CN102212005A

CN102212005A - 一种采用正相色谱法纯化丹参酚酸a的方法

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Publication number: CN102212005A
Application number: CN2010101436895A
Authority: CN
Inventors: 何克江; 刘珂; 韩飞; 陈栋; 刘军锋; 张祁
Original assignee: HAINAN XINHONGKAI INDUSTRIAL CO LTD; Shandong Target Drug Research Co Ltd
Current assignee: HAINAN XINHONGKAI INDUSTRIAL CO LTD; Shandong Target Drug Research Co Ltd
Priority date: 2010-04-06
Filing date: 2010-04-06
Publication date: 2011-10-12

Abstract

本发明基于丹参化学成分的理化性质、色谱行为及其与单元分离技术适应性，提供了一种采用正相色谱纯化丹酚酸A的方法，所述的正相色谱填料为色谱硅胶，粒度100～200目，其中所述的正相色谱操作为：用乙酸乙酯萃取丹参酚酸A水溶液，再浓缩乙酸乙酯萃取液至固含量约20％～30％，再加入丹酚酸A含量2～2.5倍的色谱硅胶，放入旋转蒸发器中减压干燥制成流动性固体样品，将固体样品置于硅胶湿柱顶端。该方法制备的产品质量稳定可控、成本可接受。

Description

一种采用正相色谱法纯化丹参酚酸A的方法

技术领域

本发明涉及一种采用正相色谱法纯化丹参酚酸A的方法。

背景技术

丹参是我国心脑血管病的基本治疗药物，因疗效确切，丹参已成为我国用量最大(1.5万吨/年)、销售额最高、制剂生产厂最多的中药(制剂生产厂960家，剂型主要有丹参滴丸、丹参注射液、丹参片、丹参颗粒、丹参冲剂和丹参胶囊)，此外丹参还与其它药材复方，用于肺心病、高脂血症、高血粘度综合征、哮喘、支气管肺炎、肝炎、肝硬化、肾病综合征、关节炎、糖尿病循环障碍、各种细菌性和病毒性感染、抗内毒素、肿瘤、硬皮病、皮肤炎、银屑病、过敏性紫癜、红斑狼疮、血栓闭塞性脉管炎、痤疮、难治性癫痫、视网膜病变等多种疾病的治疗。

丹参的主要有效成分是丹酚酸。现代药理研究表明，丹酚酸是以抗氧化、抗炎(通过NF-κβ途径抑制多种炎性细胞因子表达)为特点、同时具有保护脉管内皮细胞、降脂、升高高密度脂蛋白、保护心肌缺血缺氧、扩张冠脉血管、改善微循环、抑制血小板聚集、抑制纤维蛋白原合成、激活纤溶、抑制血栓形成、螯合钙铁离子等多种药理作用。在所有已知酚类化合物中(包括黄酮类化合物)丹酚酸类化合物的抗氧化活性最强，其中又以丹酚酸A(salvianolic acid A，SA)的活性最佳〔《中草药现代研究》II，1996，498-533.Yi Yang Hu et al.，World JGastroentero，2000；6(3)：402-404.Cheng Hai Liu et al.，World J Gastroentero，2000；6(3)：361-364.Yun-Lian Lin et al.J.Nat.Prod.2002，65，745-747.Lin YL et al..J.Ethnopharmacol.2005.Chen YF et al..J.Chromatogr A.2005；1088(1-2)：140-5.Hsu YC et al..J Biomed Sci.2005；12(1)：185-95.Lay IS et al..J Surg Res.2003；115(2)：279-85.Lay IS et al..Planta Med.2003；69(1)：26-32.Chen YL et al..J CellBiochem.2001；83(3)：484-93.Chen YH et al..J Cell Biochem.2001；82(3)：512-21.Hung HH et al..Histol Histopathol.2001；16(1)：175-83.Wu YJ et al..ArteriosclerThromb Vasc Biol.1998；18(3)：481-6.〕，但是，丹参中丹酚酸A的天然含量及其纯化技术一直制约着丹酚酸A的研发。

丹参药材中，主要含丹酚酸B，丹酚酸A的含量约为0.03％～0.06％。在高温处理丹参提取物制备丹酚酸A的技术建立，基本解决了其资源供给后，丹酚酸A的开发利用主要面临批量分离纯化的挑战。

