CN102171570A - 用于检测癌的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于检测癌的方法，其包括测定从生物体分离的样本中与抗CAPRIN-1蛋白抗体通过抗原抗体反应具有结合反应性的多肽的表达，其中所述的CAPRIN-1蛋白包含序列表中偶数编号的SEQID NO：2-30所示的任一氨基酸序列。也公开了用于检测癌的试剂，其包含CAPRIN-1蛋白或其片段、抗CAPRIN-1蛋白或其片段的抗体、或编码CAPRIN-1蛋白或其片段的多核苷酸。
Description
技术领域
本发明涉及应用CAPRIN-1作为肿瘤标记物的癌的检测方法。
背景技术
癌是死亡的主要原因。目前对癌进行的治疗主要是以手术疗法为主、组合使用放射疗法和化学疗法的对症疗法。目前随着医疗技术的进步，如果能够早期检测的话则癌几乎是可治愈的疾病。因此，需要一种无需癌患者付出太多体力或经济负担的，能够使用血清或尿等简便地进行检查的癌的检测方法。
作为使用血液或尿的癌诊断方法，测定肿瘤标记物等肿瘤生产物的方法目前已变得很普及。所谓肿瘤生产物是指与肿瘤相关的抗原、酶、特定蛋白质、代谢产物、肿瘤基因、肿瘤基因产物及肿瘤抑制基因等，癌胚抗原CEA、糖蛋白质CA19-9、CA125、前列腺特异抗原PSA、在甲状腺中产生的肽类激素降钙素等在一些癌类型中作为肿瘤标记物被用于癌诊断。但是在多种癌中，不存在对癌诊断有用的肿瘤标记物。另外，目前所知的大部分肿瘤标记物仅以痕量(约为pg/mL级程度)存于体液中。所以为了检测此类标记物需要高灵敏度的测定方法或特殊的技术。在这种现状中，预期提供能够以简便操作方法高灵敏度地检测各种癌类型的新型癌检查方法，从而产生用于各种癌的诊断用途。
另外，如果不仅能够检测癌，还能够对在肉眼看不见的部分产生的癌进行诊断、进行癌的程度诊断、癌的恶性程度或术后追踪诊断、复发诊断、转移诊断等，那么将非常有用。
具体而言，如果能够对在肉眼看不见的部位产生的癌进行诊断，则对腹腔内等不易察觉部位的癌的早期检测来说有用。另外，可检测对尚未达到肉眼能确认程度的大小的肿瘤的情形下，即使通过超声波检查、CT(计算机化断层显像)或MRI(核磁共振成像)也不能发现的癌。
另外，基于肿瘤在原发部位的扩散程度以及向局部淋巴结、远位器官的转移的有无来分类癌的进展程度。通常，有5个疾病阶段(每一个称为“阶段”)，阶段数字越大表明癌的更晚期。严格来说，阶段的定义根据器官而不同。然而，例如病期0的癌是指存留在上皮内的癌，病期IV是指远位转移的癌。在发现了这种癌程度的情况下，可以决定适合的治疗方针，以及诊断抗癌剂治疗效果。作为决定治疗方针的具体例子，在前列腺癌等的情况下，存在无需治疗的类型，因为它们恶性程度非常低并且基本不发展。反之，也存在需要治疗的类型，因为它们是引起向骨等转移、伴随疼痛直至患者死亡的进行性癌。诸如激素疗法及摘除手术等的治疗分别伴随着副作用。因此，需要适当判断并决定治疗方法。另外，如果能够适当地判断抗癌剂的选择是否适合，或适当地判断结束施与抗癌剂的时机等，则还可以减轻患者体力上、经济上的负担。因此，能够诊断癌进展程度是重要的。
癌细胞的特征之一是它们进行幼化，即去分化。除去一部分癌类型，低分化或者未分化等分化度低的癌细胞在转移后迅速生长并且导致治疗预后不良。我们说这种癌的恶性程度高。相反，具有高分化度的高分化的癌细胞中保留受影响器官的结构和功能性质。可以说此类癌具有相对低的恶性程度。如果能明确这种癌的恶性程度，则可以采取以下考量。即使肿瘤小，但如果恶性程度高，则在摘除肿瘤时可以确保多些边缘。此外，在关注周围组织的较大范围时能进行追踪观察。
如果能够进行包括复发和转移的术后追踪，则可以诊断能否通过手术完全摘除肿瘤。未完全肿瘤摘除时很可能引起复发。因此，此类诊断可以提供以短的间隔更仔细地进行追踪观察、或需要时尽早再次进行手术的标准。另外，如果复发的话，能够早期发现的可能性也高。在远位转移发生时发现往往检测已晚。然而，如果能够进行转移诊断，则可能提供将检查范围扩大至除摘除部位及其周边之外区域的标准。
已知犬比人变老快7倍。最近，陪伴动物通常作为家族的一员被饲养，并且具有与饲养人相同的生活习惯。因此，当其陪伴动物患癌时，可以预测饲养人将来患癌的危险性高。如果能够简便且正确对陪伴动物进行癌诊断，则期待能提供预防饲养人患癌的线索。
