CN102180833B - 依达拉奉二聚体及其互变异构体的制备方法及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属药物领域，具体涉及依达拉奉二聚体或其互变异构体的制备方法及其检测方法。其制备方法特征在于将依达拉奉溶于溶剂中，加入催化剂，加热，过滤，得到不溶物，洗涤，干燥即得。其检测方法在于采用高效液相色谱法。本发明的制备方法操作简便、起始原料易得，检测方法可用于依达拉奉原料及制剂样品中的依达拉奉二聚体的检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种依达拉奉二聚体3，3’-二甲基-1，1’-二苯基-1H，1’H-[4，4’-二吡唑]-5，5’二醇或其互变异构体3，3’-二甲基-1，1’-二苯基-1H，1’H-[4，4’-二吡唑]-5，5’(4H，4’H)-二酮的制备方法、及其检测方法。
背景技术
依达拉奉是由日本三菱东京制药株式会社开发，2001年6月在日本上市的一种脑保护剂(自由基清除剂)，其适应症为急性脑梗塞，主要用于改善急性脑梗塞所致的神经症状、日常生活活动能力和功能障碍。
依达拉奉的临床研究提示N-乙酰门冬氨酸(NAA)是特异性的存活神经细胞的标志，脑梗塞发病初期含量急剧减少。脑梗塞急性期患者给予依达拉奉，可抑制梗塞周围局部脑血流量的减少，使发病后第28天脑中NAA含量较甘油对照组明显升高。临床前研究提示，大鼠在缺血/缺血再灌注后静脉给予依达拉奉，可阻止脑水肿和脑梗塞的进展，并缓解所伴随的神经症状，抑制迟发性神经元死亡。机理研究提示，依达拉奉可清除自由基，抑制脂质过氧化，从而抑制脑细胞、血管内皮细胞、神经细胞的氧化损伤。目前依达拉奉在临床广泛应用。
式(I)所示的依达拉奉二聚体3，3’-二甲基-1，1’-二苯基-1H，1’H-[4，4’-二吡唑]-5，5’二醇(以下简称为依达拉奉二聚体)与式(II)所示的3，3’-二甲基-1，1’-二苯基-1H，1’H-[4，4’-二吡唑]-5，5’(4H，4’H)-二酮(以下简称为依达拉奉二聚体互变异构体)为依达拉奉二聚合物的烯醇式与酮式互变异构体，在一定条件下可相互转化，属于同一化合物的两种表示方式。
此前的文献有报道依达拉奉二聚体及其互变异构体的合成，比如文献Chemistry ofHeterocyclic Compounds(New York，NY，United States)(Transltion of KhimiyaGeterotsiklicheskikh Soedinenii)，39(11)，1478-1486；2003中报道以3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮为原料与3，6-二苯基-1，2，4-三嗪-4-氧化物反应来制备，但是该方法报道的反应物3，6-二苯基-1，2，4-三嗪-4-氧化物很难获得，市场上难以采购到，制备复杂。目前尚无文献报道以来源易得的依达拉奉(3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮)为原料进行制备。
另外，经过研究，我们发现，依达拉奉注射液在制备和长期存放过程中，会产生依达拉奉二聚体。该二聚体溶解性极差，在溶液中达到一定浓度即析出，所析出的二聚体结晶在制剂中形成不溶性微粒或可见异物，如果注射进入人体会造成严重不良反应，而事实是依达拉奉的注射液等制剂在制备过程中一般都要经过高温灭菌，而在灭菌过程中是较易产生二聚体的，这给药物的临床使用带来安全隐患，因此有必要对依达拉奉二聚体的限度进行控制。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种依达拉奉二聚体3，3’-二甲基-1，1’-二苯基-1H，1’H-[4，4’-二吡唑]-5，5’二醇(式I)或其互变异构体(式II)3，3’-二甲基-1，1’-二苯基-1H，1’H-[4，4’-二吡唑]-5，5’(4H，4’H)-二酮的制备方法。
具体而言，本发明所述的依达拉奉二聚体或其互变异构体的制备方法为：将依达拉奉与催化剂溶于溶剂中，加热一定时间后，过滤，得到不溶物，洗涤，干燥即得依达拉奉二聚体。
在本发明所述的依达拉奉二聚体或其互变异构体的制备方法中，所述溶剂为极性溶剂，选自水、C1～C4醇、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、乙腈或硝基甲烷的一种或多种；所述催化剂为钠盐，选自亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、硫代硫酸钠或硫酸钠的一种或多种，优选亚硫酸氢钠；在反应中加热的温度为60～150℃，优选80～120℃。