但由于丹酚酸A水溶性高、不结晶、共存大量性质相近化合物和拟“胶体”类杂质，目前文献报道和专利公开的纯化技术或不能批量制备(如葡聚糖疑胶sephadex LH-20价格高昂、流速低、处理量小；C₈或C₁₈处理量小、寿命短)，或产品达不到安全可控的药用要求，致使丹酚酸A至今没有得到实际应用。

根据色谱行为(图1、图2)，丹A待分离体系的化学物质分为四大类：1、前沿杂质(主要是以丹参酮为代表的低极性物质)；2、酚酸类杂质(主要是丹参素、原儿茶醛和丹B)；3、丹A邻近杂质；4、拟“胶体”类杂质(主要是以在TLC分析中原点处物质为代表的一类杂质)。

前沿杂质较容易分离，大孔吸附树脂便可有效实现；酚酸类杂质无论在反相色谱或正相色谱上均具有满足批量制备的分离度(分离度≥2)，分离难度不大，分离丹A邻近杂质本发明人也取得了显著的成果，因此，丹A原料药制备所面临的主要问题是拟“胶体”类杂质(主要是以在TLC分析中原点处物质为代表的一类杂质)的分离。

拟“胶体”类杂质是从色谱行为上对植物中目前尚未给出明确化学表征的一类物质。该类物质在正相和反相TLC上均主要集中于原点，却又少量全程分布于正相和反相TLC上；在TLC上没有明确的斑点，在HPLC又无明确的UV吸收峰；在任何极性的洗脱液洗脱时，都有少量被洗脱。这一独特的行为使拟“胶体”类杂质去除成为天然产物分离纯化关键问题之一，特别是对那些不能结晶的化合物。它的去除与否在很大程度上决定了目标化合物的纯度是否满足药用要求。作为口服制剂，只有在肠道游离的目标化合物才能被吸收，胶体与目标化合物相互作用强，影响生物利用度；作为注射剂，刺激、过敏、凝聚试验和异常毒性均可能与这类物质密切相关。

目前，分离拟“胶体”类化合物的相关技术有：1、膜分离技术；2、C₁₈反相色谱；3、溶剂萃取；

膜分离技术尽管能有效去除拟“胶体”类杂质，但因其属于非切向力分离技术，目标化合物往往与这类杂质有极高亲和力，而导致目标化合物损失严重。此外，膜技术用于这类杂质的分离时，还面临膜孔阻塞和膜寿命的问题。

溶剂萃取技术中溶剂的选择性至关重要，效果也不理想。

传统的C₁₈反相色谱因使用上样量小、pH范围有限、不能进行有效再生、寿命短、受限于成本等因素，不能广泛使用。

因此，丹A工业化生产的制备一直受此制约，因此，迫切需要提供一种新的纯化丹酚酸A的方法，以便更有效的分离丹A拟“胶体”类杂质。

发明内容

本发明从现有技术中存在的缺陷出发，提供了一种新的采用正相色谱纯化丹酚酸A的方法。

本发明提供的采用正相色谱纯化丹酚酸A的方法，所述的正相色谱填料为色谱硅胶，粒度100～200目，其中所述的正相色谱操作为：用乙酸乙酯萃取丹参酚酸A水溶液，再浓缩乙酸乙酯萃取液至固含量约20％～30％，再加入丹酚酸A含量2～2.5倍的色谱硅胶，放入旋转蒸发器中减压干燥制成流动性固体样品，将固体样品置于硅胶湿柱顶端。

优选的，其中所述的正相色谱操作为：用乙酸乙酯萃取丹参酚酸A水溶液，再浓缩乙酸乙酯萃取液至固含量约25％，再加入丹酚酸A含量2.3倍的色谱硅胶，放入旋转蒸发器中减压干燥制成流动性固体样品，将固体样品置于硅胶湿柱顶端。

另外，将固体样品置于硅胶湿柱顶端后，依次用8/2或7/3的正己烷/乙酸乙酯，或者8/2或7/3的正己烷/丙酮，或者95/5或98/2的氯仿/甲醇，或者95/5或98/2的二氯甲烷/甲醇洗脱完杂质，用7/3或6/4的正己烷/乙酸乙酯，或者7/3或6/4的正己烷/丙酮，或9/1的氯仿/甲醇，或9/1的二氯甲烷/甲醇洗脱收集丹参酚酸A，最后用6/4或5/5的正己烷/乙酸乙酯，或者6/4或5/5正己烷/丙酮，或85/15氯仿/甲醇或85/15二氯甲烷/甲醇洗脱合并的含杂质的丹参酚酸A。。

