CN102226786A - 一种准确测定卷烟主流烟气中游离烟碱的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种准确测定卷烟主流烟气中游离烟碱的方法。该方法采用聚二甲基硅氧烷/苯乙烯为萃取材料对卷烟主流烟气滤片进行固相微萃取，并进行气相色谱/质谱联用仪定量分析，得到游离烟碱初步结果，将该初步结果经水分校正曲线进行校正后，得到卷烟主流烟气游离烟碱测定结果。方法评价数据表明，本方法具有测定结果准确，重现性好、对游离烟碱与质子态烟碱之间的平衡破坏少等优点。

Description

一种准确测定卷烟主流烟气中游离烟碱的方法

技术领域

本发明属于卷烟评测技术领域，具体涉及一种能够准确测定卷烟主流烟气中游离烟碱的方法。

背景技术

卷烟主流烟气中迄今为止鉴定了5000余种化合物，但烟碱在这些化合物中起到了重要的作用并因此激发了科学家们更多的研究兴趣。1970年，Armitage（Armitage, Nature, 1970）发现游离烟碱比质子态烟碱具有更强的亲酯性，更易于穿透口腔黏膜从而更快速的被人体吸收。人们针对游离烟碱在人体中的吸收代谢（Schievelbein, Agents Actions 1973; Taylor, Proc. Natl. Acad. Sci. 2010）、游离烟碱的成瘾性以及游离烟碱与卷烟抽吸品质（陈建潭，烟草科技 2000; 于川芳，烟草科技 2006）等方面开展了大量的工作。

由于游离烟碱与质子态烟碱存在动态的平衡，游离烟碱的含量易受到诸如水分、温度、溶剂等因素的干扰。因此，游离烟碱的测定方法研究仍然为本领域的一项技术难题。

目前所报道的游离烟碱的测定方法主要有：pH测定法、溶剂萃取法、核磁共振法、气袋捕集法和计算法。随着现代测量仪器的发展，顶空固相微萃取法被应用到游离烟碱的测定中。

pH测定法：通过测定卷烟烟气pH值，利用pH值和烟碱酸碱平衡常数之间的关系，计算得到游离烟碱和质子态烟碱的比值，再结合卷烟烟气中总烟碱的含量，计算得到游离烟碱的含量（Morie, Tobacco Science 1972; 陈建潭，烟草科技 2000）。

溶剂萃取法：利用游离烟碱溶于有机溶剂，而质子态烟碱不溶的性质，采用有机溶剂对剑桥滤片进行萃取，分析游离烟碱的含量（卢斌斌, 烟草科技 2002; 卢斌斌, 烟草科技 2003; 卢斌斌, 中国烟草学报 2005）。

核磁共振法：根据烟碱分子中吲哚环N-CH3核磁共振氢谱信号在N原子被质子化和非质子化状态下的不同，通过测定N-CH3信号的化学位移，信号积分的的关系，得出卷烟烟气中游离烟碱的含量（Pankow, Chem. Res. Toxicol 2003）。

气袋捕集法：利用游离态烟碱具有一定挥发性，而质子态烟碱无挥发性的特点，将烟气用气袋捕集，在将气袋气体部分进行采用TENAX^®-TA材料富集，将富集的脱附管进行分析，得出游离烟碱的含量（Pankow, Chem. Res. Toxicol 2003）。

理论计算研究表明，烟碱吡咯环的N原子碱性明显大于吡啶环的N原子。现有研究表明，当pH为3.1时，双质子化烟碱和单质子化烟碱各占50%，而在pH为6.0时，烟碱便开始部分游离，在pH为8.0时，游离烟碱和吡咯环单质子化烟碱比例各为50%（Sussman, Science, 1991; Dougherty, Science, 1990; Graton, J. Am. Chem. Soc., 2002）。

Watson将顶空固相微萃取应用到卷烟主流烟气游离烟碱的测定中，并考察了低极性、不受pH影响的氘代甲苯和氘代烟碱作为内标的优略。其方法为了保证烟碱的游离，使用液氮冷却方式定量通入氨气，建立了标准曲线，并在实际样品中加入了2 mL的缓冲溶液测定，方法具有很强的创新性，系首次将顶空固相微萃取引入到游离烟碱的测定中。在标准曲线的绘制上，其操作略显复杂（Watson, J. Agric. Food Chem. 2004）。

