CN102186976A - 修饰型生物素结合蛋白 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及修饰型生物素结合蛋白。本发明的修饰型生物素结合蛋白是在包含SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列、或在该序列中具有一个～数个氨基酸突变的氨基酸序列、或与该序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列且显示生物素结合活性的蛋白质中，选自下组中的一个或多个残基被取代成酸性氨基酸残基或中性氨基酸残基而成的：1)SEQ ID NO：2的104位的精氨酸残基；2)SEQ ID NO：2的141位的赖氨酸残基；3)SEQ ID NO：2的26位的赖氨酸残基；以及4)SEQ ID NO：2的73位的赖氨酸残基。
Description
技术领域
本申请要求2008年8月13日提出的日本国专利申请2008-208766的优先权。
本发明涉及修饰型生物素结合蛋白。
背景技术
抗生物素蛋白是卵清来源的蛋白质，链霉菌抗生物素蛋白是放线菌(Streptomyces avidinii)来源的蛋白质。抗生物素蛋白或链霉菌抗生物素蛋白与生物素(D-[(+)-cis-六氢-2-氧代-1H-噻吩并-(3，4)-咪唑-4-戊酸]之间的亲和性(affinity)非常高(KD＝10-16～-14)，是两生物分子间相互作用之中最强的相互作用之一。分子量是60kDa左右。现在，抗生物素蛋白/链霉菌抗生物素蛋白-生物素相互作用在生物化学、分子生物学或医学领域有着广泛应用(Green，(1975)，Adv.Protein Chem.，29：85-133；Green，(1990)，Methods Enzymol.，184：51-67)。抗生物素蛋白/链霉菌抗生物素蛋白这两种蛋白质均形成四聚体，每一个亚基结合1分子的生物素。
在抗生物素蛋白的利用方面，其非特异性结合是一个问题。抗生物素蛋白有些情况下与细胞、DNA、蛋白质或膜这些生物体成分非特异性结合，例如，在使用抗生物素蛋白-生物素结合对物质进行检测时，有些情况下抗生物素蛋白与检测对象物质以外的物质发生非特异性结合，导致背景增高。作为抗生物素蛋白的非特异性结合高的理由，可以列举出等电点高、具有分子量的约10％的糖链、等等。抗生物素蛋白是强碱性蛋白质，其等电点为10以上非常之高，整体上带有正电荷，因而可以认为其容易与带负电荷的物质居多的生物体成分发生结合。
此外，可以认为，抗生物素蛋白表面的糖链容易与生物体成分结合(Marttila等，(2000)FEBS Lett，467，31-36)。为了降低抗生物素蛋白的非特异性结合，进行了下述的研究：利用糖苷酶除去抗生物素蛋白的糖链而得到的化学修饰中性抗生物素蛋白的研究(Bayer等，(1995)Appl Biochem Biotechnol，53(1)，1-9)，通过将抗生物素蛋白中的糖基化靶点即17位的天冬酰胺残基取代成异亮氨酸残基来生物合成不受糖链修饰的抗生物素蛋白的研究(Marttila等，(2000)FEBS Lett，467，31-36)，等等。而且，还进行了通过采用基因工程方法将抗生物素蛋白所具有的赖氨酸残基、精氨酸残基变换为中性氨基酸、酸性氨基酸，来降低抗生物素蛋白的等电点的研究(Marttila等，(1998)FEBS Lett，441，313-317)。
然而，通过这样的修饰，虽然例如DNA、细胞针对抗生物素蛋白的非特异性结合得以降低，但关于在应用于临床检查系统等时所必须的针对人血清的非特异性结合的抑制，尚未进行充分研究。此外，在生物合成抗生物素蛋白变体时，有必要使用基于昆虫细胞的表达系统。因此，现状是因培养需要时间及成本高，序列修饰抗生物素蛋白尚未达到实用化。
作为关于抗生物素蛋白、链霉菌抗生物素蛋白这样的生物素结合性蛋白质与生物素之间的亲和性的研究，有报告称，对链霉菌抗生物素蛋白的结构进行大的修饰，增强了其与荧光生物素的结合(Aslan等，(2005)Proc Natl Acad Sci U.S.A.，102，8507-8512)。但是，该蛋白质同时大幅损失了与生物素的结合能力。
本发明人等从食用菌白黄侧耳(Plueurotus conucopiae)中纯化了对稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)显示抗菌性的蛋白质。发现该蛋白质显示生物素结合性，将其命名为tamavidin(tamavidin 1)。tamavidin 1蛋白质的氨基酸序列、以及编码该蛋白质的基因的碱基序列均在WO02/072817中公开(WO02/072817中的SEQ ID NO：1和2)。而且，还从同一食用菌中鉴定出tamavidin 1的同源物(tamavidin 2)，其显示具有强的生物素结合能力。tamavidin 2蛋白质的氨基酸序列、以及编码该蛋白质的基因的碱基序列均在WO02/072817中公开(WO02/072817中的SEQ ID NO：3和4)，且重组蛋白质的生产也取得了成功。tamavidin 1和2可在大肠杆菌中表达，特别是tamavidin2可以通过使用亚胺基生物素柱的纯化容易地制备，且其与链霉菌抗生物素蛋白相比具有更高的耐热性，就这点而言，其是一种优异的生物素结合性蛋白质。然而，在针对核酸和/或蛋白质的非特异性结合方面，其虽然比传统的抗生物素蛋白少，但却与链霉菌抗生物素蛋白程度等同。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：WO02/072817A1
非专利文献
非专利文献2：WO2008/081938A1
非专利文献1：Marttila等，(2000)FEBS Lett，467，31-36
非专利文献2：Bayer等，(1995)Appl Biochem Biotechnol，53(1)，1-9)
非专利文献3：Marttila等，(1998)FEBS Lett，441，313-317
非专利文献4：Alon等，(1990)Biochem Biophys Res Commun，170，1236-1241
非专利文献5：Aslan等，(2005)Proc Natl Acad Sci U.S.A.，102，8507-8512
非专利文献6：Weber等，(1989)Science 243：85-88
非专利文献7：Livnah等，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：5076-5080
非专利文献8：Qureshi et al.(2001)J.Biol.Chem.276(49)，p.46422-46428
发明内容
发明所要解决的问题
本发明的课题是提供：在保持生物素结合能力高的tamavidin的特性的同时，性能提升的修饰型生物素结合蛋白，所述性能提升是指非特异性结合性降低和/或进一步的生物素结合提高。
解决问题的方法
本发明通过对天然的tamavidin 2(以下，在本说明书中也记作“TM2”)的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)进行修饰，成功地提高了其性能。
本发明的优选实施方式
本发明优选包含以下实施方式。
[实施方式1]
在包含SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列、或在该序列中具有一个～数个氨基酸突变的氨基酸序列、或与该序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列，且显示生物素结合活性的蛋白质中，选自下组中的一个或多个残基被取代成酸性氨基酸残基或中性氨基酸残基的修饰型生物素结合蛋白：
1)SEQ ID NO：2的104位的精氨酸残基；
2)SEQ ID NO：2的141位的赖氨酸残基；
3)SEQ ID NO：2的26位的赖氨酸残基；以及
4)SEQ ID NO：2的73位的赖氨酸残基。
[实施方式2]
实施方式1所述的修饰型生物素结合蛋白，其中，选自1)～4)中的氨基酸残基被取代成疏水性指数为2以下的氨基酸残基。
[实施方式3]
实施方式1所述的修饰型生物素结合蛋白，其中，1)SEQ ID NO：2的104位的精氨酸残基、和/或、2)SEQ ID NO：2的141位的赖氨酸残基被取代成酸性氨基酸残基或中性氨基酸残基。
[实施方式4]
实施方式3所述的修饰型生物素结合蛋白，其中，1)SEQ ID NO：2的104位的精氨酸残基、和/或、2)SEQ ID NO：2的141位的赖氨酸残基被取代成酸性氨基酸残基。
[实施方式5]
实施方式3或4所述的修饰型生物素结合蛋白，其中，1)SEQ ID NO：2的104位的精氨酸残基、和/或、2)SEQ ID NO：2的141位的赖氨酸残基被取代成谷氨酸残基。
[实施方式6]
实施方式1～5中任一项所述的修饰型生物素结合蛋白，其中，进一步，SEQ ID NO：2的40位的天冬氨酸残基被取代成天冬酰胺残基。
[实施方式7]
实施方式1～6中任一项所述的修饰型生物素结合蛋白，其选自下组：
在SEQ ID NO：2中，104位的精氨酸残基被取代成谷氨酸残基、且141位的赖氨酸残基被取代成谷氨酸残基的修饰型生物素结合蛋白(R104E-K141E)；
在SEQ ID NO：2中，40位的天冬氨酸残基被取代成天冬酰胺残基、且104位的精氨酸残基被取代成谷氨酸残基的修饰型生物素结合蛋白(D40N-R104E)；
在SEQ ID NO：2中，40位的天冬氨酸残基被取代成天冬酰胺残基、且141位的赖氨酸残基被取代成谷氨酸残基的修饰型生物素结合蛋白(D40N-K141E)；以及
在SEQ ID NO：2中，40位的天冬氨酸残基被取代成天冬酰胺残基、104位的精氨酸残基被取代成谷氨酸残基、且141位的赖氨酸残基被取代成谷氨酸残基的修饰型生物素结合蛋白(D40N-R104E-K141E)。
[实施方式8]
实施方式1～7中任一项所述的修饰型生物素结合蛋白，其满足以下a)-l)的条件中的一个至全部：
a)SEQ ID NO：2的14位的天冬酰胺残基未被修饰、或者被取代成谷氨酰胺或天冬氨酸；
b)SEQ ID NO：2的18位的丝氨酸残基未被修饰、或者被取代成苏氨酸或酪氨酸；
c)SEQ ID NO：2的34位的酪氨酸残基未被修饰、或者被取代成丝氨酸、苏氨酸或苯丙氨酸；
d)SEQ ID NO：2的36位的丝氨酸残基未被修饰、或者被取代成苏氨酸或酪氨酸；
e)SEQ ID NO：2的40位的天冬氨酸残基未被修饰、或者被取代成天冬酰胺；
f)SEQ ID NO：2的69位的色氨酸残基未被修饰；
g)SEQ ID NO：2的76位的丝氨酸残基未被修饰、或者被取代成苏氨酸或酪氨酸；
h)SEQ ID NO：2的78位的苏氨酸残基未被修饰、或者被取代成丝氨酸或酪氨酸；
i)SEQ ID NO：2的80位的色氨酸残基未被修饰；
j)SEQ ID NO：2的96位的色氨酸残基未被修饰；
k)SEQ ID NO：2的108位的色氨酸残基未被修饰；以及
l)SEQ ID NO：2的116位的天冬氨酸残基未被修饰、或者被取代成谷氨酸或天冬酰胺。
[实施方式9]
实施方式1所述的修饰型生物素结合蛋白，其包含与SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列具有90％以上的同一性的氨基酸序列。
[实施方式10]
实施方式1～9中任一项所述的修饰型生物素结合蛋白，其满足以下性质中的一个至全部：