现在，据说犬的饲养数在日本约为6,700,000只，另外美国约为17,640,000只。除接种狂犬病育苗之外通常接种5种、7种、8种等混合疫苗也较为普及，因此致死率高的感染症已经减少，诸如犬细小病毒感染、犬瘟热病毒感染、犬副流感(犬舍咳)、犬腺病毒II型感染症(犬舍咳)、犬传染性肝炎、犬冠状病毒感染以及钩端螺旋体病等。因此，犬的平均寿命延长。7岁以上的高龄犬占全部饲养狗数的35.5％。家犬死亡原因也与人的那些相同，诸如持续增加的癌、高血压和心脏病。在美国1年间约有4,000,000只犬被诊断为癌。日本也有约1,600,000只潜在患有某种肿瘤的犬。
但是，目前为止没有简便的动物用癌诊断药。此外，动物医疗中还未普及利用X射线、CT扫描、MRI进行摄影或照相等的检查方法。触诊后，进行简单的血液检查和利用X射线照相的检查，诊断目前主要依赖于兽医经验。虽然使用血清的检查方法也已经部分地进行，但由于还未发现犬的肿瘤标记物所以该方法使用人的肿瘤标记物。
正确的癌诊断需要开腹手术，其给犬带来很大的体力负担、给饲养人带来费用负担。如果能够简便地进行犬及猫等陪伴动物的癌诊断，则能早期检测或正确诊断癌，并且预期对陪伴动物的癌治疗有用。另外，如果可以使用上述血清进行简便地癌诊断，则期待不仅能够进行癌诊断，还对定期健康诊断、手术前诊断及决定治疗方针等具有巨大贡献。
陪伴动物尚未普及像人那样的健康检查。所以癌在很多情况下发现较晚，使得肿瘤变大饲养人才开始注意并入院就诊。该变大的肿瘤为恶性时，很多情况下即使进行了手术等外科疗法或应用抗癌剂的药物等，治疗也已经为时过晚。因此，通常兽医在判断为恶性时不进行手术而进行抗癌剂治疗。如果进行手术，也需要严格实施确保边缘的大小及手术中血液、细胞飞散对策等手术中的对策。最好手术后立即开始抗癌剂治疗，以短的间隔进行追踪观察。如果将上述癌诊断合并到最近日渐普及的且称为用于犬的完全医学检查的犬健康检查，则期待可导致早期检测。
另一方面，在良性肿瘤的情况下，即使肿瘤较大也可以进行手术。手术后只需要护理切除部分，不必进行昂贵的抗癌剂治疗，追踪观察中也不必紧张。
在当前情况下，提供可以适用于动物癌诊断的、高灵敏度且简便的癌检测方法，则使得可进行正确且有效的治疗，这给饲养人和兽医都带来了很多好处。
胞质和增殖相关蛋白1(CAPRIN-1)是当静止期的正常细胞被活化或发生细胞分裂时表达的胞内蛋白。CAPRIN-1还已知涉及例如通过细胞中RNA形成胞内应激颗粒调节的mRNA运输、以及翻译控制。同时，CAPRIN-1具有不同的名称。此类名称的实例包括GPI锚定的膜蛋白1和膜组分表面标记1蛋白(M11S1)，似乎这一蛋白被认为是膜蛋白。这些不同的名称源自这样的报告：CAPRIN-1基因序列最初具有GPI结合区并且CAPRIN-1是在大肠癌细胞中表达的膜蛋白(J.Biol.Chem.，270：20717-20723，1995)。后来报导了：该报告中描述的CAPRIN-1基因序列是不正确的；1个核苷酸从GenBank等中目前登记的CAPRIN-1基因序列中的缺失造成移码，因而导致80个氨基酸从C端缺失，并且因而所得的人为产物(74个氨基酸)是前述报告中所提及的GPI结合区；并且在该序列的5’侧也存在错误，由此导致53个氨基酸从N端缺失(J.Immunol.，172：2389-2400，2004)。此外，已经报道了由GenBank等中目前所登记CAPRIN-1基因序列编码的蛋白质不是细胞膜蛋白(J.Immunol.，172：2389-2400，2004)。
此外，基于J.Biol.Chem.，270：20717-20723(1995)对CAPRIN-1是细胞膜蛋白的报告，US 2008/0075722和WO 2005/100998公开了名为M11S1的CAPRIN-1作为细胞膜蛋白可作为癌治疗的靶(实施例中没有提及)。然而，如J.Immunol.，172：2389-2400(2004)中所报道的那样，从US2008/0075722和WO2005/100998申请以来直到现在，一般认为CAPRIN-1不表达在细胞表面。显然仅基于不正确信息即CAPRIN-1是细胞膜蛋白的US 2008/0075722和WO 2005/100998的公开内容不应当理解为本领域技术人员的技术常识。此外，从未有CAPRIN-1在乳腺癌细胞等中比在正常细胞中以更高水平表达的报道。
发明概述
本发明待解决的技术问题。
本发明的目的在于提供在癌的诊断中有用的癌的检测手段。
解决该问题的手段