Bao对Watson的方法进行了改进，对同一块剑桥滤片均匀的分割，采用了氘代甲苯为内标，对其中半块滤片进行游离烟碱分析，另半块滤片进行水分的分析，并用水份校正曲线对游离烟碱分析结果进行校正。研究对2R4F和Canadian Monitor 8两种卷烟为研究对象，采用了ISO抽吸模式和Canadian Intense抽吸模式对游离烟碱测定结果对比（Bao, Analytical Chimica Acta, 2010），但其对固相微萃取材料的研究较少。

综上所述，建立一种易于推广并能准确测定卷烟主流烟气中游离烟碱的含量的方法，可以客观真实的反应卷烟烟气中游离烟碱的含量，对卷烟配方设计、产品维护及质量控制等方面具有指导借鉴意义。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，尤其是针对现有测定方法对游离烟碱水分校正曲线的建立方式重现性差、内标在不同牌号卷烟烟气滤片上表现值差异较大、预平衡时间过短导致没有达到游离烟碱稳定平衡点等缺陷，以及现有测定方法操作复杂等问题，提供一种方法简便，能够准确测定卷烟主流烟气中游离烟碱的方法。

本发明的目的通过以下技术方案实现。

除非另有说明，本发明所采用的百分数均为质量百分数。

一种准确测定卷烟主流烟气中游离烟碱的方法，包括以下步骤：

1、标准工作曲线的建立

①配制浓度为5 g/L、10 g/L、25 g/L、50 g/L、100 g/L的烟碱标准工作溶液，溶剂为正己烷；

②取5个干燥的带盖顶空瓶，在每个顶空瓶中放置一个干燥的空白玻璃纤维滤片，自上述不同浓度的烟碱标准工作溶液中各取2 μL加入到一个滤片上，每个滤片对应一个浓度的标准工作溶液，为了保证标准曲线建立的准确性，须将顶空瓶在30 ℃条件下充分平衡5 h，再进行分析测试；

③将5个标准样品的游离烟碱响应值与游离烟碱的含量进行线性回归，得到标准工作曲线，曲线强制归零，线性相关系数R²须大于0.999；

2、水分校正曲线的建立

①配制25 g/L的烟碱正己烷溶液，再分别配置浓度为25 g/L、10 g/L、6.25 g/L、5 g/L、2.5 g/L、2 g/L的烟碱水溶液，共7种烟碱溶液；

②分别向7个内装有一个干燥空白玻璃纤维滤片的顶空瓶中加入上述7种烟碱溶液，每个顶空瓶中滴加一种烟碱溶液；分别是2.0 μL浓度为25 g/L的烟碱正己烷溶液、2.0 μL浓度为25 g/L的烟碱水溶液、5.0 μL浓度为10 g/L的烟碱水溶液、8.0 μL浓度为6.25 g/L的烟碱水溶液、10.0 μL浓度为5 g/L的烟碱水溶液、20.0 μL浓度为2.5 g/L的烟碱水溶液和25.0 μL浓度为2 g/L的烟碱水溶液；上述7个水分校正标准样品中，游离烟碱的总量为50 µg，水分含量分别为0 mg、2 mg、5 mg、8 mg、10 mg、20 mg和25 mg，为了保证水分校正曲线建立的准确性，水分校正标准样品须在30 ℃平衡48 h后，上机测试；

③记录7个水分校正标准样品中游离烟碱响应值，分别将该响应值与烟碱正己烷溶液样品的响应值相除，得到7个水分校正标准样品的响应值比，将该响应值比的倒数与滤片水分含量进行线性回归，得到水分校正曲线，线性相关系数R²须大于0.99；

3、待测样品准备

①卷烟样品放置于温度20℃、相对湿度RH60%的恒温恒湿箱中平衡48 h；

②按照ISO 3308:2000《Routine analytical cigarette-smoking machine -- Definitions and standard conditions》，即《卷烟--常规分析用吸烟机—定义和标准条件》所定义的抽吸条件抽吸5支卷烟，抽吸两次，得到两个滤片；