依达拉奉与所述的溶剂的比例为1∶5～1∶100(w/v)，催化剂的加入量为：1∶0.1～1∶2(依达拉奉：催化剂，w/w)，加热时间为5～72小时，所得固体分别以反应溶剂、水、甲醇、乙酸乙酯洗涤，过滤所用设备可随意选择。
在一个实施方案中，一种式I或式II的依达拉奉二聚体或其互变异构体的制备方法为：将依达拉奉与催化剂(选用硫代硫酸钠，用量为1∶0.8)，溶剂选用水，温度选用80-100℃，加热24～48小时，滤纸过滤，以水、甲醇、乙酸乙酯洗涤固体即得。
本发明的另一个目的是提供依达拉奉原料或制剂样品中所述依达拉奉二聚体的检测方法，具体检测步骤如下：HPLC法，色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶或八烷基硅烷键合硅胶、或六烷基硅烷键合硅胶为填充剂或采用氨基柱；流动相可以选择为：甲醇水系统、甲醇缓冲盐系统、乙腈缓冲盐系统等。配比为有机系统∶水系统＝30∶70～70∶30，流速0.5～2.0ml/min，检测波长为220至280nm。
其优选的含量测定方法：HPLC法，色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇-0.05mol/L磷酸二氢铵溶液(50∶50)(20％磷酸调pH3.5)为流动相，流速1.0ml/min，检测波长为245nm。理论板数以依达拉奉的色谱峰计算应不低于1000。取依达拉奉注射液适量，加流动相制成每1ml含0.18mg的溶液，作为供试品溶液。另精密称取依达拉奉二聚体适量，加甲醇溶解并稀释制成每1ml含1.8μg的溶液，作为二聚体对照品溶液。量取二聚体对照品溶液20μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使依达拉奉二聚体的峰高为满量程的20％～30％。再精密量取上述两种溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录供试品溶液色谱图至主成分峰保留时间的3.5倍。供试品溶液如有依达拉奉二聚体峰，不得大于对照溶液主峰峰面积0.1倍(0.1％)。
本发明的还一个目的是提供所述依达拉奉二聚体在依达拉奉制剂检测中的用途。
采用本制备方法可简便的实现依达拉奉及其制剂中可能存在的杂质——二聚体的制备，并可作为依达拉奉制剂检测方法中杂质对照品使用。本方法避免了使用已有文献报道的市场上难以采购获得，并且很难制备的反应物3，6-二苯基-1，2，4-三嗪-4-氧化物的使用。操作简便、起始原料易得，制备量完全可以满足作为依达拉奉制剂检测方法中杂质对照品使用的需要。曾尝试仅使用依达拉奉为原料，不加入催化剂，在各种极性溶剂中加热反应，均未能获得二聚体。依达拉奉二聚体产生的反应历程为自由基反应，催化剂(亚硫酸氢钠等)加入后，溶解在极性溶剂(水、甲醇等)中，并在加热的条件下促进了该反应，使制备获得了成功。
采用高效液相色谱法来控制依达拉奉注射液中的二聚体含量，能达到依达拉奉与其二聚体的完全分离，两者峰形较好，理论板数按依达拉奉计能达到2000以上；且对于二聚体的检测灵敏度较其他常规方法高，最低检测限能达到0.1ug/ml，在依达拉奉注射液制备与保存过程中能有效的监控其二聚体的产生与变化情况，为依达拉奉注射液的临床应用提供进一步的安全性保障。
具体实施方式
实施例仅对发明内容做进一步说明，并不限于实施例内容。
实施例1：依达拉奉二聚体的制备
称取依达拉奉5.0g，亚硫酸氢钠3.0g，溶于250ml水中，加热至100℃左右，保温搅拌24h，反应液中有红色固体逐渐析出，冷却至室温，普通滤纸过滤，固体以水、甲醇、乙酸乙酯各5ml分别洗涤，60℃真空干燥后，得浅褐色粉末0.2g。
结构确证：MS (ESI)：347[M+H]+，369[M+Na]+
1H NMR：11.49，s，2H(5-OH，5’-OH)；7.77，m，4H(11-H，7-H，11’-H，7’-H，J＝7.6)；7.46，t，4H(10-H，8-H，10’-H，8’-H，J＝7.6)；7.23，t，2H(9-H，9’-H，J＝7.6)；2.20，s，6H(3-CH3，3’-CH3)
实施例2：依达拉奉二聚体的制备
