CN102178955A - 一种变应原溶媒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种变应原溶媒及其制备方法，该变应原溶媒含有以下成分：人血白蛋白、氯化钠、苯酚和磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液。本发明提供的变应原溶媒稀释配制的变应原产品比较稳定，活性蛋白不容易发生变性或被吸附，提高了变应原疫苗使用的有效性。

Description

一种变应原溶媒及其制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种变应原溶媒及其制备方法。

背景技术

随着全球气候和人类生存环境的变化，过敏性疾病呈逐年上升的趋势。2010年WHO把变态反应性疾病定义为世界上第四类最重要的慢性疾病。

自从1911年Noon和Freeman首次用花粉提取液来治疗花粉热以来，变应原特异性脱敏治疗已有100多年的历史。在这一百年中，治疗用的变应原产品经历了一系列的技术变革。从最初的变应原粗浸液到标准化的变应原疫苗(包括修饰变应原、基因重组变应原等，以及不同的给药方式如舌下滴剂、片剂等)。

最初用于变态反应性疾病治疗的是变应原粗浸液，即将引起变态反应性疾病的变应原原料用缓冲液浸取，经过除杂、除菌过滤后直接用于特异性免疫治疗。粗浸液通常用投料比(原料重量/缓冲液体积)或总蛋白氮标示。但是这两种标定方法与变应原疫苗总生物活性的线性相关并不明显，导致变应原疫苗各批次之间差异性也很大。

在上世纪70年代。欧洲和美国相继开始了标准化变应原疫苗的研究和制备。标准化变应原疫苗利用体内和体外实验测定变应原疫苗的总生物活性，建立内部参考品体系，从蛋白组分、总蛋白含量、主要致敏蛋白含量、总生物活性等几方面对变应原疫苗的生产进行全面分析和质量控制。标准化的变应原疫苗各生产批次之间的差异性很小，大大的减少了医生用药的风险。同时，各国变态反应学界也在研究修饰后的变应原疫苗(也叫类变应原疫苗)以及基因重组变应原疫苗。修饰变应原分为物理修饰和化学修饰。物理修饰主要指含佐剂的疫苗，包括氢氧化铝佐剂疫苗、磷酸铝佐剂疫苗、吸附到酪氨酸上的疫苗。化学修饰的变应原疫苗主要包括甲醛、戊二醛、盐酸处理后的变应原疫苗。基因重组的变应原疫苗目前仍处于研究阶段，未得到广泛应用。

上世纪90年代起，欧洲开始研发用于免疫治疗的舌下给药剂型如滴剂和片剂等。但是目前为止最常用的特异性脱敏治疗方法仍然以皮下注射为主。

变应原溶媒主要用于使用变应原浸液的注射脱敏治疗中：用变应原溶媒将变应原浸液或标准化的变应原疫苗稀释成梯度系列后，通过皮试确定合适的起始最低剂量，然后从最低剂量开始逐级递增给药剂量直到增加到维持剂量并维持注射一段时间后完成整个疗程。目前全世界的变态反应特异性脱敏治疗主要采用这种方法。由于稀释梯度的范围极广(可达1012倍)，合适的变应原溶媒在治疗过程中是必不可少的。美国市场上90％以上产品都需要医生用变应原溶媒配制成合适浓度后给药。

近几年来，变应原疫苗生产企业正在研究开发变应原疫苗的冻干制剂。变应原疫苗的冻干制剂相对液体变应原疫苗较稳定，降低了变应原疫苗运输和储存的困难。变应原疫苗的冻干制剂在使用时也需要用变应原溶媒溶解后使用，所以开发一种稳定性的变应原溶媒具有广泛的应用前景。

目前在中国市场的变应原溶媒的主要成分为含有苯酚的盐溶液，名称为变应原溶媒(Solvent of Allergen)，又称抗原溶媒，主要成分为：每9ml含氯化钠81mg；苯酚18mg，主要用于支气管哮喘、过敏性鼻炎、花粉症等速发型过敏性疾病配制脱敏注射用。