i)与由SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列组成的蛋白质相比，具有低的等电点；
ii)与由SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列组成的蛋白质相比，显示对核酸和/或蛋白质的低的非特异性结合；
iii)与由SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列组成的蛋白质相比，显示低的纤连蛋白结合性；
iv)与由SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列组成的蛋白质相比，显示高的生物素结合性。
[实施方式11]
在包含SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列、或在该序列中具有一个～数个氨基酸突变的氨基酸序列、或与该序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列，且显示生物素结合活性的蛋白质中，SEQ ID NO：2的40位的天冬氨酸残基被取代成天冬酰胺残基的修饰型生物素结合蛋白。
[实施方式12]
实施方式11所述的修饰型生物素结合蛋白，其与由SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列组成的蛋白质相比，显示高的生物素结合性。
[实施方式13]
编码实施方式1～12中任一项所述的蛋白质的核酸。
[实施方式14]
包含实施方式13所述的核酸的载体。
[实施方式15]
固定化有实施方式1～14中任一项所述的蛋白质的载体。
以下，对用于实施本发明的优选实施方式进行说明。
tamavidin
tamavidin是从作为食用菌的担子菌白黄侧耳(Pleurotus conucopiae)中发现的新的生物素结合蛋白(WO02/072817)。该文献中记载：
-tamavidin 1与tamavidin 2相互之间的氨基酸同源性为65.5％，与生物素强结合；
-tamavidin 2在大肠杆菌中高表达在可溶性级分中；以及
-用大肠杆菌表达tamavidin 2时，经过4.5小时的培养，每50ml培养可以获得约1mg的高纯度纯化重组蛋白质。与已知的生物素结合性蛋白质抗生物素蛋白、链霉菌抗生物素蛋白相比，这是非常高的值。
本说明书中的“tamavidin 2”是指：tamavidin 2(TM2)或其变体。本发明通过对TM2或其变体的特定氨基酸残基进行修饰，提供显示对核酸和/或蛋白质的非特异性结合比野生型TM2更低的修饰型TM2。在本说明书中，当记作“tamavidin 2”、“TM2”时，如无特别说明，是指野生型的TM2及其变体。但是，根据文意，有些情况下也作为包括本发明的修饰型TM2在内的TM2的野生型、突变型和本发明的修饰型的统称使用。此外，TM2显示生物素结合性，因而在本说明书中，有时也将TM2称作“生物素结合蛋白”。
具体地，TM2(野生型)典型地，可以是包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的蛋白质、或由包含SEQ ID NO：1的碱基序列的核酸编码的蛋白质。或者，TM2可以是包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的蛋白质或由包含SEQ IDNO：1的碱基序列的核酸编码的蛋白质的变体，该蛋白质具有与tamavidin 2等同的生物素结合活性。TM2的变体可以是包含在SEQ ID NO：2的氨基酸序列中包含一个或多个氨基酸的缺失、取代、插入和/或添加的氨基酸序列的蛋白质，该蛋白质具有与TM2等同的生物素结合活性。取代可以是保守取代，即将特定的氨基酸残基替换为具有相似物理化学特征的残基。保守取代的非限定性例子包括含脂肪族基团的氨基酸残基之间的取代(例如Ile、Val、Leu或Ala间的相互取代)、极性残基之间的取代(例如Lys和Arg、Glu和Asp、Gln和Asn之间的相互取代)等。
氨基酸缺失、取代、插入和/或添加而成的变体可以通过对编码野生型蛋白质的DNA实施例如作为公知技术的定点诱变(例如参见Nucleic Acid Research，Vol.10，No.20，p.6487-6500，1982，通过引用将其全文引入到本说明书中)而产生。在本说明书中，“一个或多个氨基酸”是指通过定点诱变方法能够缺失、取代、插入和/或添加的程度的氨基酸。此外，在本说明书中，“一个或多个氨基酸”根据情况可以指一个或数个氨基酸。
就定点诱变方法而言，例如，除希望的变异即特定的不一致之外，还可以使用与要突变的单链噬菌体DNA互补的合成寡核苷酸引物按如下方式进行。即，使用上述合成寡核苷酸作为引物合成与噬菌体互补的链，用得到的双链DNA转化宿主细胞。将转化后的细菌的培养物铺在琼脂上，由含噬菌体的单个细胞形成噬菌斑。这样，理论上有50％的新菌落含有单链形式的具有突变的噬菌体，其余的50％携带原序列。在合适的温度下，使获得的噬菌斑与通过激酶处理而标记的合成探针杂交，所述合适的温度指该温度下所述探针与和带有目的突变的DNA完全一致的噬菌斑杂交，而不与携带原有链的噬菌斑杂交。然后，收集与该探针杂交的噬菌斑，进行培养，回收DNA。
而且，在保持其活性的同时对生物活性肽的氨基酸序列施加一个或多个氨基酸的缺失、取代、插入和/或添加的方法，除了上述的定点突变外，还有用诱变物处理基因的方法，以及选择性地断开基因，然后删除、取代、插入或添加选定的核苷酸，再进行连接的方法。更优选地，本发明中的TM2是由在SEQ ID NO：2中缺失、取代或添加1～10个氨基酸的氨基酸序列组成、且具有生物素活性的蛋白质。
TM2的变体还可以是包含与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少80％以上、优选85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、或99％以上、更优选99.3％以上的氨基酸同一性的氨基酸序列、且具有与TM2等同的生物素结合活性的蛋白质。
两个氨基酸序列的同一性％可通过目测和数学计算来确定。或者两个蛋白质序列的同一性百分比可以通过使用以Needleman，S.B.及Wunsch，C.D.(J.Mol.Bol.，48：443-453，1970)的算法为基础的、可从威斯康星州大学遗传学计算机组(UWGCG)获得的GAP计算机程序进行序列信息比较来确定。GAP程序优选的默认参数包括：(1)Henikoff，S.以及Henikoff，J.G.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：10915-10919，1992)所记载的得分/矩阵(スコアリング·マトリツクス)、blosum62；(2)一个空位扣12分；(3)连续空位加扣4分；以及(4)末端空位不扣分。
也可使用该领域技术人员使用的进行序列比较的其它程序。关于同一性百分比，例如：Altschul等(Nucl.Acids.Res.，25，p.3389-3402，1997)中记载的可用BLAST程序对序列信息进行比较和确定。该程序可于网络上在Nantional Center for Biotechnology Information(NCBI)或DNA Data Bank of Japan(DDBJ)网站使用。在相同站点，对利用BLAST程序进行同一性检索的各种条件(参数)进行了详细记载，可对部分设定进行适当变更，但检索通常使用默认值来进行。此外，两个氨基酸序列的同一性％也可用遗传信息处理软件GENETYX Ver.7(GENETYX制)等程序或FASTA算法等来确定。此时，也可用默认值进行检索。
两个核酸序列的同一性％可通过目测和数学计算来确定，此外，该比较更优选使用计算机程序对序列信息进行比较。具有代表性的优选计算机程序为遗传学计算机组(GCG；威斯康星州Madison)的威斯康星·软件包、10.0版“GAP”程序(Devereux等，1984，Nucl.Acids Res.，12：387)。使用该“GAP”程序，不仅可对两个核酸序列进行比较，还可比较两个氨基酸序列，并可对核酸序列和氨基酸序列进行比较。此处，“GAP”程序的优选默认参数包括：(1)实行关于核苷酸的(包括相同物质为1，不同物质为0的值)一元(unary)比较矩阵的GCG时，如Schwartz和Dayhoff主编的”多肽序列及结构图谱(Atlas of Polypeptide Sequence and Structure)”(国立生物医学研究财团，353-358页，1979年)所记载的Gribskov及Burgess(Nucl.Acids Res.，14：6745，1986)的加权氨基酸比对矩阵；或其它可比对的比对矩阵；(2)氨基酸的各空位罚分30，各空位中的各记号追加1罚分；此外，核苷酸序列的各空位罚分50，各空位中的各记号追加3罚分；(3)末端空位不罚分；以及(4)长空位没有最大罚分。技术人员使用的其它序列比较程序中，可使用例如美国国立医学图书馆的网站：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bls.html提供的版本2.2.7的BLASTN程序、或UW-BLAST2.0算法。关于UW-BLAST2.0标准默认参数的设定，以下网站：http://blast.wustl.edu中有记载。而且，BLAST算法使用BLOSUM62氨基酸得分矩阵，可使用的选择参数如下：(A)包含具有低组成复杂性的提问序列片断(由Wootton及Federhen的SEG程序(Computers and Chemistry，1993)确定；参考Wootton及Federhen，1996“序列数据库中组成偏移区域的分析(Analysis of compositionally biased regions in sequence databases)”Methods Enzymol.，266：544-71)，或用于掩蔽短周期性内部重复形成的片段(由Claverie及States(Computers and Chemistry，1993)的XNU程序确定)的滤器，以及(B)用于报告数据库序列匹配的有统计学意义的阈值，或根据E-得分(Karlin和Altschul，1990)统计学模型得到的单纯偶然发现匹配的期待几率；某种匹配引起的有统计学意义的差值大于E-得分阈值时，不能报告该匹配；优选的E-得分阈值的数值为0.5，此外按照优选度增大的顺序依次为0.25、0.1、0.05、0.01、0.001、0.0001、1e-5、1e-10、1e-15、1e-20、1e-25、1e-30、1e-40、1e-50、1e-75、1e-100。
此外，TM2的变体还可以是由包含在严格条件下与SEQ ID NO：1的碱基序列的互补链杂交的碱基序列的核酸编码的、具有与TM2等同的生物素结合活性的蛋白质。
此处，“严格条件下”是指：在中度或高度的严格条件下进行杂交。具体来说，关于中度严格条件，根据例如DNA长度，掌握常规技术的该领域技术人员能够容易地确定。基本条件如Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版，第6章，Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001所示，例如包括下述条件的使用：5×SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)的预洗涤溶液、约42℃的约50％的甲酰胺、2×SSC-6×SSC优选5-6×SSC、0.5％SDS(或约42℃、约50％甲酰胺中的Stark’s溶液等其它类似的杂交液)的杂交条件，以及例如在约50℃-68℃、0.1-6×SSC、0.1％SDS的洗涤条件。优选的中度严格条件包括约50℃、6×SSC、0.5％SDS的杂交条件(及洗涤条件)。关于高度严格条件，根据例如DNA长度，本领域技术人员能够容易地确定。