通过深入的研究，通过SEREX方法，应用衍生自犬睾丸组织的cDNA文库和来自患乳腺癌的狗的血清，本发明人已经获得了编码与存在于带癌活生物来源血清中的抗体相结合的蛋白质的cDNA，并且基于该cDNA，他们制备了具有SEQ ID NO：6、8、10、12和14所示氨基酸序列的犬CAPRIN-1多肽。基于与所获得基因同源的人基因，本发明人还制备了具有SEQ ID NO：2和4所示氨基酸序列的人CAPRIN-1多肽。此外，本发明发明人还发现：编码这些蛋白质的基因在犬和人睾丸及恶性癌细胞中特异性表达(参见实施例1)；基于这些蛋白质氨基酸序列制备的重组多肽仅与来自带癌活体的血清特异性反应；以及利用使用该重组多肽制备的抗体，可以从带癌活体中特异性检测出CAPRIN-1。由此，从而完成了本申请发明。
具体地，本发明提供一种癌的检测方法，所述方法是针对从生物体中分离的试样所进行，包括测定CAPRIN-1的表达。此外，本发明还提供了用于检测癌的试剂，其包含在体内被诱导的抗CAPRIN-1抗体，以及进行抗原抗体反应的多肽。此外，本发明提供了用于检测癌的试剂，其包含与CAPRIN-1进行抗原抗体反应的抗体，或其抗原结合片段。此外，本发明提供了用于检测癌的试剂，其包含与序列表中SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13等所示核苷酸序列中15个或更多个核苷酸、优选20至25个或更多个核苷酸、以及更优选30或更多个核苷酸的部分序列特异性杂交的多核苷酸。
具体地，本发明具有以下特征：
(1)癌检测方法，包括测定从生物体分离的样本中通过抗原抗体反应而与抗CAPRIN-1蛋白抗体具有结合反应性的多肽的表达，其中所述的CAPRIN-1蛋白具有序列表中偶数编号的SEQ ID NO：2-30所示的任一氨基酸序列。
(2)根据上述(1)的方法，其中待测定的多肽是具有偶数编号的SEQ IDNO：2-30(即，SEQ ID NO：2、4、6、8、...30)所示任一氨基酸序列的CAPRIN-1蛋白，或与该CAPRIN-1蛋白具有85％或更多序列同一性的多肽。
(3)根据上述(1)或(2)的方法，其中所述的生物体是人、狗或猫。
(4)根据上述(3)的方法，其中所述的生物体是狗，并且所述待测定的多肽具有偶数编号的SEQ ID NO：2-30任一项所示的氨基酸序列。
(5)根据上述(4)的方法，其中所述的生物体是狗，并且所述待测定的多肽具有SEQ ID NO：6、8、10、12或14所示的氨基酸序列。
(6)根据上述(3)的方法，其中所述的生物体是人，并且所述待测定的多肽具有SEQ ID NO：2或4所示的氨基酸序列。
(7)根据上述(1)至(6)任一项的方法，其中通过抗体的免疫测定法测定所述多肽的表达，其中所述抗体可包含于样本中并且是在体内针对待测多肽而被诱导的。
(8)根据上述(1)至(7)任一项的方法，其中所述的样本是血清、血浆、腹水或胸腔积液。
(9)根据上述(1)至(6)任一项的方法，其中通过测定样本中所包含的编码该多肽的mRNA来测定所述多肽的表达。
(10)根据上述(9)的方法，包括应用与上述mRNA核苷酸序列中15个或更多个核苷酸、优选20至25个或更多个核苷酸、以及更优选30或更多个核苷酸的部分序列特异性杂交的多核苷酸检测样本中所述mRNA的存在量。
(11)根据上述(10)的方法，其中所述生物体是狗，并且上述多核苷酸是与SEQ ID NO：5、7、9、11或13所示核苷酸序列中15个或更多个核苷酸、优选20至25个或更多个核苷酸、以及更优选30或更多个核苷酸的部分序列特异性杂交的多核苷酸。
(12)根据上述(10)的方法，其中所述生物体是人，并且上述多核苷酸是与SEQ ID NO：1或3所示核苷酸序列中15个或更多个核苷酸、优选20至25个或更多个核苷酸、以及更优选30或更多个核苷酸的部分序列特异性杂交的多核苷酸。
(13)根据上述(9)至(12)任一项的方法，其中上述样本是组织或细胞。
(14)根据上述(1)至(13)任一项的方法，其中所述的癌是选自以下的至少一种类型：脑肿瘤，头、颈、肺、子宫或食管的鳞状细胞癌，黑素瘤，肺或子宫的腺癌、肾癌、恶性混合瘤、肝细胞癌、基底细胞癌、棘皮瘤样牙龈瘤、口腔瘤、肛门周围腺癌、肛囊瘤、肛囊顶泌腺癌、Sertoli细胞癌、阴道前庭癌、皮脂腺瘤、皮脂腺上皮瘤、脂腺腺瘤、汗腺癌、鼻腔内腺癌、鼻腺癌、甲状腺癌、大肠癌、支气管腺癌、腺癌、腺管癌、乳腺癌、复合型乳腺癌、乳腺恶性混合瘤、乳管内乳头状腺癌、纤维肉瘤、血管外皮瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、软组织肉瘤、组织细胞肉瘤、粘液肉瘤、未分化肉瘤、肺癌、肥大细胞瘤、皮肤平滑肌瘤、腹膜内平滑肌瘤、平滑肌瘤、慢性淋巴细胞性白血病、淋巴瘤、胃肠淋巴瘤、消化器型淋巴瘤、小细胞至中细胞淋巴瘤、肾上腺髓质瘤、颗粒细胞瘤和嗜铬细胞瘤。