为了取得更优的效果，其中用乙酸乙酯萃取丹参酚酸A水溶液还包括：先将丹参酚酸A水溶液减压浓缩后回收乙醇，无醇丹参酚酸A浓缩液再用乙酸乙酯萃取多次，乙酸乙酯与无醇丹参酚酸A浓缩液的体积比为1∶(3～5)，再将乙酸乙酯萃取液减压浓缩回收乙酸乙酯至小体积得到丹参酚酸A乙酸乙酯浓缩液，固含量约20％～30％。

优选的，其中用乙酸乙酯萃取丹参酚酸A水溶液还包括：先将丹参酚酸A水溶液减压浓缩后回收乙醇，无醇丹参酚酸A浓缩液再用乙酸乙酯萃取3次，乙酸乙酯与无醇丹参酚酸A浓缩液的体积比为1∶4，再将乙酸乙酯萃取液减压浓缩回收乙酸乙酯至小体积得到丹参酚酸A乙酸乙酯浓缩液，固含量约25％。

另一方面，为取得更好的纯化效果，其中所述的硅胶湿柱为正己烷预装色谱硅胶，其中丹参酚酸A与预装色谱硅胶的重量比为1∶(5～8)。

优选的，其中丹参酚酸A与预装色谱硅胶的重量比为1∶6。

综上所述，本发明通过大量的实验，提供了一种新的正相色谱填料，并确定了合理的粒度范围，并在此基础上，进一步通过合理的配置正相色谱填料的加入量，从而大大提高了分离丹A拟“胶体”类杂质的效率，并且成本大大降低，采用本发明提供的正相树脂填料，可有效去除提取物中大量的拟“胶体”类杂质，经济方便，大大降低了后续分离负荷。并且待分离体系与树脂适应性好时，也能用于单体化合物的纯化，为大批量生产丹酚酸A提供了产品质量稳定可控、成本可接受的新的方法。

附图说明

图1丹参化学成分的TLC图谱

图2丹参化学成分的HPLC图谱

图3工艺流程图-丹A的正相色谱纯化

图4产品样品的TLC图谱

图5产品样品的HPLC图谱

图6产品样品的紫外吸收光谱

图7产品样品的红外吸收光谱

图8产品样品的高分辨质谱图谱

图9产品样品的电喷雾电离负离子质谱图谱

图10产品样品的¹H-NMR图谱

图11产品样品的¹³C-NMR图谱

具体实施方式

首先，附图1中的各数字所代表的含义和具体条件为，1：丹酚酸B；2：丹酚酸A；3：丹参水提物；4：65％丹酚酸B；色谱条件：C18柱(4.6mm×250mm，5μm)，流速1.0ml/min，检测波长280nm，流动相梯度为：0～8分钟，8～18％B；8～15分钟，18～21％B；14～40分钟，21～34％B；溶剂剂A：H₃PO₄∶H₂O＝0.02∶100；溶剂剂B：H₃PO₄∶CH₃CN＝0.02∶100]。

附图5中的具体条件为色谱条件：ODS柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：乙腈-0.2％磷酸水(30∶70)；检测波长：285nm；柱温：30℃；流速：1.0ml/min。

下面详细对本发明进行描述。

本发明提供的采用正相色谱纯化丹酚酸A的方法，所述的正相色谱填料为色谱硅胶，粒度100～200目，其中所述的正相色谱操作为：用乙酸乙酯萃取丹参酚酸A水溶液，再浓缩乙酸乙酯萃取液至固含量约20％～30％，再加入丹酚酸A含量2～2.5倍的色谱硅胶，放入旋转蒸发器中减压干燥制成流动性固体样品，将固体样品置于硅胶湿柱顶端。其中色谱硅胶加入量为丹参酚酸A的重量的2～2.5倍。具体的，色谱硅胶与丹参酚酸A的重量比可以采用如下表1所示，但并不局限于表1所示的具体实施方式。

表1：

色谱硅胶∶丹参酚酸A	2∶1
		色谱硅胶∶丹参酚酸A	2.1∶1
色谱硅胶∶丹参酚酸A	2.2∶1
		色谱硅胶∶丹参酚酸A	2.3∶1
色谱硅胶∶丹参酚酸A	2.4∶1
		色谱硅胶∶丹参酚酸A	2.5∶1