通常，这样的条件包括较中度严格条件更高温度和/或更低盐浓度的杂交(例如：含0.5％左右的SDS、约65℃，6×SSC～0.2×SSC，优选6×SSC、更优选2×SSC、更优选0.2×SSC或者0.1×SSC的杂交)和/或洗涤，例如可定义为上述杂交条件以及伴随大约65℃-68℃、0.2～0.1×SSC、0.1％SDS的洗涤。关于杂交及洗涤的缓冲液，可以使用SSPE(1×SSPE为0.15M NaCl、10mMNaH2PO4以及1.25mM EDTA，pH7.4)代替SSC(1×SSC为0.15M NaCl以及15mM柠檬酸钠)，在杂交结束后15分钟～1小时左右进行洗涤。
此外，也可使用探针中不使用放射性物质的市售杂交试剂盒。具体可以列举出使用ECL direct labeling & detection system(Amersham公司制)进行的杂交等。严格杂交条件的例子为，向试剂盒的杂交缓冲液中加入5％(w/v)的封闭试剂，使NaCl达到0.5M，在42℃进行4小时杂交，关于洗涤，在0.4％SDS、0.5xSSC中，55℃条件下洗涤两次，每次20分钟，在2xSSC中，室温条件下，洗涤一次5分钟。
TM2的变体的生物素结合活性可以采用任何公知方法来测定。例如，可以像Kada等(Biochim.Biophys.Acta.，1427：44-48(1999))所描述的那样，采用使用了荧光生物素的方法来测定。该方法是利用以下性质的测定系统：在生物素结合蛋白的生物素结合位点上结合荧光生物素时，荧光生物素的荧光强度消失。或者，可以使用基于表面等离子体共振原理的生物传感器等能够测定蛋白与生物素间的结合的传感器，来评价变体蛋白的生物素结合活性。
在本发明的修饰tamavidin中，希望不进行修饰的氨基酸残基如后述。
本发明的非特异性结合降低的修饰tamavidin
本发明的修饰型TM2的特征是：在包含SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列、或在该序列中具有一个～数个氨基酸突变的氨基酸序列、或与该序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列，并显示生物素结合活性的蛋白质(野生型TM2以及突变型TM2)中，选自下组中的一个或多个残基被取代成酸性氨基酸残基或中性氨基酸残基：
1)SEQ ID NO：2的104位的精氨酸残基；
2)SEQ ID NO：2的141位的赖氨酸残基；
3)SEQ ID NO：2的26位的赖氨酸残基；以及
4)SEQ ID NO：2的73位的赖氨酸残基。
野生型TM2的等电点(pI)，由其一级结构计算得到的值是约7.4，实测值为8.2-8.6左右，是中性～弱碱性的蛋白质。TM2的非特异性结合程度远比抗生物素蛋白少，与作为中性蛋白质的链霉菌抗生物素蛋白基本上等同。
本发明人等对进一步减少TM2的非特异性结合进行了研究。即，本发明人认为，即使是TM2这样的中性～弱碱性蛋白质，通过降低pI，也可能进一步降低非特异性结合，从而将TM2所具有的碱性氨基酸残基修饰成酸性氨基酸或中性氨基酸，并进行了实验。
这里，对于链霉菌抗生物素蛋白或抗生物素蛋白而言，已知有些情况下一个或数个氨基酸的取代会导致其对生物素的结合亲和力降低，因此，在实验中，不仅是降低等电点，还对如何不损害作为TM2的优良特征的高生物素结合能力进行了如后述的研究，来进行氨基酸残基的修饰。
深入研究的结果，本发明人等发现：满足这样的条件的本发明的低pI修饰型TM2是包含选自下组中的一个或多个残基的突变的修饰TM2蛋白质，从而想到了本发明：
1)SEQ ID NO：2的104位的精氨酸残基(R104)；
2)SEQ ID NO：2的141位的赖氨酸残基(K141)；
3)SEQ ID NO：2的26位的赖氨酸残基(K26)；以及
4)SEQ ID NO：2的73位的赖氨酸残基(K73)。
突变后的氨基酸是酸性氨基酸残基(天冬氨酸、谷氨酸)或中性氨基酸残基(天冬酰胺、丝氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、甘氨酸、酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸)。
此外，非极性的氨基酸存在具有基于疏水性相互作用的非特异性结合的可能性，因而优选疏水性指数为2以下的酸性氨基酸残基或中性氨基酸残基。疏水性指数(hydropathy inde是指：例如Kyte and Doolittle，J.Mol.Biol.，157，105-132(1982)中记载的将各氨基酸残基的疏水性程度数值化而得到的指数，其是本领域技术人员公知的。“疏水性指数为2以下的酸性氨基酸残基或中性氨基酸残基”是作为酸性氨基酸残基的天冬氨酸和谷氨酸，以及作为中性氨基酸残基的天冬酰胺、丝氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、甘氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸和丙氨酸。
更优选，1)SEQ ID NO：2的104位的精氨酸残基、和/或、2)SEQ ID NO：2的141位的赖氨酸残基被取代成酸性氨基酸残基或中性氨基酸残基。更优选，1)SEQ ID NO：2的104位的精氨酸残基、和/或、2)SEQ ID NO：2的141位的赖氨酸残基被取代成酸性氨基酸残基。
K26的位置上更优选A(丙氨酸)、K73的位置上更优选Q(谷氨酰胺)、R104的位置上更优选E(谷氨酸)或D(天冬氨酸)、K141的位置上更优选E(谷氨酸)或D(天冬氨酸)；而R104的位置上更优选E，K141的位置上更优选E。
本发明的低pI型修饰TM2与野生型TM2相比，显示显著低的等电点。具体地，可以明确：在实施例1的1-8)中导入了突变的修饰型TM2的等电点，均较野生型的TM2降低了1以上。
由此性质，与野生型或突变型TM2蛋白质相比，本发明的修饰型TM2蛋白质显示对核酸和/或蛋白质的低的非特异性结合。具体地，在实施例1的1-11)中显示了针对DNA的非特异性结合降低。而且，实施例1的1-9)中显示血清蛋白质的非特异吸附性降低。在K26、K73、K141的位置上发生突变，均减少至野生型TM2的6成左右；而R104-K141(R104和K141这两个位置发生突变)甚至减少至TM2的2成多。与此相对，对于抗生物素蛋白的碱性氨基酸变体，虽然有报告称对DNA或细胞的非特异性结合降低(Marttila等，(2000)FEBS，467，p.31-36)，但对血清蛋白质的非特异性结合的这样的大幅降低还未见报告。
此外，对于本发明的低pI型修饰TM2，考察了与纤连蛋白之间的结合性，发现其大幅降低。纤连蛋白是存在于细胞外基质中的细胞粘附分子，特别是在对血浆、血清中的蛋白质进行检测时，其会成为噪声的原因之一。因此，希望与纤连蛋白之间的结合少。如实施例1的1-10)所示，与TM2相比，任何一种变体的纤连蛋白结合量均减少。特别是，就K141、R104-K141而言，结合量显著减少至野生型TM2结合量的1成～2成。而，pI值与纤连蛋白结合能力之间的关系是此前未知的，实际上未发现pI值与纤连蛋白减少程度明确相关。考虑到这一点，K141、R104-K141的变体的纤连蛋白结合量的减少非常之大，达到了意料不到的显著。
纤连蛋白结合减少的本发明的优选修饰TM2的一例是，将TM2氨基酸序列的141位的赖氨酸残基修饰成酸性氨基酸或中性氨基酸而得到的修饰TM2。更优选修饰成疏水性指数为2以下的酸性氨基酸或中性氨基酸而得到的修饰TM2。更优选E(谷氨酸)或D(天冬氨酸)，其中最优选E。
或者，纤连蛋白结合减少的其它修饰TM2是，将R104和K141这两个氨基酸残基同时修饰成酸性氨基酸或中性氨基酸而得到的修饰TM2。更优选修饰成疏水性指数为2以下的酸性氨基酸或中性氨基酸而得到的修饰TM2，更优选E(谷氨酸)或D(天冬氨酸)，其中最优选E。
生物素结合能力提高的修饰tamavidin
TM2与生物素之间的结合速度常数(ka)是9.19×105(M-1S-1)，解离速度常数(kd)是6.83×10-6(s-1)，解离常数(KD)是7.43×10-12(M)，TM2非常强烈地结合生物素。针对作为其它生物素结合性蛋白质的链霉菌抗生物素蛋白进行了同样的测定，结果ka是2.28×106(M-1S-1)，kd是2.52×10-6(s-1)，KD是1.11×10-12(M)。即，与链霉菌抗生物素蛋白相比，TM2与生物素之间的结合力处于同一数量级，但稍弱(WO2008/081938A1)。在希望生物素结合蛋白与生物素更快结合或更多结合的情况下，需要具有更高的生物素结合能力。
发明人等对TM2的氨基酸残基进行修饰，成功制作了针对原本就具有高生物素结合能力的野生型TM2进一步提高了生物素结合能力的高亲和性型修饰TM2。本发明的高亲和性型TM2是在TM2的SEQ ID NO：2的氨基酸序列中、至少40位的天冬氨酸残基(D40)发生突变而得到的。突变后的氨基酸优选为N(天冬酰胺)。
D40的修饰可以与前述的用于降低非特异性结合的R104、K141、K26和/或K73的修饰组合进行(实施方式6)，或者也可以单独进行(实施方式11)。如实施例2和3所示，与野生型TM2相比，D40经修饰的修饰TM2显示显著地高的生物素结合能力。
非特异性结合降低、且生物素结合能力提高的修饰tamavidin
制作将上述的“非特异性结合降低的修饰tamavidin”和“生物素结合能力提高的修饰tamavidin”中的氨基酸突变组合而成的修饰tamavidin时，得到了非特异性结合降低、生物素结合能力提高的修饰tamavidin。这样的修饰tamavidin是包含TM2氨基酸序列的K26、K73、R104、K141中的至少一个氨基酸残基的突变、且D40的氨基酸残基突变成N而得到的修饰TM2蛋白质(实施方式6)。
K26、K73、R104、K141突变后的氨基酸是酸性氨基酸或中性氨基酸，优选疏水性指数(hydropathy index：Kyte and Doolittle，J.Mol.Biol.，157，105-132(1982))为2以下的酸性氨基酸或中性氨基酸。K26的位置上更优选A(丙氨酸)、K73的位置上更优选Q(谷氨酰胺)、R104的位置上更优选E(谷氨酸)或D(天冬氨酸)、K141的位置上更优选E(谷氨酸)或D(天冬氨酸)；而R104的位置上更优选E，K141的位置上更优选E。
对于同时进行了R104与D40的修饰而得到的修饰tamavidin，可见亲和性提高和蛋白质非特异性结合的降低(实施例3的3-7)和3-9))。
此外，对于同时修饰了R104、K141、D40而得到的修饰tamavidin，观察到了等电点的降低、亲和性提高、蛋白质非特异性结合的降低、纤连蛋白结合性的降低以及核酸非特异性结合的降低(实施例3的3-6)、3-7)、3-9)、3-10)和3-11)。而且，令人惊讶的是，蛋白质结构的热稳定性大幅提高(实施例3的3-8))。
因此，优选同时对D40和R104氨基酸残基进行修饰，更优选同时对D40、R104和K141进行修饰。