(15)根据上述(1)至(14)任一项的方法，包括基于当上述多肽的表达水平比对照高时则癌恶性程度高这一事实来进一步检测癌的恶性程度。
(16)根据上述(1)至(15)任一项的方法，包括基于当所述多肽的表达水平比对照高时则癌进展程度是进展的这一指示来进一步检测癌的进展程度。
(17)用于检测癌的试剂，其包含与针对CAPRIN-1蛋白在体内诱导的抗体通过抗原抗体反应具有结合反应性的多肽，其中所述的CAPRIN-1蛋白具有序列表中偶数编号的SEQ ID NO：2-30所示的任一氨基酸序列。
(18)用于检测癌的试剂，其包含与多肽进行抗原抗体反应的抗体或其抗原结合片段，其中所述多肽通过抗原抗体反应与抗CAPRIN-1蛋白抗体具有结合反应性并且所述多肽是在体内(或在生物体中)产生的，其中所述CAPRIN-1蛋白具有序列表中偶数编号的SEQ ID NO：2-30所示的任一氨基酸序列。
(19)根据上述(18)的用于检测癌的试剂，其中所述的与多肽进行抗原抗体反应的抗体或其抗原结合片段是与癌细胞表面结合的抗体或其抗原结合片段。
(20)根据上述(18)或(19)的用于检测癌的试剂，其中所述的与多肽进行抗原抗体反应的抗体或其抗原结合片段与
包含除SEQ ID NO：6和18之外偶数编号的SEQ ID NO：2至30所示任一氨基酸序列的氨基酸残基编号50-98或氨基酸残基编号233-305的区域中7个或更多个连续氨基酸残基的氨基酸序列的多肽，或
包含上述多肽为部分序列的多肽
具有免疫学反应性。
(21)根据(18)-(20)任一项的用于检测癌的试剂，其中所述的与多肽进行抗原抗体反应的抗体或其抗原结合片段是与SEQ ID NO：43结合的抗体或其抗原结合片段，具有SEQ ID NO：44和45的氨基酸序列的单克隆抗体或其抗原结合片段，具有SEQ ID NO：44和46的氨基酸序列的单克隆抗体或其抗原结合片段，具有SEQ ID NO：44和47的氨基酸序列的单克隆抗体或其抗原结合片段，具有SEQ ID NO：44和48的氨基酸序列的单克隆抗体或其抗原结合片段，具有SEQ ID NO：49和50的氨基酸序列的单克隆抗体或其抗原结合片段，具有SEQ ID NO：51和52的氨基酸序列的单克隆抗体或其抗原结合片段，具有SEQ ID NO：53和54的氨基酸序列的单克隆抗体或其抗原结合片段，具有SEQ ID NO：55和56的氨基酸序列的单克隆抗体或其抗原结合片段，具有SEQ ID NO：57和58的氨基酸序列的单克隆抗体或其抗原结合片段，或具有SEQ ID NO：59和60的氨基酸序列的单克隆抗体或其抗原结合片段。
(22)用于检测癌的试剂，其包含与序列表中奇数编号的SEQ ID NO：1-29(即，SEQ ID NO：1、3、5、7、..29)所示任一核苷酸序列中15个或更多个核苷酸、优选20至25个或更多个核苷酸、以及更优选30或更多个核苷酸的部分序列特异性杂交的多核苷酸。
本发明的效果
根据本发明，提供了癌检测的新方法。如在以下给出的实施例中详细描述的那样，基于CAPRIN-1(或也称为Caprin-1)的氨基酸序列制备的重组多肽与特异性存在于癌患者血清中的抗体反应。因此，在生物体中存在的癌可通过本发明的方法检测样本中的抗体而检测出。此外，还可通过测定CAPRIN-1本身来检测生物体中存在的癌。根据本发明的方法，可检测肉眼不可见小尺寸癌或体内深处的癌。因此，本发明的方法可用于在健康检查等时间早期检测癌。另外，通过在癌治疗后在对患者的追踪观察中利用本发明的方法，还可以早期检测出复发的癌。并且，根据本发明的方法，还可以进行癌的进展程度诊断，诸如肿瘤增大、对周围组织的浸润以及癌向淋巴结及远位器官的转移。另外，恶性程度高的癌患者与恶性程度低的癌患者相比，其血清抗体水平更高。根据本发明的方法，还可以诊断癌的恶性程度。此外，如以下实施例所述，编码CAPRIN-1的mRNA在睾丸和癌细胞中特异性高水平表达。因此，还可通过测定该mRNA检测癌。
附图简述
图1显示了编码CAPRIN-1蛋白的基因在正常组织和肿瘤细胞系中的表达模式。参考编号1表示编码CAPRIN-1蛋白的基因的表达模式。参考编号2表示GAPDH基因的表达模式。
图2显示了通过考马斯染色法检测犬CAPRIN-1衍生多肽的结果，所述多肽是本发明中使用的多肽一个实例，其由实施例中的大肠杆菌产生并经纯化的。参考编号3表示犬CAPRIN-1衍生多肽的条带。
图3显示了使用实施例中制备的犬CAPRIN-1衍生多肽对带癌犬的癌诊断结果的一部分。
图4显示了使用实施例中制备的犬CAPRIN-1衍生多肽对带癌犬的癌详细诊断结果的一部分。