变应原疫苗在使用时可能需要以非常高的稀释比例稀释。高稀释度时变应原疫苗有效活性蛋白浓度很低，此条件下蛋白稳定性差且容易因容器的吸附或者苯酚引起的变性而损失。

人血白蛋白作为一种蛋白稳定剂，被广泛用于疫苗和蛋白质药物，是一种安全和有效的蛋白稳定剂。现有国外上市的变应原溶媒有两种：

其一由0.9g/100ml氯化钠、0.03g/100ml人血白蛋白、0.4g/100ml苯酚组成；

其二由0.8g/100ml氯化钠、0.03g/100ml、0.02g/ml氯化钾、0.12g/ml磷酸氢二钠、0.02g/100ml磷酸二氢钾组成；

以上两种国外上市的变应原溶媒，第一种变应原溶媒不含有缓冲液组分，在变应原疫苗贮存的过程中不能提供一种稳定的pH环境；第二种变应原溶媒缓冲体系是国际上一种标准的PBS缓冲液(8g/100ml氯化钠、0.02g/100ml氯化钾、0.12g/100ml磷酸氢二钠、0.02g/100ml磷酸二氢钾)，PBS缓冲体系是上世纪80年代广泛用于生物医药行业的一种缓冲液，但是由于该缓冲液含有钾离子，逐渐被取代。

因此需要提供一种可以避免其稳定性、避免使用钾离子的变应原溶媒。

发明内容

本发明提供了一种相对稳定的pH环境，改善了稀释后的稳定性，提高了变应原疫苗使用时的有效性的变应原溶媒。

本发明的另外一个目是提供变应原溶媒的制备方法。

本发明提供的一种变应原溶媒，含有以下成分：人血白蛋白、氯化钠、苯酚和磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液。

优选地，本发明提供的变应原溶媒，含有以下成分：0.01-1g/100ml人血白蛋白、0.5-1g/100ml氯化钠、0.2-0.5g/100ml苯酚和2mM-100mM磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液，pH5.5-8.5。

进一步优选地，本发明提供的一种变应原溶媒，含有以下重量比的活性成分：0.03g/100ml人血白蛋白、0.5g/100ml氯化钠、0.4g/100ml苯酚、50mM磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液，pH6.0-8.0。

所述人血红白蛋白的为人注射用人血白蛋白制剂。

本发明还提供了制备该变应原溶媒的方法，包括以下步骤：

1)氯化钠溶液和苯酚溶液的配制；

2)用活性炭脱色和除热源；

3)过滤除去炭颗粒；

4)在炭脱色和除热原后的氯化钠溶液中，加入人血白蛋白；

5)除菌过滤；

具体的，本发明提供的变应原溶媒的制备方法，包括以下步骤：

1)将氯化钠和苯酚用30-100℃的注射用水溶解，全部溶解后，用30-60℃的注射用水定容，备用；

2)加入0.2-2％的针用活性炭，30-60℃搅拌30-60min，除去溶液中的热原，并脱色；

3)用0.22μm-1μm的滤膜或钛棒过滤，除去炭颗粒，脱炭后的盐溶液用30-60℃注射用水定容；加入0.05％针用活性炭，60℃搅拌吸附30分钟，用0.22μm-1μm的滤膜或钛棒过滤，除去活性炭；4)在除去碳颗粒后的氯化钠溶液中加入人血白蛋白搅拌混匀，用注射用水定容；

5)混匀的溶液经0.45μm膜或滤芯过滤，再经0.22μm膜或滤芯除菌过滤，然后无菌分装。

本发明所述mM为毫摩尔每升；所述针用活性炭中的“％”为g/100ml。

本发明还提供了变应原溶媒在制备治疗变态反应性疾病的药物中的应用。

与目前市场的变应原溶媒相比，本发明提供的变应原溶媒具有以下优势：

1)主要成分中含有人血白蛋白，含有人血白蛋白的变应原溶媒可以保持稀释后低浓度变应原活性成分的稳定性，提高了变应原疫苗原液使用的有效性；

2)原国外上市的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲系统，本发明提供的变应原溶媒中，含有磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，保障变应原活性成分处于一个相对稳定的pH环境，可以提高变应原活性成分的稳定性，本发明的变应原的溶媒缓冲液为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，不含有钾盐，因为钾盐在临床上使用，能使病人增加疼痛的感觉，所以本发明的变应原溶媒使用磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲体系相对其它缓冲液体系安全有效；