如以上，优选本发明的修饰型TM2可以选自下组，但不限于此：
在SEQ ID NO：2中，40位的天冬氨酸残基被取代成天冬酰胺残基、且104位的精氨酸残基被取代成谷氨酸残基的修饰型生物素结合蛋白(D40N-R104E)；
在SEQ ID NO：2中，40位的天冬氨酸残基被取代成天冬酰胺残基、且141位的赖氨酸残基被取代成谷氨酸残基的修饰型生物素结合蛋白(D40N-K141E)；以及
在SEQ ID NO：2中，40位的天冬氨酸残基被取代成天冬酰胺残基、104位的精氨酸残基被取代成谷氨酸残基、且141位的赖氨酸残基被取代成谷氨酸残基的修饰型生物素结合蛋白(D40N-R104E-K141E)。
本发明的修饰TM2蛋白质的优选实施方式具有例如SEQ ID NO：8、10、16、20、22、24以及25中的任何一个氨基酸序列。
更优选D40N-R104E、D40N-K141E或D40N-R104E-K141E，最优选D40N-R104E-K141E。
本申请发明的修饰型TM2蛋白质优选满足以下性质中的一个直至全部：
i)与由SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列组成的蛋白质相比，具有低的等电点；
ii)与由SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列组成的蛋白质相比，显示对核酸和/或蛋白质的低的非特异性结合；
iii)与由SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列组成的蛋白质相比，显示低的纤连蛋白结合性；
iv)与由SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列组成的蛋白质相比，显示高的生物素结合性。
关于i)，野生型TM2的等电点是约8.5-8.8。本发明的修饰TM2的等电点优选是8.0以下，更优选是7.7以下。
关于iii)，设野生型TM2对纤连蛋白的结合性为1.3～1.4的情况下，本发明的修饰TM2的纤连蛋白结合性优选是1.0以下、更优选0.7以下、0.25以下、0.15以下。
希望在本发明的修饰TM2中未进行修饰的氨基酸残基
关于本发明的修饰TM2中的氨基酸残基的修饰，需要不影响生物素结合能力。另一方面，作为生物素结合蛋白之一的链霉菌抗生物素蛋白的生物素口袋(pocket)已经阐明。该链霉菌抗生物素蛋白与TM2之间的氨基酸序列同源性仅为50％左右，但发明人等为了获得关于TM2的生物素口袋的认识，将TM2与链霉菌抗生物素蛋白的氨基酸序列进行了并列比较。于是发现：形成链霉菌抗生物素蛋白的生物素口袋的氨基酸中的、与生物素直接相互作用的残基N23、S27、Y43、S45、N49、W79、S88、T90、W92、W108、W120、D128(Weber等，(1989)Science 243：85-88、Livnah等，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：5076-5080)，在TM2中分别相当于N14、S18、Y34、S36、D40、W69、S76、T78、W80、W96、W108、D116，是非常保守的。
唯一的例外是，链霉菌抗生物素蛋白的49位的N(天冬酰胺)在TM2中是40位的D(天冬氨酸)，正如所述，将其修饰成与链霉菌抗生物素蛋白相同的天冬酰胺而得到的D40N TM2的生物素结合能力提高。由这些结果可以认为，TM2与链霉菌抗生物素蛋白的生物素结合口袋具有非常相似的结构，这些氨基酸残基在很大程度上参与了生物素结合。
特别是，4个色氨酸残基(W69、W80、W96、W108)被认为对生物素口袋的结构起着重要的作用，因而希望不进行修饰。另一方面，被认为参与与生物素的结合的其它氨基酸，即被认为在TM2中与生物素直接相互作用的氨基酸残基(N14、S18、Y34、S36、S76、T78、D116)，也希望不进行修饰。或者，在对这些氨基酸进行修饰时，希望修饰成性质或者结构类似的氨基酸，以能够维持与生物素的结合。例如，对于天冬酰胺(N14)，希望修饰成谷氨酰胺(Q)、天冬氨酸(D)，优选天冬氨酸；对于天冬氨酸(D40)，希望修饰成天冬酰胺(N)；对于丝氨酸(S18、S36、S76)，希望修饰成苏氨酸(T)或者酪氨酸(Y)，优选苏氨酸；对于酪氨酸(Y34)，希望修饰成丝氨酸(S)、苏氨酸(T)或者苯丙氨酸(F)，优选苯丙氨酸；对于苏氨酸(T78)，希望修饰成丝氨酸(S)、酪氨酸(Y)，优选丝氨酸；对于天冬氨酸(D116)，希望修饰成谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)，优选天冬酰胺。
氨基酸的修饰方法
用于对TM2的氨基酸进行修饰来获得本发明的修饰TM2的方法，可以采用公知的对氨基酸序列实施突变的方法，对其没有特殊限制。优选对编码TM2的核酸的碱基序列实施修饰，来进行修饰。
例如，为了对氨基酸序列的特定位置的氨基酸进行修饰，可以列举出例如利用PCR的方法(Higuchi等(1988)，Ho等(1989))。即，通过利用包含目标突变的错配密码子的引物进行PCR，制作编码目的变体的DNA并使之表达，能够得到目的变体。
另外，氨基酸缺失、取代、插入和/或添加而成的变体可以通过对编码野生型蛋白质的DNA实施例如作为公知技术的定点诱变(例如参见Nucleic Acid Research，Vol.10，No.20，p.6487-6500，1982，通过引用将其全文引入到本说明书中)而产生。就定点诱变方法而言，例如，除希望的变异即特定的不一致之外，还可以使用与要突变的单链噬菌体DNA互补的合成寡核苷酸引物按如下方式进行。即，使用上述合成寡核苷酸作为引物合成与噬菌体互补的链，用得到的双链DNA转化宿主细胞。将转化后的细菌的培养物铺在琼脂上，由含噬菌体的单个细胞形成噬菌斑。这样，理论上有50％的新菌落含有单链形式的具有突变的噬菌体，其余的50％携带原序列。在下述温度下，使获得的噬菌斑与通过激酶处理而标记的合成探针杂交，所述温度下所述探针与和带有目的突变的DNA完全一致的噬菌斑杂交，而不与携带原有链的噬菌斑杂交。然后，收集与该探针杂交的噬菌斑，进行培养，回收DNA。
编码修饰tamavidin 2(TM2)蛋白质的核酸
本发明提供编码本发明的修饰型TM2的核酸。这样的核酸的碱基序列是将TM2的碱基序列(SEQ ID NO：1)修饰成编码修饰型TM2蛋白质的修饰氨基酸的碱基序列而得到的。被修饰的碱基序列只要是编码修饰后氨基酸的碱基序列即可，对其没有限制。例如包括：为了对由SEQ ID NO：1的碱基序列组成的核酸，或与其互补链在严格条件下杂交、且编码具有生物素结合活性的蛋白质的核酸(以下称作“TM2基因”)实施本发明的修饰，而对碱基序列进行修饰而得到的。
本发明的核酸优选编码SEQ ID NO：8、10、16、20、22、24以及25中的任何一个氨基酸序列。更优选编码氨基酸序列22或24。本发明的核酸优选由SEQ ID NO：7、9、15、19、21以及23的核酸序列组成。更优选由SEQID NO：21或23的核酸序列组成。
包含发明的核酸的载体
此外，本发明提供包含编码修饰TM2蛋白质的核酸的载体。优选用于表达修饰TM2蛋白质的表达载体。
编码本发明的修饰TM2蛋白质的核酸如上述“编码修饰tamavidin蛋白质的核酸”中所述，没有特殊限制。
而且，编码修饰TM2蛋白质的核酸的一端或两端可以具有限制酶识别位点或aatB1、aatB2、aatB3等Gateway系统(Invitrogen公司)中使用的序列等，此外修饰TM2蛋白质编码核酸的上游可以配置在希望的宿主中发挥功能的启动子，或者其下游可以配置终止子。
而且，对于限制酶识别位点的种类没有特殊限制，但优选在表达载体中其是唯一的识别位点。对识别位点的数量没有特殊限制，可以是1个或2个以上，优选10个以下。
而且，限制酶位点、aatB序列与修饰TM2核酸的碱基序列之间可以配置编码1个氨基酸以上、优选5个氨基酸以上、更优选10个氨基酸以上、更优选25个氨基酸以上且50个氨基酸以下的接头氨基酸序列(对其没有特殊限制，可以是富含甘氨酸、丝氨酸的序列等本领域技术人员通常使用的序列)的核酸序列，此外，并非特殊限制，还可以配置例如编码诸如肠激酶、FactorXa等蛋白酶的识别位点的序列。
此外，在将例如scFv、Fab等抗体基因插入该表达载体的情况下，在细胞质内部这样的还原条件不适合融合蛋白质的表达时，在启动子与由用于插入编码修饰tamavidin的核酸序列构成的单元之间，可以包含编码诸如信号肽、分泌信号等前导肽的核酸序列。
本发明的载体优选是表达载体。表达载体除了具有这样的表达单元之外，还可以具有用于能够在希望的宿主中进行复制的单元例如具有复制起点，或者还可以具有用于选择希望的宿主细胞的药物抗性标记基因。对于宿主没有特殊限制，优选是大肠杆菌。此外，该表达载体中还可以组合入例如大肠杆菌中的乳糖阻遏物系统这样的合适的表达调控系统。
固定化有修饰tamavidin的载体
本发明提供固定化有本发明的修饰TM2蛋白质的载体。
构成的载体的材料可以使用公知材料。包括例如纤维素、特氟隆、硝酸纤维素、琼脂糖、葡聚糖、壳聚糖、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚酯、聚碳酸酯、聚酰胺、聚丙烯、尼龙、聚偏二氟乙烯、胶乳、二氧化硅、玻璃、玻璃纤维、金、铂、银、铜、铁、不锈钢、铁氧体、硅晶片、聚乙烯、聚乙烯亚胺、聚乳酸、树脂、多糖类、蛋白质(白蛋白等)、碳或它们的组合，但不限于此。此外，优选具有一定强度、组成稳定、且非特异性结合少的载体。
固体载体的形状包括但不限于：珠子、磁珠、薄膜、微细管、滤膜、平板、微量板、碳纳米管、传感器芯片等。正如本技术领域公知的那样，薄膜或平板等平坦的固体载体上可以设置凹坑、沟槽、滤膜底部等。
在本发明的一类实施方式中，珠子可以具有约25nm～约1mm范围的球体直径。在优选的实施方式中，珠子具有约50nm～约10μm范围的直径。磁珠的尺寸可以根据特定的用途来进行选择。数种细菌孢子具有约1μm数量级的尺寸，因此用于捕捉这些孢子的优选珠子具有大于1μm的直径。
对于蛋白质针对载体的结合没有特殊限制，可以使用使蛋白质结合于载体的公知方法。具体的结合方法，本领域技术人员可以根据载体的种类等适宜选择。
发明的效果
根据本发明，能够提供：在保持tamavidin的生物素结合能力高的特性的同时，性能提升的修饰型生物素结合蛋白，所述性能提升是指非特异性结合性降低和/或进一步的生物素结合提高。通过利用这些修饰tamavidin，能够在利用了抗生物素蛋白-生物素结合的用于测定检测对象的检测方法例如免疫测定、核酸杂交测定中，谋求降低背景、提高灵敏度、保持恶劣环境(高温、变性剂、酶存在下等)中的生物素结合性。
附图说明
图1显示了本发明的低pI型修饰TM2蛋白质对于血清蛋白质固定化磁珠的非特异性结合性。**p＜0.01对TM2
图2显示了本发明的低pI型修饰TM2蛋白质对于纤连蛋白的非特异性结合性。*p＜0.01对TM2
图3显示了本发明的低pI型修饰TM2蛋白质对DNA的非特异性结合性。
图4中考察了血清蛋白质针对固定化有本发明的低非特异性结合-高亲和性型TM2蛋白质的磁珠的非特异吸附性。*p＜0.1对TM2
图5显示了本发明的低非特异性结合-高亲和性型TM2蛋白质对纤连蛋白的非特异性结合性。*p＜0.01对TM2
图6显示了本发明的低非特异性结合-高亲和性型TM2蛋白质对DNA的非特异性结合性。图6的上、中、下分别显示了野生型TM2、TM2R104EK141E、TM2D40NR104EK141E的结果。