实施本发明的最佳方案
根据发明的方法，使用从生物体分离样本测定CAPRIN-1的表达。测定CAPRIN-1表达的方法的实例包括：包括对样本中含有的抗CAPRIN-1抗体进行免疫测定的方法(第1方法)；包括对样本中含有的CAPRIN-1本身进行免疫测定的方法(第2方法)；及包括测定样本中含有的编码CAPRIN-1的mRNA的方法(第3方法)。本发明的方法中，可以采用上述任一种方法测定CAPRIN-1的表达。在本发明中，术语“测定”是指检测、定性检测、定量检测及半定量检测中的任一种。
SEQ ID NO：6、8、10、12或14所示的氨基酸序列是犬CAPRIN-1的氨基酸序列。犬CAPRIN-1具有这样的氨基酸序列，即通过SEREX方法，应用衍生自犬睾丸组织的cDNA文库以及来自带癌犬的血清，作为能与特异性地存在于来自带瘤犬的血清中的抗体结合的多肽而鉴定的序列(见实施例1)。具体而言，针对具有SEQ ID NO：6、8、10、12或14所示氨基酸序列的CAPRIN-1的抗体在带瘤犬中在体内被特异性地诱导。因此，可应用上述第1方法，通过测定上述针对具有SEQ ID NO：6、8、10、12或14所示氨基酸序列的CAPRIN-1的抗体来检测犬癌(参见实施例3和4)。还可应用上述第2方法，通过测定SEQ ID NO：6、8、10、12或14所示的作为抗原的CAPRIN-1本身来检测犬癌(参见实施例5和6)。此外，如以下实施例所述，可通过测定编码CAPRIN-1的mRNA来检测犬癌，因为该mRNA在睾丸和癌细胞中以显著高的水平表达(参见实施例1)。
本文中使用的术语“具有氨基酸序列”是指氨基酸残基以所述顺序进行排列。因此，例如，表述“具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的多肽”是指具有由SEQ ID NO：2所示的Met Pro Ser Ala...(中略)...Gln Gln ValAsn氨基酸序列组成的709个氨基酸残基的多肽。另外，例如，还可将“具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的多肽”简称为“SEQ ID NO：2的多肽”。“具有核苷酸序列”的表述方式也是同样的。在这一情况下，术语“具有”可被表述“由......组成”替换。
另外，本文所使用的术语“多肽”是指多个氨基酸通过形成肽键而形成的分子。此类分子的实例不仅包括具有大量组成氨基酸的多肽分子，还包括具有少量氨基酸的低分子量分子(寡肽)，及全长蛋白质，本发明中还包括全长CAPRIN-1蛋白，其每一个具有SEQ ID NO：2-30中偶数序列ID所示的氨基酸序列。
在本发明的方法中，不仅是SEQ ID NO：6、8、10、12或14的犬CAPRIN-1，其他哺乳动物的CAPRIN-1(下文中，还可能称为犬CAPRIN-1的“同源物”。当简单地称为“CAPRIN-1”时，本文不仅包括来自狗的CAPRIN-1，还包括来自其他动物的CAPRIN-1)也用于进行测定。如以下实施例具体描述的那样，编码人CAPRIN-1的mRNA在人睾丸和癌细胞中以高水平显著地表达，如SEQ ID NO：6、8、10、12或14的犬CAPRIN-1的情况一样。然而，在健康人体中，没有检测到抗人CAPRIN-1的抗体。此外，在健康猫科动物身体中没有检测到抗猫CAPRIN-1的抗体，而是仅在带癌猫中检测到。因此，可通过测定哺乳动物中的CAPRIN-1表达检测狗以外的哺乳动物的癌。本发明的方法的测定对象、除狗之外的哺乳动物的CAPRIN-1的实例包括但不限于人CAPRIN-1和猫科动物CAPRIN-1。编码人CAPRIN-1的核苷酸序列及其氨基酸序列分别在序列表的SEQ IDNO：1和3，以及2和4所示。与犬CAPRIN-1的序列同一性就核苷酸序列而言是94％，以及就氨基酸序列而言是98％。即使遗传上远距离的哺乳动物的犬和人也共享就CAPRIN-1氨基酸序列而言非常高的98％的序列同一性。因此，认为犬和除人之外的哺乳动物，即犬CAPRIN-1及其同源物共享高达约85％或更高的序列同一性。因此，本发明方法测定其表达的CAPRIN-1与SEQ ID NO：6、8、10、12或14所示的犬CAPRIN-1氨基酸序列优选具有85％或高、以及更优选95％或更高的序列同一性。