③其中一个滤片样品放置于顶空瓶中并密封，在30 ℃平衡5 h后进行游离烟碱分析测试；

④另一个滤片样品按照YC/T 157-2001《卷烟 总粒相物中水分的测定 气相色谱法》测定其水分含量；

4、游离烟碱仪器分析条件

①固相微萃取针：

萃取材料为：聚二甲基硅氧烷/苯乙烯材料，部分交联，材料膜厚为65 μm；

②固相微萃取条件：

预平衡温度：30 ℃；预平衡时间：600 s；萃取时间：600 s；脱附时间：180 s；洗针时间：900 s；洗针温度：250 ℃；洗针气体：纯度≥99.999%的高纯氮气；洗针压力设置为：0.2 MPa；

③色谱分析条件：

以纯度≥99.999%的氦气为载气，恒流模式，流量为1.5 mL/min；采用分流进样方式，分流比为40:1，程序升温条件为初始温度50 ℃，保持2 min，以30 ℃/min的升温速率升至210 ℃，保持2 min，以30 ℃/min的升温速率升至240 ℃，保持3 min；

④质谱分析条件：

电离方式采用电子轰击源，电离能量为70 eV；离子源温度为230 ℃；四极杆温度为150 ℃；传输线温度为250 ℃；游离烟碱定量离子为84，辅助定量离子为133和162；

5、分析结果的计算及分析结果的校正

①读出待测样品游离烟碱的响应值，根据步骤（1）所建立的标准曲线计算得到样品的游离烟碱初始数据；

②记录步骤（3）中所测定的样品的水分结果，将该结果采用步骤（2）所建立的水分校正曲线对样品的游离烟碱初始数据进行校正，即得到样品主流烟气中游离烟碱的含量。

与现有技术相比，本发明具有以下优势：

1、改进了水分校正曲线的建立方式，使得水分校正曲线的线性关系更为良好，校正结果更为准确。

2、采用了外标法定量，避免了内标在不同牌号卷烟主流烟气中响应值不稳定的现象，使定量结果更为准确。

3、优化了样品的预平衡时间，使测试样品得以充分的平衡，测定结果更为准确。

附图说明

图1为采用水分校正曲线校正3R4F参比卷烟样品游离烟碱的数据对比；

图2为不同水分含量对3R4F参比卷烟主流烟气游离烟碱的影响。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明分析条件等技术要点，并不用于限定本发明。

实施例 1

所使用的主要试剂及仪器

烟碱：纯度≥99%；

正己烷：色谱纯，美国Fisher公司；

超纯水：18 MΩ，Millipore纯水仪自制；

3R4F参比卷烟，美国Kentucky大学；

顶空固相微萃取自动进样器的气相色谱/质谱联用仪，美国Agilent公司；

ZB-624弹性毛细管14%氰丙基苯和86%二甲基聚硅氧烷柱，长度为30 m，内径为0.32 mm，膜厚为1.8 μm，美国Phenomenex公司；

65 µm聚二甲基硅氧烷/苯乙烯固相微萃取头，部分交联，美国Supelco公司；

RM-20H圆盘式吸烟机，德国Borgwaldt公司；

玻璃纤维滤片，直径44mm；

分析天平，感量0.1 mg；

手动微量进样针；

各种规格棕色容量瓶；

1. 标准工作样品的建立

1.1 将直径44 mm空白玻璃纤维滤片，20 mL带盖顶空瓶在100 ℃烘箱中干燥5个小时，待水分去除后放置于干燥皿中保存待用。将空白玻璃纤维滤片分别放置于5个20 mL顶空瓶中，每瓶放置一个滤片。

1.2 配制浓度为5 g/L、10 g/L、25 g/L、50 g/L、100 g/L的烟碱标准工作溶液，以正己烷为溶剂定容。

1.3 在5个顶空瓶中的滤片上分别准确加入2 μL浓度为5 g/L、10 g/L、25 g/L、50 g/L、100 g/L烟碱标准工作溶液，将顶空瓶在30 ℃平衡5 h后进行分析测试。