实施例
以下，通过实施例对本发明进行具体说明，但这些并不是对本发明的技术范围的限定。本领域技术人员可以基于本说明书的记载容易地对本发明加以修饰、变更，这些也包含在本发明的技术范围内。
实施例1低pI型TM2的构建与分析
1-1)低pI型TM2的构建
以降低TM2的等电点为目的，将TM2中的碱性氨基酸残基取代成中性氨基酸或酸性氨基酸，构建了以下的7个修饰体。
(1)将26位的赖氨酸取代成丙氨酸的TM2(以下称作“TM2K26A”，碱基序列SEQ ID NO：3，氨基酸序列SEQ ID NO：4)；
(2)将73位的赖氨酸取代成谷氨酰胺的TM2(以下称作“TM2K73Q”，碱基序列为SEQ ID NO：5，氨基酸序列为SEQ ID NO：6)；
(3)将104位的精氨酸取代成谷氨酸的TM2(以下称作“TM2R104E”，碱基序列为SEQ ID NO：7，氨基酸序列为SEQ ID NO：8)；
(4)141位的赖氨酸突变成谷氨酸的TM2(以下称作“TM2K141E”，碱基序列为SEQ ID NO：9，氨基酸序列为SEQ ID NO：10)；
(5)具有33位的赖氨酸→苏氨酸的取代和37位的赖氨酸→丙氨酸的取代的TM2(以下称作“TM2K33TK37A”，碱基序列为SEQ ID NO：11，氨基酸序列为SEQ ID NO：12)；
(6)具有33位的赖氨酸→苏氨酸的取代、37位的赖氨酸→丙氨酸的取代以及104位的精氨酸→谷氨酸的取代的TM2(以下称作“TM2K33TK37AR104E”，碱基序列为SEQ ID NO：13，氨基酸序列为SEQ IDNO：14)；以及
(7)具有104位的精氨酸→谷氨酸的取代和141位的赖氨酸→谷氨酸的取代的TM2(以下称作“TM2R104EK141E”，碱基序列为SEQ ID NO：15，氨基酸序列为SEQ ID NO：16)。
(8)将19位的赖氨酸取代成苏氨酸的TM2(以下称作“TM2K19T”，碱基序列为SEQ ID NO：17，氨基酸序列为SEQ ID NO：18)；
R104E的E、K33TK37A的T和A是通过TM2与链霉菌抗生物素蛋白的氨基酸序列比较，参考链霉菌抗生物素蛋白序列上的该部分的氨基酸确定的。此外，K141E的E是参考tamavidin 1序列上的该部分的氨基酸确定的。
首先，为了构建低pI型TM2，设计了用于导入各突变的引物。设计了由TM2基因的5’部分及在其上游编码Pci I限制酶切割位点(ACATGT)的序列构成的引物Tm2NtermPci、以及由TM2基因的3’部分及在其下游编码BamH I限制酶切割位点(GGATCC)的序列构成的引物Tm2CtermBam。针对各变体的包含错配密码子的一系列有义引物和反义引物分别如下(SEQ IDNO：26-37)。
表1低pI型TM2构建用引物
[表1]
限制酶识别位点用下划线表示，突变导入位点用点划线表示。
1-2)PCR
为了构建低pI型TM2基因，进行了两步PCR。第1步PCR以将TM2基因导入载体pTrc99A而得到的质粒作为模板，使用引物Tm2NtermPci与包含各变体的错配密码子的各反义引物Tm2K26A R、Tm2K73Q R、Tm2K33TK37A R、Tm2R104E R、Tm2K19T R，进行5’部分的扩增；使用包含错配密码子的有义引物Tm2K26A F、Tm2K73Q F、Tm2K33TK37A F、Tm2R104E F、Tm2K19T F之一与Tm2CtermBam，进行3’部分的扩增。
对于TM2K141E，使用引物Tm2NtermPci和Tm2K141E Bam，在第1PCR反应中导入突变。
PCR反应条件如下：50μL的反应液中添加有模板DNA 500ng、10×Pyrobest buffer(Takara公司)5μL、2.5mM dNTP 4μL、引物各25pmol、5U/μL Pyrobest DNA polymerase(Takara公司制)0.5μL，使用程序控温系统PC-700(ASTEK)，进行96℃-3分钟1轮，96℃-1分钟、55℃-1分钟、72℃-2分钟10轮，72℃-6分钟1轮。其结果，在5’部分方面，得到了TM2K33TK37A的约120bp、TM2K R104E的约330bp的PCR产物；在3’部分方面，得到了TM2K33TK37A的约310bp、TM2K R104E的约100bp、TM2K19T的约60bp的PCR产物。此外，对于TM2K141E，得到了约430bp的PCR产物。
对于这些PCR产物，使用低熔点琼脂糖(SeaPlaqueGTG)在TAE缓冲液中进行了琼脂糖电泳。将各DNA片段按凝胶切出，加入与凝胶等量的200mM NaCl，70℃处理10分钟，融解凝胶。对于该样品，进行苯酚抽提、苯酚-氯仿抽提、氯仿抽提各1次，通过乙醇沉淀回收了5’部分和3’部分的DNA片段。以该片段作为模板，为了构建TM2K141E以外的基因，使用引物Tm2NtermPci和Tm2CtermBam，进行了第2步PCR。反应条件与第1步相同。其结果，得到了430bp的PCR产物。
1-3)克隆
将通过PCR获得的低pI型TM2基因片段克隆至载体pCR4Blunt TOPO(Invitrogen公司制)中。连接反应按载体试剂盒附带的说明书进行。在大肠杆菌TB1中采用电穿孔法导入DNA，按常规方法(Sambrook等，1989，Molecular Cloning，A laboratory manual，2nd edition)抽提了质粒DNA。对于确认了插入物的克隆，使用M13引物(Takara公司)，用ABI PRISM荧光测序仪(Model 310Genetic Analyzer，Perkin Elmer公司)从两端起测定了PCR产物的碱基序列，确认对象碱基中导入了突变。
对于确认了碱基序列的基因，对将其插入pCR4Blunt TOPO中而得到的质粒用Pci I和BamH I进行双重消化，采用前述方法进行凝胶纯化，回收了DNA片段。使用Ligation kit(Takara公司制)将该片段连接至预先用NcoI和BamH I消化的大肠杆菌表达用载体pTrc99A中。用连接产物转化大肠杆菌TB1，按照常规方法抽提质粒DNA并进行限制酶分析，确认插入基因的有无，制作完成了低pI型TM2蛋白表达用载体TM2K26A/pTrc99A、TM2K73Q/pTrc99A、TM2K33TK37A、TM2R104E/pTrc99A、TM2K141E/pTrc99A、TM2K19T/pTrc99A。而且，编码TM2R104EK141E的基因的构建是通过以载体TM2R104E/pTrc99A作为模板、使用引物Tm2NtermPci和Tm2K141EBam的PCR导入了突变。此外，编码TM2K33TK37AR104E的基因的构建是通过以载体TM2K33TK37A/pTrc99A作为模板、使用引物Tm2NtermPci和Tm2K141E Bam的PCR导入突变，并按与上述相同的方法进行了克隆。
1-4)低pI型TM2的大肠杆菌表达
将用各低pI型TM2/pTrc99A转化的大肠杆菌TB1接种于含抗生素氨苄西林(最终浓度100μg/mL)的LB培养基6mL中，于37℃振荡培养至OD600处的吸光度为0.5。然后，添加1mM IPTG，再于37℃振荡培养过夜。对培养液1mL进行离心收集大肠杆菌，悬浮于20mM磷酸缓冲液(pH7)400uL中后，利用超声波破碎菌体。对破碎液进行离心(15000rpm)，将其上清作为可溶性级分。
对该可溶性级分进行Western印迹分析。将该可溶性级分与2×SDS样品缓冲液(250mM Tris-HCl pH 6.8，20％2-巯基乙醇，20％SDS，20％甘油(グルセロ一ル)等量混合，95℃加热10分钟，然后在SDS-PAGE上展开，应用于Westem印迹分析。作为第1抗体，使用了兔抗TM2抗体(PCT/JP2006/326260)。而且，作为第2抗体，使用了碱性磷酸酶标记抗兔IgG抗体(BIO-RAD公司制)。Western印迹分析的结果是，对于任何一种用低pITM2/pTrc99A转化的大肠杆菌均检测出了15.5kDa附近的条带，而该条带在用未插入低pI型TM2基因的载体pTrc99A转化的大肠杆菌中不存在。这些条带的大小与通过TM2的氨基酸序列预测的单体的分子量15.5kDa一致。
然后，按照Bayer等(1996，Electrophoresis 17(8)1319-24)的方法，确认了非变性状态的TM2变体是否形成四聚体。即，将未添加DTT、巯基乙醇等还原剂的SDS样品缓冲液与TM2变体可溶性级分混合，不进行加热处理而进行SDS-PAGE分析。其结果是，对于任何一种TM2变体均检测出了与野生型TM2相同大小的条带，因而形成了四聚体。此外，平均每1L培养液的可溶性低pI型TM2蛋白的表达量方面，TM2K26A、TM2K73Q、TM2R104E、TM2K141E、TM2R104EK141E均为20mg。这与野生型TM2的表达量等同。
另一方面，与这些变体相比，TM2K33TK37A、TM2K33TK37AR104E、TM2K19T的表达量为2mg。
1-5)利用荧光生物素进行活性测定
按照Biochim.Biophys.Acta，1427，44-48(1999)的方法对大肠杆菌表达的各低pI型TM2的生物素结合能力进行了确认。用1.5mL的20mM磷酸缓冲液(pH7)从25mL培养液中抽提各低pI型TM2，得到了抽提液，进行制备使得150μL Assay Buffer(50mM NaH2PO4、100mM NaCl、1mMEDTA(pH7.5))中有梯度地包含所述抽提液。在该溶液中混合10pmol/μL荧光生物素溶液(biotin-4-fluorescein：Molecular Probe公司制)50μL(500pmol)，室温下反应10分钟后，使用Infinite M200(TECAN公司制)以Ex＝460nm、Em＝525nm测定荧光强度。
其结果是，荧光强度与低pI型TM2抽提液的添加量成比例地降低。由此可以确认，将碱性氨基酸取代成中性和酸性氨基酸的全长TM2与类生物素化合物结合。
1-6)低pI型TM2的纯化
低pI型TM2的纯化是按照Hofmann等(1980)的方法，使用充填有2-亚胺基生物素琼脂糖(2-iminobiotin agarose)(Sigma公司制)的柱子进行的。将经诱导表达各低pI型TM2的大肠杆菌培养液25mL悬浮于含50mM NaCl的50mM CAPS(pH11)1.5mL中，将超声波破碎后的上清上样至充填有2-亚胺基生物素琼脂糖500μL的柱子。用含500mM NaCl的50mM CAPS(pH11)充分洗涤柱子后，用50mM NH4OAC(pH4)进行洗脱。各低pI型TM2的纯化蛋白质量与各大肠杆菌表达量为同等程度，纯化度为95％以上。
1-7)生物素结合能力的测定
使用Biacore(注册商标)3000(Biacore公司制，基于表面等离子体共振原理的生物传感器)，实施了低pI型TM2的生物素结合试验。采用胺偶联法，将用EZ-Link(R)NHS-LC-Biotin(22.4
)或EZ-Link(注册商标)NHS-LCLC-Biotin(30.5
)(两者均为PIERCE公司制)生物素化的牛血清白蛋白(BSA)固定在传感器芯片CM5(Biacore公司制)上。使用HBS-EP(Biacore公司制)作为工作(running)缓冲液，对于各低pI型TM2，于25℃以流速20μl/分钟各注射40μl(2分钟)。