另外，将固体样品置于硅胶湿柱顶端后，依次用8/2或7/3的正己烷/乙酸乙酯，或者8/2或7/3的正己烷/丙酮，或者95/5或98/2的氯仿/甲醇，或者95/5或98/2的二氯甲烷/甲醇洗脱完杂质，用7/3或6/4的正己烷/乙酸乙酯，或者7/3或6/4的正己烷/丙酮，或9/1的氯仿/甲醇，或9/1的二氯甲烷/甲醇洗脱收集丹参酚酸A，最后用6/4或5/5的正己烷/乙酸乙酯，或者6/4或5/5正己烷/丙酮，或85/15氯仿/甲醇或85/15二氯甲烷/甲醇洗脱合并的含杂质的丹参酚酸A。

为了取得更优的效果，其中用乙酸乙酯萃取丹参酚酸A水溶液包括：先将丹参酚酸A水溶液减压浓缩后回收乙醇，无醇丹参酚酸A浓缩液再用乙酸乙酯萃取多次，乙酸乙酯与无醇丹参酚酸A浓缩液的体积比为1∶(3～5)，再将乙酸乙酯萃取液减压浓缩回收乙酸乙酯至小体积得到丹参酚酸A乙酸乙酯浓缩液，固含量约20％～30％。

优选的，其中用乙酸乙酯萃取丹参酚酸A水溶液包括：先将丹参酚酸A水溶液减压浓缩后回收乙醇，无醇丹参酚酸A浓缩液再用乙酸乙酯萃取3次，乙酸乙酯与无醇丹参酚酸A浓缩液的体积比为1∶4，再将乙酸乙酯萃取液减压浓缩回收乙酸乙酯至小体积得到丹参酚酸A乙酸乙酯浓缩液，固含量约25％。

优选的，其中丹参酚酸A与预装色谱硅胶的重量比为1∶6。

下面，结合图3进一步详细说明本发明，其中附图3中已经明确示出的内容不再重复描述。需要说明的是，下面只是将其中涉及的重点内容进一步加以描述，但以下所有的过程及其工艺条件并不是作为必要条件加以描述的。

所述的正相色谱操作为：反相纯丹酚酸A水溶液→减压浓缩(50℃)回收乙醇→无醇丹A浓缩液→乙酸乙酯萃取3次(乙酸乙酯与无醇丹A浓缩液的体积比为1∶4)→乙酸乙酯萃取液→减压浓缩(50℃)回收乙酸乙酯至小体积→丹A乙酸乙酯浓缩液(固含量约25～30％)→加入硅胶(2～2.5倍)拌匀→旋转蒸发器中减压干燥(50℃)→流动性固体样品→硅胶湿柱(正己烷预装)→7/3正己烷/叔丁基甲基醚(7/3的正己烷/乙酸乙酯、7/3正己烷/丙酮、98/2氯仿/甲醇或98/2二氯甲烷/甲醇)洗脱至丹A检出(按柱体积收集洗脱液，TLC定性检测，分杂质和丹A两段合并)→6/4正己烷/叔丁基甲基醚(6/4的正己烷/乙酸乙酯、6/4正己烷/丙酮、9/1氯仿/甲醇或9/1二氯甲烷/甲醇)洗脱至丹A微量(按柱体积收集洗脱液→TLC定性检测→合并)。

丹A段→减压浓缩(50℃)回收溶剂至干→丹A产品。

杂质段→减压浓缩(50℃)回收溶剂至干→残渣→弃去(附图3)。

实施例1：

丹酚酸A粗品(94.7％SA，346.5g)→溶于少量乙酸乙酯(约800ml)→加入800g硅胶拌匀→旋转蒸发器中减压干燥成流动性粉未(50℃)→硅胶湿柱(Φ100×1000，正己烷预装1500g硅胶)→正己烷/叔丁基甲基醚(7/3)洗脱至SA检出(按柱体积收集洗脱液→HPLC定量、TLC定性检测和合并浓缩干燥→A段)→正己烷/叔丁基甲基醚(6/4)洗脱至SA微量(按柱体积收集洗脱液→HPLC定量、TLC定性检测和合并浓缩干燥→B段)→正己烷/叔丁基甲基醚(5/5)洗脱至洗脱液无色(按柱体积收集洗脱液→HPLC定量、TLC定性检测和合并浓缩干燥→C段)。B段总重209.1克(金黄色粉未)，丹酚酸A 201.2克，含量96.2％，收率61.3％。A+C段总重98克，丹酚酸A 49.2克，含量50.2％，收率14.7％。