1.4 将5个标准样品的游离烟碱响应值与游离烟碱的含量进行线性回归，得到标准工作曲线，曲线强制归零，线性相关系数R²为0.999。

2. 待测样品准备

2.1 卷烟样品放置于恒温恒湿箱平衡48 h，恒温恒湿箱温度为20 ℃，相对湿度设定为RH60%。按照ISO 3308:2000抽吸条件抽吸5支卷烟，抽吸两次，抽吸前检查抽吸容量，并按规定作相应修正。

2.2 将一个滤片样品放置于20 mL顶空瓶中并密封，在30 ℃平衡5 h后进行游离烟碱分析测试。另一个滤片样品按照YC/T 157-2001测定其水分含量。

3. 水分校正样品的准备

3.1 将直径44 mm空白玻璃纤维滤片，20 mL带盖顶空瓶在100 ℃烘箱中干燥5个小时，待水分去除后放置于干燥皿中保存待用。将空白玻璃纤维滤片分别放置于7个20 mL顶空瓶中，每瓶放置一个滤片。

3.2 向每个顶空瓶中加入以下烟碱溶液，见表1，各样品在30 ℃平衡48 h后上机测试。

*所用溶剂为正己烷

3.3 记录7个水分校正标准样品中游离烟碱响应值，将该响应值与烟碱正己烷溶液样品的响应值相除，得到7个水分校正标准样品的响应值比，将该响应值比的倒数与滤片水分含量进行线性回归，得到水分校正曲线，曲线不强制归1，线性相关系数R²须为0.999。

4. 游离烟碱仪器分析条件

4.1 采用聚二甲基硅氧烷/苯乙烯材料，部分交联，材料膜厚为65 μm。预平衡温度：30 ℃；预平衡时间：600 s；萃取时间：600 s；脱附时间：180 s；洗针时间：900 s；洗针温度：250 ℃；洗针气体：纯度≥99.999%的高纯氮气；洗针压力设置为：0.2 MPa

4.2 以纯度≥99.999%的氦气为载气，恒流模式，流量为1.5 mL/min；进样口温度为250 ℃；采用分流进样方式，分流比40：1；升温程序为初始温度50 ℃，保持2 min，以30 ℃/min的升温速率升至210 ℃，保持2 min，以30 ℃/min的升温速率升至240 ℃，保持3 min；

4.3 采用电离方式采用电子轰击源，电离能量为70 eV；离子源温度为230 ℃；四极杆温度为150 ℃；传输线温度为250 ℃。游离烟碱定量离子为84，辅助定量离子为133和162。

5. 分析结果的计算及分析结果的校正

5.1 读出待测样品游离烟碱的响应值，根据1.4所建立的标准曲线计算得到样品的游离烟碱分析结果。根据抽吸卷烟的数量，得出每支卷烟主流烟气中游离烟碱的含量。

5.2 记录2.2中所测定的样品的水分结果，将该结果采用步骤3.3所建立的水分校正曲线对游离烟碱分析结果进行校正，得到样品主流烟气中游离烟碱的含量。

6. 方法评价

6.1 方法的标准曲线、水分校正曲线的验证、检出限和定量限

根据上述分析方法，建立了分析方法的标准曲线，其回归方程为Y=60045X，线性相关系数R²为0.999，其中Y为游离烟碱的响应值，X为5支卷烟滤片中游离烟碱的总含量，60045为回归方程斜率。

根据上述水分校正曲线建立方法，所建立的水分校正曲线回归方程为：Y=0.127X+1.05，线性相关系数R²为0.999。其中Y为各水分含量样品游离烟碱含量的倒数，X为各样品水分含量，0.127为回归方程斜率，1.05为回归方程截距。同时，采用肯塔基3R4F参比卷烟为实验对象，分别抽吸得到9块滤片，其中一块用于测定该滤片中水分的含量，选取其中4块滤片作为空白对照，测定其中游离烟碱的含量。另外4块滤片加入5~20 mg的水分，并将4块滤片测定结果进行水分校正，得到4块滤片游离烟碱的含量，将该含量与空白对照的含量进行比对，见附图1。结果表明：经过水分校正的样品的游离烟碱的含量与空白样品游离烟碱的含量差别较小，并且水分校正曲线线性相关系数R²为0.999，充分说明本方法所建立的水分校正曲线建立科学、有效。

