，反应时间为5ｍｉｎ，反应完毕后，抽掉反应液，依次用3Nml二甲基甲酰胺、3Nml甲醇、3Nml二氯甲烷各洗涤树脂一次，干燥获得Fmoc-Gly-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂；
(8)制备Gly-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂
在步骤(7)的Fmoc-Gly -Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂中，加入8Nml上述脱帽试剂，然后置于微波反应器中反应，所述微波反应条件是：温度为55℃，反应时间为5ｍｉｎ，反应完毕后，过滤抽掉溶液，依次用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷各洗涤树脂一次，干燥获得
Gly-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂；
(9)免疫七肽粗产品的获得
把干燥的Gly-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂放入密闭的容器中，加入切肽试剂，置于上述微波反应器中反应，微波反应条件为：温度42℃，反应时间为16ｍｉｎ，然后过滤掉树脂，收集滤液，旋转蒸发除去三氟乙酸，向剩下的液体中加入冰乙醚，沉淀出多肽，然后离心，去除上清液，得到免疫七肽粗品；所述切肽试剂由TFA 9.5Nml、EDT 0.25Nml、和H2O 0.25Nml组成。
优选在本发明的第二方面，该方法进一步包括：
（10）免疫七肽的纯化
将步骤（9）的免疫七肽粗品溶于水溶液中，过滤，滤液经C18色谱柱纯化，其色谱纯化条件是：流动相A：0.1%三氟乙酸加99.9%水（v/v）；流动相B：0.1%三氟乙酸加99.9%乙腈（v/v）；梯度洗脱；流速为10ml／min；检测波长为： 215nm；用液相色谱仪跟踪收集所需要的流出液，收集样品峰，冻干，获得免疫7肽纯品。若需制备醋酸盐免疫7肽，在收集样品峰（含乙腈）中加入醋酸转成醋酸盐形式或将收集的样品峰液体上阳离子树脂柱被吸附，再用醋酸将其洗脱下来，浓缩体积冷冻干燥，获得免疫七肽的醋酸盐成品。
优选在本发明的第二方面，该方法中N大于0.5，优选为0.7至5，更优选为0.8至2，最优选为1。
本发明的其他有益效果是：具备规模化生产能力，工艺稳定，原辅材料来源方便，生产周期短，生产成本低，收率高，纯度好，质量稳定，极具市场竞争力；该温和的Fmoc路线，每步脱Fmoc仅用20%的PIP，每步缩合反应时间短，大大缩短的生产周期；采用合理封闭技术，提高粗产品纯度；切割采用TFA，避免使用氟化氢，大大减少了三废，有利于工业化生产。
术语、试剂、设备
本文的术语解释如下：
GQTYTSG的肽: 本文中简称为“免疫七肽”
英文代号 化学名称
Gly-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly
Gly glycine 甘氨酸 G 购自吉尔生化（上海）有限公司……
Gln glutamine 谷氨酰胺 Q 购自吉尔生化（上海）有限公司……
Thr threonine 苏氨酸 T 购自吉尔生化（上海）有限公司………
Tyr tyrosine 酪氨酸 Y 购自吉尔生化（上海）有限公司
Ser serine 丝氨酸 S 购自吉尔生化（上海）有限公司……
PIP 六氢吡啶 哌啶 购自吉尔生化（上海）有限公司……
DIC N,N-异丙基碳化二亚胺 购自天津市福晨化学试剂厂………
HOBt 1-羟基-苯并-三氮唑 购自天津市福晨化学试剂厂………
DMF 二甲基甲酰胺 购自天津市福晨化学试剂厂………
DIEA N,N-二异丙基乙胺 购自…天津市福晨化学试剂厂……
DCM 二氯甲烷 购自天津市福晨化学试剂厂………
TFA 三氟乙酸 购自上海诚心化工有限公司………
EDT 乙二硫醇 购自吉尔生化（上海）有限公司…
乙醚…… 购自西安化学试剂厂
p-Cresol 对甲苯酚 购自吉尔生化（上海）有限公司………
tBu 叔丁基 购自吉尔生化（上海）有限公司………
Trt 三苯甲基 购自吉尔生化（上海）有限公司………
ACN 乙腈 购自美国Fisher公司……
Fmoc 芴甲氧羰酰基 购自吉尔生化（上海）有限公司………
BOP 7-氮杂苯并唑-1-基-氧·(三-(二甲胺基)膦)六氟磷酸盐 购吉尔生化（上海）有限公司……
HOAt N·羟基-7-偶氮苯并三氮唑 购自吉尔生化（上海）有限公司
HATU 2-(7-偶氮苯并三氮唑)- N,N,N`,N`,-四甲基脲六氟磷酸酯 购自吉尔生化（上海）有限公司
HCTU 6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯 购自吉尔生化（上海）有限公司
HOBT 1-羟基-苯并-三氮唑 购自吉尔生化（上海）有限公司…
TBTU 1-氧-双二甲胺羰基苯骈三氮唑四氟化硼盐 购自吉尔生化（上海）有限公司…
