JPWO2010018859A1 - 改変型ビオチン結合タンパク質 - Google Patents
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Abstract
本発明は、改変型ビオチン結合タンパク質に関する。本発明の改変型ビオチン結合タンパク質は、配列番号２に記載のアミノ酸配列、あるいはこの配列中に１から数個のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列、又はこの配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ビオチン結合活性を示すタンパク質において、以下のグループ１）配列番号２の１０４番目のアルギニン残基；２）配列番号２の１４１番目のリジン残基；３）配列番号２の２６番目のリジン残基；４）配列番号２の７３番目のリジン残基から選択される１または複数の残基が、酸性アミノ酸残基又は中性アミノ酸残基に置換されていることを特徴とする。
Description
本出願は、２００８年８月１３日に出願された日本国特許出願２００８−２０８７６６に基づく優先権を主張する。
本発明は、改変型ビオチン結合タンパク質に関する。
アビジンは卵白由来タンパク質、ストレプトアビジンは放線菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｉｄｉｎｉｉ）由来のタンパク質である。アビジン又はストレプトアビジンは、ビオチン（Ｄ−［（＋）−ｃｉｓ−ヘキサヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−チエノ−（３，４）−イミダゾール−４−吉草酸］との親和性（アフィニティ）が非常に高く（ＫＤ＝１０−１６〜−１４）、生体二分子間の相互作用としては、最も強い相互作用の一つである。分子量は６０ｋＤａ程度である。現在、アビジン／ストレプトアビジン−ビオチン相互作用は、生化学、分子生物学、あるいは医学の分野で広く応用されている（Ｇｒｅｅｎ， （１９７５）， Ａｄｖ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ．， ２９： ８５−１３３；Ｇｒｅｅｎ， （１９９０）， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．， １８４： ５１−６７）。アビジン／ストレプトアビジンは両タンパク質とも四量体を形成し、１つのサブユニット当たり１分子のビオチンと結合する。
アビジンの利用に関して、その非特異結合が問題となっている。アビジンは細胞の他、ＤＮＡやタンパク質、あるいは膜といった生体成分に非特異に結合する場合があり、例えばアビジン−ビオチン結合を用いて物質を検出しようとするとき、アビジンが検出対象物質以外にも非特異に結合し、バックグラウンドを高めてしまう場合がある。アビジンの非特異結合が高い理由として、等電点が高いこと、分子量の約１０％の糖鎖を有していること、などが挙げられている。アビジンは、強塩基性のタンパク質であり、等電点が１０以上と非常に高く、全体として正の電荷を帯びているため、負の電荷を帯びているものの多い生体成分と結合しやすいと考えられている。
また、アビジン表面の糖鎖は、生体成分と結合しやすいと考えられている（Ｍａｒｔｔｉｌａ ｅｔ ａｌ. （２０００） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ， ４６７， ３１−３６）。アビジンの非特異結合を低下させるために、グリコシダーゼによってアビジンの糖鎖を除去した化学修飾ニュートラアビジンの研究（Ｂａｙｅｒ ｅｔ ａｌ. （１９９５） Ａｐｐｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， ５３（１）， １−９）や、アビジンにおいてグリコシル化のターゲットとなっている１７番目のアスパラギン残基をイソロイシン残基に置換することによって、糖鎖修飾を受けないアビジンを生合成する研究（Ｍａｒｔｔｉｌａ ｅｔ ａｌ. （２０００） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ， ４６７， ３１−３６）などが行われている。さらに、アビジンが有するリジン残基、アルギニン残基を中性アミノ酸や酸性アミノ酸に遺伝子工学的に変換することによって、アビジンの等電点を下げる研究も行われている（Ｍａｒｔｔｉｌａ ｅｔ ａｌ． （１９９８） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ， ４４１， ３１３−３１７）。
しかし、このような改変によって、例えばアビジンに対するＤＮＡや細胞の非特異結合は低下しているものの、臨床検査システムなどへの応用時に必要なヒト血清への非特異結合抑制に関しては十分に検討されていない。また、アビジン変異体を生合成する際は、昆虫細胞による発現系を使用する必要がある。そのため、培養に時間を要することと、コストが高いことから、配列改変アビジンの実用化には至っていないのが現状である。
アビジンやストレプトアビジンのようなビオチン結合性タンパク質とビオチンとのアフィニティ（親和性）に関する研究として、ストレプトアビジンの構造を大きく改変させて、蛍光ビオチンとの結合を強化したという報告がある（Ａｓｌａｎ ｅｔ ａｌ. （２００５） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．， １０２，８５０７−８５１２）。しかし、このタンパク質は、同時にビオチンとの結合能を大幅に損なってしまっている。
本発明者らは、食用キノコタモギタケ（Ｐｕｅｕｒｏｔｕｓ ｃｏｎｕｃｏｐｉａｅ）から、イネいもち病菌Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａに対して抗菌性を示すタンパク質を精製した。当該タンパク質は、ビオチン結合性を示すことが見いだされ、タマビジン（タマビジン１）と命名された。タマビジン１タンパク質のアミノ酸配列、及び当該タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列はともにＷＯ０２／０７２８１７に開示されている（ＷＯ０２／０７２８１７中の配列番号１及び２）。さらに、タマビジン１のホモローグ（タマビジン２）も同キノコから同定され、強いビオチン結合能を有することが示された。タマビジン２タンパク質のアミノ酸配列、及び当該タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列はともにＷＯ０２／０７２８１７に開示されており、（ＷＯ０２／０７２８１７中の配列番号３及び４）、組換えタンパク質の生産にも成功している。タマビジン１及び２は、大腸菌で発現をさせることができ、特にタマビジン２は、イミノビオチンカラムを用いた精製により容易に調製でき、ストレプトアビジンと比べても高い耐熱性を有する、といった点で優れたビオチン結合性タンパク質である。しかしながら、核酸及び／又はタンパク質に対する非特異結合については、従来のアビジンよりも少ないもののストレプトアビジンと同程度には存在していた。
ＷＯ２００８／０８１９３８ Ａ１
Ｍａｒｔｔｉｌａ ｅｔ ａｌ． （２０００） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ， ４６７， ３１−３６
Ｂａｙｅｒ ｅｔ ａｌ. （１９９５） Ａｐｐｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， ５３（１）， １−９）
Ｍａｒｔｔｉｌａ ｅｔ ａｌ. （１９９８） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ， ４４１， ３１３−３１７
Ａｌｏｎ ｅｔ ａｌ. （１９９０） Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ， １７０， １２３６−１２４１
Ａｓｌａｎ ｅｔ ａｌ. （２００５） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．， １０２，８５０７−８５１２
Ｗｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３： ８５−８８
Ｌｉｖｎａｈ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９０： ５０７６−５０８０
Ｑｕｒｅｓｈｉ ｅｔ ａｌ.（２００１） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７６（４９），ｐ．４６４２２−４６４２８
本発明の課題は、高いビオチン結合能というタマビジンの特性を保持しつつ、非特異結合性の低下、及び／又は更なるビオチン結合の向上、といった性能を向上させた改変型ビオチン結合タンパク質の提供である。
本発明は天然のタマビジン２（以下、本明細書において「ＴＭ２」と記載する場合がある）のアミノ酸配列（配列番号２）を改変することにより、その性能を向上させることに成功したものである。
本発明の好ましい態様
本発明は好ましくは以下の態様を含む。
［態様１]
配列番号２に記載のアミノ酸配列、あるいはこの配列中に１から数個のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列、又はこの配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ビオチン結合活性を示すタンパク質において、以下のグループ
１）配列番号２の１０４番目のアルギニン残基；
２）配列番号２の１４１番目のリジン残基；
３）配列番号２の２６番目のリジン残基；及び
４）配列番号２の７３番目のリジン残基
から選択される１又は複数の残基が、酸性アミノ酸残基又は中性アミノ酸残基に置換されていることを特徴とする、改変型ビオチン結合タンパク質。
［態様２]
１）〜４）のいずれかのアミノ酸残基が、疎水性指標が２以下のアミノ酸残基に置換されている、態様１に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。
［態様３]
１）配列番号２の１０４番目のアルギニン残基、及び／又は、２）配列番号２の１４１番目のリジン残基が、酸性アミノ酸残基又は中性アミノ酸残基に置換されている、態様１に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。
［態様４]
１）配列番号２の１０４番目のアルギニン残基、及び／又は、２）配列番号２の１４１番目のリジン残基が、酸性アミノ酸残基に置換されている、態様３に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。
［態様５]
１）配列番号２の１０４番目のアルギニン残基、及び／又は、２）配列番号２の１４１番目のリジン残基が、グルタミン酸残基に置換されている、態様３又は４に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。
［態様６]
さらに、配列番号２の４０番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基に置換されている、態様１ないし５のいずれか１項に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。
［態様７]
配列番号２において、１０４番目のアルギニン残基がグルタミン酸残基に置換されており、そして、１４１番目のリジン残基がグルタミン酸残基に置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（Ｒ１０４Ｅ−Ｋ１４１Ｅ）；
配列番号２において、４０番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基に置換されており、そして、１０４番目のアルギニン残基がグルタミン酸残基に置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（Ｄ４０Ｎ−Ｒ１０４Ｅ）；
配列番号２において、４０番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基に置換されており、そして、１４１番目のリジン残基がグルタミン酸残基に置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（Ｄ４０Ｎ−Ｋ１４１Ｅ）；並びに、
配列番号２において、４０番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基に置換されており、１０４番目のアルギニン残基がグルタミン酸残基に置換されており、そして、１４１番目のリジン残基がグルタミン酸残基に置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（Ｄ４０Ｎ−Ｒ１０４Ｅ−Ｋ１４１Ｅ）、
からなるグループから選択される、態様１ないし６のいずれか１項に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。
［態様８]
以下のａ）−ｌ）
ａ）配列番号２の１４番目のアスパラギン残基は改変されていない、あるいはグルタミン又はアスパラギン酸に置換されている；
ｂ）配列番号２の１８番目のセリン残基は改変されていない、あるいはスレオニン又はチロシンに置換されている；
ｃ）配列番号２の３４番目のチロシン残基は改変されていない、あるいはセリン、スレオニン又はフェニルアラニンに置換されている；
ｄ）配列番号２の３６番目のセリン残基は改変されていない、あるいはスレオニン又はチロシンに置換されている；
ｅ）配列番号２の４０番目のアスパラギン酸残基は改変されていない、あるいはアスパラギンに置換されている；
ｆ）配列番号２の６９番目のトリプトファン残基は改変されていない；
ｇ）配列番号２の７６番目のセリン残基は改変されていない、あるいはスレオニン又はチロシンに置換されている；
ｈ）配列番号２の７８番目のスレオニン残基は改変されていない、あるいはセリン又はチロシンに置換されている；
ｉ）配列番号２の８０番目のトリプトファン残基は改変されていない；
ｊ）配列番号２の９６番目のトリプトファン残基は改変されていない；
ｋ）配列番号２の１０８番目のトリプトファン残基は改変されていない；
そして、
ｌ）配列番号２の１１６番目のアスパラギン酸残基は改変されていない、あるいはグルタミン酸又はアスパラギンに置換されている
の１ないし全ての条件を満たす、態様１ないし７のいずれか１項に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。
［態様９]
配列番号２に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む、態様１に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。
［態様１０]
以下の性質
ｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質よりも、低い等電点を有する；
ｉｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質よりも、核酸及び／又はタンパク質に対する低い非特異的結合を示す；
ｉｉｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質よりも、低いフィブロネクチン結合性を示す；
ｉｖ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質よりも、高いビオチン結合性を示す；
の１ないし全部を満たす、態様１ないし９のいずれか１項に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。
［態様１１]
配列番号２に記載のアミノ酸配列、あるいはこの配列中に１から数個のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列、又はこの配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ビオチン結合活性を示すタンパク質において、配列番号２の４０番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基に置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質。
［態様１２]
配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質よりも、高いビオチン結合性を示す、態様１１に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。
［態様１３]
態様１ないし１２のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする核酸。
［態様１４]
態様１３に記載の核酸を含む、ベクター。
［態様１５]
態様１ないし１４のいずれか１項に記載のタンパク質を固定化した担体。
本発明は好ましくは以下の態様を含む。
［態様１]
配列番号２に記載のアミノ酸配列、あるいはこの配列中に１から数個のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列、又はこの配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ビオチン結合活性を示すタンパク質において、以下のグループ
１）配列番号２の１０４番目のアルギニン残基；
２）配列番号２の１４１番目のリジン残基；
３）配列番号２の２６番目のリジン残基；及び
４）配列番号２の７３番目のリジン残基
から選択される１又は複数の残基が、酸性アミノ酸残基又は中性アミノ酸残基に置換されていることを特徴とする、改変型ビオチン結合タンパク質。
［態様２]
１）〜４）のいずれかのアミノ酸残基が、疎水性指標が２以下のアミノ酸残基に置換されている、態様１に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。
［態様３]
１）配列番号２の１０４番目のアルギニン残基、及び／又は、２）配列番号２の１４１番目のリジン残基が、酸性アミノ酸残基又は中性アミノ酸残基に置換されている、態様１に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。
［態様４]
１）配列番号２の１０４番目のアルギニン残基、及び／又は、２）配列番号２の１４１番目のリジン残基が、酸性アミノ酸残基に置換されている、態様３に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。
［態様５]
１）配列番号２の１０４番目のアルギニン残基、及び／又は、２）配列番号２の１４１番目のリジン残基が、グルタミン酸残基に置換されている、態様３又は４に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。