在上述第1方法中，可以通过使用了与该抗体进行抗原抗体反应的抗原性物质的免疫测定法而容易地测定可存在于样本中的上述抗体。免疫测定方法本身为公知的常用方法，如下详述的那样。作为免疫测定法的抗原物质，例如可以使用在带癌犬身体中诱导该抗体的，SEQ ID NO：6、8、10、12或14的犬CAPRIN-1。另外，抗体具有交叉反应性。因此，即使实际为作为免疫原的抗原物质之外的分子，但只要该分子上存在与免疫原的表位类似的结构，则该分子也可以通过抗原抗体反应与针对免疫原被诱导的抗体结合。特别地，来自哺乳动物的蛋白及来自其它哺乳动物的其同源物共享很高的氨基酸序列同一性，并且通常具有彼此类型的表位结构。如下述实施例中的具体记载所示，SEQ ID NO：6、8、10、12或14的犬CAPRIN-1，不仅在带癌犬体内与针对该犬CAPRIN-1诱导的抗体进行抗原抗体反应，还在带癌猫体内与针对猫CAPRIN-1诱导的抗体进行抗原抗体反应。另外，人CAPRIN-1与带癌犬体内及带癌猫体内被诱导的上述抗体进行抗原抗体反应。因此，在本发明的第1方法中，可以使用源自任一种哺乳动物CAPRIN-1作为免疫测定法的抗原。
通常，当抗原物质是具有复杂结构和高分子量的蛋白质等时，在分子上存在结构不同的多个部位。因此，在生物体内生产出能够识别并结合此类抗原物质不同位点的多种抗体。具体地，生物体内针对诸如蛋白质的抗原物质产生的抗体，是作为多种抗体的混合物的多克隆抗体。本申请发明人等发现的抗体也是多克隆抗体。其特异性存在于源自带癌活体的血清中的，与重组CAPRIN-1蛋白通过抗原抗体反应而特异性结合。本发明所使用的术语“多克隆抗体”是指在源自体内含有抗原物质的活体的血清中存在的抗体，并且是在体内针对该抗原物质被诱导的抗体。
作为用于免疫测定带癌活动物中特异性抗体的抗原，在下述实施例中，制备SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8(犬CAPRIN-1)的多肽，以及SEQ IDNO：2(人CAPRIN-1)的多肽。确认这些多肽与源自带癌活体的血清中上述抗体的反应性。但是，由于上述抗体为多克隆抗体，所以其天然地与由SEQID NO：6、8或2的同源物组成的多肽结合。即使在所述多肽的片段的情况下，由于所述多克隆抗体中可以含有能够识别相关片段的结构的抗体，所以仍然可以与源自带癌活体的血清中含有的上述抗体结合。即，无论是SEQ ID NO：6、8或2的同源物的多肽(即，全长CAPRIN-1蛋白)，还是其片段，均可以同样地用于测定在带癌活体血清中特异性含有的上述多克隆抗体，并且均对癌的检测有用。因此，本发明的第1方法中作为免疫测定的抗原使用的多肽的实例，并不仅为由CAPRIN-1全长区域(例如SEQID NO：6、8或2)组成的多肽，还包括由CAPRIN-1的氨基酸序列中的连续7个或更多个、优选连续8个或更多个、9个或更多个、或10个或更多个氨基酸组成，并且与针对CAPRIN-1的多克隆抗体进行抗原抗体反应的多肽片段(以下，可简称为“特异反应性部分多肽”)。本领域公知，约7个或更多个氨基酸残基的多肽可发挥抗原性。然而，如果构成多肽的氨基酸残基的数量太少，此类多肽非常可能与样本中存在的、针对CAPRIN-1之外的蛋白质的抗体进行交叉反应。因此，从提高免疫测定精度的观点考虑，多肽片段的理想的氨基酸残基数目可以优选为30或更多个、或50或更多个，更优选100或更多个、或150或更多个，更优选300或更多个，甚至更优选600或更多个，以及更优选1000或更多个，以及1500或更多个。
用作抗原的多肽的特别优选的实例是偶数编号的SEQ ID NO：2-30的多肽或其片段。
编码由偶数编号的SEQ ID NO：2-30(即，SEQ ID NO：2、4、6…28、30)的氨基酸序列组成的蛋白的多核苷酸的核苷酸序列显示于奇数编号的SEQ ID NO：1-29(即，SEQ ID NO：1、3、5..27、29)。
通常，蛋白质抗原领域技术人员公知，即使当在蛋白质的氨基酸序列中替代、缺失、添加或者插入少数氨基酸残基时，所得产物也可能具有与原蛋白质基本等价的抗原性。因此，如下所述的多肽(以下，可简称为“特异反应性修饰多肽”)也可以以与上述多肽相同的方式用于癌的检测，所述多肽具有就CAPRIN-1的氨基酸序列而言替代、缺失和/或插入少数(优选1个或几个)氨基酸残基，并且与原始序列具有80％或更多、优选90％或更多、更优选95％或更多、更优选98％或更多的序列同一性的序列，并且该多肽通过抗原抗体反应与针对CAPRIN-1的多克隆抗体特异性结合。优选该特异反应性修饰多肽具有就CAPRIN-1的氨基酸序列而言替代、缺失、添加和/或插入1个或几个氨基酸残基的氨基酸序列。本文所使用的术语“几个”是指2-10的整数，优选2-6的整数，以及更优选2-4的整数。