使用分析软件BIAevaluation version 4.1，从所得传感图谱计算出结合速度常数(ka)、解离速度常数(kd)、解离常数(KD)。该结果如表2所示。表中的()内的值表示为Biacore 3000的检测限以下(ka＜5×10-6)。任何一种低pI型TM2均显示出与生物素的特异性结合，表明这些突变未对生物素结合力产生大的影响。
表2低pI型TM2与生物素的相互作用分析
[表2]
1-8)等电点电泳
通过使用XCell SureLock Mini-Cell(Invitrogen公司制)的等电点电泳，对低pI型TM2的等电点进行了测定。按照操作说明书的记载，分别将各低pI型TM2500ng与IEF Sample Buffer pH 3-10(2×)(Invitrogen公司制)混合，添加至pH范围3-10的聚丙烯酰胺凝胶(pH3-10IEF Gel(Invitrogen公司制))。按100V 1小时、200V 1小时、500V 45分钟的顺序提高电压，同时进行电泳。
电泳后，将凝胶在印迹缓冲液(0.7％醋酸)中振荡10分钟后，使用XCellll Blot Module(Invitrogen公司制)，在10V的条件下对PVDF膜转印1小时。使该PVDF膜与作为第1抗体的兔抗TM2抗体(PCT/JP2006/326260)、作为第2抗体的碱性磷酸酶标记抗兔IgG抗体(BIO-RAD公司制)进行反应，并用Alkaline Phosphatase Substrate Kit II＜VECTOR Black＞(VECTRO公司制)进行了条带的检测。
结果可知，导入突变的TM2的等电点均比野生型TM2降低了1以上。利用等电点电泳获得的pI实测值与利用Genetyx获得pI计算值如以下的表3所示。
表3低pI型TM2的等电点
[表3]
1-9)对人血清的非特异性结合
在本实施例中，以针对血清蛋白质固定化磁珠的低pI型TM2的非特异吸附性的形式，考察了针对人血清的非特异性结合。具体地，为了研究低pI型TM2的非特异性结合性，使人血清蛋白质共价结合于磁珠，并测定了该珠子上吸附的低pI型TM2量。作为所研究的低pI型TM2，选择了在大肠杆菌中的表达量高的TM2K26A、TM2K73Q、TM2R104E、TM2K141E、TM2R104EK141E。
人血清蛋白质与磁珠的结合按以下方法进行。将表面用羧基包覆的磁珠(Dynabeads M-270Carboxylic Acid，Dynal公司制)210μl用0.01N氢氧化钠210μL洗涤10分钟后，再用超纯水210μL洗涤3次，每次10分钟。在洗涤完毕的磁珠中添加溶解在冷超纯水中的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)carbodiimideHydrochloride(1-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl)carbodiimideHydrochloride，EDC)(PIERCE公司制)，使得其最终浓度为0.2M，室温振荡30分钟。然后，先用冷超纯水210μl、再用50mM MES缓冲液(pH5.0)210μL洗涤磁珠。
在该磁珠中添加用50mM MES缓冲液(pH 5.0)进行了透析的1mg/mL人血清蛋白质(CHEMICON公司制)210μL。通过室温振荡30分钟，使人血清蛋白质与磁珠通过共价键结合。用磁铁回收磁珠，除去上清。然后，用50mMTris缓冲液(pH 7.0)210μl清除珠子的未反应活性基团后，用含0.5％BSA、0.1％Tween 20的PBS缓冲液420μl对磁珠进行了封闭。用PBS缓冲液210μl悬浮磁珠，制作完成了人血清蛋白质固定化磁珠。
将该磁珠7μL与0.56μg/mL的各低pI型TM2 100μL混合，室温反应1小时。用磁铁回收磁珠，除去上清。然后，用含500mM氯化钠的20mM磷酸钾缓冲液500μL进行洗涤，然后在磁珠中添加2×SDS样品缓冲液(250mMTris-HCl pH 6.8，20％2-巯基乙醇，20％SDS，20％甘油)20μL，通过95℃加热20分钟，使低pI型TM2从磁珠上游离出来。
对该样品进行SDS-PAGE后进行Western印迹分析，从而确认了低pI型TM2的存在量。作为第1抗体使用了兔抗tamavidin 2抗体，作为第2抗体使用了碱性磷酸酶标记山羊抗兔IgG抗体。使用Alkaline Phosphatase Substrate Kit II＜VECTOR Black＞(VECTRO公司制)进行了条带的检测，用Las-3000(FUJIFILM)进行了这些条带的定量化。结果如图1所示。
如图1所示，与野生型TM2相比，吸附于人血清蛋白质的比例方面，TM2R104E减少了1成、TM2K26A减少了3成、K73Q和K141E减少了4成、TM2R104EK141E减少了7成，而与TM2相比，K26A、K73Q、K141E、K104EK141E的非特异性结合显著低。
1-10)对纤连蛋白的非特异性结合
将纤连蛋白固相化于微量板，比较了各低pI型TM2的结合性。在New ELISA平板(住友Bakelite公司)上各添加50μl用New ELISA平板专用固定化溶液调整成50μg/ml的纤连蛋白，通过37℃振荡4小时进行了固相化。然后，用含有0.1％Triton X-100的PBS 300μl洗涤3次，自然干燥。
向其中添加50μg/ml的TM2、K26A、K73Q、R104E、K141E、R104EK141E50μl，室温静置1小时。用300μL/孔的PBST(含0.1％Tween 20的PBS缓冲液)洗涤3次后，添加50μL/孔的用含0.5％BSA的PBST稀释5000倍的生物素化HRP，室温反应1小时。再用300μL/孔的PBST洗涤3次后，用50μL/孔的1-Step Ultra TMB-ELISA进行生色。用50μL/孔的2M硫酸终止生色后，用Infinite 200测定了450nm处的吸光度。其结果是，与TM2相比，任何低pI型TM2对纤连蛋白的结合性均显著地降低。
结果如图2所示。如图2所示，与纤连蛋白的结合抑制效果由高至低依次为R104EK141E、K141E、R104E、K26A、K73Q。
1-11)对DNA的非特异性结合
分析了低pI型TM2对DNA的非特异性结合性。
对用2×SSC缓冲液从10μg～1μg梯度稀释的鲑鱼精DNA进行碱变性，使用Bio-Dot SF(BIO-RAD)，吸附于Hybond N+膜(Amersham Biosceinces)。用5×Denhart’s液(0.1％BSA、0.1％聚蔗糖、0.1％聚乙烯基吡咯烷酮(ポロビニルプロリドン))对膜进行封闭后，在25μg/mL的各低pI型TM2、野生型TM2中室温下浸泡90分钟。然后，将膜用TTBS缓冲液(含0.05％Tween20的TBS缓冲液)室温下洗涤3次，每次5分钟。用含3％脱脂牛奶、0.1％Tween20的TBS缓冲液对膜进行1小时的封闭。与用含3％脱脂牛奶、0.1％Tween20的TB S缓冲液5000倍稀释的Biotinylated Horseradise Peroxidase(Vector公司制)于室温反应1小时。再次用含有0.1％Tween 20的TBS洗涤膜后，在由ECL(Amasham公司制)的试剂1和试剂2等量混合而成的溶液中将膜振荡1分钟。然后，使用Las3000(FUJIFILM)进行鲁米诺反应的检测。
结果如图3所示。如图3所示，对于10μg DNA，仅TM2有微弱结合，导入了低pI突变的全部TM2均为检测限以下。因此这表明，低pI型TM2对DNA的非特异性结合性显著地降低。
基于实施例1的结果，将本发明的低pI型修饰TM2的特性总结于下表4。
表4低pI型修饰TM2的特性的总结
[表4]
实施例2高亲和性型TM2的构建与分析
2-1)高亲和性型TM2的构建
为了验证是否提高对生物素的亲和性，将氨基酸突变导入TM2。
作为链霉菌抗生物素蛋白，已知有streptmyces violaceus的链霉菌抗生物素蛋白v2(保藏号：Q53533，Bayer等，(1995)Biochim Biophys Acta1263：p.60-66)、链霉菌抗生物素蛋白v1(保藏号：Q53532)、阿维丁氏链霉菌(streptmyces avidinii)的链霉菌抗生物素蛋白(保藏号：P22629，Argarana等，(1986)Nucleic Acids Res 14：p.1871-1882)等。如WO02/072817所记载，这些链霉菌抗生物素蛋白与TM2蛋白质的氨基酸序列的同一性分别为50％、48％、48％，即约50％左右。
然而，本发明人等认为，TM2蛋白质为了保持生物素结合性、或者获得更高的生物素结合性，可能有必要具有与链霉菌抗生物素蛋白类似的结构。对于链霉菌抗生物素蛋白中被认为对与生物素的结合起重要作用的色氨酸残基、参与氢键的残基(Qureshi et al.(2001)，J.Biol.Chem.276(49)，p.46422-46428)，比较了链霉菌抗生物素蛋白与TM2的氨基酸序列。
结果发现：在参与与生物素的氢键的残基中，链霉菌抗生物素蛋白序列的49位的天冬酰胺与TM2序列中相应的氨基酸(40位的天冬氨酸)不同。将该TM2的D40修饰成链霉菌抗生物素蛋白型的天冬酰胺，对于亲和性是否提高进行了确认。
首先，为了构建高亲和性型TM2，设计了导入上述突变的引物。由TM2基因的5’部分与在其上游编码Pci I限制酶切割位点(ACATGT)的序列构成的引物Tm2NtermPci、由TM2基因的3’部分与在其下游编码BamH I限制酶切割位点(GGATCC)的序列构成的引物Tm2CtermBam如上述。针对各变体的包含错配密码子的一系列有义引物和反义引物分别如下(SEQ IDNO：38-39)。
表5高亲和性型TM2构建用引物
[表5]
SEQ ID NO：38and 39
限制酶识别位点用下划线表示，突变导入位点用点划线表示。
2-2)PCR、克隆
像上述那样，构建了将40位的天冬氨酸取代成天冬酰胺而成的TM2变体(以下称作“TM2D40N”，碱基序列为SEQ ID NO：19，氨基酸序列为SEQ IDNO：20)。
为了构建编码该TM2变体的基因，反复进行了两步PCR。最初的第1步PCR是以将TM2基因导入载体pTrc99A而得到的质粒作为模板，使用引物Tm2NtermPci与包含各变体的错配密码子的反义引物TM2SA D40N R进行5’部分的扩增，并使用包含错配密码子的有义引物TM2SAD40N F与Tm2CtermBam进行3’部分的扩增。
PCR反应条件如下：50μL的反应液中添加有模板DNA 500ng、10×Pyrobest buffer(Takara公司)5μL、2.5mM dNTP 4μL、引物各25pmol、5U/μLPyrobest DNA polymerase(Takara公司制)0.5μL，使用程序控温系统PC-700(ASTEK)进行96℃-3分钟1轮、96℃-1分钟、55℃-1分钟、72℃-2分钟10轮、72℃-6分钟1轮。其结果是，在5’部分方面，获得了预想大小的PCR产物。对于这些PCR产物，使用低熔点琼脂糖(SeaPlaqueGTG)在TAE缓冲液中进行琼脂糖电泳，如上述地纯化了DNA片段。
以该片段作为模板，使用引物Tm2NtermPci和Tm2CtermBam，进行了第2步PCR。反应条件与第1步相同。将所得的430bp的高亲和性型TM2基因片段克隆至载体pCR4Blunt TOPO(Invitrogen公司制)。方法与上述相同。其结果是，制作完成了TM2D40N蛋白表达用载体TM2D40N/pTrc99A。
2-3)高亲和性型TM2的大肠杆菌表达