［態様６]
さらに、配列番号２の４０番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基に置換されている、態様１ないし５のいずれか１項に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。
［態様７]
配列番号２において、１０４番目のアルギニン残基がグルタミン酸残基に置換されており、そして、１４１番目のリジン残基がグルタミン酸残基に置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（Ｒ１０４Ｅ−Ｋ１４１Ｅ）；
配列番号２において、４０番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基に置換されており、そして、１０４番目のアルギニン残基がグルタミン酸残基に置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（Ｄ４０Ｎ−Ｒ１０４Ｅ）；
配列番号２において、４０番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基に置換されており、そして、１４１番目のリジン残基がグルタミン酸残基に置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（Ｄ４０Ｎ−Ｋ１４１Ｅ）；並びに、
配列番号２において、４０番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基に置換されており、１０４番目のアルギニン残基がグルタミン酸残基に置換されており、そして、１４１番目のリジン残基がグルタミン酸残基に置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（Ｄ４０Ｎ−Ｒ１０４Ｅ−Ｋ１４１Ｅ）、
からなるグループから選択される、態様１ないし６のいずれか１項に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。
［態様８]
以下のａ）−ｌ）
ａ）配列番号２の１４番目のアスパラギン残基は改変されていない、あるいはグルタミン又はアスパラギン酸に置換されている；
ｂ）配列番号２の１８番目のセリン残基は改変されていない、あるいはスレオニン又はチロシンに置換されている；
ｃ）配列番号２の３４番目のチロシン残基は改変されていない、あるいはセリン、スレオニン又はフェニルアラニンに置換されている；
ｄ）配列番号２の３６番目のセリン残基は改変されていない、あるいはスレオニン又はチロシンに置換されている；
ｅ）配列番号２の４０番目のアスパラギン酸残基は改変されていない、あるいはアスパラギンに置換されている；
ｆ）配列番号２の６９番目のトリプトファン残基は改変されていない；
ｇ）配列番号２の７６番目のセリン残基は改変されていない、あるいはスレオニン又はチロシンに置換されている；
ｈ）配列番号２の７８番目のスレオニン残基は改変されていない、あるいはセリン又はチロシンに置換されている；
ｉ）配列番号２の８０番目のトリプトファン残基は改変されていない；
ｊ）配列番号２の９６番目のトリプトファン残基は改変されていない；
ｋ）配列番号２の１０８番目のトリプトファン残基は改変されていない；
そして、
ｌ）配列番号２の１１６番目のアスパラギン酸残基は改変されていない、あるいはグルタミン酸又はアスパラギンに置換されている
の１ないし全ての条件を満たす、態様１ないし７のいずれか１項に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。
［態様９]
配列番号２に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む、態様１に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。
［態様１０]
以下の性質
ｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質よりも、低い等電点を有する；
ｉｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質よりも、核酸及び／又はタンパク質に対する低い非特異的結合を示す；
ｉｉｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質よりも、低いフィブロネクチン結合性を示す；
ｉｖ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質よりも、高いビオチン結合性を示す；
の１ないし全部を満たす、態様１ないし９のいずれか１項に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。
［態様１１]
配列番号２に記載のアミノ酸配列、あるいはこの配列中に１から数個のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列、又はこの配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ビオチン結合活性を示すタンパク質において、配列番号２の４０番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基に置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質。
［態様１２]
配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質よりも、高いビオチン結合性を示す、態様１１に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。
［態様１３]
態様１ないし１２のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする核酸。
［態様１４]
態様１３に記載の核酸を含む、ベクター。
［態様１５]
態様１ないし１４のいずれか１項に記載のタンパク質を固定化した担体。
以下、本発明を実施するための好ましい形態について説明する。
タマビジン
タマビジンは、食用キノコである担子菌タモギタケ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｃｏｎｕｃｏｐｉａｅ）から発見された新規ビオチン結合タンパク質である（ＷＯ０２／０７２８１７）。当該文献には、
−タマビジン１とタマビジン２の相互のアミノ酸相同性は６５．５％で、ビオチンと強く結合する；
−タマビジン２は、大腸菌で可溶性画分に高発現する；そして
−タマビジン２を大腸菌で発現させた場合、４．５時間の培養で、５０ｍｌの培養当たり約１ｍｇの純度の高い精製組換えタンパク質が得られた。これはビオチン結合性タンパク質として知られているアビジンやストレプトアビジンと比較しても、非常に高い値である；
ことが記載されている。
タマビジンは、食用キノコである担子菌タモギタケ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｃｏｎｕｃｏｐｉａｅ）から発見された新規ビオチン結合タンパク質である（ＷＯ０２／０７２８１７）。当該文献には、
−タマビジン１とタマビジン２の相互のアミノ酸相同性は６５．５％で、ビオチンと強く結合する；
−タマビジン２は、大腸菌で可溶性画分に高発現する；そして
−タマビジン２を大腸菌で発現させた場合、４．５時間の培養で、５０ｍｌの培養当たり約１ｍｇの純度の高い精製組換えタンパク質が得られた。これはビオチン結合性タンパク質として知られているアビジンやストレプトアビジンと比較しても、非常に高い値である；
ことが記載されている。
本明細書における「タマビジン２」は、タマビジン２（ＴＭ２）又はそれらの変異体を意味する。本発明は、ＴＭ２又はその変異体の特定のアミノ酸残基を改変させることにより、核酸及び／又はタンパク質への非特異的結合を示す、改変型ＴＭ２を提供するものである。本明細書において「タマビジン２」、「ＴＭ２」と記載した場合には、特に言及しない限り野生型のＴＭ２及びその変異体を意味する。ただし、文意により、本発明の改変型ＴＭ２も含めてＴＭ２の野生型、変異型、本発明の改変型の総称として使用する場合もある。また、ＴＭ２はビオチン結合性を示すことから、本明細書においてＴＭ２を「ビオチン結合タンパク質」と呼称することがある。
具体的には、ＴＭ２（野生型）は典型的には、配列番号２のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質、又は、配列番号１の塩基配列を含んでなる核酸によってコードされるタンパク質、であってよい。あるいは、ＴＭ２は、配列番号２のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質、又は、配列番号１の塩基配列を含んでなる核酸によってコードされるタンパク質、の変異体であって、タマビジン２と同様のビオチン結合活性を有するタンパク質であってよい。ＴＭ２の変異体は、配列番号２のアミノ酸配列において、１または複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入および／または付加を含むアミノ酸配列を含んでなるタンパク質であって、ＴＭ２と同様のビオチン結合活性を有するタンパク質であってもよい。置換は、保存的置換であってもよく、これは、特定のアミノ酸残基を類似の物理化学的特徴を有する残基で置き換えることである。保存的置換の非限定的な例には、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、ＬｅｕまたはＡｌａ相互の置換のような脂肪族基含有アミノ酸残基の間の置換、Ｌｙｓ及びＡｒｇ、Ｇｌｕ及びＡｓｐ、Ｇｌｎ及びＡｓｎ相互の置換のような極性残基の間での置換などが含まれる。
アミノ酸の欠失、置換、挿入および／または付加による変異体は、野生型タンパク質をコードするＤＮＡに、例えば周知技術である部位特異的変異誘発（例えば、Nucleic Acid Research, Vol.10, No. 20, p.6487-6500, 1982参照、引用によりその全体を本明細書に援用する）を施すことにより作成することができる。本明細書において、「１又は複数のアミノ酸」とは、部位特異的変異誘発法により欠失、置換、挿入及び／又は付加できる程度のアミノ酸を意味する。また、本明細書において「１又は複数のアミノ酸」とは、場合により、１又は数個のアミノ酸を意味してもよい。
部位特異的変異誘発法は、例えば、所望の変異である特定の不一致の他は、変異を受けるべき一本鎖ファージＤＮＡに相補的な合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて次のように行うことができる。即ち、プライマーとして上記合成オリゴヌクレオチドを用いてファージに相補的な鎖を合成させ、得られた二重鎖ＤＮＡで宿主細胞を形質転換する。形質転換された細菌の培養物を寒天にプレーティングし、ファージを含有する単一細胞からプラークを形成させる。そうすると、理論的には５０％の新コロニーが一本鎖として変異を有するファージを含有し、残りの５０％が元の配列を有する。上記所望の変異を有するＤＮＡと完全に一致するものとはハイブリダイズするが、元の鎖を有するものとはハイブリダイズしない温度において、得られたプラークをキナーゼ処理により標識した合成プローブとハイブリダイズさせる。次に該プローブとハイブリダイズするプラークを拾い、培養してＤＮＡを回収する。
なお、生物活性ペプチドのアミノ酸配列にその活性を保持しつつ１または複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入及び／又は付加を施す方法としては、上記の部位特異的変異誘発の他にも、遺伝子を変異源で処理する方法、及び遺伝子を選択的に開裂し、次に選択されたヌクレオチドを除去、置換、挿入又は付加し、次いで連結する方法もある。より好ましくは、本発明におけるＴＭ２は、配列番号２において１ないしは１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、ビオチン活性を有するタンパク質である。
ＴＭ２の変異体はさらに、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％以上、好ましくは８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上、より好ましくは９９．３％以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるタンパク質であって、ＴＭ２と同様のビオチン結合活性を有するタンパク質であってもよい。
２つのアミノ酸配列の同一性％は、視覚的検査および数学的計算によって決定してもよい。あるいは、２つのタンパク質配列の同一性パーセントは、Needleman, S. B. 及びWunsch, C. D. （J. Mol. Biol., 48: 443-453, 1970）のアルゴリズムに基づき、そしてウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）より入手可能なＧＡＰコンピュータープログラムを用い配列情報を比較することにより、決定してもよい。ＧＡＰプログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）Henikoff, S. 及びHenikoff, J. G. （Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 10915-10919, 1992）に記載されるような、スコアリング・マトリックス、ｂｌｏｓｕｍ６２；（２）１２のギャップ加重；（３）４のギャップ長加重；及び（４）末端ギャップに対するペナルティなし、が含まれる。
当業者に用いられる、配列比較の他のプログラムもまた、用いてもよい。同一性のパーセントは、例えばAltschulら(Nucl. Acids. Res., 25, p.3389-3402, 1997）に記載されているＢＬＡＳＴプログラムを用いて配列情報と比較し決定することが可能である。当該プログラムは、インターネット上でNational Center for Biotechnology Information（ＮＣＢＩ）、あるいはDNA Data Bank of Japan（ＤＤＢＪ）のウェブサイトから利用することが可能である。ＢＬＡＳＴプログラムによる同一性検索の各種条件（パラメーター）は同サイトに詳しく記載されており、一部の設定を適宜変更することが可能であるが、検索は通常デフォルト値を用いて行う。又は、２つのアミノ酸配列の同一性％は、遺伝情報処理ソフトウエアＧＥＮＥＴＹＸ Ｖｅｒ．７（ゼネティックス製）などのプログラム、又は、ＦＡＳＴＡアルゴリズムなどを用いて決定してもよい。その際、検索はデフォルト値を用いてよい。
２つの核酸配列の同一性％は、視覚的検査と数学的計算により決定可能であるか、またはより好ましくは、この比較はコンピュータ・プログラムを使用して配列情報を比較することによってなされる。代表的な、好ましいコンピュータ・プログラムは、遺伝学コンピュータ・グループ（ＧＣＧ；ウィスコンシン州マディソン）のウィスコンシン・パッケージ、バージョン１０．０プログラム「ＧＡＰ」である（Devereux, et al., 1984, Nucl. Acids Res., 12: 387）。この「ＧＡＰ」プログラムの使用により、２つの核酸配列の比較の他に、２つのアミノ酸配列の比較、核酸配列とアミノ酸配列との比較を行うことができる。ここで、「ＧＡＰ」プログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）ヌクレオチドについての（同一物について１、及び非同一物について０の値を含む）一元（unary）比較マトリックスのＧＣＧ実行と、Schwartz及びDayhoff監修「ポリペプチドの配列および構造のアトラス（Atlas of Polypeptide Sequence and Structure）」国立バイオ医学研究財団、３５３−３５８頁、１９７９により記載されるような、GribskovおよびBurgess, Nucl. Acids Res., 14: 6745, 1986の加重アミノ酸比較マトリックス；又は他の比較可能な比較マトリックス；（２）アミノ酸の各ギャップについて３０のペナルティと各ギャップ中の各記号について追加の１のペナルティ；又はヌクレオチド配列の各ギャップについて５０のペナルティと各ギャップ中の各記号について追加の３のペナルティ；（３）エンドギャップへのノーペナルティ：及び（４）長いギャップへは最大ペナルティなし、が含まれる。当業者により使用される他の配列比較プログラムでは、例えば、米国国立医学ライブラリーのウェブサイト：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bls.htmlにより使用が利用可能なＢＬＡＳＴＮプログラム、バージョン２．２．７、またはＵＷ−ＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムが使用可能である。ＵＷ−ＢＬＡＳＴ２．０についての標準的なデフォルトパラメーターの設定は、以下のインターネットサイト：http://blast.wustl.eduに記載されている。さらに、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、ＢＬＯＳＵＭ６２アミノ酸スコア付けマトリックスを使用し、使用可能である選択パラメーターは以下の通りである：（Ａ）低い組成複雑性を有するクエリー配列のセグメント（WoottonおよびFederhenのＳＥＧプログラム（Computers and Chemistry, 1993）により決定される；WoottonおよびFederhen, 1996「配列データベースにおける組成編重領域の解析（Analysis of compositionally biased regions in sequence databases)」Methods Enzymol., 266: 544-71も参照されたい）、又は、短周期性の内部リピートからなるセグメント（ClaverieおよびStates（Computers and Chemistry, 1993）のＸＮＵプログラムにより決定される）をマスクするためのフィルターを含むこと、及び（Ｂ）データベース配列に対する適合を報告するための統計学的有意性の閾値、またはＥ−スコア（KarlinおよびAltschul, 1990）の統計学的モデルにしたがって、単に偶然により見出される適合の期待確率；ある適合に起因する統計学的有意差がＥ−スコア閾値より大きい場合、この適合は報告されない）；好ましいＥ−スコア閾値の数値は０．５であるか、または好ましさが増える順に、０．２５、０．１、０．０５、０．０１、０．００１、０．０００１、１ｅ−５、１ｅ−１０、１ｅ−１５、１ｅ−２０、１ｅ−２５、１ｅ−３０、１ｅ−４０、１ｅ−５０、１ｅ−７５、または１ｅ−１００である。