本文所使用的术语“(氨基酸序列的)序列同一性”如下获得：将两氨基酸序列进行比对从而使待比较的2个氨基酸序列的氨基酸残基尽可能多地匹配、用匹配的氨基酸残基数除以总氨基酸残基数，并以百分比表示所得结果。上述比对时，需要时，在待比较的一个或两个序列中适宜地插入空位。这类序列的比对可以使用公知程序进行，诸如BLAST、FASTA或CLUSTALW(Karlin和Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，87：2264-2268，1993；Altschul等，Nucleic Acids Res.，25：3389-3402，1997)。
构成天然蛋白质的20种氨基酸可以分成如下几组：具有低极性侧链的中性氨基酸(Gly、Ile、Val、Leu、Ala、Met和Pro)、具有亲水性侧链的中性氨基酸(Asn、Gln、Thr、Ser、Tyr和Cys)、酸性氨基酸(Asp和Glu)、碱性氨基酸(Arg、Lys和His)以及芳香族氨基酸(Phe、Tyr、Trp和His)，其中每组的成员之间具有彼此类似的性质。已知这些氨基酸之间的替代(即，保守替代)很少改变所得多肽的性质。因此，当替代CAPRIN-1的氨基酸残基时，通过在相同组的成员间进行替代，从而使得维持与对应抗体的结合性的可能性增高。然而，在本发明中，上述变体可包括非保守替代，只要赋予了与非变体等价或几乎等价的免疫诱导活性即可。
如下所述的多肽(以下，可简称为“特异反应性加成多肽”)也可以以与上述多肽类似的方式用于癌的检测，所述多肽含有本发明使用的上述多肽作为部分序列(即，在本发明中使用的多肽的一端或者两端添加另一(多)肽制得的产物)、并且通过抗原抗体反应与针对CAPRIN-1的多克隆抗体特异性结合。
本发明中使用的上述多肽可以根据化学合成法进行合成，诸如Fmoc法(芴甲氧羰基法)和tBoc法(叔丁氧基羰基法)(日本生物化学学会编辑，生物化学实验讲座(Biochemical Experimental Lecture Series)1，蛋白质化学IV，化学修饰和肽合成，TOKYO KAGAKU DOZIN CO.，LTD(日本)，1981)。另外，还可以利用各种市售的肽合成仪通过常用方法进行合成。备选地，可以使用公知的基因工程技术容易地制备(Sambrook等，MolecularCloning，第二版，Current Protocols in Molecular Biology(1989)，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Ausubel等，Short Protocols inMolecular Biology，3rd Edition，A Compendium of Methods from CurrentProtocols in Molecular Biology(1995)，John Wiley & Sons，等)。例如，从表达编码SEQ ID NO：2的人CAPRIN-1或其同源物的基因的组织中提取RNA，通过RT-PCR制备该基因的cDNA。将该cDNA的全长或者所希望的一部分整合至到表达载体中，然后将载体导入宿主细胞，由此得到目的多肽。编码SEQ ID NO：6、8、10、12和14的犬CAPRIN-1的cDNA核苷酸序列分别显示于SEQ ID NO：5、7、9、11和13。其人类同源因子，即编码SEQ ID NO：2和4的人CAPRIN-1的cDNA核苷酸序列分别显示于SEQ ID NO：1和3。因此可以参照这些核苷酸序列容易地设计RT-PCR中使用的引物。另外，如下述所述，可应用参照奇数编号的SEQ ID NO：1-29的核苷酸序列设计的引物扩增编码非人哺乳动物CAPRIN-1的基因。例如，可通过与上述技术类似的技术容易地制备编码猫科动物CAPRIN-1的cDNA。RNA的提取、RT-PCR、cDNA向载体中的整合至以及载体向宿主细胞的导入，可以采用公知的方法进行，例如如下所述。另外，本文使用的载体及宿主细胞也为众所周知的，并且各种载体和宿主细胞可商购获得。
上述宿主细胞可以是任何细胞，只要它们可以表达上述多肽即可。原核细胞的实例包括大肠杆菌等。真核细胞的实例包括：诸如猴肾细胞(COS1)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、人胚肾细胞系(HEK293)以及小鼠胚胎皮肤细胞系(NIH3T3)的哺乳动物培养细胞，出芽酵母、裂殖酵母、蚕细胞以及非洲爪蟾卵细胞。