用2-2)中制作的插入了TM2变体的pTrc99A载体转化大肠杆菌TB1，将其接种于含抗生素氨苄西林(最终浓度100μg/mL)的LB培养基6mL中，于37℃振荡培养直至OD600处的吸光度达到0.5。
然后，添加1mM IPTG，再于37℃振荡培养过夜。从培养液1mL中通过离心收集大肠杆菌，将其悬浮于20mM磷酸缓冲液(pH7)400μL中后，利用超声波破碎菌体。对破碎液进行离心(15000rpm)，将其上清作为可溶性级分。对于该可溶性级分，进行Western印迹分析。将可溶性级分与2×SDS样品缓冲液等量混合，95℃加热10分钟后用SDS-PAGE进行展开，进行Western印迹分析。作为第1抗体，使用了兔抗TM2抗体(PCT/JP2006/326260)。而且，作为第2抗体，使用了碱性磷酸酶标记抗兔IgG抗体(BIO-RAD公司制)。
其结果是，在用插入了TM2D40N的pTrc99A载体转化的大肠杆菌中，检测到了15.5kDa附近的条带，而该条带在用未插入TM2变体的pTrc99A载体转化的大肠杆菌中不存在。它们的大小与根据TM2的氨基酸序列预测的单体的分子量15.5kDa一致。然后，像低pI型TM2那样，采用Bayer等，(1996)，Electrophoresis.17(8)1319-1324)的方法确认了非变性状态的高亲和性型TM2是否形成四聚体。其结果是，在高亲和性型TM2中也检测到了与野生型TM2同样大小的条带，可知形成了四聚体。此外，平均每1L培养液中的可溶性TM2D40N蛋白的表达量为20mg。
2-4)高亲和性型TM2的纯化
高亲和性型TM2的纯化如上述地按照Hofmann et al.(1980)的方法进行。其结果是，TM2变体的纯化蛋白质量与大肠杆菌表达量为同等程度，纯化度为95％以上。
2-5)利用荧光生物素进行活性测定
采用Biochim.Biophys.Acta，1427，44-48(1999)的方法确认了纯化的TM2变体的生物素结合能力。其结果是，荧光强度与TM2变体溶液的添加量成比例地降低。由此可以确认，D40N的突变不对TM2与类生物素化合物的结合产生大的阻碍。
2-6)等电点电泳
通过使用XCell SureLock Mini-Cell(Invitrogen)进行的等电点电泳，测定了高亲和性型TM2的等电点。按照操作说明书的记载，使用高亲和性型TM2200ng进行了分析，结果如表6所示。取代成碱性的氨基酸的TM2D40N，在等电点电泳中显示高于野生型TM2的等电点。
表6高亲和性型TM2的等电点
[表6]
2-7)生物素结合能力的测定
使用Biacore 3000(Biacore公司制)，实施高亲和性型TM2的亚胺基生物素(Iminobiotin)结合试验以及生物素结合试验，进行了分子间相互作用的分析。
2-7-1)亚胺基生物素结合试验
作为贴附于传感器芯片的配体使用的TM2或高亲和性型TM2，按照常规方法用2-亚胺基生物素琼脂糖进行纯化，并于20mM KPi(pH 7)中透析过夜。将这些试样在10mM醋酸缓冲液pH5(BIAcore公司制)中调整成50μg/ml左右。
固定化以HBS-EP(Biacore公司制)作为工作缓冲液，在25℃、流速10μl/分钟的条件下进行。采用胺偶联法，在传感器芯片CM5(Biacore公司制)上固定4000～8000RU左右的上述TM2或TM2变体。活化时间为10分钟。
特异性相互作用的测定，以亚胺基生物素BSA作为分析物(流路系统中流动的物质)，以CAPS buffer(50mM CAPS、150mM NaCl、0.005％Tween20、pH11)作为工作缓冲液，在25℃、流速20μl/分钟的条件下进行。亚胺基生物素BSA如下地制作。将高纯化度的BSA(Sigma)2mg与NHS-Iminobiotin(亚胺基生物素)(Pierce)1mg溶解在1ml的50mM硼酸钠pH8.0中，4℃温育2小时。将其装入透析管(MWCO 6-8,000)中，相对于50mM碳酸钠pH6.7于4℃透析过夜。将这样制作的亚胺基生物素-BSA结合物(MW 67kDa，30μM)作为Biacore(注册商标)生物传感器的分析物。亚胺基生物素-BSA的注射时间为2分钟、解离时间为10分钟。测定在不进行再生操作的情况下，从低浓度起梯度性地提高浓度来进行。首先，在固定化有目的蛋白质的流动池(flow cell)中，从低浓度侧起注射用工作缓冲液稀释成9.375nM、18.75nM、37.5nM、75nM、150nM、300nM、600nM的BSA 40μl(2分钟)，测定了解离。然后，在相同流动池中，同样地测定了按上述方法制作的亚胺基生物素-BSA。
对于观察到相互作用的，使用分析软件BIAevaluation ver.4.1计算出各常数。从用各浓度的亚胺基生物素-BSA获得的传感图谱中减去作为基准的用同浓度的BSA获得的传感图谱，针对所得的传感图谱，使用反应模型1∶1(Langmuir)binding进行反应速度论分析，计算出结合速度常数(ka)和解离速度常数(kd)。解离常数(KD)由kd/ka求出。而且，在不进行再生操作的情况下，每进行各浓度的测定，Rmax(分析物的最大结合量)减少，但在分析时将Rmax进行局部拟合(local fitting)，按浓度进行计算。此时，仅采用能够近似1∶1(Langmuir)binding模型的浓度(主要是18.75～75nM)的结果。
其结果是，与TM2相比，TM2D40N对亚胺基生物素的结合速度常数(ka)上升了约40％，解离速度常数(kd)降低了45％。作为结果，KD减少约60％。即，与TM2相比，TM2D40N对亚胺基生物素的亲和性是2.5倍(表7)。
2-7-2)生物素结合试验
将高纯化度的BSA(Sigma)2mg与NHS-LC-生物素(Pierce)1mg溶解在1ml的50mM硼酸钠pH8.0中，4℃温育2小时。将其装入透析管(MWCO6-8,000)，相对于50mM碳酸钠pH6.7于4℃透析过夜。将这样制作成的生物素-LC-BSA结合物(MW 67kDa，30μM)作为Biacore(注册商标)生物传感器的配体。另一方面，作为分析物，将TM2以及高亲和性型TM2(D40N)如上述地用2-亚胺基生物素琼脂糖进行纯化，相对于20mM KPi(pH7)透析过夜，进行了制备。
将生物素-LC-BSA和作为阴性对照的BSA采用胺偶联法固定化于CM5传感器芯片。进行调节，使得固定化量为200RU左右。将固定化有BSA的芯片配置于流动池1和3，将固体化有生物素-LC-BSA的芯片配置于流动池2和4。将TM2加载于流动池1和2，将高亲和性型TM2(D40N)加载于流动池3和4，流速20μl/分钟进行2分钟，使用工作缓冲液[10mM HEPESpH7.4，150mM NaCl，3mM EDTA，0.005％Surfactantat20(Biacore Inc.)]。
然后，监测样品的解离60分钟。而且，因为使结合的TM2以及高亲和性型TM2(D40N)解离是不可能的，所以，在测定中不进行再生操作，从低浓度侧起进行7个梯度的测定(3.125、6.25、12.5、25、50、100和200nM)。以BSA的数据作为基准，从BSA-LC-生物素的数据中将其减去。测定在25℃进行。根据所得传感图谱，使用分析软件BIAevaluation ver.4.1采用1∶1结合模型进行反应速度论分析，计算出结合速度常数(ka)和解离速度常数(kd)。解离常数(KD)由kd/ka求出。在不进行再生操作的情况下，每进行各浓度的测定，Rmax(分析物的最大结合量)减少，但在分析时将Rmax进行局部拟合(local fitting)，按浓度进行计算。此外，仅采用能够近似1∶1结合模型的分析物浓度的数据。
其结果是，与TM2相比，TM2D40N的结合速度常数(ka)上升、解离速度常数(kd)降低(表7)。
以上表明，TM2D40N的生物素结合能力(亲和性)提高。
表7高亲和性型TM2与亚胺基生物素及生物素的相互作用分析
[表7]
基于实施例2的结果，将本发明的高亲和性型TM2的特性总结如下表8。
表8高亲和性型TM2的特性的总结
[表8]
实施例3低非特异性结合-高亲和性型TM2的构建与分析
3-1)低非特异性结合-高亲和性型TM2(HALU TM2：高亲和性和低非特
异性(High affinity and low unspecificity))的构建
将用于在降低非特异性结合性的同时、提高对生物素的亲和性的突变导入TM2。
在用于降低非特异性结合性的突变方面，鉴于实施例1的结果，作为降低非特异性结合性的氨基酸突变，导入了R104E与K141E的突变。此外，在用于提高对生物素的亲和性的突变方面，根据实施例2的生物素结合能力测定结果，导入了D40N的突变。即，在D40N的基础上，构建了同时具有R104E的突变的TM2(以下称作“TM2D40NR104E”，碱基序列为SEQ IDNO：21，氨基酸序列为SEQ ID NO：22)、以及同时具有R104EK141E的突变的TM2(以下称作“TM2D40NR104EK141E”，碱基序列为SEQ ID NO：23，氨基酸序列为SEQ ID NO：24)。
3-2)PCR、克隆
用于构建HALU TM2的引物，使用了在导入上述各突变时使用的引物。此外，PCR的条件、克隆也按照与上述相同的方法实施。
编码TM2D40NR104E的基因的构建如下进行：以载体TM2D40N/pTrc99A作为模板，使用引物Tm2NtermPci和Tm2R104E R、Tm2R104E F和Tm2CtermBam进行2次PCR反应来导入突变，从而制作完成了TM2D40NR104E蛋白表达用载体TM2D40NR104E/pTrc99A。编码TM2D40NR104EK141E 的基因的构建如下进行：以载体TM2D40NR104E/pTrc99A作为模板，使用引物Tm2NtermPci与Tm2K141E Bam进行1次PCR反应来导入突变，从而制作完成了TM2D40NR104EK141E蛋白表达用载体TM2D40NR104EK141E/pTrc99A。
3-3)HALU TM2的大肠杆菌表达
用插入了各TM2变体的pTrc99A载体转化大肠杆菌TB1，将其接种于含抗生素氨苄西林(最终浓度100μg/mL)的LB培养基6mL中，37℃或25℃振荡培养直至OD600处的吸光度达到0.5。然后，添加1mM IPTG，再于37℃或25℃振荡培养过夜。通过离心从培养液1mL中收集大肠杆菌，将其悬浮于20mM磷酸缓冲液(pH7)400μL中后，利用超声波破碎菌体。对破碎液进行离心(15000rpm)，将其上清作为可溶性级分。将该可溶性级分与2×SDS样品缓冲液等量混合，95℃加热10分钟后，在SDS-PAGE上展开蛋白质，然后通过CBB染色进行了蛋白质的检测。
其结果是，在任何用插入了TM2变体的pTrc99A载体转化的大肠杆菌中均检测到了15.5kDa附近的条带，而该条带在用未插入TM2变体的pTrc99A载体转化的大肠杆菌中不存在。它们的大小与根据TM2的氨基酸序列预测的单体的分子量15.5kDa一致。然后，采用Bayer等(1996，Electrophoresis.17(8)1319-24)的方法确认了非变性状态的HALU TM2是否与低pI型TM2、高亲和性型TM2一样形成四聚体。其结果是，对于HALU TM2也检测出了与野生型TM2同样大小的条带，这表明形成了四聚体。此外，平均每1L培养液中的可溶性TM2变体蛋白质的表达量方面，TM2D40NR104E在37℃培养时为24mg，TM2D40NR104EK141E在37℃培养时为10mg，TM2D40NR104E在25℃培养时为32mg。TM2D40NR104EK141E通过将宿主变更为BL21(DE3)，在25℃培养时的可溶性表达量增加至43mg。