ＴＭ２の変異体はまた、配列番号１の塩基配列の相補鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を含んでなる核酸によってコードされるタンパク質であって、ＴＭ２と同様のビオチン結合活性を有するタンパク質であってもよい。
ここで、「ストリンジェントな条件下」とは、中程度または高程度にストリンジェントな条件においてハイブリダイズすることを意味する。具体的には、中程度にストリンジェントな条件は、例えば、ＤＮＡの長さに基づき、一般の技術を有する当業者によって、容易に決定することが可能である。基本的な条件は、Sambrookら，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第３版，第６章，Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001に示され、例えば５×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の前洗浄溶液、約４２℃での、約５０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ−６×ＳＳＣ、好ましくは５−６×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ（または約４２℃での約５０％ホルムアミド中の、スターク溶液（Stark’s solution）などの他の同様のハイブリダイゼーション溶液）のハイブリダイゼーション条件、及び例えば、約５０℃−６８℃、０．１−６×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳの洗浄条件の使用が含まれる。好ましくは中程度にストリンジェントな条件は、約５０℃、６×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳのハイブリダイゼーション条件（及び洗浄条件）を含む。高ストリンジェントな条件もまた、例えばＤＮＡの長さに基づき、当業者によって、容易に決定することが可能である。
一般に、こうした条件は、中程度にストリンジェントな条件よりも高い温度及び／又は低い塩濃度でのハイブリダイゼーション（例えば、０．５％程度のＳＤＳを含み、約６５℃、６×ＳＳＣないし０．２×ＳＳＣ、好ましくは６×ＳＳＣ、より好ましくは２×ＳＳＣ、より好ましくは０．２×ＳＳＣ、あるいは０．１×ＳＳＣのハイブリダイゼーション）及び／又は洗浄を含み、例えば上記のようなハイブリダイゼーション条件、及びおよそ６５℃−６８℃、０．２ないし０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳの洗浄を伴うと定義される。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の緩衝液では、ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび１５ｍＭ クエン酸ナトリウムである）にＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、および１．２５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４である）を代用することが可能であり、洗浄はハイブリダイゼーションが完了した後で１５分間ないし１時間程度行う。
また、プローブに放射性物質を使用しない市販のハイブリダイゼーションキットを使用することもできる。具体的には、ECL direct labeling & detection system（Amersham社製）を使用したハイブリダイゼーション等が挙げられる。ストリンジェントなハイブリダイゼーションとしては、例えば、キット中のhybridization bufferにBlocking試薬を５％（ｗ／ｖ）、ＮａＣｌを０．５Ｍになるように加え、４２℃で４時間行い、洗浄は、０．４％ ＳＤＳ、０．５ｘＳＳＣ中で、５５℃で２０分を２回、２ｘＳＳＣ中で室温、５分を一回行う、という条件が挙げられる。
ＴＭ２の変異体のビオチン結合活性は、公知の手法のいずれかにより測定することが可能である。例えば、Ｋａｄａら（Biochim. Biophys. Acta., 1427: 33-43 (1999)）に記載されるように蛍光ビオチンを用いる方法により測定してもよい。この方法は、ビオチン結合タンパク質のビオチン結合サイトに蛍光ビオチンが結合すると、蛍光ビオチンの蛍光強度が消失する性質を利用したアッセイ系である。あるいは、表面プラズモン共鳴を原理としたバイオセンサーなど、タンパク質とビオチンの結合を測定することが可能なセンサーを用いて、変異体タンパク質のビオチン結合活性を評価することもできる。
本発明の改変タマビジンにおいて、改変しないことが望ましいアミノ酸残基については後述する。
本発明の非特異結合を低下させた改変タマビジン
本発明の改変型ＴＭ２は、配列番号２に記載のアミノ酸配列、あるいはこの配列中に１から数個のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列、又はこの配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ビオチン結合活性を示すタンパク質（野生型ＴＭ２及び変異型ＴＭ２）において、以下のグループ
１）配列番号２の１０４番目のアルギニン残基；
２）配列番号２の１４１番目のリジン残基；
３）配列番号２の２６番目のリジン残基；及び
４）配列番号２の７３番目のリジン残基
から選択される１又は複数の残基が、酸性アミノ酸残基又は中性アミノ酸残基に置換されていることを特徴とする。
本発明の改変型ＴＭ２は、配列番号２に記載のアミノ酸配列、あるいはこの配列中に１から数個のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列、又はこの配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ビオチン結合活性を示すタンパク質（野生型ＴＭ２及び変異型ＴＭ２）において、以下のグループ
１）配列番号２の１０４番目のアルギニン残基；
２）配列番号２の１４１番目のリジン残基；
３）配列番号２の２６番目のリジン残基；及び
４）配列番号２の７３番目のリジン残基
から選択される１又は複数の残基が、酸性アミノ酸残基又は中性アミノ酸残基に置換されていることを特徴とする。
野生型ＴＭ２の等電点（ｐＩ）は、その一次構造から計算された値は約７．４、実測値は８．２−８．６程度であり、中性〜弱塩基性のタンパク質である。ＴＭ２の非特異結合の程度についてはアビジンよりも遥かに少なく、中性タンパク質であるストレプトアビジンとほぼ同等である。
本発明者らは、ＴＭ２の非特異結合をさらに小さくすることを検討した。すなわち、ＴＭ２のような中性〜弱塩基性タンパク質であっても、ｐＩを低下させることにより、非特異結合がさらに下がるのではないかと考え、ＴＭ２が有する塩基性アミノ酸残基を、酸性アミノ酸又は中性アミノ酸に改変し、実験を行なった。
ここで、ストレプトアビジンまたはアビジンでは、１つ又は数個のアミノ酸の置換によりビオチンへの結合親和力が低下してしまう場合があることが知られていることから、実験にあたっては、等電点を下げるだけでなく、ＴＭ２の優れた特徴である、高いビオチン結合能を損なわないよう、後述のような検討を行ないつつアミノ酸残基の改変を行なった。
鋭意研究の結果、本発明者らはこのような条件を満たす本発明の低ｐＩの改変型ＴＭ２は、以下のグループ
１）配列番号２の１０４番目のアルギニン残基（Ｒ１０４）；
２）配列番号２の１４１番目のリジン残基（Ｋ１４１）；
３）配列番号２の２６番目のリジン残基（Ｋ２６）；及び
４）配列番号２の７３番目のリジン残基（Ｋ７３）
から選択される１または複数の残基の変異を含む改変ＴＭ２タンパク質であることを見いだし、本発明を想到した。
１）配列番号２の１０４番目のアルギニン残基（Ｒ１０４）；
２）配列番号２の１４１番目のリジン残基（Ｋ１４１）；
３）配列番号２の２６番目のリジン残基（Ｋ２６）；及び
４）配列番号２の７３番目のリジン残基（Ｋ７３）
から選択される１または複数の残基の変異を含む改変ＴＭ２タンパク質であることを見いだし、本発明を想到した。
変異後のアミノ酸は、酸性アミノ酸残基（アスパラギン酸、グルタミン酸）又は中性アミノ酸残基（アスパラギン、セリン、グルタミン、トレオニン、グリシン、チロシン、トリプトファン、システイン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン）である。
また、非極性のアミノ酸は疎水性相互作用に基づく非特異結合があることが懸念されるため、好ましくは疎水性指標が２以下の酸性アミノ酸残基又は中性アミノ酸残基である。疎水性指標（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ ｉｎｄｅｘ）とは、例えばＫｙｔｅ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， １５７， １０５−１３２（１９８２）に記載されている各アミノ酸残基の疎水性の程度を数値化したものであり、当業者に公知である。「疎水性指標が２以下の酸性アミノ酸残基または中性アミノ酸残基」は、酸性アミノ酸残基のアスパラギン酸及びグルタミン酸、並びに中性アミノ酸残基のアスパラギン、セリン、グルタミン、トレオニン、グリシン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、プロリン及びアラニン、である。
より好ましくは、１）配列番号２の１０４番目のアルギニン残基、及び／又は、２）配列番号２の１４１番目のリジン残基が、酸性アミノ酸残基又は中性アミノ酸残基に置換されている。さらに好ましくは、１）配列番号２の１０４番目のアルギニン残基、及び／又は、２）配列番号２の１４１番目のリジン残基が、酸性アミノ酸残基に置換されている。
Ｋ２６においてはＡ（アラニン）、Ｋ７３においてはＱ（グルタミン）、Ｒ１０４においてはＥ（グルタミン酸）もしくはＤ（アスパラギン酸）、Ｋ１４１においてはＥ（グルタミン酸）もしくはＤ（アスパラギン酸）であり、Ｒ１０４においてはＥが、Ｋ１４１においてはＥが、一層好ましい。
本発明の低ｐＩ型改変ＴＭ２は、野生型ＴＭ２と比べ有意に低い等電点を示す。具体的には、実施例１の１−８）では変異を導入した改変型ＴＭ２の等電点はいずれも、野生型のＴＭ２より１以上低下していることが明らかになった。
この性質により、本発明の改変型ＴＭ２タンパク質は、野生型または変異型ＴＭ２タンパク質よりも、核酸及び／又はタンパク質に対する低い非特異的結合を示す。具体的には、実施例１の１−１１）において、ＤＮＡに対する非特異結合が低下していることが示された。さらに、実施例１の１−９）には、血清タンパク質の非特異吸着性が低下したことが示された。Ｋ２６、Ｋ７３、Ｋ１４１を変異させたものについてはいずれも野生型ＴＭ２の６割程度にまで減少し、さらにＲ１０４−Ｋ１４１（Ｒ１０４とＫ１４１の両方を変異させたもの）に至ってはＴＭ２の２割強にまで減少していた。これに対し、アビジンの塩基性アミノ酸変異体については、ＤＮＡ若しくは細胞に関する非特異結合の低下は報告されているものの（Ｍａｒｔｔｉｌａ ｅｔ ａｌ. （２０００） ＦＥＢＳ， ４６７，ｐ．３１−３６）、血清タンパク質の非特異結合に関するこのような大きな低下は報告されていない。
また、本発明の低ｐＩ型改変ＴＭ２について、フィブロネクチンとの結合性を調べたところ、大きく低下していた。フィブロネクチンは細胞外マトリクスにある細胞接着分子であり、特に血漿や血清中のタンパク質を検出する場合にノイズの一因となるものである。従って、フィブロネクチンとの結合が少ないことが望ましい。実施例１の１−１０）に示されたように、ＴＭ２と比べ、いずれの変異体もフィブロネクチンの結合量が減少していた。特に、Ｋ１４１、Ｒ１０４−Ｋ１４１については、野生型ＴＭ２結合量の１割〜２割の結合量にまで著しく減少していた。なお、ｐＩ値とフィブロネクチン結合能との関係は知られておらず、実際にｐＩ値とフィブロネクチン減少度合いに明確な相関は見られなかった。このことを考慮しても、Ｋ１４１、Ｒ１０４−Ｋ１４１の変異体のフィブロネクチン結合量の減少は非常に大きく、予想できない顕著なものであった。
フィブロネクチン結合を減少させる、本発明の好ましい改変ＴＭ２の一つは、ＴＭ２アミノ酸配列の１４１番目のリジン残基を、酸性アミノ酸または中性アミノ酸に改変したものである。さらに好ましくは疎水性指標が２以下の酸性アミノ酸または中性アミノ酸に改変したものである。さらに好ましくは、Ｅ（グルタミン酸）もしくはＤ（アスパラギン酸）であり、中でもＥが最も好ましい。
あるいは、フィブロネクチン結合を減少させる別の改変ＴＭ２は、Ｒ１０４及びＫ１４１の両方のアミノ酸残基を同時に酸性アミノ酸または中性アミノ酸に改変したものである。さらに好ましくは疎水性指標が２以下の酸性アミノ酸または中性アミノ酸に改変したもの、さらに好ましくは、Ｅ（グルタミン酸）もしくはＤ（アスパラギン酸）であり、中でもＥが最も好ましい。
ビオチン結合能を向上させた改変タマビジン
ＴＭ２とビオチンとの結合速度定数（ｋａ）は９．１９´１０５（Ｍ−１ Ｓ−１）、解離速度定数（ｋｄ）は６．８３´１０−６（ｓ−１）、解離定数（ＫＤ）は７．４３´１０−１２（Ｍ）であり、ビオチンと非常に強く結合する。他のビオチン結合性タンパク質であるストレプトアビジンについて同様に測定したところ、ｋａは２．２８´１０６（Ｍ−１ Ｓ−１）、ｋｄは２．５２´１０−６（ｓ−１）、ＫＤは１．１１´１０−１２（Ｍ）であった。すなわちＴＭ２とビオチンとの結合力をストレプトアビジンと比較すると、オーダーは同じものの、やや弱い(ＷＯ２００８／０８１９３８ Ａ１)。ビオチン結合タンパク質とビオチンを、より早く結合させたい場合やより多く結合させたい場合には、より高いビオチン結合能を有することが望ましい。
ＴＭ２とビオチンとの結合速度定数（ｋａ）は９．１９´１０５（Ｍ−１ Ｓ−１）、解離速度定数（ｋｄ）は６．８３´１０−６（ｓ−１）、解離定数（ＫＤ）は７．４３´１０−１２（Ｍ）であり、ビオチンと非常に強く結合する。他のビオチン結合性タンパク質であるストレプトアビジンについて同様に測定したところ、ｋａは２．２８´１０６（Ｍ−１ Ｓ−１）、ｋｄは２．５２´１０−６（ｓ−１）、ＫＤは１．１１´１０−１２（Ｍ）であった。すなわちＴＭ２とビオチンとの結合力をストレプトアビジンと比較すると、オーダーは同じものの、やや弱い(ＷＯ２００８／０８１９３８ Ａ１)。ビオチン結合タンパク質とビオチンを、より早く結合させたい場合やより多く結合させたい場合には、より高いビオチン結合能を有することが望ましい。
発明者らは、ＴＭ２のアミノ酸残基を改変し、元来高いビオチン結合能を持つ野生型ＴＭ２について、さらにビオチン結合能の向上した高アフィニティ型改変ＴＭ２の作製に成功した。本発明の高アフィニティ型ＴＭ２は、ＴＭ２の配列番号２のアミノ酸配列のうち、少なくとも４０番目のアスパラギン酸残基（Ｄ４０）を変異させたものである。変異後のアミノ酸は、Ｎ（アスパラギン）が好ましい。
Ｄ４０の改変は、前述の非特異的結合を低下させるためのＲ１０４、Ｋ１４１、Ｋ２６及び／又はＫ７３の改変と組み合わせて行ってもよく（態様６）、あるいは、単独で行ってもよい（態様１１）。実施例２及び３で示されたように、Ｄ４０の改変された改変ＴＭ２は野生型ＴＭ２よりも有意に高いビオチン結合能を示す。
非特異結合を低下させ、かつビオチン結合能を向上させた改変タマビジン
上記の「非特異結合を低下させた改変タマビジン」と「ビオチン結合能を向上させた改変タマビジン」におけるアミノ酸変異を組み合わせた改変タマビジンを作製したところ、非特異結合が低下し、ビオチン結合能を向上させた改変タマビジンを得ることができた。このような改変タマビジンは、ＴＭ２アミノ酸配列のＫ２６、Ｋ７３、Ｒ１０４、Ｋ１４１のうち、少なくとも一つのアミノ酸残基の変異を含み、さらにＤ４０のアミノ酸残基をＮに変異させた改変ＴＭ２タンパク質である（態様６）。
上記の「非特異結合を低下させた改変タマビジン」と「ビオチン結合能を向上させた改変タマビジン」におけるアミノ酸変異を組み合わせた改変タマビジンを作製したところ、非特異結合が低下し、ビオチン結合能を向上させた改変タマビジンを得ることができた。このような改変タマビジンは、ＴＭ２アミノ酸配列のＫ２６、Ｋ７３、Ｒ１０４、Ｋ１４１のうち、少なくとも一つのアミノ酸残基の変異を含み、さらにＤ４０のアミノ酸残基をＮに変異させた改変ＴＭ２タンパク質である（態様６）。
Ｋ２６、Ｋ７３、Ｒ１０４、Ｋ１４１の変異後のタンパク質は、酸性アミノ酸又は中性アミノ酸であり、好ましくは疎水性指標（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ ｉｎｄｅｘ：Ｋｙｔｅ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， １５７， １０５−１３２（１９８２））が２以下の酸性アミノ酸又は中性アミノ酸である。さらに好ましくは、Ｋ２６においてはＡ（アラニン）、Ｋ７３においてはＱ（グルタミン）、Ｒ１０４においてはＥ（グルタミン酸）もしくはＤ（アスパラギン酸）、Ｋ１４１においてはＥ（グルタミン酸）もしくはＤ（アスパラギン酸）であり、Ｒ１０４においてはＥが、Ｋ１４１においてはＥが、一層好ましい。
Ｒ１０４とＤ４０の改変とを同時に行なった改変タマビジンについては、アフィニティ向上及びタンパク質非特異結合の低下が見られた（実施例３の、３−７）及び３−９））。
またＲ１０４、Ｋ１４１、Ｄ４０を同時に改変した改変タマビジンについては、等電点の低下、アフィニティ向上、タンパク質非特異結合の低下、フィブロネクチン結合性の低下、及び核酸非特異結合の低下（実施例３の３−６）、３−７）、３−９）、３−１０）、及び３−１１）が観察された。さらに、驚くべきことにタンパク質構造の熱安定性が大幅に向上した（実施例３の３−８））。
従って、Ｄ４０とＲ１０４アミノ酸残基を同時に改変することが好ましく、Ｄ４０、Ｒ１０４及びＫ１４１を同時に改変することがより好ましい。
以上より、好ましくは本発明の改変型ＴＭ２は、非限定的に、
配列番号２において、４０番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基に置換されており、そして、１０４番目のアルギニン残基がグルタミン酸残基に置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（Ｄ４０Ｎ−Ｒ１０４Ｅ）；
配列番号２において、４０番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基に置換されており、そして、１４１番目のリジン残基がグルタミン酸残基に置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（Ｄ４０Ｎ−Ｋ１４１Ｅ）；並びに、