多肽合成反应器 自制
超纯水净水器 美国Millipore 公司SA67120
磁力搅拌器 杭州仪表电机有限公司
台式低速自动平衡离心机 湖南湘仪实验仪器开发有限公司
液相色谱纯化系统 美国Waters公司Delta600
微波合成仪 VOYAGER产品 Explorer 12
冻干机 浦东冷冻干燥设备厂CJ300B
实验室常规试剂和实验室常规仪器
以上术语中包含了本发明所需要的试剂、所需要的仪器设备。
本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。
为了便于理解，以下将通过具体的实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见了。
具体实施方式
以下将通过具体的实施例进行说明，未特别指明来源之化学物质，均可通过市售渠道获得；未特别指明之操作，可参见J.M. Steward和J.D. Young的《Solid Phase Peptide Synthesis》(第二版，Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois(1984))和J. Meienhofer的《Hormonal Proteins and Peptides》（第2卷，Academic Press，纽约(1973)）等书籍。
实施例1 1克级别二氯树脂的免疫七肽合成过程
(1)制备Fmoc-Gly-树脂
称取2-氯-三苯氯甲基树脂(载量：1.0mmol／g)1克加注入反应柱中，加入10ml DCM，室温浸泡30分钟后用真空泵抽干，加入Fmoc-Gly-OH 0.3g、DIEA 0.8ml、和DCM 10ml，室温反应1.5小时，再加入封闭试剂甲醇3ml室温反应0.5小时，树脂依次用10mlDMF洗涤3次，10ml异丙醇洗涤3次，重蒸过的5ml DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Gly-树脂；
(2)制备Fmoc-Ser（tBu）-Gly-树脂
在步骤(1)的Fmoc-Gly-树脂中，加入7.5ml脱帽试剂（20%哌啶的DMF溶液（v/v）），室温反应5分钟，抽干，重新加入7.5ml该脱帽试剂室温反应20分钟，依次用8ml DMF洗涤3次，8ml异丙醇洗涤3次，重蒸过的5ml DMF洗涤2次，抽干，加入Fmoc-Ser(tBu)-OH 0.64Ng、DIEA0.4ml、TBTU 0.56Ng、HoBT 0.94Ng、和DMF10ml于室温反应1.5小时，用真空泵抽干，依次用10ml DMF洗涤3次，10ml异丙醇洗涤3次，重蒸过的5ml DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Ser(tBu)-Gly-树脂；
(3)制备Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂
在步骤(2)的Fmoc-Ser（tBu）-Gly-树脂中，加入7.5ml上述脱帽试剂，室温反应5分钟，抽干，重新加入7.5ml该脱帽试剂室温反应20分钟，依次用8ml DMF洗涤3次，8ml异丙醇洗涤3次，重蒸过的5ml DMF洗涤2次，抽干，加入Fmoc- Thr(tBu)-OH 0.5g、DIEA 0.4ml、TBTU 0.56Ng、HoBT 0.94Ng、和DMF10ml反应1.5小时，用真空泵抽干，依次用10ml DMF洗涤3次，10ml异丙醇洗涤3次，重蒸过的5ml DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂；
(4)制备Fmoc-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂
在步骤(3)的Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂中，加入7.5ml上述脱帽试剂，室温反应5分钟，抽干，重新加入7.5ml该脱帽试剂室温反应20分钟，依次用8ml DMF洗涤3次，8ml异丙醇洗涤3次，重蒸过的5ml DMF洗涤2次，抽干，加入Fmoc- Tyr(tBu)-OH 0.8g、DIEA0.4ml、TBTU 0.56Ng、HoBT 0.94Ng、和DMF10ml反应1.5小时，用真空泵抽干，依次用10ml DMF洗涤3次，10ml异丙醇洗涤3次，重蒸过的5ml DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂；
(5)制备Fmoc-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂
在步骤(4)的Fmoc-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂中，加入7.5ml上述脱帽试剂，室温反应5分钟，抽干，重新加入7.5ml该脱帽试剂室温反应20分钟，依次用8ml DMF洗涤3次，8ml异丙醇洗涤3次，重蒸过的5ml DMF洗涤2次，抽干，加入Fmoc- Thr(tBu)-OH 0.5g、DIEA 0.4ml、TBTU 0.56Ng、HoBT 0.94Ng、和DMF10ml反应1.5小时，用真空泵抽干，依次用10ml DMF洗涤3次，10ml异丙醇洗涤3次，重蒸过的5ml DMF洗涤2次，抽干，获得
Fmoc-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂；
(6)制备Fmoc-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂
在步骤(5)的Fmoc-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂中，加入7.5ml上述脱帽试剂，室温反应5分钟，抽干，重新加入7.5ml该脱帽试剂室温反应20分钟，依次用8ml DMF洗涤3次，8ml异丙醇洗涤3次，重蒸过的5ml DMF洗涤2次，抽干，加入Fmoc-Gln(Trt)-OH 1.1g、DIEA 0.4ml、TBTU 0.56Ng、HoBT 0.94Ng、和DMF10ml反应1.5小时，用真空泵抽干，依次用10ml DMF洗涤3次，10ml异丙醇洗涤3次，重蒸过的5ml DMF洗涤2次，抽干，获得
Fmoc-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂；
(7)制备Fmoc-Gly-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂
在步骤(6)的Fmoc-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂中，加入7.5ml上述脱帽试剂，室温反应5分钟，抽干，重新加入7.5ml该脱帽试剂室温反应20分钟，依次用8ml DMF洗涤3次，8ml异丙醇洗涤3次，重蒸过的5ml DMF洗涤2次，抽干，加入Fmoc-Gly-OH 0.52g、DIEA 0.4ml、TBTU 0.56Ng、HoBT 0.94Ng、和DMF10ml反应1.5小时，用真空泵抽干，依次用10ml DMF洗涤3次，10ml异丙醇洗涤3次，重蒸过的5ml DMF洗涤2次，抽干，获得
Fmoc-Gly-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂；
(8)制备Gly-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂
在步骤(7)的Fmoc-Gly -Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂中，加入7.5ml上述脱帽试剂，室温反应5分钟，抽干，重新加入7.5ml该脱帽试剂室温反应20分钟，依次用8ml DMF洗涤3次，8ml异丙醇洗涤3次，重蒸过的5ml DMF洗涤2次，5ml甲醇洗涤2次，用5ml甲醇浸泡0.5~3小时，抽干，用氮气吹干树脂颗粒，所得到的树脂为Gly-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂；
(9)免疫七肽粗产品的获得
把吹干的Gly-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂倒入玻璃的切割瓶中，加入预冷至-20~10℃的切肽试剂(配方：TFA 9.5ml，EDT 0.25ml，H2O 0.25ml)，室温反应1.5小时，过滤除去树脂，加冰乙醚500ml沉淀，3500转3分钟离心收集沉淀物，用5ml乙醚洗涤3次，用纯水溶解后，低温冷冻干燥24小时，获得免疫七肽粗品0.53g，纯度为78 %；
（10）免疫七肽的纯化
将上述免疫七肽粗品溶于水溶液中，过滤，滤液经C18色谱柱（可购自岛津公司）纯化，其条件是：流动相A：0.1%三氟乙酸加99.9%水（v/v）；流动相B：0.1%三氟乙酸加99.9%乙腈（v/v）；梯度洗脱；流速为10ml／min；检测波长为： 215；用液相色谱仪跟踪收集所需要的流出液，收集样品峰，冻干，获得成品0.39g(MW：712.8)，纯度为98 %。
实施例2微波固相合成免疫七肽
所述方法基本与实施例1相同，不同之处在于：
（1）在实施例1各步骤（2）-（8）中的“加入7.5ml脱帽试剂（20%哌啶的DMF溶液（v/v））”直至该步骤结束的过程被替换为：
加入7.5ml脱帽试剂（20%哌啶的DMF溶液（v/v）），然后置于微波反应器（ VOYAGER产品 Explorer 12）中反应，微波条件是：温度为55℃，反应时间为5ｍｉｎ，反应完毕后，过滤抽掉溶液，依次用3ml二甲基甲酰胺、3ml甲醇、3ml二氯甲烷各洗涤树脂一次，加入与实施例1中相同量的Fmoc保护的氨基酸（如，实施例1步骤（2）中的Fmoc-Ser(tBu)-OH，以此类推其他步骤）和DIEA，置于上述微波反应器中反应，微波条件是：温度为55℃，反应时间为5ｍｉｎ，反应完毕后，抽掉反应液，依次用3ml二甲基甲酰胺、3ml甲醇、3ml二氯甲烷各洗涤树脂一次，干燥。