3-4)HALUTM2的纯化
HALU TM2的纯化如上述地按照Hofmann et al.(1980)的方法进行。其结果是，各TM2变体的纯化蛋白质量与各蛋白质表达量为同等程度，纯化度为90％以上。
3-5)利用荧光生物素进行活性测定
对于纯化的各TM2变体的生物素结合能力，采用Biochim.Biophys.Acta，1427，44-48(1999)的方法进行了确认。其结果是，荧光强度与所有的HALUTM2变体溶液的添加量成比例地降低。由此可以确认HALU TM2变体与类生物素化合物结合。
3-6)等电点电泳
通过使用XCell SureLock Mini-Cell(Invitrogen)的等电点电泳测定了HALU TM2的等电点。按照操作说明书的记载，使用各HALU TM24μg通过CBB染色检测了条带。结果如表9所示。可知：TM2D40N的实测等电点为9.7，通过施加R104E的突变下降至8.9，进一步通过施加K141E的突变下降至7.3-7.5。
表9HALU TM2的等电点
[表9]
3-7)生物素结合能力的测定
使用Biacore 3000(Biacore公司制)，实施了高亲和性型TM2的生物素结合试验。
用于配体的生物素BSA像上述的2-7-2)那样制备。另一方面，作为分析物使用的TM2或HALU TM2，按照常规方法用2-亚胺基生物素琼脂糖进行纯化，并相对于20MM KPi(pH 7)透析过夜。进行调整，使得分析物在10mM醋酸缓冲液pH5(BIAcore公司制)中的浓度为50μg/ml左右。
配体的固定化、与分析物的特异性相互作用的测定及其分析像2-7-2)那样进行。其结果是，与TM2相比，两种HALU TM2对生物素的结合速度常数(ka)均提高。
此外，TM2D40NR104EK141E显示解离速度常数(kd)降低、生物素结合能力进一步提高。
表10高亲和性TM2与生物素的相互作用分析
[表10]
生物素-BSA(22.4)
3-8)HALU TM2蛋白质结构的热稳定性
将调整成0.2μg/μL的TM2变体各10μL(2μg)于室温、50、60、70、80、90、99℃加热20分钟。然后，以15000rpm离心10分钟，将上清的可溶性蛋白质悬浮于等量的2×SDS样品缓冲液(250mM Tris-HCl pH6.8，20％2-巯基乙醇，20％SDS，20％甘油)中，95℃加热10分钟后进行SDS-PAGE。蛋白质条带通过CBB染色进行检测。使用Las-3000(FUJIFILM)以定量标记(LMW ELECTROPHORESIS CALIBRATION KIT；Pharmacia Biotech)为基础制作标准曲线，对蛋白质条带进行了定量化。
其结果是，D40NR104E的50％的蛋白质消失的温度为78℃。另一方面，D40NR104EK141E即使在99℃加热，仍有78％的蛋白质保留在上清中。而且，50％的蛋白质消失的温度对TM2而言是87.5℃，对链霉菌抗生物素蛋白而言是70℃。
3-9)HALU TM2对人血清的非特异性结合
在本实施例中，研究了血清蛋白质对HALU TM2固定化磁珠的非特异吸附性。
在磁珠(Dynabeads M-270Carboxylic Acid，Dynal公司制)上采用上述的1-9)的方法共价结合TM2 D40NR104E和TM2D40NR104EK141E，测定该珠子吸附的人血清蛋白质量。制备磁珠，使得各HALU TM2的固定化量为10μg/100μl珠子。将人血清(CHEMICON公司制)用PBS缓冲液稀释800倍，向其中添加调整了固定化蛋白质量的HALU TM2磁珠50μl，室温下上下颠倒混合15分钟。用含0.1％Tween 20的PBS缓冲液(PBST)500μl洗涤4次后，添加用含0.5％BSA的PBST稀释5000倍的HRP标记小鼠抗人IgG抗体100μL，室温下进行15分钟的抗原抗体反应。然后用PBST 500μl洗涤5次后，用1-Step Ultra TMB-ELISA 100μl进行生色。用2M硫酸100μl终止生色后，用磁铁回收磁珠，用Infinite 200测定了上清在450nm处的吸光度。
结果如图4所示。如图4所示，TM2D40NR104E和TM2D40NR104EK141E均显示比野生型TM2磁珠低的值。
3-10)对纤连蛋白的非特异性结合
对于HALU TM2，采用与实施例1的1-10)相同的方法进行了对纤连蛋白的非特异性结合实验。
其结果是，TM2D40NR104EK141E对纤连蛋白的结合性也极低，与TM2相比，对纤连蛋白的结合性显著地降低(图5)。与低pI TM2中与纤连蛋白的结合抑制效果最显著的TM2R104EK141E相比，D40NR104EK141E为同等程度。
由该结果可以确认，D40N突变不影响R104EK141E与纤连蛋白的结合。
3-11)对DNA的非特异性结合
采用实施例1的1-11)的方法对HALU TM2对DNA的非特异性结合性进行了分析。其结果是，相对于10μg DNA，野生型TM2微弱结合，而TM2D40NR104EK141E与TM2R104EK141E一样为检测限以下(图6)。因此，可以确认D40N突变对与DNA的结合也没有影响。
基于实施例3的结果，将本发明的低非特异性结合-高亲和性型TM2的特性总结于以下的表11。
表11低非特异性结合-高亲和性型TM2的特性的总结
[表11]
NT：未测定
Claims (15)
1.一种修饰型生物素结合蛋白，其是在包含SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列、或在该序列中具有一个～数个氨基酸突变的氨基酸序列、或与该序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列且显示生物素结合活性的蛋白质中，选自下组中的一个或多个残基被取代成酸性氨基酸残基或中性氨基酸残基而成的：
1)SEQ ID NO：2的104位的精氨酸残基；
2)SEQ ID NO：2的141位的赖氨酸残基；
3)SEQ ID NO：2的26位的赖氨酸残基；以及
4)SEQ ID NO：2的73位的赖氨酸残基。
2.根据权利要求1所述的修饰型生物素结合蛋白，其中，选自1)～4)中的氨基酸残基被取代成疏水性指数为2以下的氨基酸残基。
3.根据权利要求1所述的修饰型生物素结合蛋白，其中，1)SEQ ID NO：2的104位的精氨酸残基，和/或2)SEQ ID NO：2的141位的赖氨酸残基被取代成酸性氨基酸残基或中性氨基酸残基。
4.根据权利要求3所述的修饰型生物素结合蛋白，其中，1)SEQ ID NO：2的104位的精氨酸残基，和/或2)SEQ ID NO：2的141位的赖氨酸残基被取代成酸性氨基酸残基。
5.根据权利要求3或4所述的修饰型生物素结合蛋白，其中，1)SEQ IDNO：2的104位的精氨酸残基、和/或2)SEQ ID NO：2的141位的赖氨酸残基被取代成谷氨酸残基。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的修饰型生物素结合蛋白，其中，进一步SEQ ID NO：2的40位的天冬氨酸残基被取代成天冬酰胺残基。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的修饰型生物素结合蛋白，其选自下组：
在SEQ ID NO：2中104位的精氨酸残基被取代成谷氨酸残基、且141位的赖氨酸残基被取代成谷氨酸残基的修饰型生物素结合蛋白(R104E-K141E)；
在SEQ ID NO：2中40位的天冬氨酸残基被取代成天冬酰胺残基、且104位的精氨酸残基被取代成谷氨酸残基的修饰型生物素结合蛋白(D40N-R104E)；
在SEQ ID NO：2中40位的天冬氨酸残基被取代成天冬酰胺残基、且141位的赖氨酸残基被取代成谷氨酸残基的修饰型生物素结合蛋白(D40N-K141E)；以及
在SEQ ID NO：2中，40位的天冬氨酸残基被取代成天冬酰胺残基、104位的精氨酸残基被取代成谷氨酸残基、且141位的赖氨酸残基被取代成谷氨酸残基的修饰型生物素结合蛋白(D40N-R104E-K141E)。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的修饰型生物素结合蛋白，其满足以下a)-l)中的一个至全部条件：
a)SEQ ID NO：2的14位的天冬酰胺残基未被修饰、或者被取代成谷氨酰胺或天冬氨酸；
b)SEQ ID NO：2的18位的丝氨酸残基未被修饰、或者被取代成苏氨酸或酪氨酸；
c)SEQ ID NO：2的34位的酪氨酸残基未被修饰、或者被取代成丝氨酸、苏氨酸或苯丙氨酸；
d)SEQ ID NO：2的36位的丝氨酸残基未被修饰、或者被取代成苏氨酸或酪氨酸；
e)SEQ ID NO：2的40位的天冬氨酸残基未被修饰、或者被取代成天冬酰胺；
f)SEQ ID NO：2的69位的色氨酸残基未被修饰；
g)SEQ ID NO：2的76位的丝氨酸残基未被修饰、或者被取代成苏氨酸或酪氨酸；
h)SEQ ID NO：2的78位的苏氨酸残基未被修饰、或者被取代成丝氨酸或酪氨酸；
i)SEQ ID NO：2的80位的色氨酸残基未被修饰；
j)SEQ ID NO：2的96位的色氨酸残基未被修饰；
k)SEQ ID NO：2的108位的色氨酸残基未被修饰；以及
l)SEQ ID NO：2的116位的天冬氨酸残基未被修饰、或者被取代成谷氨酸或天冬酰胺。
9.根据权利要求1所述的修饰型生物素结合蛋白，其包含与SEQ IDNO：2所述的氨基酸序列具有90％以上的同一性的氨基酸序列。
10.根据权利要求1～9中任一项所述的修饰型生物素结合蛋白，其满足以下的一个至全部性质：
i)与由SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列组成的蛋白质相比，具有更低的等电点；
ii)与由SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列组成的蛋白质相比，显示对核酸和/或蛋白质的更低的非特异性结合；
iii)与由SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列组成的蛋白质相比，显示更低的纤连蛋白结合性；
iv)与由SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列组成的蛋白质相比，显示更高的生物素结合性。
11.在包含SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列、或在该序列中具有一个～数个氨基酸突变的氨基酸序列、或与该序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列，且显示生物素结合活性的蛋白质中，SEQ ID NO：2的40位的天冬氨酸残基被取代成天冬酰胺残基的修饰型生物素结合蛋白。
12.根据权利要求11所述的修饰型生物素结合蛋白，该修饰型生物素结合蛋白与由SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列组成的蛋白质相比，显示更高的生物素结合性。
13.编码权利要求1～12中任一项所述的蛋白质的核酸。
14.包含权利要求13所述的核酸的载体。
15.固定化有权利要求1～14中任一项所述的蛋白质的载体。
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