配列番号２において、４０番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基に置換されており、１０４番目のアルギニン残基がグルタミン酸残基に置換されており、そして、１４１番目のリジン残基がグルタミン酸残基に置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（Ｄ４０Ｎ−Ｒ１０４Ｅ−Ｋ１４１Ｅ）、
からなるグループから選択される。
配列番号２において、４０番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基に置換されており、そして、１０４番目のアルギニン残基がグルタミン酸残基に置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（Ｄ４０Ｎ−Ｒ１０４Ｅ）；
配列番号２において、４０番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基に置換されており、そして、１４１番目のリジン残基がグルタミン酸残基に置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（Ｄ４０Ｎ−Ｋ１４１Ｅ）；並びに、
配列番号２において、４０番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基に置換されており、１０４番目のアルギニン残基がグルタミン酸残基に置換されており、そして、１４１番目のリジン残基がグルタミン酸残基に置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（Ｄ４０Ｎ−Ｒ１０４Ｅ−Ｋ１４１Ｅ）、
からなるグループから選択される。
本発明の改変ＴＭ２タンパク質の好ましい態様は、例えば、配列番号８、１０、１６、２０、２２、２４及び２５のいずれかのアミノ酸配列を有する。
より好ましくはＤ４０Ｎ−Ｒ１０４Ｅ、Ｄ４０Ｎ−Ｋ１４１Ｅ又はＤ４０Ｎ−Ｒ１０４Ｅ−Ｋ１４１Ｅ、もっとも好ましくはＤ４０Ｎ−Ｒ１０４Ｅ−Ｋ１４１Ｅである。
本願発明の改変型ＴＭ２タンパク質は、好ましくは、以下の性質
ｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質よりも、低い等電点を有する；
ｉｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質よりも、核酸及び／又はタンパク質に対する低い非特異的結合を示す；
ｉｉｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質よりも、低いフィブロネクチン結合性を示す；
ｉｖ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質よりも、高いビオチン結合性を示す；
の１ないし全部を満たす。
ｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質よりも、低い等電点を有する；
ｉｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質よりも、核酸及び／又はタンパク質に対する低い非特異的結合を示す；
ｉｉｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質よりも、低いフィブロネクチン結合性を示す；
ｉｖ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質よりも、高いビオチン結合性を示す；
の１ないし全部を満たす。
ｉ）について野生型のＴＭ２の等電点は、約８．５−８．８である。本発明の改変ＴＭ２の等電点は、好ましくは８．０以下、より好ましくは７，７以下である。
ｉｉｉ）について、野生型ＴＭ２のフィブロネクチンへの結合性を１．３〜１．４とした場合、本発明の改変ＴＭ２のフィブロネクチン結合性は好ましくは１．０以下、より好ましくは０．７以下、０．２５以下、０．１５以下である。
本発明の改変ＴＭ２において改変されないことが望ましいアミノ酸残基
本発明の改変ＴＭ２におけるアミノ酸残基の改変については、ビオチン結合能に影響を及ぼさないことが求められる。ところで、ビオチン結合タンパク質の一つであるストレプトアビジンのビオチンポケットについては既に解明が進んでいる。このストレプトアビジンとＴＭ２のアミノ酸配列のホモロジーは５０％程度に過ぎないが、発明者らは、ＴＭ２のビオチンポケットについての知見を得るべく、ＴＭ２とストレプトアビジンのアミノ酸配列を並列させて比較した。すると、ストレプトアビジンのビオチンポケットを形成するアミノ酸の中で、ビオチンと直接相互作用する残基Ｎ２３、Ｓ２７、Ｙ４３、Ｓ４５、Ｎ４９、Ｗ７９、Ｓ８８、Ｔ９０、Ｗ９２、Ｗ１０８、Ｗ１２０、Ｄ１２８（Ｗｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３： ８５−８８、Ｌｉｖｎａｈ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９０： ５０７６−５０８０）は、ＴＭ２では各々、Ｎ１４、Ｓ１８、Ｙ３４、Ｓ３６、Ｄ４０、Ｗ６９、Ｓ７６、Ｔ７８、Ｗ８０、Ｗ９６、Ｗ１０８、Ｄ１１６に該当し、非常によく保存されていることが見出された。
本発明の改変ＴＭ２におけるアミノ酸残基の改変については、ビオチン結合能に影響を及ぼさないことが求められる。ところで、ビオチン結合タンパク質の一つであるストレプトアビジンのビオチンポケットについては既に解明が進んでいる。このストレプトアビジンとＴＭ２のアミノ酸配列のホモロジーは５０％程度に過ぎないが、発明者らは、ＴＭ２のビオチンポケットについての知見を得るべく、ＴＭ２とストレプトアビジンのアミノ酸配列を並列させて比較した。すると、ストレプトアビジンのビオチンポケットを形成するアミノ酸の中で、ビオチンと直接相互作用する残基Ｎ２３、Ｓ２７、Ｙ４３、Ｓ４５、Ｎ４９、Ｗ７９、Ｓ８８、Ｔ９０、Ｗ９２、Ｗ１０８、Ｗ１２０、Ｄ１２８（Ｗｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３： ８５−８８、Ｌｉｖｎａｈ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９０： ５０７６−５０８０）は、ＴＭ２では各々、Ｎ１４、Ｓ１８、Ｙ３４、Ｓ３６、Ｄ４０、Ｗ６９、Ｓ７６、Ｔ７８、Ｗ８０、Ｗ９６、Ｗ１０８、Ｄ１１６に該当し、非常によく保存されていることが見出された。
唯一、ストレプトアビジンの４９番目のＮ（アスパラギン）は、ＴＭ２においては４０番目のＤ（アスパラギン酸）になっており、例外であったが、これをストレプトアビジンと同様にアスパラギンに改変したＤ４０Ｎ ＴＭ２は前記のとおり、ビオチン結合能が向上していた。これらの結果から、ＴＭ２とストレプトアビジンのビオチン結合ポケットは非常に似た構造を有し、これらのアミノ酸残基はビオチン結合に大きく関与していると考えられる。
特に４つのトリプトファン残基（Ｗ６９、Ｗ８０、Ｗ９６、Ｗ１０８）はビオチンポケットの構造に重要な役割を果たしていると考えられるため、改変されないことが望ましい。一方、ビオチンとの結合に関与すると考えられるその他のアミノ酸すなわち、ＴＭ２においては、ビオチンと直接相互作用すると考えられるアミノ酸残基（Ｎ１４、Ｓ１８、Ｙ３４、Ｓ３６、Ｓ７６、Ｔ７８、Ｄ１１６）についても改変されないことが望ましい。あるいは、これらを改変する場合にはビオチンとの結合を維持できるよう、性質あるいは構造が類似したアミノ酸に改変することが望ましく、例えばアスパラギン（Ｎ１４）の場合は、グルタミン（Ｑ）やアスパラギン酸（Ｄ）へ、好ましくはアスパラギン酸へ、アスパラギン酸（Ｄ４０）の場合は、アスパラギン（Ｎ）へ、セリン（Ｓ１８、Ｓ３６、Ｓ７６）の場合は、スレオニン（Ｔ）あるいはチロシン（Ｙ）へ、好ましくはスレオニンへ、チロシン（Ｙ３４）の場合は、セリン（Ｓ）やスレオニン（Ｔ）あるいはフェニルアラニン（Ｆ）へ、好ましくはフェニルアラニンへ、スレオニン（Ｔ７８）の場合は、セリン（Ｓ）やチロシン（Ｙ）へ、好ましくはセリンへ、アスパラギン酸（Ｄ１１６）の場合は、グルタミン酸（Ｅ）やアスパラギン（Ｎ）へ、好ましくはアスパラギンへ、それぞれ改変することが望ましい。
アミノ酸の改変方法
ＴＭ２のアミノ酸を改変して、本発明の改変ＴＭ２を得るための方法は、公知のアミノ酸配列に変異を施す方法を使用でき、特に限定されない。好ましくは本発明の改変タンパク質をコードする核酸の塩基配列に修飾を施し改変する。
ＴＭ２のアミノ酸を改変して、本発明の改変ＴＭ２を得るための方法は、公知のアミノ酸配列に変異を施す方法を使用でき、特に限定されない。好ましくは本発明の改変タンパク質をコードする核酸の塩基配列に修飾を施し改変する。
例えば、アミノ酸配列の特定の位置のアミノ酸を改変するには、例えばＰＣＲを利用した方法が挙げられる（Ｈｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ （１９８８）， Ｈｏ ｅｔ ａｌ．（１９８９））。すなわち、標的変異のミスマッチコドンを含むプライマーを利用してＰＣＲを行ない、目的の変異体をコードするＤＮＡを作成しこれを発現させることにより、目的の変異体を得ることができる。
また、アミノ酸の欠失、置換、挿入及び／又は付加による変異体は、野生型タンパク質をコードするＤＮＡに、例えば周知技術である部位特異的変異誘発（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｖｏｌ．１０， Ｎｏ． ２０， ｐ．６４８７−６５００， １９８２参照、引用によりその全体を本明細書に援用する）を施すことにより作成することができる。部位特異的変異誘発法は、例えば、所望の変異である特定の不一致の他は、変異を受けるべき一本鎖ファージＤＮＡに相補的な合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて次のように行うことができる。即ち、プライマーとして上記合成オリゴヌクレオチドを用いてファージに相補的な鎖を合成させ、得られた二重鎖ＤＮＡで宿主細胞を形質転換する。形質転換された細菌の培養物を寒天にプレーティングし、ファージを含有する単一細胞からプラークを形成させる。そうすると、理論的には５０％の新コロニーが一本鎖として変異を有するファージを含有し、残りの５０％が元の配列を有する。上記所望の変異を有するＤＮＡと完全に一致するものとはハイブリダイズするが、元の鎖を有するものとはハイブリダイズしない温度において、得られたプラークをキナーゼ処理により標識した合成プローブとハイブリダイズさせる。次に該プローブとハイブリダイズするプラークを拾い、培養してＤＮＡを回収する。
改変タマビジン２（ＴＭ２）タンパク質をコードする核酸
本発明は、本発明の改変型ＴＭ２をコードする核酸を提供する。このような核酸の塩基配列は、ＴＭ２の塩基配列（配列番号１）を改変型ＴＭ２タンパク質の改変アミノ酸をコードする塩基配列に改変したものである。改変される塩基配列は、改変後アミノ酸をコードする塩基配列であれば限定されない。例えば、配列番号１の塩基配列からなる核酸、またはそれらの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつビオチン結合活性を有するタンパク質をコードする核酸（以下、「ＴＭ２遺伝子」）に本発明の改変を施すために塩基配列を改変させたものを含む。
本発明は、本発明の改変型ＴＭ２をコードする核酸を提供する。このような核酸の塩基配列は、ＴＭ２の塩基配列（配列番号１）を改変型ＴＭ２タンパク質の改変アミノ酸をコードする塩基配列に改変したものである。改変される塩基配列は、改変後アミノ酸をコードする塩基配列であれば限定されない。例えば、配列番号１の塩基配列からなる核酸、またはそれらの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつビオチン結合活性を有するタンパク質をコードする核酸（以下、「ＴＭ２遺伝子」）に本発明の改変を施すために塩基配列を改変させたものを含む。
本発明の核酸は、好ましくは、配列番号８、１０、１６、２０、２２、２４及び２５のいずれかのアミノ酸配列をコードする。より好ましくはアミノ酸配列２２または２４をコードする。本発明の核酸は、好ましくは配列番号７、９、１５、１９、２１及び２３の核酸配列からなる。より好ましくは、配列番号２１又は２３の核酸配列からなる。
本発明の核酸を含むベクター
また、本発明は、改変ＴＭ２タンパク質をコードする核酸を含むベクターを提供する。好ましくは、改変ＴＭ２タンパク質を発現するための発現ベクターである。
また、本発明は、改変ＴＭ２タンパク質をコードする核酸を含むベクターを提供する。好ましくは、改変ＴＭ２タンパク質を発現するための発現ベクターである。
本発明の改変ＴＭ２タンパク質をコードする核酸は、上記「改変タマビジンタンパク質をコードする核酸」に記載された通りであり、特に限定されない。
さらに、改変ＴＭ２タンパク質をコードする核酸の片側もしくは両端に、制限酵素認識部位や、ａａｔＢ１、ａａｔＢ２、ａａｔＢ３などのＧａｔｅｗａｙシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で用いられる配列などを有し、さらに改変ＴＭ２タンパク質コード核酸の上流には所望の宿主で機能するプロモーターが、またその下流にはターミネーターが配置されていてもよい。
なお、制限酵素認識部位の種類は特に限定されないが、発現ベクターにおいては、それが唯一の認識部位であることが好ましい。認識部位の数も特に限定されないが、１又は２個以上であり、好ましくは１０個以下である。
なお、制限酵素部位やａａｔＢ配列と改変ＴＭ２核酸の塩基配列の間には、１アミノ酸以上、好ましくは５アミノ酸以上、更に好ましくは１０アミノ酸以上、更に好ましくは２５アミノ酸以上であり、５０アミノ酸以下のリンカーアミノ酸配列（特に限定されないが、グリシンやセリンを多く含む配列など、当業者が通常使用する配列でよい）をコードする核酸配列を配置してもよく、また特に限定されないが、例えばエンテロキナーゼやＦａｃｔｏｒ Ｘａ等のようなプロテアーゼの認識部位をコードする配列を配置してもよい。
また、例えばｓｃＦｖやＦａｂ等の抗体遺伝子を本発現ベクターに挿入する場合において、融合タンパク質の発現に細胞質内部のような還元条件が適さないときには、プロモーターと、改変タマビジンコード核酸を挿入するための配列からなるユニットとの間に、シグナルペプチドや分泌シグナルなどのような、リーダーペプチドをコードする核酸配列を含んでもよい。
本発明のベクターは、好ましくは発現ベクターである。発現ベクターは、このような発現ユニットの他に、所望の宿主で複製できるためのユニット、例えば複製開始点を有し、また所望の宿主細胞を選抜するための、薬剤抵抗性マーカー遺伝子を有してもよい。宿主は特に限定されないが、好ましくは大腸菌である。また、本発現ベクターに、例えば、大腸菌におけるラクトースリプレッサー系のような適当な発現制御系を組み込んでもよい。
改変タマビジンを固定化した担体
本発明は、本発明の改変ＴＭ２タンパク質を固定化した担体を提供する。
本発明は、本発明の改変ＴＭ２タンパク質を固定化した担体を提供する。
担体を構成する材料は公知のものを使用可能である。例えば、セルロース、テフロン、ニトロセルロース、アガロース、デキストラン、キトサン、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリプロピレン、ナイロン、ポリジビニリデンジフルオライド、ラテックス、シリカ、ガラス、ガラス繊維、金、白金、銀、銅、鉄、ステンレススチール、フェライト、シリコンウエハ、ポリエチレン、ポリエチレンイミン、ポリ乳酸、樹脂、多糖類、タンパク（アルブミン等）、炭素又はそれらの組合せ、などを含むがこれらに限定されない。また、一定の強度を有し、組成が安定し、かつ非特異結合が少ないものが好ましい。
固体担体の形状は、ビーズ、磁性ビーズ、薄膜、微細管、フィルター、プレート、マイクロプレート、カーボンナノチューブ、センサーチップなどを含むがこれらに限定されない。薄膜やプレートなどの平坦な固体担体は、当該技術分野で知られているように、ピット、溝、フィルター底部などを設けてもよい。
発明の一態様において、ビーズは、約２５ｎｍ〜約１ｍｍの範囲の球体直径を有しうる。好ましい態様では、ビーズは約５０ｎｍ〜約１０μｍの範囲の直径を有する。ビーズのサイズは特定の適用に応じて選択されうる。いくらかの細菌スポアは約１μｍのオーダーのサイズを有するので、かかるスポアを捕捉するための好ましいビーズは１μｍよりも大きい直径を有する。
タンパク質の担体への結合は特に限定されず、タンパク質を担体に結合させるための公知の方法を使用することが可能である。具体的な結合方法は、担体の種類等によって、当業者が適宜選択可能である。
本発明によって、高いビオチン結合能というタマビジンの特性を保持しつつ、非特異結合性の低下、及び／又は更なるビオチン結合の向上、といった性能を向上させた改変タマビジンが提供された。これらの改変タマビジンを利用することにより、アビジン−ビオチン結合を利用した被検体を測定するための検出法、例えばイムノアッセイや核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおいて、バックグラウンドの低下、感度の向上、劣悪環境（高温、変性剤、酵素存在下など）におけるビオチンとの結合性維持を図ることができる。
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するためのものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
実施例１ 低ｐＩ型ＴＭ２の構築と分析
１−１） 低ｐＩ型ＴＭ２の構築
ＴＭ２の等電点を低下させることを目的に、ＴＭ２中の塩基性アミノ酸残基を、中性アミノ酸または酸性アミノ酸に置換し、以下の７つの改変体を構築した。
１−１） 低ｐＩ型ＴＭ２の構築
ＴＭ２の等電点を低下させることを目的に、ＴＭ２中の塩基性アミノ酸残基を、中性アミノ酸または酸性アミノ酸に置換し、以下の７つの改変体を構築した。
（１）２６番目のリジンをアラニンに置換したＴＭ２（以下、「ＴＭ２ Ｋ２６Ａ」、塩基配列は配列番号３に記載、アミノ酸配列は配列番号４に記載）；
（２）７３番目のリジンをグルタミンに置換したＴＭ２（以下、「ＴＭ２ Ｋ７３Ｑ」、塩基配列は配列番号５に記載、アミノ酸配列は配列番号６に記載）；
（３）１０４番目のアルギニンをグルタミン酸に置換したＴＭ２（以下、「ＴＭ２ Ｒ１０４Ｅ」、塩基配列は配列番号７に記載、アミノ酸配列は配列番号８に記載）；
（４）１４１番目のリジンをグルタミン酸に変異したＴＭ２（以下、「ＴＭ２ Ｋ１４１Ｅ」、塩基配列は配列番号９に記載、アミノ酸配列は配列番号１０に記載）；
（５）３３番目のリジンからスレオニンへの置換と３７番目のリジンからアラニンへの置換を持つＴＭ２（以下、「ＴＭ２ Ｋ３３ＴＫ３７Ａ」、塩基配列は配列番号１１に記載、アミノ酸配列は配列番号１２に記載）；