称取依达拉奉5.0g，亚硫酸氢钠0.5g，悬浮于500ml甲醇中，加热至65℃左右，保温搅拌72h，反应液中有红色固体逐渐析出，冷却至室温，过滤，固体以水、甲醇、乙酸乙酯分别洗涤，干燥后，得浅褐色粉末0.05g。
结构确证：MS(ESI)和1H NMR数据与实施例1相同。
实施例3：依达拉奉二聚体的制备
称取依达拉奉5.0g，硫代硫酸钠3.5g，悬浮于200ml乙醇中，加热至80℃左右，保温搅拌48h，反应液中有红色固体逐渐析出，冷却至室温，过滤，固体以乙醇、水、甲醇、乙酸乙酯各5ml分别洗涤，真空干燥后，得浅褐色粉末0.13g。
结构确证：MS(ESI)和1H NMR数据与实施例1相同。
实施例4：依达拉奉二聚体的制备
称取依达拉奉5.0g，亚硫酸氢钠3.0g，悬浮于250ml正丙醇中，加热至100℃左右，保温搅拌48h，反应液中有红色固体逐渐析出，冷却至室温，过滤，固体以正丙醇、水、甲醇、乙酸乙酯各5ml分别洗涤，真空干燥后，得浅褐色粉末0.18g。
结构确证：MS(ESI)和1HNMR数据与实施例1相同。
实施例5：依达拉奉二聚体的制备
称取依达拉奉5.0g，亚硫酸氢钠10g，悬浮于350ml正丁醇中，加热至120℃左右，保温搅拌48h，反应液中有红色固体逐渐析出，冷却至室温，过滤，固体以正丁醇、水、甲醇、乙酸乙酯各5ml分别洗涤，真空干燥后，得浅褐色粉末0.08g。
结构确证：MS(ESI)和1HNMR数据与实施例1相同。
实施例6：依达拉奉二聚体的制备
称取依达拉奉5.0g，亚硫酸氢钠3.0g，悬浮于30ml N，N-二甲基甲酰胺中，加热至150℃左右，保温搅拌36h，反应液中有红色固体逐渐析出，冷却至室温，过滤，固体以N，N-二甲基甲酰胺、水、甲醇、乙酸乙酯各5ml分别洗涤，真空干燥后，得浅褐色粉末0.06g。
结构确证：MS(ESI)和1H NMR数据与实施例1相同。
实施例7：依达拉奉二聚体的制备
称取依达拉奉5.0g，焦亚硫酸钠2.5g，悬浮于100ml乙腈中，加热至85℃左右，保温搅拌48h，反应液中有红色固体逐渐析出，冷却至室温，过滤，固体以乙腈、水、甲醇、乙酸乙酯分别洗涤，真空干燥后，得浅褐色粉末0.14g。
结构确证：MS(ESI)和1H NMR数据与实施例1相同。
实施例8：依达拉奉二聚体的制备
称取依达拉奉5.0g，硫酸钠0.8g，悬浮于25ml硝基甲烷中，加热至105℃左右，保温搅拌24h，反应液中有红色固体逐渐析出，冷却至室温，过滤，固体以硝基甲烷、水、甲醇、乙酸乙酯分别洗涤，真空干燥后，得浅褐色粉末0.16g。
结构确证：MS(ESI)和1H NMR数据与实施例1相同。
实施例9：依达拉奉二聚体的检测
检测方法：
系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇-0.05mol/L磷酸二氢铵溶液(50∶50)(20％磷酸调pH值为3.5)为流动相，流速1.0ml/min，检测波长为245nm。理论板数以依达拉奉的色谱峰计算应不低于1000。
测定方法取依达拉奉或其制剂适量，加流动相制成每1ml含180μg的溶液，作为供试品溶液。精密量取供试品溶液适量，用流动相稀释制成每1ml含1.8μg的溶液，作为对照溶液(1)。另精密称取依达拉奉二聚体对照品(比如，实施例1制备的)适量，加甲醇溶解并定量稀释制成每1ml含1.8μg的溶液作为二聚体对照品溶液(2)。取对照溶液(1)20μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成份峰的峰高为满量程的20％～25％；再精密量取上述三种溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录供试品溶液色谱图至主成分峰保留时间的3.5倍。供试品溶液的色谱图中如显依达拉奉二聚体峰，不得大于对照溶液(1)的主峰面积的0.1倍(0.1％)。
实施例10：依达拉奉二聚体的检测
检测方法：
系统适用性试验：碳八色谱柱，以甲醇-0.05mol/L磷酸二氢铵溶液(50∶50)(20％磷酸调pH值为3.5)为流动相，流速1.0ml/min，检测波长为265nm。测定方法同实施例9
实施例11：依达拉奉二聚体的检测
检测方法：
系统适用性试验：碳十八色谱柱，以甲醇-0.02mol/L磷酸二氢钾溶液(70∶30)(20％磷酸调pH值为3.0)为流动相，流速2.0ml/min，检测波长为280nm。测定方法同实施例9。
实施例12：依达拉奉二聚体的检测
检测方法：