（2）实施例1步骤（9）被替换为：
把干燥的Gly-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂放入密闭的容器中，加入切割试剂(配方：TFA 9.5ml，EDT 0.25ml，H2O 0.25ml)，置于上述微波反应器中反应，微波条件为：温度42℃，反应时间为16ｍｉｎ，然后过滤掉树脂，收集滤液，旋转蒸发除去三氟乙酸，向剩下的液体中加入冰乙醚，沉淀出多肽，然后离心，去除上清液，得到免疫七肽粗品0.55g，纯度为80%。
实施例 3 产业规模化的免疫七肽合成过程
将实施例1的实验室级制备直接扩大20倍进行规模化生产，即称取2-氯-三苯氯甲基树脂(载量：1.0mmol／g)20克加注入相应工业用反应柱中，如未特别说明，所需试剂均为实施例1的20倍，条件均于实施例1相同，进行相应的步骤（1）-（9），得13g免疫七肽粗品，纯度为80.5%。由此可见，根据本发明的优化条件可以直接进行放大生产，其产量和纯度都不会在扩大中造成损失。
Claims (2)
1.制备免疫七肽的方法，其依次包括以下步骤：
(1)制备Fmoc-Gly-树脂
称取2-氯-三苯氯甲基树脂1克加注入反应柱中，加入10ml DCM，室温浸泡30分钟后用真空泵抽干，加入Fmoc-Gly-OH 0.3g、DIEA 0.8ml、和DCM 10ml，室温反应1.5小时，再加入封闭试剂甲醇3ml室温反应0.5小时，树脂依次用DMF洗涤3次，异丙醇洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Gly-树脂；
(2)制备Fmoc-Ser（tBu）-Gly-树脂
在步骤(1)的Fmoc-Gly-树脂中，加入7.5ml脱帽试剂，室温反应5分钟，抽干，重新加入7.5ml该脱帽试剂室温反应20分钟，依次用DMF洗涤3次，异丙醇洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，加入Fmoc-Ser(tBu)-OH 0.64g、DIEA0.4ml、TBTU 0.56g、HoBT0.94g、和DMF10ml于室温反应1.5小时，用真空泵抽干，依次用DMF洗涤3次，异丙醇洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Ser(tBu)-Gly-树脂；所述脱帽试剂为20%哌啶的DMF溶液v/v；
(3)制备Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂
在步骤(2)的Fmoc-Ser（tBu）-Gly-树脂中，加入7.5ml上述脱帽试剂，室温反应5分钟，抽干，重新加入7.5ml该脱帽试剂室温反应20分钟，依次用DMF洗涤3次，异丙醇洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，加入Fmoc- Thr(tBu)-OH 0.5g、DIEA 0.4ml、TBTU 0.56g、HoBT0.94g、和DMF10ml反应1.5小时，用真空泵抽干，依次用DMF洗涤3次，异丙醇洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂；
(4)制备Fmoc-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂
在步骤(3)的Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂中，加入7.5ml上述脱帽试剂，室温反应5分钟，抽干，重新加入7.5ml该脱帽试剂室温反应20分钟，依次用DMF洗涤3次，异丙醇洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，加入Fmoc- Tyr(tBu)-OH 0.8g、DIEA0.4ml、TBTU 0.56g、HoBT 0.94g、和DMF10ml反应1.5小时，用真空泵抽干，依次用DMF洗涤3次，异丙醇洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂；
(5)制备Fmoc-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂
在步骤(4)的Fmoc-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂中，加入7.5ml上述脱帽试剂，室温反应5分钟，抽干，重新加入7.5ml该脱帽试剂室温反应20分钟，依次用DMF洗涤3次，异丙醇洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，加入Fmoc- Thr(tBu)-OH 0.5g、DIEA 0.4ml、TBTU 0.56g、HoBT0.94g、和DMF10ml反应1.5小时，用真空泵抽干，依次用DMF洗涤3次，异丙醇洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂；