3)本发明利用浓配稀释法，相对传统工艺，将针用活性炭由一次加入药液吸附改为二次加入药液吸附，控制活性炭吸附作用的温度，大大提高成品的澄明度；

4)治疗变态反应性疾病的应用方面：

变态反应性疾病的治疗是将变应原原液用溶媒稀释，形成10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5------等10倍系列梯度，根据皮试结果，从最小浓度开始注射直到维持剂量；

现市售的变应原溶媒，主要成分为0.9％氯化钠、0.2％苯酚，在变应原原液10倍系列稀释的过程中，较小浓度的产品蛋白变性快，实际效价和理论效价差异性大，整个治疗过程不能保证有效；

与现市售的变应原溶媒相比，本发明的变应原溶媒含有人血白蛋白和缓冲液组分，在系列稀释梯度的产品中，蛋白含量较小的产品比较稳定，在稀释后，实际的效价和理论上的效价差异不大，能保证有效稳定的治疗效果。

附图说明

图1：变应原溶媒的制备流程图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

人血白蛋白购自武汉生物制品研究所，规格为20％(10g:50ml)，在此只是为了说明本发明，不应该用来限制本发明的范围。

实施例1：变应原溶媒

1、组成：50mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、0.5g/100ml氯化钠、0.4g/100ml苯酚、0.03g/100ml人血白蛋白，pH8.0，该注射液的规格是1.8ml/瓶。

2、制备方法(如图1流程图所示)

1)称取99.23g磷酸氢二钠(0.699mol)、6.12g磷酸二氢钠(0.051mol)、75g氯化钠和60g苯酚，用2L 60℃注射用水溶解，用60℃注射用水定容至8L，备用；

2)当温度降至30℃时，加入0.2％针用活性炭，30℃搅拌30分钟；

3)使用1μm钛棒将溶液过滤，除去炭颗粒，脱炭后的盐溶液用60℃注射水定容至14.5L，加入0.05％针用活性炭，60℃搅拌吸附30分钟，用0.8μm膜过滤，除去活性炭；

4)在除去炭的盐溶液中加入22.5ml 20％的人血白蛋白搅拌混匀，用注射用水定容至15L，经0.45μm滤柱过滤，再经0.22μm滤柱过滤除菌，无菌分装，压塞，扎盖。

3、各项检定指标如下：内毒素、无菌检查、成品合格率检查。

具体检测方法参照：

1)内毒素含量的检测方法：凝胶限度试验(见2010药典三部附录XIIE)；

2)无菌检查：见2010药典三部附录XIIA；

3)成品合格率检查：成品经灯检，瓶子、瓶盖有破损处，瓶内有可见异物为不合格产品；

4)成品合格率＝合格成品/成品总数。

检测结果表1：

表1：

实施例2：变应原溶媒

1、组成：50mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、0.5g/100ml氯化钠、0.4g/100ml苯酚、0.03g/100ml人血白蛋白，pH7.0，注射液的规格是1.8ml/瓶。

2、制备方法：

1)称取72.85g磷酸氢二钠(0.512mol)、28.44g磷酸二氢钠(0.237mol)、75g氯化钠、60g苯酚，用2L 60℃注射用水溶解，用60℃注射用水定容至8L；

2)当温度降至30℃时，加入0.2％的针用活性炭，30℃搅拌30分钟；

3)将溶液用1μm钛棒过滤，除去炭颗粒，脱炭后的盐溶液用60℃注射水定容至14.5L；加入0.05％针用活性炭，60℃搅拌吸附30分钟，用0.8μm膜过滤，除去活性炭；

4)在除去炭颗粒后的盐溶液中加入22.5ml20％的人血白蛋白搅拌混匀，用注射用水定容至15L，经0.45μm滤柱过滤，再经0.22μm滤柱过滤除菌，无菌分装，压塞，扎盖。

3、各项检定指标表2(方法同实施例1)：

表2：

实施例3：变应原溶媒

1、组成：50mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、0.5％氯化钠、0.4％苯酚、0.03％人血白蛋白，PH6.0，规格为1.8ml/瓶。

2、制备方法：

1)称取18.96g磷酸氢二钠(0.134mol)、73.98g磷酸二氢钠(0.616mol)、75g氯化钠、和60g苯酚，用2L 60℃注射用水溶解，用60℃注射用水定容至8L；