采用标准曲线最低浓度的标准溶液平行测定10次，并计算其标准偏差，得到方法的检出限（LOD）为0.2 µg/支，定量限（LOQ）为0.5 µg/支。

6.2 方法的精密度

以肯塔基3R4F参比卷烟为实验对象，平行测定10份样品的游离烟碱，如表2所示，相对标准偏差为8.3%，方法精密度达到检测要求。

实施例 2

重复实施例1，有以下不同点：固相微萃取材料采用聚二甲基硅氧烷，非键合，材料膜厚为100 μm。

结果表明：采用本实施例所用固相微萃取材料，其选择性较差，但对游离烟碱的选择性离子扫描无明显干扰。

实施例 3

重复实施例1，有以下不同点：固相微萃取材料采用聚二甲基硅氧烷，键合，材料膜厚为7 μm。

结果表明：采用本实施例所用固相微萃取材料，其选择性较差，杂质干扰较多，此外，萃取材料对游离烟碱萃取容量小，当用于高游离烟碱含量样品分析时，存在过载现象。

实施例 4

重复实施例1，有以下不同点：固相微萃取材料采用聚丙烯酸酯，部分交联，材料膜厚为85 μm。

结果表明：采用本实施例所用固相微萃取材料，其选择性较好，但对游离烟碱的萃取效率较低。

实施例 5

重复实施例1，有以下不同点：固相微萃取材料采用聚乙二醇/苯乙烯，部分交联，材料膜厚为65 μm。

结果表明：采用本实施例所用固相微萃取材料，游离烟碱色谱峰拖尾严重，萃取效率低。

实施例 6

重复实施例1，有以下不同点：固相微萃取材料采用碳分子筛/聚二甲基硅氧烷，部分交联，材料膜厚为75 μm。

结果表明：采用本实施例所用固相微萃取材料，对游离烟碱的萃取效率低。

实施例 7

重复实施例1，有以下不同点：固相微萃取材料采用聚苯乙烯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷，高度交联，材料膜厚为50/30 μm。

结果表明：采用本实施例所用固相微萃取材料，对游离烟碱的萃取效率一般，游离烟碱色谱峰拖尾严重。

实施例 8 ～ 12

重复实施例1，有以下不同点：针对同一样品，梯度加入不同溶剂用量，以考察溶剂对游离烟碱萃取效率的影响，实施例8采用1 μL正己烷，实施例9采用2 μL正己烷，实施例10采用3 μL正己烷，实施例11采用4 μL正己烷，实施例12采用5 μL正己烷。

通过以上实施例的实施，结果表明：5 μL以内的正己烷用量对游离烟碱的萃取效率及响应值无显著影响。

实施例 13 ～ 21

重复实施例1,有以下不同点：采用不同平衡时间，以考察游离烟碱和质子态烟碱是否达到平衡，以及确定样品的稳定性，以保证测定数据的科学性。实施例13采用1 min，实施例14采用5 min，实施例15采用30 min，实施例16采用60 min，实施例17采用120 min，实施例18采用200 min，实施例19采用300 min，实施例20采用900 min，实施例21采用2880 min。

通过实施例13～21的实施，结果表明：在30 ℃平衡300 min之后，游离烟碱的响应峰面积达到平台，表明游离烟碱在滤片和气相中已达到平衡，并且在48 h内保持稳定。如表3所示。

表 3 不同预平衡时间对测定结果的影响

实施例	预平衡时间(min)	游离烟碱响应
			实施例13	1	479745
实施例14	5	584588
			实施例15	30	689247
实施例16	60	787364
			实施例17	120	884908
实施例18	240	980124
			实施例19	360	1057877
实施例20	900	1088322
			实施例21	2880	1088841

实施例 22 ～ 23

重复实施例1，有以下不同点：采用不同萃取温度，以考察不同温度对游离烟碱测定结果的影响。实施例22采用40 ℃，实施例23采用50 ℃。

通过实施例22和23的实施，结果表明：随着温度的升高，游离烟碱的萃取量在显著增加，但游离烟碱在卷烟抽吸时为30 ℃左右，过高的温度不能真实反映卷烟抽吸时的游离烟碱释放量，本方法采用自动固相微萃取进样器的最低使用温度为游离烟碱的测定温度。