(6)制备Fmoc-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂
在步骤(5)的Fmoc-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂中，加入7.5ml上述脱帽试剂，室温反应5分钟，抽干，重新加入7.5ml该脱帽试剂室温反应20分钟，依次用DMF洗涤3次，异丙醇洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，加入Fmoc-Gln(Trt)-OH 1.1g、DIEA 0.4ml、TBTU 0.56g、HoBT 0.94g、和DMF10ml反应1.5小时，用真空泵抽干，依次用DMF洗涤3次，异丙醇洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂；
(7)制备Fmoc-Gly-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂
在步骤(6)的Fmoc-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂中，加入7.5ml上述脱帽试剂，室温反应5分钟，抽干，重新加入7.5ml该脱帽试剂室温反应20分钟，依次用DMF洗涤3次，异丙醇洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，加入Fmoc-Gly-OH 0.52g、DIEA 0.4ml、TBTU 0.56g、HoBT 0.94g、和DMF10ml反应1.5小时，用真空泵抽干，依次用DMF洗涤3次，异丙醇洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc-Gly-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂；
(8)制备Gly-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂
在步骤(7)的Fmoc-Gly -Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂中，加入7.5ml上述脱帽试剂，室温反应5分钟，抽干，重新加入7.5ml该脱帽试剂室温反应20分钟，依次用DMF洗涤3次，异丙醇洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，甲醇洗涤2次，用甲醇浸泡0.5~3小时，抽干，用氮气吹干树脂颗粒，所得到的树脂为Gly-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂；
(9)免疫七肽粗产品的获得
把吹干的Gly-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-树脂倒入玻璃的切割瓶中，加入预冷至-20~10℃的切肽试剂，室温反应1.5小时，过滤除去树脂，加冰乙醚500ml沉淀，3500转3分钟离心收集沉淀物，用乙醚洗涤1~6次，用纯水溶解后，低温冷冻干燥24小时，获得免疫七肽粗品；所述切肽试剂由TFA 9.5ml、EDT 0.25ml、和H2O 0.25ml组成;
Gly glycine 甘氨酸
Gln glutamine 谷氨酰胺
Thr threonine 苏氨酸
Tyr tyrosine 酪氨酸
Ser serine 丝氨酸
tBu 叔丁基
Trt 三苯甲基
Fmoc 芴甲氧羰酰基
DCM 二氯甲烷
DMF 二甲基甲酰胺
DIEA N,N-二异丙基乙胺
TFA 三氟乙酸
EDT 乙二硫醇。
2.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括：
（10）免疫七肽的纯化
将步骤（9）的免疫七肽粗品溶于水溶液中，过滤，滤液经C18色谱柱纯化，其色谱纯化条件是：流动相A：0.1%三氟乙酸加99.9%水 v/v；流动相B：0.1%三氟乙酸加99.9%乙腈v/v；梯度洗脱；流速为10ml／min；检测波长为： 215nm；用液相色谱仪跟踪收集所需要的流出液，收集样品峰，冻干，获得免疫七肽纯品；若需制备醋酸盐免疫七肽，在收集含乙腈的样品峰中加入醋酸转成醋酸盐形式或将收集的样品峰液体上阳离子树脂柱被吸附，再用醋酸将其洗脱下来，浓缩体积冷冻干燥，获得免疫七肽的醋酸盐成品。
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