2)当温度降至30℃时，加入0.2％针用活性炭，30℃搅拌30分钟；

3)然后使用1μm钛棒将溶液过滤除去碳颗粒，脱碳后的盐溶液用60℃注射水定容至14.5L；加入0.05％针用活性炭，60℃搅拌吸附30分钟，用0.8μm膜过滤，除去活性炭；

4)加入22.5ml 20％人血白蛋白搅拌混匀，用注射用水定容至15L，经0.45μm滤柱过滤，再经0.22μm滤柱过滤除菌，无菌分装，压塞，扎盖。

3、各项检定指标表4(具体方法同实施例1)：

表3：

实施例4：稳定性考察

对实例1-3和市售的变应原溶媒在2-8℃储藏条件下，稳定性考察12个月，以性状、内毒素含量、无菌为考察指标，方法如同实例1，其中市售的变应原溶媒(山西恒大制药)，活性成分为0.9％氯化钠、0.2％苯酚。

结果如下：

表5：稳定性考察

上述试验结果表明：实例1-3制备的变应原溶媒和市售的变应原溶媒在2-8℃条件下保存，分别在3月、6月、12月取样检查各项考核指标，均符合规定。说明本专利发明的变应原溶媒在2-8℃条件下贮存，性状稳定。市售变应原溶媒本身稳定性没有问题，问题是用它配置的变应原制剂稳定性不好。

实施例5：缓冲液在变应原溶媒中的作用

按本发明工艺制备一批不含缓冲液的变应原溶媒5L，

1、实验方法：

用本发明实施例2提供的变应原溶媒，采用不含缓冲液的实施例2作为对比例(配方：0.03g/100ml人血白蛋白、0.9g/100ml氯化钠、0.4g/100ml苯酚，用6M盐酸调节pH为7.0，规格为1.8ml/每瓶。)，将20000AU户尘螨变应原冻干制剂溶解，浓度为20000AU/ml，用本发明的变应原溶媒和市售的变应原溶媒稀释户尘螨变应原制剂形成10^-1、10^-2、10^-3、10^-4五个梯度。活性依次为2000AU/ml、200AU/ml、20AU/ml、2AU/ml。

2、具体操作方法：是从上一个浓度的制剂中，用1ml注射器吸取0.2ml药液转移到1.8ml溶媒中，形成一个新的梯度。将用两种溶媒制备的五个提取制剂分别置于2-8℃条件下，于0天、10天、1月、2月、3月、6月测量pH，用pH计测量pH。

表6：实施例2配制的变应原溶媒配制的户尘螨变应原制剂

表7：对比例(即不含缓冲液的实施例2)配制的户尘螨变应原制剂

通过以上实验知：用实例2制备的变应原溶媒稀配的户尘螨变应原疫苗在贮存6个月中，pH变化不明显(P＞0.05)；而用实例6制备的变应原溶媒的变应原溶媒稀配的户尘螨变应原疫苗在贮存6个月中，pH变化明显(P＜0.05)。pH变化是变应原疫苗活性损失一个主要原因，本发明的变应原溶媒含有缓冲液，可以为变应原疫苗提供一个稳定pH环境，稳定变应原活性成分的活性。

实施例6：在变态反应性疾病方面的应用

1、实验方法：用本发明实施例1-3提供的变应原溶媒、国内市售的变应原溶媒(山西恒大制药生产，活性成分为0.9％氯化钠、0.2％苯酚)、国外上市变应原溶媒A(成分：9g/100ml氯化钠、0.03g/100ml人血白蛋白、0.4g/100ml苯酚)和国外上市变应原溶媒B(0.8g/100ml氯化钠、0.03g/100ml、0.02g/ml氯化钾、0.12g/ml磷酸氢二钠、0.02g/100ml磷酸二氢钾)将20000AU户尘螨变应原冻干制剂溶解，浓度为20000AU/ml，用本发明的变应原溶媒和市售的变应原溶媒稀释户尘螨变应原制剂形成10^-1、10^-2、10^-3、10^-4五个梯度。活性依次为2000AU/ml、200AU/ml、20AU/ml、2AU/ml。

2、具体操作方法：是从上一个浓度的制剂中，用1ml注射器吸取0.2ml药液转移到1.8ml溶媒中，形成一个新的梯度。将用两种溶媒制备的五个提取制剂分别置于2-8℃条件下，于0天、10天、1月、2月、3月、6月考察活性，其中活性的检测方法是用免疫荧光竞争抑制法。