（６）３３番目のリジンからスレオニンへの置換と３７番目のリジンからアラニンへの置換、さらに１０４番目のアルギニンからグルタミン酸への置換をもつＴＭ２（以下、「ＴＭ２ Ｋ３３ＴＫ３７ＡＲ１０４Ｅ」、塩基配列は配列番号１３に記載、アミノ酸配列は配列番号１４に記載）；並びに
（７）１０４番目のアルギニンからグルタミン酸への置換と１４１番目のリジンからグルタミン酸への置換を持つＴＭ２（以下、「ＴＭ２ Ｒ１０４ＥＫ１４１Ｅ」、塩基配列は配列番号１５に記載、アミノ酸配列は配列番号１６に記載）。
（２）７３番目のリジンをグルタミンに置換したＴＭ２（以下、「ＴＭ２ Ｋ７３Ｑ」、塩基配列は配列番号５に記載、アミノ酸配列は配列番号６に記載）；
（３）１０４番目のアルギニンをグルタミン酸に置換したＴＭ２（以下、「ＴＭ２ Ｒ１０４Ｅ」、塩基配列は配列番号７に記載、アミノ酸配列は配列番号８に記載）；
（４）１４１番目のリジンをグルタミン酸に変異したＴＭ２（以下、「ＴＭ２ Ｋ１４１Ｅ」、塩基配列は配列番号９に記載、アミノ酸配列は配列番号１０に記載）；
（５）３３番目のリジンからスレオニンへの置換と３７番目のリジンからアラニンへの置換を持つＴＭ２（以下、「ＴＭ２ Ｋ３３ＴＫ３７Ａ」、塩基配列は配列番号１１に記載、アミノ酸配列は配列番号１２に記載）；
（６）３３番目のリジンからスレオニンへの置換と３７番目のリジンからアラニンへの置換、さらに１０４番目のアルギニンからグルタミン酸への置換をもつＴＭ２（以下、「ＴＭ２ Ｋ３３ＴＫ３７ＡＲ１０４Ｅ」、塩基配列は配列番号１３に記載、アミノ酸配列は配列番号１４に記載）；並びに
（７）１０４番目のアルギニンからグルタミン酸への置換と１４１番目のリジンからグルタミン酸への置換を持つＴＭ２（以下、「ＴＭ２ Ｒ１０４ＥＫ１４１Ｅ」、塩基配列は配列番号１５に記載、アミノ酸配列は配列番号１６に記載）。
（８）１９番目のリジンをスレオニンに置換したＴＭ２（以下、「ＴＭ２ Ｋ１９Ｔ」、塩基配列は配列番号１７に記載、アミノ酸配列は配列番号１８に記載）；
Ｒ１０４ＥのＥ、Ｋ３３ＴＫ３７ＡのＴとＡは、ＴＭ２とストレプトアビジンのアミノ酸配列の比較から、ストレプトアビジン配列上の当該部分のアミノ酸を参考にして決定した。また、Ｋ１４１ＥのＥはタマビジン１配列上の該当部分のアミノ酸を参考にして決定した。
Ｒ１０４ＥのＥ、Ｋ３３ＴＫ３７ＡのＴとＡは、ＴＭ２とストレプトアビジンのアミノ酸配列の比較から、ストレプトアビジン配列上の当該部分のアミノ酸を参考にして決定した。また、Ｋ１４１ＥのＥはタマビジン１配列上の該当部分のアミノ酸を参考にして決定した。
まず、低ｐＩ型ＴＭ２を構築するために、各変異を導入するようなプライマーを設計した。ＴＭ２遺伝子の５’部分と、その上流にＰｃｉ Ｉ制限酵素切断部位（ＡＣＡＴＧＴ）をコードする配列からなるプライマーＴｍ２ＮｔｅｒｍＰｃｉ、ＴＭ２遺伝子の３’部分と、その下流にＢａｍＨ Ｉ制限酵素切断部位（ＧＧＡＴＣＣ）をコードする配列からなるプライマーＴｍ２ＣｔｅｒｍＢａｍを設計した。各変異体についてのミスマッチコドンを含む一連のセンスプライマー、およびアンチセンスプライマーは、それぞれ以下の通りである（配列番号２６−３７）。
表１ 低ｐＩ型ＴＭ２構築用プライマー
１−２） ＰＣＲ
低ｐＩ型ＴＭ２遺伝子を構築するために、２段階のＰＣＲを行った。１段階目のＰＣＲは、ＴＭ２遺伝子がベクターｐＴｒｃ９９Ａに組み込まれたプラスミドを鋳型にして、プライマー Ｔｍ２ＮｔｅｒｍＰｃｉと各変異体のミスマッチコドンを含むアンチセンスプライマーＴｍ２ Ｋ２６Ａ Ｒ、Ｔｍ２ Ｋ７３Ｑ Ｒ、Ｔｍ２ Ｋ３３ＴＫ３７Ａ Ｒ、Ｔｍ２ Ｒ１０４Ｅ Ｒ、Ｔｍ２ Ｋ１９Ｔ Ｒそれぞれを用いて５’部分の増幅を、ミスマッチコドンを含むセンスプライマーＴｍ２ Ｋ２６Ａ Ｆ、Ｔｍ２ Ｋ７３Ｑ Ｆ、Ｔｍ２ Ｋ３３ＴＫ３７Ａ Ｆ、Ｔｍ２ Ｒ１０４Ｅ Ｆ、Ｔｍ２ Ｋ１９Ｔ ＦのいずれかとＴｍ２ＣｔｅｒｍＢａｍを用いて３’部分の増幅を、それぞれ行った。
低ｐＩ型ＴＭ２遺伝子を構築するために、２段階のＰＣＲを行った。１段階目のＰＣＲは、ＴＭ２遺伝子がベクターｐＴｒｃ９９Ａに組み込まれたプラスミドを鋳型にして、プライマー Ｔｍ２ＮｔｅｒｍＰｃｉと各変異体のミスマッチコドンを含むアンチセンスプライマーＴｍ２ Ｋ２６Ａ Ｒ、Ｔｍ２ Ｋ７３Ｑ Ｒ、Ｔｍ２ Ｋ３３ＴＫ３７Ａ Ｒ、Ｔｍ２ Ｒ１０４Ｅ Ｒ、Ｔｍ２ Ｋ１９Ｔ Ｒそれぞれを用いて５’部分の増幅を、ミスマッチコドンを含むセンスプライマーＴｍ２ Ｋ２６Ａ Ｆ、Ｔｍ２ Ｋ７３Ｑ Ｆ、Ｔｍ２ Ｋ３３ＴＫ３７Ａ Ｆ、Ｔｍ２ Ｒ１０４Ｅ Ｆ、Ｔｍ２ Ｋ１９Ｔ ＦのいずれかとＴｍ２ＣｔｅｒｍＢａｍを用いて３’部分の増幅を、それぞれ行った。
ＴＭ２ Ｋ１４１Ｅについては、プライマーＴｍ２ＮｔｅｒｍＰｃｉとＴｍ２ Ｋ１４１Ｅ Ｂａｍを用いて、１度のＰＣＲ反応で変異を導入した。
ＰＣＲ反応条件は、５０μＬの反応液中に鋳型ＤＮＡを５００ｎｇ、１０×Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ｂｕｆｆｅｒ（Ｔａｋａｒａ社）を５μＬ、２．５ｍＭ ｄＮＴＰを４μＬ、プライマーを各２５ｐｍｏｌｅｓ、５Ｕ／μＬ Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ社製）を０．５μＬ添加し、プログラムテンプコントロールシステムＰＣ−７００（ＡＳＴＥＫ）を用いて、９６℃−３分を１回、９６℃−１分、５５℃−１分、７２℃−２分を１０回、７２℃−６分を１回とした。その結果、５’部分において、ＴＭ２ Ｋ３３ＴＫ３７Ａは約１２０ｂｐ、ＴＭ２ Ｋ Ｒ１０４Ｅは約３３０ｂｐ、３’部分において、ＴＭ２ Ｋ３３ＴＫ３７Ａは約３１０ｂｐ、ＴＭ２ Ｋ Ｒ１０４Ｅは約１００ｂｐ、ＴＭ２ Ｋ１９Ｔは約６０ｂｐのＰＣＲ産物が得られた。また、ＴＭ２ Ｋ１４１Ｅにおいては、約４３０ｂｐのＰＣＲ産物が得られた。
これらのＰＣＲ産物を、低融点アガロース（ＳｅａＰｌａｑｕｅＧＴＧ）を用いてＴＡＥ緩衝液中でアガロース電気泳動を行った。各ＤＮＡ断片をゲルごと切り出し、ゲルと等量の２００ ｍＭ ＮａＣｌを加え、７０℃で１０分間処理し、ゲルを融解した。このサンプルをフェノール抽出、フェノール・クロロホルム抽出、クロロホルム抽出を各１回行い、エタノール沈殿によって５’部分と３’部分のＤＮＡ断片を回収した。この断片を鋳型にして、ＴＭ２ Ｋ１４１Ｅ以外の遺伝子を構築するためにプライマーＴｍ２ＮｔｅｒｍＰｃｉとＴｍ２ＣｔｅｒｍＢａｍを用いて、２段階目のＰＣＲを行った。反応条件は１段階目と同様とした。その結果、４３０ｂｐのＰＣＲ産物が得られた。
１−３） クローニング
ＰＣＲによって得られた低ｐＩ型ＴＭ２遺伝子断片をベクターｐＣＲ４ Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にクローニングした。ライゲーション反応はベクターキット添付の説明書きに従った。大腸菌ＴＢ１にエレクトロポレーション法を用いてＤＮＡを導入し、常法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． １９８９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ）に従ってプラスミドＤＮＡを抽出した。インサートが確認されたクローンに関して、Ｍ１３プライマー（Ｔａｋａｒａ社）を用いて、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ蛍光シークエンサー（Ｍｏｄｅｌ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ， Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）で、ＰＣＲ産物の塩基配列をその両端から決定し、対象塩基に変異が導入されていることを確認した。
ＰＣＲによって得られた低ｐＩ型ＴＭ２遺伝子断片をベクターｐＣＲ４ Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にクローニングした。ライゲーション反応はベクターキット添付の説明書きに従った。大腸菌ＴＢ１にエレクトロポレーション法を用いてＤＮＡを導入し、常法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． １９８９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ）に従ってプラスミドＤＮＡを抽出した。インサートが確認されたクローンに関して、Ｍ１３プライマー（Ｔａｋａｒａ社）を用いて、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ蛍光シークエンサー（Ｍｏｄｅｌ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ， Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）で、ＰＣＲ産物の塩基配列をその両端から決定し、対象塩基に変異が導入されていることを確認した。
塩基配列が確認された遺伝子について、それらがｐＣＲ４ Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯに組み込まれたプラスミドをＰｃｉ ＩとＢａｍＨ Ｉで二重消化し、前述の方法でゲル精製を行い、ＤＮＡ断片を回収した。この断片を、あらかじめＮｃｏＩとＢａｍＨ Ｉで消化しておいた大腸菌発現用ベクターｐＴｒｃ９９Ａに、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ社製）を用いてライゲーションした。ライゲーション産物を大腸菌ＴＢ１に形質転換し、常法に従いプラスミドＤＮＡを抽出、制限酵素分析を行い、挿入遺伝子の有無を確認し、低ｐＩ型ＴＭ２タンパク発現用のベクターＴＭ２ Ｋ２６Ａ／ｐＴｒｃ９９Ａ、ＴＭ２ Ｋ７３Ｑ／ｐＴｒｃ９９Ａ、ＴＭ２ Ｋ３３ＴＫ３７Ａ、ＴＭ２ Ｒ１０４Ｅ／ｐＴｒｃ９９Ａ、ＴＭ２ Ｋ１４１Ｅ／ｐＴｒｃ９９Ａ、ＴＭ２ Ｋ１９Ｔ／ｐＴｒｃ９９Ａを完成させた。さらに、ＴＭ２ Ｒ１０４ＥＫ１４１Ｅをコードする遺伝子の構築は、ベクターＴＭ２ Ｒ１０４Ｅ／ｐＴｒｃ９９Ａを鋳型として、プライマーＴｍ２ＮｔｅｒｍＰｃｉとＴｍ２ Ｋ１４１Ｅ Ｂａｍを用いたＰＣＲによって変異を導入した。また、ＴＭ２ Ｋ３３ＴＫ３７ＡＲ１０４Ｅをコードする遺伝子の構築は、ベクターＴＭ２ Ｋ３３ＴＫ３７Ａ／ｐＴｒｃ９９Ａを鋳型として、プライマーＴｍ２ＮｔｅｒｍＰｃｉとＴｍ２ Ｋ１４１Ｅ Ｂａｍを用いたＰＣＲによって変異を導入し、上記と同様の方法でクローニングした。
１−４） 低ｐＩ型 ＴＭ２の大腸菌発現
各低ｐＩ型ＴＭ２／ｐＴｒｃ９９Ａにより形質転換した大腸菌 ＴＢ１を、抗生物質アンピシリン（最終濃度１００μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ培地６ｍＬに接種し、ＯＤ６００における吸光度が０．５に達するまで３７℃で振とう培養した。その後、１ｍＭ ＩＰＴＧを添加し、さらに３７℃で一晩振とう培養した。培養液１ｍＬから遠心にて大腸菌を集菌し、２０ ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７）４００ｕＬ中に懸濁後、菌体を超音波により破砕した。破砕液を遠心（１５０００ｒｐｍ）し、その上清を可溶性画分とした。
各低ｐＩ型ＴＭ２／ｐＴｒｃ９９Ａにより形質転換した大腸菌 ＴＢ１を、抗生物質アンピシリン（最終濃度１００μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ培地６ｍＬに接種し、ＯＤ６００における吸光度が０．５に達するまで３７℃で振とう培養した。その後、１ｍＭ ＩＰＴＧを添加し、さらに３７℃で一晩振とう培養した。培養液１ｍＬから遠心にて大腸菌を集菌し、２０ ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７）４００ｕＬ中に懸濁後、菌体を超音波により破砕した。破砕液を遠心（１５０００ｒｐｍ）し、その上清を可溶性画分とした。
この可溶性画分についてウエスタンブロッティング解析を行った。可溶性画分と２×ＳＤＳ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ（２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ６．８， ２０％ ２−メルカプトエタノール， ２０％ ＳＤＳ， ２０％ グルセロール）を等量ずつ混和し、９５℃で１０分間加熱したものをＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開し、ウエスタンブロッティング解析に用いた。１次抗体としてウサギ抗ＴＭ２抗体（ＰＣＴ／ＪＰ２００６／３２６２６０）を用いた。さらに、２次抗体としてアルカリフォスファターゼ標識抗ウサギ ＩｇＧ抗体（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いた。ウエスタンブロッティング解析の結果、低ｐＩ ＴＭ２／ｐＴｒｃ９９Ａで形質転換した大腸菌いずれにおいても、低ｐＩ型ＴＭ２遺伝子を挿入していないベクターｐＴｒｃ９９Ａで形質転換した大腸菌にはない、１５．５ｋＤａ付近のバンドが検出された。これらのバンドのサイズは、ＴＭ２のアミノ酸配列から予測される単量体の分子量１５．５ｋＤａと一致した。
続いて、Ｂａｙｅｒら（１９９６，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １７（８） １３１９−２４）の方法に従って、非変性状態のＴＭ２変異体が四量体を形成しているか否かを確認した。つまり、ＤＴＴやメルカプトエタノール等の還元剤を添加していないＳＤＳ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒとＴＭ２変異体可溶性画分を混和し、加熱処理を加えずにＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を行なった。その結果、いずれのＴＭ２変異体も野生型ＴＭ２と同様のサイズにバンドが検出されたため、四量体を形成していた。また、培養液１Ｌ当たりの可溶性低ｐＩ型ＴＭ２タンパクの発現量は、ＴＭ２ Ｋ２６Ａ、ＴＭ２ Ｋ７３Ｑ、ＴＭ２ Ｒ１０４Ｅ、ＴＭ２ Ｋ１４１Ｅ、ＴＭ２ Ｒ１０４ＥＫ１４１Ｅはいずれも２０ｍｇであった。これは、野生型ＴＭ２の発現量と同等であった。
一方、これらの変異体と比較してＴＭ２Ｋ３３ＴＫ３７Ａ、ＴＭ２ Ｋ３３ＴＫ３７ＡＲ１０４Ｅ、ＴＭ２ Ｋ１９Ｔは発現量が２ｍｇであった。
１−５） 蛍光ビオチンによる活性測定
大腸菌発現した各低ｐＩ型ＴＭ２のビオチン結合能を、Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ， １４２７， ４４−４８（１９９９）の方法に従って確認した。１５０μＬ Ａｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５））中に、２５ｍＬ培養液から１．５ｍＬの２０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７）で各低ｐＩ型ＴＭ２を抽出した抽出液を段階的に含むように調整した。この溶液に１０ｐｍｏｌ／μＬ 蛍光ビオチン溶液（ｂｉｏｔｉｎ−４−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ： Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社製）５０μＬ（５００ｐｍｏｌ）を混和し、室温で１０分間反応後、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００（ＴＥＣＡＮ社製）を用いてＥｘ＝４６０ｎｍ、Ｅｍ＝５２５ｎｍにて蛍光強度を測定した。
大腸菌発現した各低ｐＩ型ＴＭ２のビオチン結合能を、Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ， １４２７， ４４−４８（１９９９）の方法に従って確認した。１５０μＬ Ａｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５））中に、２５ｍＬ培養液から１．５ｍＬの２０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７）で各低ｐＩ型ＴＭ２を抽出した抽出液を段階的に含むように調整した。この溶液に１０ｐｍｏｌ／μＬ 蛍光ビオチン溶液（ｂｉｏｔｉｎ−４−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ： Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社製）５０μＬ（５００ｐｍｏｌ）を混和し、室温で１０分間反応後、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００（ＴＥＣＡＮ社製）を用いてＥｘ＝４６０ｎｍ、Ｅｍ＝５２５ｎｍにて蛍光強度を測定した。
その結果、低ｐＩ型ＴＭ２抽出液の添加量に比例して、蛍光強度が低下した。このことから、塩基性アミノ酸を中性および酸性アミノ酸に置換した全長ＴＭ２は、ビオチン様化合物と結合することが確認された。
１−６） 低ｐＩ型ＴＭ２の精製
低ｐＩ型ＴＭ２の精製は、Ｈｏｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９８０）の方法に従い、２−ｉｍｉｎｏｂｉｏｔｉｎ ａｇａｒｏｓｅ（Ｓｉｇｍａ社製）を充填したカラムを用いて行った。各低ｐＩ型ＴＭ２の発現誘導をかけた大腸菌培養液２５ｍＬを５０ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ ＣＡＰＳ（ｐＨ１１） １．５ｍＬで懸濁し、超音波破砕後の上清を２−ｉｍｉｎｏｂｉｏｔｉｎ ａｇａｒｏｓｅ ５００μＬを充填したカラムに供した。５００ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ ＣＡＰＳ（ｐＨ１１）でカラムをよく洗浄した後、５０ｍＭ ＮＨ４ＯＡＣ（ｐＨ４）で溶出した。各低ｐＩ型ＴＭ２の精製タンパク質量は、それぞれの大腸菌発現量と同程度であり、精製度は９５％以上であった。
低ｐＩ型ＴＭ２の精製は、Ｈｏｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９８０）の方法に従い、２−ｉｍｉｎｏｂｉｏｔｉｎ ａｇａｒｏｓｅ（Ｓｉｇｍａ社製）を充填したカラムを用いて行った。各低ｐＩ型ＴＭ２の発現誘導をかけた大腸菌培養液２５ｍＬを５０ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ ＣＡＰＳ（ｐＨ１１） １．５ｍＬで懸濁し、超音波破砕後の上清を２−ｉｍｉｎｏｂｉｏｔｉｎ ａｇａｒｏｓｅ ５００μＬを充填したカラムに供した。５００ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ ＣＡＰＳ（ｐＨ１１）でカラムをよく洗浄した後、５０ｍＭ ＮＨ４ＯＡＣ（ｐＨ４）で溶出した。各低ｐＩ型ＴＭ２の精製タンパク質量は、それぞれの大腸菌発現量と同程度であり、精製度は９５％以上であった。