系统适用性试验：碳六色谱柱，以乙腈-0.02mol/L磷酸二氢钾溶液(30∶70)(20％磷酸调pH值为3.0)为流动相，流速0.5ml/min，检测波长为220nm。测定方法同实施例9。
实施例13：依达拉奉二聚体的检测
检测方法：
系统适用性试验：氨基柱，以乙腈-水(50∶50)(20％磷酸调pH值为3.0)为流动相，流速1ml/min，检测波长为220nm。测定方法同实施例12。
Claims (9)
1.依达拉奉二聚体或其互变异构体的制备方法，其特征在于将依达拉奉溶于溶剂中，加入催化剂，加热，过滤，得到不溶物，洗涤，干燥即得；所述的溶剂为极性溶剂；所述的催化剂为钠盐，选自亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、硫代硫酸钠或硫酸钠中的一种或多种。
2.权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的溶剂选自水、C1～C4醇、N，N-二甲基甲酰胺、乙腈或硝基甲烷中的一种或多种。
3.权利要求1所述的制备方法，其特征在于依达拉奉与所述的溶剂的比例为1∶5～1∶100(w/v)。
4.权利要求1所述的制备方法，其特征在于依达拉奉与催化剂催化剂的比例为1∶0.1～1∶2(w/w)。
5.权利要求1-5所述的制备方法，其特征在于加热的温度为60～150℃，加热时间为5～72小时。
6.权利要求5所述的制备方法，其特征在于加热的温度为80～120℃。
7.权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的洗涤是以反应溶剂、水、甲醇、乙酸乙酯分别清洗。
8.依达拉奉二聚体在依达拉奉原料或制剂样品中的检测方法，其特征在于：采用高效液相色谱，色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶、八烷基硅烷键合硅胶或六烷基硅烷键合硅胶为填充剂或采用氨基柱；流动相可以选择为：甲醇水系统、甲醇缓冲盐系统、乙腈缓冲盐系统；流动相配比为有机系统：水系统＝30∶70～70∶30，流速0.5～2.0ml/min，检测波长为220至280nm。
9.如权利要求8所述的检测方法，其特征在于采用高效液相色谱，色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇-0.05mol/L磷酸二氢铵溶液按50∶50混合后用20％磷酸调pH为3.5的溶液为流动相，流速1.0ml/min，检测波长为245nm；理论板数以依达拉奉的色谱峰计算应不低于1000；取依达拉奉注射液适量，加流动相制成每1ml含0.18mg的溶液，作为供试品溶液；另精密称取依达拉奉二聚体适量，加甲醇溶解并稀释制成每1ml含1.8μg的溶液，作为二聚体对照品溶液；量取二聚体对照品溶液20μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使依达拉奉二聚体的峰高为满量程的20％～30％；再精密量取上述两种溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录供试品溶液色谱图至主成分峰保留时间的3.5倍；供试品溶液如有依达拉奉二聚体峰，不得大于对照溶液主峰峰面积0.1倍。
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Inventor after: Li Zhan Inventor after: Chu Gang Inventor after: Zeng Ying Inventor after: Zhu Lijun Inventor after: Ye Hai Inventor after: Huang Haiyan Inventor after: Li Wei Inventor after: Chao Yang Inventor after: Yu Lili Inventor before: Li Zhan Inventor before: Chu Gang Inventor before: Zeng Ying Inventor before: Zhu Lijun Inventor before: Ye Hai Inventor before: Huang Haiyan Inventor before: Li Wei Inventor before: Chao Yang Inventor before: Yu Lili |