3、结果见表8-13所示：

表8：市售的变应原溶媒配制的户尘螨变应原制剂

表9：实施例1配制的变应原溶媒配制的户尘螨变应原制剂

表10：实施例2配制的变应原溶媒配制的户尘螨变应原制剂

表11：实施例3配制的变应原溶媒配制的户尘螨变应原制剂

表12：国外上市变应原溶媒A配制的户尘螨变应原制剂

表13：国外上市变应原溶媒B配制的户尘螨变应原制剂

本实验模拟变应原临床使用的过程，用国内外市售变应原溶媒和本发明的变应原溶媒去溶解和稀释注射用户尘螨变应原，配制20000AU/ml、2000AU/ml、200AU/ml、20AU/ml、2AU/ml五个梯度，分别在各个时间段考察其活性：

活性变化：国内市售的变应原溶媒配制的20000AU/ml户尘螨变应原，放置6月，活性损失比较大；本发明的变应原溶媒和国外上市变应原溶媒B配制的户尘螨变应原制剂活性在放置6月活性变化不大，而国外上市变应原溶媒A配制的户尘螨变应原制剂活性在前3月活性值预期理论值和实际测量值相差不大，存放6月时，活性下降明显。

国内市售的变应原溶媒配制的200AU/ml、20AU/ml、2AU/ml户尘螨变应原，实际测量活性和预期理论活性值相差较大(P＜0.05)，而本发明的变应原溶媒和国外上市变应原溶媒配制的系列梯度户尘螨变应原注射液，实际测量活性和预期理论活性值差异性不大(P＞0.05)。

原因在于，国内市场上的变应原溶媒不含有人血白蛋白，而本发明的变应原溶媒含有人血白蛋白，人血白蛋白作为一种蛋白稳定剂，相比国外上市变应原溶媒A，配以磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液体系，不仅提高了变应原的稳定性，而且还提高了变应原治疗的有效性。

与国外上市的变应原溶媒B相比，钾盐相在临床上使用时给患者增加疼痛，本发明的变应原溶媒中缓冲液成分简单，并且不含钾盐，。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.一种变应原溶媒，其特征在于，该变应原溶媒含有以下成分：人血白蛋白、氯化钠、苯酚和磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液。

2.根据权利要求1所述的变应原溶媒，其特征在于，该溶媒含有以下成分：0.01-1g/100ml人血白蛋白、0.5-1g/100ml氯化钠、0.2-0.5g/100ml苯酚和2-100mM的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液，pH为5.5-8.5。

3.根据权利要求1或2所述的变应原溶媒，其特征在于，该溶媒含有以下成分：0.03g/100ml人血白蛋白、0.5g/100ml的氯化钠、0.4g/100ml苯酚、50mM磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液，pH为5.5-8.5。

4.根据权利要求1或2所述的变应原溶媒，其特征在于，所述pH为6.0-8.0。

5.一种制备权利要求1-4任一项所述的变应原溶媒的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)盐溶液和苯酚溶液的配制；

2)用活性炭脱色和除热原；

3)过滤除去炭颗粒；

4)在炭脱色和除热原后的盐溶液中，加入人血白蛋白。

5)除菌过滤。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将盐和苯酚用30-100℃的注射用水溶解，全部溶解后，用30-60℃的注射用水定容，备用；

2)加入0.2％-2％的针用活性炭，30-60℃搅拌30-60min，除去溶液中的热原，并脱色；

3)用0.22μm-1μm的滤膜或钛棒过滤，除去炭颗粒，脱炭后的盐溶液用30-60℃注射用水定容；加入0.05％针用活性炭，60℃搅拌吸附30分钟，用0.22μm-1μm的滤膜或钛棒过滤，除去活性炭；

4)在除去炭颗粒后的盐溶液中加入0.01％-1％的人血白蛋白搅拌混匀，用注射用水定容；

5)混匀的溶液经0.45μm膜或滤芯过滤，再经0.22μm膜或滤芯除菌过滤，然后无菌分装。

7.权利要求1-4任一项所述的变应原溶媒在制备治疗变态反应性疾病的药物中的应用。

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