１−７） ビオチン結合能の測定
Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標） ３０００（Ｂｉａｃｏｒｅ社製。表面プラズモン共鳴を原理としたバイオセンサー）を用いて、低ｐＩ型ＴＭ２のビオチン結合試験を実施した。センサーチップＣＭ５（Ｂｉａｃｏｒｅ社製）上に、ＥＺ−Ｌｉｎｋ(R) ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（２２．４Å）またはＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標） ＮＨＳ−ＬＣＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（３０．５Å）（両者ともＰＩＥＲＣＥ社製）でビオチン化したウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を、アミンカップリング法を用いて固定した。ランニング緩衝液にはＨＢＳ−ＥＰ（Ｂｉａｃｏｒｅ社製）を使用し、各低ｐＩ型ＴＭ２を２５℃、流速２０μｌ／ｍｉｎで４０μｌ（２分間）ずつインジェクションした。
Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標） ３０００（Ｂｉａｃｏｒｅ社製。表面プラズモン共鳴を原理としたバイオセンサー）を用いて、低ｐＩ型ＴＭ２のビオチン結合試験を実施した。センサーチップＣＭ５（Ｂｉａｃｏｒｅ社製）上に、ＥＺ−Ｌｉｎｋ(R) ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（２２．４Å）またはＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標） ＮＨＳ−ＬＣＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（３０．５Å）（両者ともＰＩＥＲＣＥ社製）でビオチン化したウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を、アミンカップリング法を用いて固定した。ランニング緩衝液にはＨＢＳ−ＥＰ（Ｂｉａｃｏｒｅ社製）を使用し、各低ｐＩ型ＴＭ２を２５℃、流速２０μｌ／ｍｉｎで４０μｌ（２分間）ずつインジェクションした。
得られたセンサーグラムから解析ソフトウェア ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｖｅｒｓｉｏｎ ４．１を用いて結合速度定数（ｋａ）、解離速度定数（ｋｄ）、解離定数（ＫＤ）を算出した。この結果を表２に示す。表中の（ ）内の値はＢｉａｃｏｒｅ ３０００の測定限界以下（ｋａ＜５×１０−６）であることを示す。いずれの低ｐＩ型ＴＭ２とも、ビオチンとの特異的な結合を示し、これらの変異はビオチン結合力に大きな影響を与えていないことが示された。
表２ 低ｐＩ型ＴＭ２とビオチンの相互作用解析
低ｐＩ型ＴＭ２の等電点を、ＸＣｅｌｌ ＳｕｒｅＬｏｃｋ Ｍｉｎｉ−Ｃｅｌｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いた等電点電気泳動にて測定した。取扱説明書の記載に従い、各低ｐＩ型ＴＭ２ ５００ｎｇずつをＩＥＦ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ ｐＨ ３−１０（２×）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）と混和し、ｐＨレンジ ３−１０のポリアクリルアミドゲル（ｐＨ３−１０ ＩＥＦ Ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製））へ添加した。１００Ｖで１時間、２００Ｖで１時間、５００Ｖで４５分間の順に電圧を上げながら電気泳動を行った。
泳動後、ゲルをブロッティング緩衝液（０．７％ 酢酸）中で１０分間振とうした後、ＸＣｅｌｌ ｌｌ Ｂｌｏｔ Ｍｏｄｕｌｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用い、ＰＶＤＦ膜へ１０Ｖで１時間転写した。このＰＶＤＦ膜に、１次抗体としてウサギ抗ＴＭ２抗体（ＰＣＴ／ＪＰ２００６／３２６２６０）、２次抗体としてアルカリフォスファターゼ標識抗ウサギ ＩｇＧ抗体（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を反応させ、Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｋｉｔ ＩＩ ＜ＶＥＣＴＯＲ Ｂｌａｃｋ＞（ＶＥＣＴＲＯ社製）でバンドの検出を行った。
その結果、変異を導入したＴＭ２の等電点はいずれも、野生型のＴＭ２より１以上低下していることが明らかになった。等電点電気泳動によるｐＩの実測値、およびＧｅｎｅｔｙｘによるｐＩの算出値を以下の表３に示す。
表３ 低ｐＩ型ＴＭ２の等電点
本実施例では、ヒト血清に対する非特異的結合を、血清タンパク質固定化磁性ビーズに対する低ｐＩ型ＴＭ２の非特異吸着性として調べた。具体的には、低ｐＩ型ＴＭ２の非特異結合性を検討するために、磁性ビーズにヒト血清タンパク質を共有結合させ、そのビーズに吸着する低ｐＩ型ＴＭ２量を測定した。検討する低ｐＩ型ＴＭ２としては、大腸菌で発現量の高かったＴＭ２ Ｋ２６Ａ、ＴＭ２ Ｋ７３Ｑ、ＴＭ２ Ｒ１０４Ｅ、ＴＭ２ Ｋ１４１Ｅ、ＴＭ２ Ｒ１０４ＥＫ１４１Ｅを選択した。
ヒト血清タンパク質と磁性ビーズの結合は以下の方法で行った。カルボキシル基で表面をコートされた磁性ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２７０ Ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ Ａｃｉｄ， Ｄｙｎａｌ社製）２１０μｌを０．０１Ｎ 水酸化ナトリウム２１０μＬで１０分間洗浄後、さらに超純水 ２１０μＬで１０分間３回洗浄した。洗浄済みの磁性ビーズに、冷超純水で溶解した１−Ｅｔｈｙｌ−３−（３−Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＥＤＣ）（ＰＩＥＲＣＥ社製）を最終濃度０．２Ｍになるように添加し３０分間、室温で振とうした。その後、冷超純水２１０μｌ、続いて５０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．０） ２１０μＬで磁性ビーズを洗浄した。
この磁性ビーズ に５０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ ５．０）で透析した１ｍｇ／ｍＬヒト血清タンパク質（ＣＨＥＭＩＣＯＮ社製） ２１０μＬを添加した。室温で３０分間振とうさせることにより、共有結合にてヒト血清タンパク質と磁性ビーズを結合させた。磁石で磁性ビーズを回収し、上清を除去した。次に５０ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ ７．０）２１０μｌでビーズの未反応の活性基を消去後、０．５％ ＢＳＡ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ緩衝液 ４２０μｌで磁性ビーズをブロッキングした。ＰＢＳ緩衝液２１０μｌで磁性ビーズを懸濁し、ヒト血清タンパク質固定化磁性ビーズを完成させた。
この磁性ビーズ７μＬと０．５６μｇ／ｍＬの各低ｐＩ型ＴＭ２ １００μＬを混和し、室温で１時間反応させた。磁石で磁性ビーズを回収し、上清を除去した。続いて、５００ｍＭ 塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液５００μＬで洗浄を行った後、磁性ビーズに２×ＳＤＳ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ（２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ６．８， ２０％ ２−メルカプトエタノール， ２０％ ＳＤＳ， ２０％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ）２０μＬを添加し、９５℃で２０分間加熱することによって磁性ビーズに低ｐＩ型ＴＭ２を遊離させた。
このサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ウエスタンブロッティング解析することによって、低ｐＩ型ＴＭ２の存在量を確認した。１次抗体としてウサギ抗タマビジン２抗体、２次抗体としてアルカリホスファターゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体を使用した。Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｋｉｔ ＩＩ ＜ＶＥＣＴＯＲ Ｂｌａｃｋ＞（ＶＥＣＴＲＯ社製）でバンドの検出を行ない、Ｌａｓ−３０００（ＦＵＪＩＦＩＬＭ）でそれらのバンドの定量化をした。結果を図１に示す。
図１に示されるように、野生型ＴＭ２と比較して、ヒト血清タンパク質に吸着した割合は、ＴＭ２ Ｒ１０４Ｅは１割減、ＴＭ２ Ｋ２６Ａは３割減、Ｋ７３ＱとＫ１４１Ｅは４割減、ＴＭ２ Ｒ１０４ＥＫ１４１Ｅは７割減であり、Ｋ２６Ａ、Ｋ７３Ｑ、Ｋ１４１Ｅ、Ｋ１０４ＥＫ１４１ＥはＴＭ２より有意に非特異結合が低かった。
１−１０） フィブロネクチンに対する非特異結合
フィブロネクチンをマイクロプレートに固相化し、各低ｐＩ型ＴＭ２の結合性を比較した。Ｎｅｗ ＥＬＩＳＡプレート専用固定化溶液で５０μｇ／ｍｌに調整したフィブロネクチンをＮｅｗ ＥＬＩＳＡプレート（住友ベークライト社）に５０μｌずつ添加し、３７℃で４時間振とうすることによって固相化した。その後、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００含有ＰＢＳ ３００μｌで３回洗浄し、自然乾燥させた。
フィブロネクチンをマイクロプレートに固相化し、各低ｐＩ型ＴＭ２の結合性を比較した。Ｎｅｗ ＥＬＩＳＡプレート専用固定化溶液で５０μｇ／ｍｌに調整したフィブロネクチンをＮｅｗ ＥＬＩＳＡプレート（住友ベークライト社）に５０μｌずつ添加し、３７℃で４時間振とうすることによって固相化した。その後、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００含有ＰＢＳ ３００μｌで３回洗浄し、自然乾燥させた。
ここに５０μｇ／ｍｌ ＴＭ２、Ｋ２６Ａ、Ｋ７３Ｑ、Ｒ１０４Ｅ、Ｋ１４１Ｅ、Ｒ１０４ＥＫ１４１Ｅを５０μｌ添加し、室温で１時間静置した。３００μＬ／ｗｅｌｌ ＰＢＳＴ(０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ緩衝液)で３回洗浄後、０．５％ ＢＳＡを含むＰＢＳＴで５０００倍希釈したビオチン化ＨＲＰを５０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、室温で１時間反応を行った。続いて３００μＬ／ｗｅｌｌ ＰＢＳＴで３回洗浄後、５０μＬ／ｗｅｌｌ １−Ｓｔｅｐ Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡで発色させた。５０μＬ／ｗｅｌｌ ２Ｍ 硫酸で発色を停止させた後、４５０ｎｍにおける吸光度をＩｎｆｉｎｉｔｅ ２００にて測定した。その結果、いずれの低ｐＩ型ＴＭ２もＴＭ２よりフィブロネクチンに対する結合性が有意に低下した。
結果を図２に示す。図２に示されるように、フィブロネクチンとの結合抑制効果はＲ１０４ＥＫ１４１Ｅ、Ｋ１４１Ｅ、Ｒ１０４Ｅ、Ｋ２６Ａ、Ｋ７３Ｑの順に高かった。
１−１１） ＤＮＡに対する非特異結合
低ｐＩ型ＴＭ２のＤＮＡに対する非特異結合性を解析した。
低ｐＩ型ＴＭ２のＤＮＡに対する非特異結合性を解析した。
２×ＳＳＣ緩衝液で１０μｇから１μｇまで段階希釈したサケ精子ＤＮＡをアルカリ変性させ、Ｂｉｏ−Ｄｏｔ ＳＦ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いて、Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ＋膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｅｉｎｃｅｓ）に吸着させた。５×デンハルト液（０．１％ＢＳＡ、０．１％フィコール、０．１％ポロビニルプロリドン）で膜をブロッキングした後、２５μｇ／ｍＬの各低ｐＩ型ＴＭ２、野生型ＴＭ２に室温で９０分間浸した。その後、膜をＴＴＢＳ緩衝液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ緩衝液）によって、室温で５分間３回洗浄した。３％スキムミルク、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ緩衝液で１時間、膜をブロッキングした。３％スキムミルク、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ緩衝液で５０００倍希釈したＢｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｅ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（Ｖｅｃｔｏｒ社製）を室温で１時間反応させた。再び０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０含有ＴＢＳで膜を洗浄後、ＥＣＬ（Ａｍａｓｈａｍ社製）の試薬１と試薬２を等量混和した溶液中で膜を１分間振とうさせた。その後、Ｌａｓ３０００（ＦＵＪＩＦＩＬＭ）を用いてルミノール反応の検出を行った。
結果を図３に示す。図３に示されるように、１０μｇ ＤＮＡに対してＴＭ２のみが弱く結合したものの、低ｐＩ変異を導入した全てのＴＭ２においては、検出限界以下であった。よって、低ｐＩ型ＴＭ２のＤＮＡに対する非特異結合性は有意に低下することが示された。
実施例１の結果に基づき、本発明の低ｐＩ型改変ＴＭ２の特性を以下の表４にまとめた。
表４ 低ｐＩ型改変ＴＭ２の特性のまとめ
２−１） 高アフィニティ型ＴＭ２の構築
ビオチンに対する親和性を高めることができるかどうか検証するため、アミノ酸変異をＴＭ２に導入した。
ストレプトアビジンとして、ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ ｖｉｏｌａｃｅｕｓのストレプトアビジン ｖ２（寄託番号：Ｑ５３５３３， Ｂａｙｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １２６３：ｐ．６０−６６）、ストレプトアビジン ｖ１（寄託番号：Ｑ５３５３２）、ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ ａｖｉｄｉｎ ｉｉのストレプトアビジン（寄託番号：Ｐ２２６２９， Ａｒｇａｒａｎａ ｅｔ ａｌ． （１９８６） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １４：ｐ．１８７１−１８８２）などが知られている。ＷＯ０２／０７２８１７に記載されているように、これらのストレプトアビジンとＴＭ２タンパク質のアミノ酸配列の同一性は、各々５０％、４８％、４８％と、約５０％程度である。
しかしながら本発明者らは、ＴＭ２タンパク質がビオチン結合性を維持するため、あるいは、より高いビオチン結合性を取得するためには、ストレプトアビジンと類似した構造を有する必要性があるのではと考えた。ストレプトアビジンのビオチンとの結合に重要な役割を果たしていると考えられるトリプトファン残基、水素結合に関与する残基（Ｑｕｒｅｓｈｉ ｅｔ ａｌ.（２００１），Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７６（４９），ｐ．４６４２２−４６４２８）について、ストレプトアビジンとＴＭ２のアミノ酸配列を比較した。
その結果、ビオチンとの水素結合に関与する残基のうち、ストレプトアビジン配列の４９番目のアスパラギンが、ＴＭ２配列における該当アミノ酸（４０番目のアスパラギン酸）と異なっていることを見出した。このＴＭ２のＤ４０をストレプトアビジン型のアスパラギンに改変し、アフィニティが向上するかどうかを確認した。
まず、高アフィニティ型ＴＭ２を構築するために、上記の変異を導入するようなプライマーを設計した。ＴＭ２遺伝子の５’部分と、その上流にＰｃｉ Ｉ制限酵素切断部位（ＡＣＡＴＧＴ）をコードする配列からなるプライマーＴｍ２ＮｔｅｒｍＰｃｉ、ＴＭ２遺伝子の３’部分と、その下流にＢａｍＨ Ｉ制限酵素切断部位（ＧＧＡＴＣＣ）をコードする配列からなるプライマーＴｍ２ＣｔｅｒｍＢａｍは、上述した通りである。各変異体についてのミスマッチコドンを含む一連のセンスプライマー、およびアンチセンスプライマーは、それぞれ以下の通りである（配列番号３８−３９）。
表５ 高アフィニティ型ＴＭ２構築用プライマー
２−２） ＰＣＲ、クローニング
上記のように４０番目のアスパラギン酸をアスパラギンに置換したＴＭ２変異体（以下、「ＴＭ２ Ｄ４０Ｎ」、塩基配列は配列番号１９に記載、アミノ酸配列は配列番号２０に記載）を構築した。
上記のように４０番目のアスパラギン酸をアスパラギンに置換したＴＭ２変異体（以下、「ＴＭ２ Ｄ４０Ｎ」、塩基配列は配列番号１９に記載、アミノ酸配列は配列番号２０に記載）を構築した。
このＴＭ２変異体をコードする遺伝子を構築するために２段階のＰＣＲを繰り返し行った。最初の１段階目のＰＣＲは、ＴＭ２遺伝子がベクターｐＴｒｃ９９Ａに組み込まれたプラスミドを鋳型にして、プライマー Ｔｍ２ＮｔｅｒｍＰｃｉと各変異体のミスマッチコドンを含むアンチセンスプライマーＴＭ２ ＳＡ Ｄ４０Ｎ Ｒを用いて５’部分の増幅を、ミスマッチコドンを含むセンスプライマーＴＭ２ ＳＡＤ４０Ｎ ＦとＴｍ２ＣｔｅｒｍＢａｍを用いて３’部分の増幅を、それぞれ行った。
ＰＣＲ反応条件は、５０μＬの反応液中に鋳型ＤＮＡを５００ｎｇ、１０×Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ｂｕｆｆｅｒ（Ｔａｋａｒａ社）を５μＬ、２．５ｍＭ ｄＮＴＰを４μＬ、プライマーを各２５ｐｍｏｌｅｓ、５Ｕ／μＬ Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ社製）を０．５μＬ添加し、プログラムテンプコントロールシステムＰＣ−７００（ＡＳＴＥＫ）を用いて、９６℃−３分を１回、９６℃−１分、５５℃−１分、７２℃−２分を１０回、７２℃−６分を１回とした。その結果、５’部分において想定されるサイズのＰＣＲ産物が得られた。これらのＰＣＲ産物を、低融点アガロース（ＳｅａＰｌａｑｕｅＧＴＧ）を用いてＴＡＥ緩衝液中でアガロース電気泳動を行い、上述の通りＤＮＡ断片を精製した。