实施例 24 ～ 33

重复实施例1,有以下不同点：采用不同萃取时间，考察萃取时间对游离烟碱测定结果的影响，实施例24采用30 s萃取时间，实施例25采用60 s萃取时间，实施例26采用180 s萃取时间，实施例27采用300 s萃取时间，实施例28采用600 s萃取时间，实施例29采用900 s萃取时间，实施例30采用1200 s萃取时间，实施例31采用1800 s萃取时间，实施例32采用3600 s萃取时间，实施例33采用6000 s萃取时间。

通过以上实施例24～33的实施，结果如表4所示，结果表明：在10 min萃取时间内，萃取量达到最大萃取时间（100 min）同一数量级范围，其灵敏度也满足分析要求，考虑到样品游离烟碱含量的差异，萃取材料必须有足够的冗余以分析高游离烟碱含量的样品，因此，选择10 min为最佳萃取时间。

表 4 不同萃取时间对测定结果的影响

实施例	萃取时间(s)	游离烟碱响应
			实施例24	30	104039
实施例25	60	185245
			实施例26	180	548681
实施例27	300	707035
			实施例28	600	1018785
实施例29	900	1334921
			实施例30	1200	1958564
实施例31	1800	2732839
			实施例32	3600	4093453
实施例33	6000	5627488

实施例 34 ～ 39

重复实施例1,有以下不同点：采用不同的脱附时间，考察游离烟碱在萃取材料的脱附效率，避免游离烟碱在萃取材料上的残余，实施例34采用30 s脱附时间，实施例35采用60 s脱附时间，实施例36采用120 s脱附时间，实施例37采用180 s脱附时间，实施例38采用300 s脱附时间，实施例39采用600 s脱附时间。

通过以上实施例34～39的实施，结果如表5所示，结果表明：180 s脱附时间可以满足分析要求。

表 5 不同脱附时间对测定结果的影响

实施例	脱附时间（s）	游离烟碱响应
			实施例34	30	557840
实施例35	60	837969
			实施例36	120	782206
实施例37	180	1041177
			实施例38	300	1020724
实施例39	600	1044297

实施例 40 ～ 43

重复实施例1，有以下不同点：在同一样品中，加入不等量的水，以考察水分对游离烟碱测定结果的影响，实施例40加入0 μL水，实施例41加入1 μL水，实施例42加入5 μL水，实施例43加入10 μL水。

通过实施例40～43的实施，并将检测结果色谱图进行叠加，如附录图2所示，从叠加色谱图可以看出：游离烟碱水分含量的变化将大大影响游离烟碱的测定结果。

实施例 44

重复实施例1，有以下不同点：改变水分校正曲线的建立方式，按照表6进行水分校正曲线的建立，将烟碱的正己烷溶液先加入到剑桥滤片上，再向滤片加入不同量的水。通过多次重复试验表明：本实施例所得到的水分校正曲线难以得到良好的线性关系。回归方程线性相关系数最高为0.878。这可能受到加样方式的限制，烟碱与水难以充分完全的平衡混合。

实施例 45

重复实施例1，有以下不同点：为验证水分校正曲线在测定游离烟碱时的准确性，实验捕集3R4F参比卷烟的烟气粒相物5份，将5、10、15、20、25 mg的超纯水分别加入到5份滤片上，30 ℃平衡48 h后进行分析，并用水分校正曲线对测定结果进行校正。结果表明：进行水分校正后，游离烟碱的测定值能与实际值较好的吻合。

实施例 46

重复实施例1，有以下不同点：本方法实验所采用的外标法定量检测游离烟碱的含量，方法具有稳定性高的优点，通常气相色谱采用内标法定量，为了验证内标法的适用性，本实施例采用了对游离烟碱无竞争性吸附的氘代甲苯为内标，考察了在不同牌号卷烟主流烟气滤片中的释放量研究，研究结果如表7所示，结果表明：由于不同牌号卷烟滤片总粒相物组成的不同，氘代甲苯的响应值发生较大的变化，作为内标，其稳定性不能保证，会直接影响游离烟碱的测定结果。因此本方法采用外标法定量。

Claims (1)