对本发明方法纯化所得产品进行了相关的理化性质和结构检测，结果如下。

1、产品样品的TLC检测(图4)

2、产品样品的HPLC检测(图5)

3、产品样品的旋光性

附表1丹酚酸A的旋光性

4、产品样品的紫外吸收光谱(图6)

附表2产品样品的摩尔消光系数

5、产品样品的红外吸收光谱(图7)

附表3产品样品的红外光谱测定数据

6、产品样品的质谱检测

(1)、高分辨质谱(图8)

高分辨质谱测得：(M+Na⁺)517.11052，推测分子式为C₂₆H₂₂O₁₀Na(计算值：517.11107)。

(2)、电喷雾电离图谱(图9)

电喷雾电离质谱测得：(M-H)^-1493.28，符合分子式C₂₆H₂₁O₁₀(计算值：493.11)。

7、产品样品的¹H NMR检测(图10)

附表4产品样品的¹H NMR谱数据

^*溶剂为DMSO

8、产品样品的¹³C-NMR检测(图11)

附表5产品样品的¹³C-NMR光谱数据(ppm)及归属

Claims

1.一种采用正相色谱纯化丹参酚酸A的方法，所述的正相色谱填料为色谱硅胶，粒度100～200目，其中所述的正相色谱操作为：用乙酸乙酯萃取丹参酚酸A水溶液，再浓缩乙酸乙酯萃取液至固含量约20％～30％，再加入丹参酚酸A含量2～2.5倍的色谱硅胶，放入旋转蒸发器中减压干燥制成流动性固体样品，将固体样品置于硅胶湿柱顶端洗脱。

2.按照权利要求1所述的方法，其中所述的正相色谱操作为：用乙酸乙酯萃取丹参酚酸A水溶液，再浓缩乙酸乙酯萃取液至固含量约25％，再加入丹参酚酸A含量2.3倍的色谱硅胶，放入旋转蒸发器中减压干燥制成流动性固体样品，将固体样品置于硅胶湿柱顶端洗脱。

3.按照权利要求1所述的方法，将固体样品置于硅胶湿柱顶端，依次用8/2或7/3的正己烷/乙酸乙酯、或者8/2或7/3的正己烷/丙酮、或者95/5或98/2的氯仿/甲醇、或者95/5或98/2的二氯甲烷/甲醇洗脱完杂质，用7/3或6/4的正己烷/乙酸乙酯、或者7/3或6/4的正己烷/丙酮、或9/1的氯仿/甲醇、或9/1的二氯甲烷/甲醇洗脱收集丹参酚酸A，最后用6/4或5/5的正己烷/乙酸乙酯、或者6/4或5/5正己烷/丙酮、或85/15氯仿/甲醇、或85/15二氯甲烷/甲醇洗脱合并的含杂质的丹参酚酸A。

4.按照权利要求1所述的方法，其中用乙酸乙酯萃取丹参酚酸A水溶液包括：先将丹参酚酸A水溶液减压浓缩后回收乙醇，无醇丹参酚酸A浓缩液再用乙酸乙酯萃取多次，乙酸乙酯与无醇丹参酚酸A浓缩液的体积比为1∶(3～5)，再将乙酸乙酯萃取液减压浓缩回收乙酸乙酯至小体积得到丹参酚酸A乙酸乙酯浓缩液，固含量约20％～30％。

5.按照权利要求4所述的方法，其中用乙酸乙酯萃取丹参酚酸A水溶液包括：先将丹参酚酸A水溶液减压浓缩后回收乙醇，无醇丹参酚酸A浓缩液再用乙酸乙酯萃取3次，乙酸乙酯与无醇丹参酚酸A浓缩液的体积比为1∶4，再将乙酸乙酯萃取液减压浓缩回收乙酸乙酯至小体积得到丹参酚酸A乙酸乙酯浓缩液，固含量约25％。

6.按照权利要求1所述的方法，其中所述的硅胶湿柱为正己烷预装色谱硅胶，其中丹参酚酸A与预装色谱硅胶的重量比为1∶(5～8)。

7.按照权利要求6所述的方法，其中丹参酚酸A与预装色谱硅胶的重量比为1∶6。