この断片を鋳型にして、プライマーＴｍ２ＮｔｅｒｍＰｃｉとＴｍ２ＣｔｅｒｍＢａｍを用いて、２段階目のＰＣＲを行った。反応条件は１段階目と同様とした。得られた４３０ ｂｐの高アフィニティ型ＴＭ２遺伝子断片をベクターｐＣＲ４ Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にクローニングした。方法は、上述と同様である。その結果ＴＭ２ Ｄ４０Ｎタンパク発現用のベクターＴＭ２ Ｄ４０Ｎ／ｐＴｒｃ９９Ａを完成させた。
２−３） 高アフィニティ型ＴＭ２の大腸菌発現
２−２）で作製したＴＭ２変異体を挿入したｐＴｒｃ９９Ａベクターにより形質転換した大腸菌 ＴＢ１を、抗生物質アンピシリン（最終濃度１００μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ培地６ｍＬに接種し、ＯＤ６００における吸光度が０．５に達するまで３７℃で振とう培養した。
２−２）で作製したＴＭ２変異体を挿入したｐＴｒｃ９９Ａベクターにより形質転換した大腸菌 ＴＢ１を、抗生物質アンピシリン（最終濃度１００μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ培地６ｍＬに接種し、ＯＤ６００における吸光度が０．５に達するまで３７℃で振とう培養した。
その後、１ｍＭ ＩＰＴＧを添加し、さらに３７℃で一晩振とう培養した。培養液１ｍＬから遠心にて大腸菌を集菌し、２０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７）４００μＬ中に懸濁後、菌体を超音波により破砕した。破砕液を遠心（１５０００ｒｐｍ）し、その上清を可溶性画分とした。この可溶性画分についてウエスタンブロッティング解析を行った。可溶性画分と２×ＳＤＳ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒを等量混和し、９５℃で１０分間加熱後したものをＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開し、ウエスタンブロッティング解析に用いた。１次抗体としてウサギ抗ＴＭ２抗体（ＰＣＴ／ＪＰ２００６／３２６２６０）を用いた。さらに、２次抗体としてアルカリフォスファターゼ標識抗ウサギ ＩｇＧ抗体（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いた。
その結果ＴＭ２ Ｄ４０Ｎを挿入したｐＴｒｃ９９Ａベクターで形質転換した大腸菌において、ＴＭ２変異体を挿入していないｐＴｒｃ９９Ａベクターで形質転換した大腸菌にはない、１５．５ｋＤａ付近のバンドが検出された。これらのサイズは、ＴＭ２のアミノ酸配列から予測される単量体の分子量１５．５ｋＤａと一致した。続いて、低ｐＩ型ＴＭ２と同様に、非変性状態の高アフィニティ型ＴＭ２が四量体を形成しているか否かをＢａｙｅｒ ｅｔ ａｌ. （１９９６）， Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ． １７（８） １３１９−１３２４）の方法に従って確認した。その結果、高アフィニティ型ＴＭ２も野生型ＴＭ２と同様のサイズにバンドが検出されたため、四量体を形成していることが明らかになった。また、培養液１Ｌ当たりの可溶性ＴＭ２ Ｄ４０Ｎタンパクの発現量は２０ｍｇであった。
２−４） 高アフィニティ型ＴＭ２の精製
高アフィニティ型ＴＭ２の精製は、上述の通りＨｏｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９８０）の方法に従って行なった。その結果、ＴＭ２変異体の精製タンパク質量は大腸菌発現量と同程度であり、精製度は９５％以上であった。
高アフィニティ型ＴＭ２の精製は、上述の通りＨｏｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９８０）の方法に従って行なった。その結果、ＴＭ２変異体の精製タンパク質量は大腸菌発現量と同程度であり、精製度は９５％以上であった。
２−５） 蛍光ビオチンによる活性測定
精製したＴＭ２変異体のビオチン結合能を、Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ， １４２７， ４４−４８（１９９９）の方法に従って確認した。その結果、ＴＭ２変異体溶液の添加量に比例して、蛍光強度が低下した。このことから、Ｄ４０Ｎの変異はＴＭ２とビオチン様化合物との結合を大きく阻害しないことが確認された。
精製したＴＭ２変異体のビオチン結合能を、Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ， １４２７， ４４−４８（１９９９）の方法に従って確認した。その結果、ＴＭ２変異体溶液の添加量に比例して、蛍光強度が低下した。このことから、Ｄ４０Ｎの変異はＴＭ２とビオチン様化合物との結合を大きく阻害しないことが確認された。
２−６） 等電点電気泳動
高アフィニティ型ＴＭ２の等電点を、ＸＣｅｌｌ ＳｕｒｅＬｏｃｋ Ｍｉｎｉ−Ｃｅｌｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた等電点電気泳動にて測定した。取扱説明書の記載に従い、高アフィニティ型ＴＭ２ ２００ｎｇ用いて解析をした結果を表６に示す。塩基性よりのアミノ酸に置換したＴＭ２ Ｄ４０Ｎは、等電点電気泳動においても、野生型ＴＭ２の等電点を上回っていた。
高アフィニティ型ＴＭ２の等電点を、ＸＣｅｌｌ ＳｕｒｅＬｏｃｋ Ｍｉｎｉ−Ｃｅｌｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた等電点電気泳動にて測定した。取扱説明書の記載に従い、高アフィニティ型ＴＭ２ ２００ｎｇ用いて解析をした結果を表６に示す。塩基性よりのアミノ酸に置換したＴＭ２ Ｄ４０Ｎは、等電点電気泳動においても、野生型ＴＭ２の等電点を上回っていた。
表６ 高アフィニティ型ＴＭ２の等電点
Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００（Ｂｉａｃｏｒｅ社製）を用いて、高アフィニティ型ＴＭ２のイミノビオチン（Ｉｍｉｎｏｂｉｏｔｉｎ）結合試験、ならびにビオチン結合試験を実施し、分子間相互作用の分析を行った。
２−７−１）イミノビオチン結合試験
センサーチップに貼付するリガンドとして用いるＴＭ２もしくは高アフィニティ型ＴＭ２は、常法に従い２−Ｉｍｉｎｏｂｉｏｔｉｎ ａｇａｒｏｓｅで精製し２０ｍＭ ＫＰｉ（ｐＨ ７）に一晩透析した。これらの試料を１０ｍＭ 酢酸緩衝液 ｐＨ５（ＢＩＡｃｏｒｅ社製）に５０μｇ／ｍｌ程度になるように調整した。
センサーチップに貼付するリガンドとして用いるＴＭ２もしくは高アフィニティ型ＴＭ２は、常法に従い２−Ｉｍｉｎｏｂｉｏｔｉｎ ａｇａｒｏｓｅで精製し２０ｍＭ ＫＰｉ（ｐＨ ７）に一晩透析した。これらの試料を１０ｍＭ 酢酸緩衝液 ｐＨ５（ＢＩＡｃｏｒｅ社製）に５０μｇ／ｍｌ程度になるように調整した。
固定化は、２５℃、流速１０μｌ／ｍｉｎ、ＨＢＳ−ＥＰ（Ｂｉａｃｏｒｅ社製）をランニングｂｕｆｆｅｒとして行った。センサーチップＣＭ５（Ｂｉａｃｏｒｅ社製）上に上記のＴＭ２もしくはＴＭ２変異体を、アミンカップリング法を用いて４０００〜８０００ＲＵ程度固定した。活性化時間は１０分とした。
特異的相互作用の測定は、イミノビオチンＢＳＡをアナライト（流路系に流す物質）として、２５℃、流速２０μｌ／ｍｉｎ、ＣＡＰＳ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ ＣＡＰＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．００５％ Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ１１）をランニングｂｕｆｆｅｒとして行った。イミノビオチンＢＳＡは以下の様に作成した。高精製度のＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）２ｍｇとＮＨＳ−Ｉｍｉｎｏｂｉｏｔｉｎ（イミノビオチン）（Ｐｉｅｒｃｅ）１ｍｇを１ｍｌの５０ｍＭ ホウ酸ナトリウム ｐＨ８．０中で溶解し、４℃で２時間インキュベーションした。これを透析チューブ（ＭＷＣＯ ６−８，０００）に入れ、５０ｍＭ 炭酸ナトリウム ｐＨ６．７に対して４℃で一晩透析した。こうして作成したイミノビオチン−ＢＳＡコンジュゲート（ＭＷ ６７ｋＤａ，３０μＭ）をＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）バイオセンサーのアナライトとした。イミノビオチン−ＢＳＡのインジェクション時間は２分間、解離時間は１０分間とした。測定は、再生操作を行わず、低濃度から段階的に濃度を上げて行った。まず目的のタンパク質を固定化したフローセルに、ランニングｂｕｆｆｅｒで９．３７５ｎＭ、１８．７５ｎＭ、３７．５ｎＭ、７５ｎＭ、１５０ｎＭ、３００ｎＭ、６００ｎＭに希釈したＢＳＡを低濃度側から４０μｌ（２分間）インジェクションし、解離を測定した。続いて、同じフローセルに、上記の方法に従い作製したイミノビオチン−ＢＳＡを同様に測定した。
相互作用の見られたものについて、解析ソフトウェアＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｖｅｒ．４．１を用いて各定数の算出を行った。イミノビオチン−ＢＳＡの各濃度で得られたセンサグラムを、同濃度のＢＳＡで得られたセンサグラムをリファレンスとして差し引きを行い、得られたセンサグラムに対して反応モデル１：１（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）ｂｉｎｄｉｎｇを用いて反応速度論的解析を行い、結合速度定数（ｋａ）と解離速度定数（ｋｄ）を計算した。解離定数（ＫＤ）は、ｋｄ／ｋａから求めた。なお、再生操作を行わない場合、各濃度の測定を行うごとにＲｍａｘ（アナライトの最大結合量）が減少するが、解析時にはＲｍａｘをローカルフィッティングして濃度ごとに算出を行った。この時、１：１（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）ｂｉｎｄｉｎｇモデルに近似できた濃度（主に１８．７５〜７５ｎＭ）の結果のみを採用した。
その結果、ＴＭ２に比べＴＭ２ Ｄ４０Ｎは、イミノビオチンへの結合速度定数（ｋａ）がおよそ４０％上昇し、解離速度定数（ｋｄ）が４５％低下した。結果としてＫＤがおよそ６０％減少した。即ち、ＴＭ２ Ｄ４０ＮはＴＭ２に比べて、イミノビオチンへの親和性が２．５倍になった（表７）。
２−７−２）ビオチン結合試験
高精製度のＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）２ｍｇとＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ）１ｍｇを１ｍｌの５０ｍＭ ホウ酸ナトリウム ｐＨ８．０中で溶解し、４℃で２時間インキュベーションした。これを透析チューブ（ＭＷＣＯ ６−８，０００）に入れ、５０ｍＭ 炭酸ナトリウム ｐＨ６．７に対して４℃で一晩透析した。こうして作成したビオチン−ＬＣ−ＢＳＡコンジュゲート（ＭＷ ６７ｋＤａ，３０μＭ）をＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）バイオセンサーのリガンドとした。一方、アナライトとしてＴＭ２ならびに高アフィニティ型ＴＭ２（Ｄ４０Ｎ）を、上述の様に２−Ｉｍｉｎｏｂｉｏｔｉｎ ａｇａｒｏｓｅを用いて精製し、２０ｍＭ ＫＰｉ（ｐＨ７）に一晩透析し調製した。
高精製度のＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）２ｍｇとＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ）１ｍｇを１ｍｌの５０ｍＭ ホウ酸ナトリウム ｐＨ８．０中で溶解し、４℃で２時間インキュベーションした。これを透析チューブ（ＭＷＣＯ ６−８，０００）に入れ、５０ｍＭ 炭酸ナトリウム ｐＨ６．７に対して４℃で一晩透析した。こうして作成したビオチン−ＬＣ−ＢＳＡコンジュゲート（ＭＷ ６７ｋＤａ，３０μＭ）をＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）バイオセンサーのリガンドとした。一方、アナライトとしてＴＭ２ならびに高アフィニティ型ＴＭ２（Ｄ４０Ｎ）を、上述の様に２−Ｉｍｉｎｏｂｉｏｔｉｎ ａｇａｒｏｓｅを用いて精製し、２０ｍＭ ＫＰｉ（ｐＨ７）に一晩透析し調製した。
ビオチン−ＬＣ−ＢＳＡ、およびネガティブコントロールとしたＢＳＡは、アミンカップリング法によってＣＭ５センサーチップに固定化した。固定化量は、２００ＲＵ程度になるように調節した。ＢＳＡを固定化したチップは、フローセル１と３に、ビオチン−ＬＣ−ＢＳＡを固体化したチップは、フローセル２と４に配置した。ＴＭ２は、フローセル１と２に、高アフィニティ型ＴＭ２（Ｄ４０Ｎ）は、フローセル３と４に、流速２０μｌ／ｍｉｎで２分間、ランニングバッファー［１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，３ｍＭ ＥＤＴＡ，０．００５％ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔａｔ２０（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｉｎｃ．）］中にロードした。
その後、６０分間、サンプルの解離をモニターした。なお、結合したＴＭ２ならびに高アフィニティ型ＴＭ２（Ｄ４０Ｎ）を解離させることは不可能であったため、測定では再生操作を行わず、低濃度側から７段階の測定を行った（３．１２５、６．２５、１２．５、２５、５０、１００、および２００ｎＭ）。ＢＳＡのデータはレファレンスとして、ＢＳＡ−ＬＣ−ビオチンのデータから差し引いた。測定は２５℃で行った。得られたセンサーグラムから、解析ソフトウェア ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｖｅｒ．４．１を用いて、１：１結合モデルを用いて、反応速度論的解析を行い、結合速度定数（ｋａ）と解離速度定数（ｋｄ）を計算した。解離定数（ＫＤ）は、ｋｄ／ｋａから求めた。なお、再生操作を行わない場合、各濃度の測定を行うごとにＲｍａｘ（アナライトの最大結合量）が減少するが、解析時にはＲｍａｘをローカルフィッティングして濃度ごとに算出を行った。また、１：１結合モデルに近似できたアナライト濃度のデータのみを採用した。
その結果、ＴＭ２に比べＴＭ２ Ｄ４０Ｎは、結合速度定数（ｋａ）が上昇し、解離速度定数（ｋｄ）が低下した（表７）。
以上のことから、ＴＭ２ Ｄ４０Ｎのビオチン結合能（親和性）が向上していることが示された。
表７ 高アフィニティ型ＴＭ２とイミノビオチンならびにビオチンとの相互作用解析
表８ 高アフィニティ型ＴＭ２の特性のまとめ
３−１） 低非特異結合・高アフィニティ型ＴＭ２（ＨＡＬＵ ＴＭ２：高アフィニティ及び低い非特異性（Ｈｉｇｈ ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｄ ｌｏｗ ｕｎｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ））の構築
非特異結合性を下げると同時に、ビオチンに対する親和性を高めるための変異をＴＭ２に導入した。
非特異結合性を下げるための変異は、実施例１の結果に鑑み、非特異結合性を下げるアミノ酸変異として、Ｒ１０４ＥとＫ１４１Ｅの変異を導入した。また、ビオチンに対する親和性を高めるための変異は、実施例２のビオチン結合能の測定の結果からＤ４０Ｎの変異を導入した。つまり、Ｄ４０Ｎに加えＲ１０４Ｅの変異を同時に有するＴＭ２（以下「ＴＭ２ Ｄ４０ＮＲ１０４Ｅ」、塩基配列は配列番号２１に記載、アミノ酸配列は配列番号２２に記載）と、Ｒ１０４ＥＫ１４１Ｅの変異を同時に有するＴＭ２（以下、「ＴＭ２ Ｄ４０ＮＲ１０４ＥＫ１４１Ｅ」、塩基配列は配列番号２３に記載、アミノ酸配列は配列番号２４に記載）を構築した。
３−２） ＰＣＲ、クローニング
ＨＡＬＵ ＴＭ２を構築するためのプライマーは、上述した各変異を導入する際に用いたものを使用した。また、ＰＣＲの条件やクローニングについても上述と同様の方法で実施した。
ＨＡＬＵ ＴＭ２を構築するためのプライマーは、上述した各変異を導入する際に用いたものを使用した。また、ＰＣＲの条件やクローニングについても上述と同様の方法で実施した。
ＴＭ２ Ｄ４０ＮＲ１０４Ｅをコードする遺伝子の構築は、ベクターＴＭ２ Ｄ４０Ｎ／ｐＴｒｃ９９Ａを鋳型として、プライマーＴｍ２ＮｔｅｒｍＰｃｉ とＴｍ２ Ｒ１０４Ｅ Ｒ、Ｔｍ２ Ｒ１０４Ｅ ＦとＴｍ２ＣｔｅｒｍＢａｍを用いて２度のＰＣＲ反応によって変異を導入し、ＴＭ２ Ｄ４０ＮＲ１０４Ｅタンパク発現用ベクターＴＭ２ Ｄ４０ＮＲ１０４Ｅ／ｐＴｒｃ９９Ａを完成させた。ＴＭ２ Ｄ４０ＮＲ１０４ＥＫ１４１Ｅをコードする遺伝子の構築は、ベクターＴＭ２ Ｄ４０ＮＲ１０４Ｅ／ｐＴｒｃ９９Ａを鋳型として、プライマーＴｍ２ＮｔｅｒｍＰｃｉ とＴｍ２ Ｋ１４１Ｅ Ｂａｍを用いて１度のＰＣＲ反応によって変異を導入し、ＴＭ２ Ｄ４０ＮＲ１０４ＥＫ１４１Ｅタンパク発現用のベクターＴＭ２ Ｄ４０ＮＲ１０４ＥＫ１４１Ｅ／ｐＴｒｃ９９Ａを完成させた。
３−３） ＨＡＬＵ ＴＭ２の大腸菌発現
各ＴＭ２変異体を挿入したｐＴｒｃ９９Ａベクターにより形質転換した大腸菌 ＴＢ１を、抗生物質アンピシリン（最終濃度１００μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ培地６ｍＬに接種し、ＯＤ６００における吸光度が０．５に達するまで３７℃、または２５℃で振とう培養した。その後、１ｍＭ ＩＰＴＧを添加し、さらに３７℃、または２５℃で一晩振とう培養した。培養液１ｍＬから遠心にて大腸菌を集菌し、２０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７）４００ｕＬ中に懸濁後、菌体を超音波により破砕した。破砕液を遠心（１５０００ｒｐｍ）し、その上清を可溶性画分とした。この可溶性画分について２×ＳＤＳ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒを等量混和し、９５℃で１０分間加熱後した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥでタンパク質を展開し、その後ＣＢＢ染色によってタンパク質の検出を行なった。