1.一种准确测定卷烟主流烟气中游离烟碱的方法，包括以下步骤：

（1）标准工作曲线的建立

①配制浓度为5 g/L、10 g/L、25 g/L、50 g/L、100 g/L的烟碱标准工作溶液，溶剂为正己烷；

②取5个干燥的带盖顶空瓶，在每个顶空瓶中放置一个干燥的空白玻璃纤维滤片，自上述不同浓度的烟碱标准工作溶液中各取2 μL加入到一个滤片上，每个滤片对应一个浓度的标准工作溶液，为了保证标准曲线建立的准确性，须将顶空瓶在30 ℃条件下充分平衡5 h，再进行分析测试；

③将5个标准样品的游离烟碱响应值与游离烟碱的含量进行线性回归，得到标准工作曲线，曲线强制归零，线性相关系数R²须大于0.999；

（2）水分校正曲线的建立

①配制25 g/L的烟碱正己烷溶液，再分别配置浓度为25 g/L、10 g/L、6.25 g/L、5 g/L、2.5 g/L、2 g/L的烟碱水溶液，共7种烟碱溶液；

②分别向7个内装有一个干燥空白玻璃纤维滤片的顶空瓶中加入上述7种烟碱溶液，每个顶空瓶中滴加一种烟碱溶液；分别是2.0 μL浓度为25 g/L的烟碱正己烷溶液、2.0 μL浓度为25 g/L的烟碱水溶液、5.0 μL浓度为10 g/L的烟碱水溶液、8.0 μL浓度为6.25 g/L的烟碱水溶液、10.0 μL浓度为5 g/L的烟碱水溶液、20.0 μL浓度为2.5 g/L的烟碱水溶液和25.0 μL浓度为2 g/L的烟碱水溶液；上述7个水分校正标准样品中，游离烟碱的总量为50 µg，水分含量分别为0 mg、2 mg、5 mg、8 mg、10 mg、20 mg和25 mg，为了保证水分校正曲线建立的准确性，水分校正标准样品须在30 ℃平衡48 h后，上机测试；

③记录7个水分校正标准样品中游离烟碱响应值，分别将该响应值与烟碱正己烷溶液样品的响应值相除，得到7个水分校正标准样品的响应值比，将该响应值比的倒数与滤片水分含量进行线性回归，得到水分校正曲线，线性相关系数R²须大于0.99；

（3）待测样品准备

①卷烟样品放置于温度20℃、相对湿度RH60%的恒温恒湿箱中平衡48 h；

②按照ISO 3308:2000《卷烟--常规分析用吸烟机—定义和标准条件》抽吸条件抽吸5支卷烟，抽吸两次，得到两个滤片；

③其中一个滤片样品放置于顶空瓶中并密封，在30 ℃平衡5 h后进行游离烟碱分析测试；

④另一个滤片样品按照YC/T 157-2001《卷烟 总粒相物中水分的测定 气相色谱法》测定其水分含量；

（4）游离烟碱仪器分析条件

①固相微萃取针：

萃取材料为：聚二甲基硅氧烷/苯乙烯材料，部分交联，材料膜厚为65 μm；

②固相微萃取条件：

预平衡温度：30 ℃；预平衡时间：600 s；萃取时间：600 s；脱附时间：180 s；洗针时间：900 s；洗针温度：250 ℃；洗针气体：纯度≥99.999%的高纯氮气；洗针压力设置为：0.2 MPa；

③色谱分析条件：

以纯度≥99.999%的氦气为载气，恒流模式，流量为1.5 mL/min；采用分流进样方式，分流比为40:1，程序升温条件为初始温度50 ℃，保持2 min，以30 ℃/min的升温速率升至210 ℃，保持2 min，以30 ℃/min的升温速率升至240 ℃，保持3 min；

④质谱分析条件：

电离方式采用电子轰击源，电离能量为70 eV；离子源温度为230 ℃；四极杆温度为150 ℃；传输线温度为250 ℃；游离烟碱定量离子为84，辅助定量离子为133和162；

（5）分析结果的计算及分析结果的校正

①读出待测样品游离烟碱的响应值，根据步骤（1）所建立的标准曲线计算得到样品的游离烟碱初始数据；

②记录步骤（3）中所测定的样品的水分结果，将该结果采用步骤（2）所建立的水分校正曲线对样品的游离烟碱初始数据进行校正，即得到样品主流烟气中游离烟碱的含量。

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