各ＴＭ２変異体を挿入したｐＴｒｃ９９Ａベクターにより形質転換した大腸菌 ＴＢ１を、抗生物質アンピシリン（最終濃度１００μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ培地６ｍＬに接種し、ＯＤ６００における吸光度が０．５に達するまで３７℃、または２５℃で振とう培養した。その後、１ｍＭ ＩＰＴＧを添加し、さらに３７℃、または２５℃で一晩振とう培養した。培養液１ｍＬから遠心にて大腸菌を集菌し、２０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７）４００ｕＬ中に懸濁後、菌体を超音波により破砕した。破砕液を遠心（１５０００ｒｐｍ）し、その上清を可溶性画分とした。この可溶性画分について２×ＳＤＳ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒを等量混和し、９５℃で１０分間加熱後した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥでタンパク質を展開し、その後ＣＢＢ染色によってタンパク質の検出を行なった。
その結果、ＴＭ２変異体を挿入したｐＴｒｃ９９Ａベクターで形質転換した大腸菌いずれにおいても、ＴＭ２変異体を挿入していないｐＴｒｃ９９Ａベクターで形質転換した大腸菌にはない１５．５ｋＤａ付近のバンドが検出された。これらのサイズは、ＴＭ２のアミノ酸配列から予測される単量体の分子量１５．５ｋＤａと一致した。続いて、低ｐＩ型ＴＭ２、高アフィニティ型ＴＭ２と同様に、非変性状態のＨＡＬＵ ＴＭ２が四量体を形成しているか否かをＢａｙｅｒ ｅｔ ａｌ. （１９９６，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ． １７（８） １３１９−２４）の方法に従って確認した。その結果、ＨＡＬＵ ＴＭ２も野生型ＴＭ２と同様のサイズにバンドが検出されたため、四量体を形成していることが明らかになった。また、培養液１Ｌ当たりの可溶性ＴＭ２変異体タンパク質の発現量は、ＴＭ２ Ｄ４０ＮＲ１０４Ｅは３７℃培養で２４ｍｇ、ＴＭ２ Ｄ４０ＮＲ１０４ＥＫ１４１Ｅは３７℃培養で１０ｍｇ、ＴＭ２ Ｄ４０ＮＲ１０４Ｅは２５℃培養で３２ｍｇであった。ＴＭ２ Ｄ４０ＮＲ１０４ＥＫ１４１Ｅは、宿主をＢＬ２１（ＤＥ３）に変更することによって２５℃培養で可溶性の発現量が４３ｍｇに増加した。
３−４） ＨＡＬＵ ＴＭ２の精製
ＨＡＬＵ ＴＭ２の精製は、上述の通りＨｏｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９８０）の方法に従って行なった。その結果、各ＴＭ２変異体の精製タンパク質量は、それぞれのタンパク質発現量と同程度であり、精製度は９０％以上であった。
ＨＡＬＵ ＴＭ２の精製は、上述の通りＨｏｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９８０）の方法に従って行なった。その結果、各ＴＭ２変異体の精製タンパク質量は、それぞれのタンパク質発現量と同程度であり、精製度は９０％以上であった。
３−５） 蛍光ビオチンによる活性測定
精製した各ＴＭ２変異体のビオチン結合能を、Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ， １４２７， ４４−４８（１９９９）の方法に従って確認した。その結果、全てのＨＡＬＵ ＴＭ２変異体溶液の添加量に比例して、蛍光強度が低下した。このことから、ＨＡＬＵ ＴＭ２変異体はビオチン様化合物と結合することが確認された。
精製した各ＴＭ２変異体のビオチン結合能を、Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ， １４２７， ４４−４８（１９９９）の方法に従って確認した。その結果、全てのＨＡＬＵ ＴＭ２変異体溶液の添加量に比例して、蛍光強度が低下した。このことから、ＨＡＬＵ ＴＭ２変異体はビオチン様化合物と結合することが確認された。
３−６） 等電点電気泳動
ＨＡＬＵ ＴＭ２の等電点を、ＸＣｅｌｌ ＳｕｒｅＬｏｃｋ Ｍｉｎｉ−Ｃｅｌｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた等電点電気泳動にて測定した。取り扱い説明書の記載に従い、各ＨＡＬＵ ＴＭ２ ４μｇを用い、ＣＢＢ染色によってバンドを検出した。結果を表９に示す。ＴＭ２ Ｄ４０Ｎの実測等電点は９．７であったが、Ｒ１０４Ｅの変異を加えることによって８．９まで下がり、さらにＫ１４１Ｅの変異を加えることによって７．３−７．５まで下がることが明らかになった。
ＨＡＬＵ ＴＭ２の等電点を、ＸＣｅｌｌ ＳｕｒｅＬｏｃｋ Ｍｉｎｉ−Ｃｅｌｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた等電点電気泳動にて測定した。取り扱い説明書の記載に従い、各ＨＡＬＵ ＴＭ２ ４μｇを用い、ＣＢＢ染色によってバンドを検出した。結果を表９に示す。ＴＭ２ Ｄ４０Ｎの実測等電点は９．７であったが、Ｒ１０４Ｅの変異を加えることによって８．９まで下がり、さらにＫ１４１Ｅの変異を加えることによって７．３−７．５まで下がることが明らかになった。
表９ ＨＡＬＵ ＴＭ２の等電点
Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００（Ｂｉａｃｏｒｅ社製）を用いて、高アフィニティ型ＴＭ２のビオチン結合試験を実施した。
リガンドに用いるビオチンＢＳＡは上述の２−７−２）の様に調製した。一方アナライトとして用いたＴＭ２もしくはＨＡＬＵ ＴＭ２は、常法に従い２−Ｉｍｉｎｏｂｉｏｔｉｎ ａｇａｒｏｓｅで精製し２０ＭＭ ＫＰｉ（ｐＨ ７）に一晩透析した。アナライトを１０ｍＭ 酢酸緩衝液 ｐＨ５（ＢＩＡｃｏｒｅ社製）に５０μｇ／ｍｌ程度になるように調整した。
リガンドの固定化、アナライトとの特異的相互作用の測定、及びその解析は、２−７−２）と同様に行った。その結果、ＴＭ２に比べＨＡＬＵ ＴＭ２は両者とも、ビオチンに対する結合速度定数（ｋａ）が上昇した。
また、ＴＭ２ Ｄ４０ＮＲ１０４ＥＫ１４１Ｅに関しては解離速度定数（ｋｄ）が低下し、よりビオチン結合能が向上していることが示された。
また、ＴＭ２ Ｄ４０ＮＲ１０４ＥＫ１４１Ｅに関しては解離速度定数（ｋｄ）が低下し、よりビオチン結合能が向上していることが示された。
表１０ 高アフィニティＴＭ２とビオチンの相互作用解析
０．２μｇ／μＬに調整したＴＭ２変異体を１０μＬ（２μｇ）ずつ室温、５０、６０、７０、８０、９０、９９℃で２０分間加熱した。続いて、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清の可溶性タンパク質を等量の２×ＳＤＳ サンプルバッファー（２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ６．８，２０％ ２−メルカプトエタノール，２０％ＳＤＳ，２０％グリセロール）と懸濁し、９５℃で１０分間加熱後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。タンパク質バンドはＣＢＢ染色によって検出した。Ｌａｓ−３０００（ＦＵＪＩＦＩＬＭ）を用いて定量マーカー（ＬＭＷ ＥＬＥＣＴＲＯＰＨＯＲＥＳＩＳ ＣＡＬＩＢＲＡＴＩＯＮ ＫＩＴ； Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）をもとに検量線を作成し、タンパク質バンドを定量化した。
その結果、Ｄ４０ＮＲ１０４Ｅの５０％のタンパク質が消失する温度は７８℃であった。一方、Ｄ４０ＮＲ１０４ＥＫ１４１Ｅは、９９℃加熱でも７８％のタンパク質が上清に残っていた。なお、５０％のタンパク質が消失する温度はＴＭ２において８７．５℃、ストレプトアビジンは７０℃であった。
３−９） ＨＡＬＵ ＴＭ２のヒト血清に対する非特異結合
本実施例では、ＨＡＬＵ ＴＭ２固定化磁性ビーズに対する血清タンパク質の非特異吸着性を調べた。
本実施例では、ＨＡＬＵ ＴＭ２固定化磁性ビーズに対する血清タンパク質の非特異吸着性を調べた。
磁性ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２７０ Ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ Ａｃｉｄ， Ｄｙｎａｌ社製）にＴＭ２ Ｄ４０ＮＲ１０４Ｅ、およびＴＭ２ Ｄ４０ＮＲ１０４ＥＫ１４１Ｅを、上述の１−９）の方法で共有結合させ、そのビーズに吸着するヒト血清タンパク質量を測定した。各ＨＡＬＵ ＴＭ２の固定化量が１０μｇ／１００μｌ ｂｅａｄｓになるように磁性ビーズを調製した。ヒト血清（ＣＨＥＭＩＣＯＮ社製）をＰＢＳ緩衝液で８００倍希釈し、ここに固定化タンパク質量を調整したＨＡＬＵ ＴＭ２磁性ビーズ ５０μｌを添加し、室温で１５分間転倒混和した。０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ緩衝液（ＰＢＳＴ） ５００μｌで４回洗浄後、０．５％ ＢＳＡを含むＰＢＳＴで５０００倍希釈したＨＲＰ標識マウス抗ヒトＩｇＧ抗体 １００μＬを添加し、室温で１５分間抗原抗体反応を行った。続いてＰＢＳＴ ５００μｌで５回洗浄後、１−Ｓｔｅｐ Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ １００μｌで発色させた。 ２Ｍ 硫酸 １００μｌで発色を停止させた後、磁石で磁性ビーズを回収し上清の４５０ｎｍにおける吸光度をＩｎｆｉｎｉｔｅ ２００にて測定した。
結果を図４に示す。図４に示される通り、ＴＭ２ Ｄ４０ＮＲ１０４Ｅ、ＴＭ２ Ｄ４０ＮＲ１０４ＥＫ１４１Ｅともに、野生型ＴＭ２磁性ビーズより低い値を示した。
３−１０） フィブロネクチンに対する非特異結合
ＨＡＬＵ ＴＭ２においても、実施例１の１−１０）と同様の方法でフィブロネクチンに対する非特異結合の実験を行なった。
ＨＡＬＵ ＴＭ２においても、実施例１の１−１０）と同様の方法でフィブロネクチンに対する非特異結合の実験を行なった。
その結果、ＴＭ２ Ｄ４０ＮＲ１０４ＥＫ１４１Ｅもフィブロネクチンに対する結合性が極めて低く、ＴＭ２と比較してフィブロネクチンに対する結合性が有意に低下した（図５）。低ｐＩ ＴＭ２の中で、フィブロネクチンとの結合抑制効果が最も表れるＴＭ２ Ｒ１０４ＥＫ１４１Ｅと比較して、Ｄ４０ＮＲ１０４ＥＫ１４１Ｅは同等であった。
この結果より、Ｄ４０Ｎ変異はＲ１０４ＥＫ１４１Ｅのフィブロネクチンとの結合に影響を与えないことが確認された。
３−１１） ＤＮＡに対する非特異結合
ＨＡＬＵ ＴＭ２のＤＮＡに対する非特異結合性を、実施例１の１−１１）の方法で解析した。その結果、１０μｇ ＤＮＡに対して野生型ＴＭ２は弱く結合したが、ＴＭ２ Ｄ４０ＮＲ１０４ＥＫ１４１Ｅは、ＴＭ２ Ｒ１０４ＥＫ１４１Ｅと同様に、検出限界以下であった（図６）。よって、Ｄ４０Ｎ変異はＤＮＡとの結合においても影響を与えないことが確認された。
ＨＡＬＵ ＴＭ２のＤＮＡに対する非特異結合性を、実施例１の１−１１）の方法で解析した。その結果、１０μｇ ＤＮＡに対して野生型ＴＭ２は弱く結合したが、ＴＭ２ Ｄ４０ＮＲ１０４ＥＫ１４１Ｅは、ＴＭ２ Ｒ１０４ＥＫ１４１Ｅと同様に、検出限界以下であった（図６）。よって、Ｄ４０Ｎ変異はＤＮＡとの結合においても影響を与えないことが確認された。
実施例３の結果に基づき、本発明の低非特異結合・高アフィニティ型ＴＭ２の特性を以下の表１１にまとめた。
表１１ 低非特異結合・高アフィニティ型ＴＭ２の特性のまとめ
Claims (15)
- 配列番号２に記載のアミノ酸配列、あるいはこの配列中に１から数個のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列、又はこの配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ビオチン結合活性を示すタンパク質において、以下のグループ
１）配列番号２の１０４番目のアルギニン残基；
２）配列番号２の１４１番目のリジン残基；
３）配列番号２の２６番目のリジン残基；及び
４）配列番号２の７３番目のリジン残基
から選択される１または複数の残基が、酸性アミノ酸残基又は中性アミノ酸残基に置換されていることを特徴とする、改変型ビオチン結合タンパク質。 - １）〜４）のいずれかのアミノ酸残基が、疎水性指標が２以下のアミノ酸残基に置換されている、請求項１に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。
- １）配列番号２の１０４番目のアルギニン残基、及び／又は、２）配列番号２の１４１番目のリジン残基が、酸性アミノ酸残基又は中性アミノ酸残基に置換されている、請求項１に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。
- １）配列番号２の１０４番目のアルギニン残基、及び／又は、２）配列番号２の１４１番目のリジン残基が、酸性アミノ酸残基に置換されている、請求項３に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。
- １）配列番号２の１０４番目のアルギニン残基、及び／又は、２）配列番号２の１４１番目のリジン残基が、グルタミン酸残基に置換されている、請求項３又は４に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。
- さらに、配列番号２の４０番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基に置換されている、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。
- 配列番号２において、１０４番目のアルギニン残基がグルタミン酸残基に置換されており、そして、１４１番目のリジン残基がグルタミン酸残基に置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（Ｒ１０４Ｅ−Ｋ１４１Ｅ）；
配列番号２において、４０番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基に置換されており、そして、１０４番目のアルギニン残基がグルタミン酸残基に置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（Ｄ４０Ｎ−Ｒ１０４Ｅ）；
配列番号２において、４０番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基に置換されており、そして、１４１番目のリジン残基がグルタミン酸残基に置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（Ｄ４０Ｎ−Ｋ１４１Ｅ）；並びに、
配列番号２において、４０番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基に置換されており、１０４番目のアルギニン残基がグルタミン酸残基に置換されており、そして、１４１番目のリジン残基がグルタミン酸残基に置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（Ｄ４０Ｎ−Ｒ１０４Ｅ−Ｋ１４１Ｅ）、
からなるグループから選択される、請求項１ないし６のいずれか１項に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。 - 以下のａ）−ｌ）
ａ）配列番号２の１４番目のアスパラギン残基は改変されていない、あるいはグルタミン又はアスパラギン酸に置換されている；
ｂ）配列番号２の１８番目のセリン残基は改変されていない、あるいはスレオニン又はチロシンに置換されている；
ｃ）配列番号２の３４番目のチロシン残基は改変されていない、あるいはセリン、スレオニン又はフェニルアラニンに置換されている；
ｄ）配列番号２の３６番目のセリン残基は改変されていない、あるいはスレオニン又はチロシンに置換されている；
ｅ）配列番号２の４０番目のアスパラギン酸残基は改変されていない、あるいはアスパラギンに置換されている；
ｆ）配列番号２の６９番目のトリプトファン残基は改変されていない；
ｇ）配列番号２の７６番目のセリン残基は改変されていない、あるいはスレオニン又はチロシンに置換されている；
ｈ）配列番号２の７８番目のスレオニン残基は改変されていない、あるいはセリン又はチロシンに置換されている；
ｉ）配列番号２の８０番目のトリプトファン残基は改変されていない；
ｊ）配列番号２の９６番目のトリプトファン残基は改変されていない；
ｋ）配列番号２の１０８番目のトリプトファン残基は改変されていない；
そして、
ｌ）配列番号２の１１６番目のアスパラギン酸残基は改変されていない、あるいはグルタミン酸又はアスパラギンに置換されている
の１ないし全ての条件を満たす、請求項１ないし７のいずれか１項に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。 - 配列番号２に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。
- 以下の性質
ｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質よりも、低い等電点を有する；
ｉｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質よりも、核酸及び／又はタンパク質に対する低い非特異的結合を示す；
ｉｉｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質よりも、低いフィブロネクチン結合性を示す；
ｉｖ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質よりも、高いビオチン結合性を示す；
の１ないし全部を満たす、請求項１ないし９のいずれか１項に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。 - 配列番号２に記載のアミノ酸配列、あるいはこの配列中に１から数個のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列、又はこの配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ビオチン結合活性を示すタンパク質において、配列番号２の４０番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基に置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質。
- 配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質よりも、高いビオチン結合性を示す、請求項１１に記載の改変型ビオチン結合タンパク質。
- 請求項１ないし１２のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする核酸。
- 請求項１３に記載の核酸を含む、ベクター。
- 請求項１ないし１４のいずれか１項に記載のタンパク質を固定化した担体。
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