当使用原核细胞作为宿主细胞时，可以使用具有原核细胞复制起点、启动子、核糖体结合部位、多克隆部位、终止子、药物耐性基因和营养缺陷互补基因等的表达载体。作为大肠杆菌用表达载体，其实例有pUC载体、pBluescriptII、pET表达系统、pGEX表达系统等。将编码上述多肽的DNA整合至这种表达载体中，用该载体转化原核宿主细胞，然后培养所得的转化体，由此可以使上述DNA编码的多肽在原核宿主细胞中表达。此时，还可以使该多肽以与其他蛋白质的融合蛋白形式进行表达。编码上述多肽的DNA例如可以如上所述通过RT-PCR制备cDNA而获得。此外，编码上述多肽的此类DNA还可以如下所述使用市售的核酸合成仪通过常用方法合成。编码SEQ ID NO：2和4的CAPRIN-1的基因的cDNA核苷酸序列分别如序列表中SEQ ID NO：1和3所示。
使用真核细胞作为宿主细胞时，使用具有启动子、剪接区域、聚(A)添加部位等的真核细胞用表达载体。此类所述表达载体的实例包括pKA1、pCDM8、pSVK3、pMSG、pSVL、pBK-CMV、pBK-RSV、EBV载体、pRS、pcDNA3和pYES2等。与上述类似，将编码本发明中使用的多肽的DNA整合到此类表达载体中，用该载体转化真核宿主细胞，然后培养所得的转化体，由此可以使上述DNA编码的多肽在真核宿主细胞中表达。当使用pIND/V5-His、pFLAG-CMV-2、pEGFP-N1、pEGFP-C1等作为表达载体时，能够以与各种标签的融合蛋白表达上述多肽，所述标签诸如His标签(例如，(His)6至(His)10)、FLAG标签、myc标签、HA标签、GFP等。
为将表达载体导入宿主细胞，可以使用公知方法，诸如电穿孔法、磷酸钙法、脂质体法、DEAE葡聚糖法、微注射、病毒感染、脂质转染法、以及与可渗透细胞膜的肽结合。
可以组合应用公知的分离技术从宿主细胞中分离和纯化目的多肽。此类公知技术的实例包括利用诸如尿素的变性剂或表面活性剂的处理、超声波处理、酶消化、盐析、溶剂分馏及沉淀法、透析、离心、超滤、凝胶过滤、SDS-PAGE、等电点聚焦电泳、离子交换色谱法、疏水色谱法、亲和层析以及反相色谱法等。
通过以上方法所得的多肽包括以与任何其他蛋白质的融合蛋白形式的多肽。此类融合蛋白的实例包括与谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、His标签等的融合蛋白。此类融合蛋白形式的多肽也是上述特异反应性加成多肽的实例，并且可以用于本发明的第1种检测方法。此外，在转化细胞中表达的多肽，可在翻译后在细胞内进行各种修饰。此类翻译后被修饰的多肽只要能与抗CAPRIN-1多克隆抗体结合，则也可以用于在本发明的第1种检测方法。上述翻译后修饰的实例包括：N端蛋氨酸的移除、N端乙酰化、糖基化、通过细胞内蛋白酶的限制分解、肉豆蔻酰化、异戊二烯化和磷酸化。
可通过使用上述多肽作为抗原的免疫测定法容易地测定样本中抗体。免疫测定法本身在该领域中是公知的。基于反应类型，可将免疫测定法分为：夹心法、竞争法、凝集法、蛋白质印迹法等。另外，基于标记物，例如可将免疫测定法分为：放射免疫测定法、荧光免疫测定法、酶免疫测定法和生物素免疫测定法等。可以使用任意的这些方法进行上述抗体的免疫测定。在本发明的方法中，优选将夹心ELISA及凝集法用于上述抗体的免疫测定技术，因为这些方法的操作简便且不需要大型装置。但该技术不限于它们。当作为抗体的标记物使用酶时，此类酶没有特别的限制，只要其满足以下条件：转换数大、即使与抗体结合也稳定、其特异性地使底物显色等。可用于通常的酶免疫测定的酶的实例包括：过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、乙酰胆碱酯酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶等。另外还可以使用酶抑制剂、辅酶等。这些酶与抗体的结合可以通过使用诸如马来酰亚胺化合物的交联剂的公知方法来进行。作为底物，可以根据所使用的酶的种类使用公知的物质。例如使用过氧化物酶作为酶时，可以使用3，3’，5，5’-四甲基联苯胺。此外，使用碱性磷酸酶作为酶时，可以使用对硝基苯酚等。作为放射性同位素，可以使用放射免疫测定中通常使用的放射性同位素，诸如125I及3H。作为荧光染料，可以使用荧光抗体技术中通常使用的荧光染料，诸如异硫氰酸荧光素(FITC)及四甲基罗丹明异硫氰酸酯(TRITC)。
由于上述免疫测定技术方法本身是公知的，在本说明书中没有必要对其进行解释。然而，当简单地描述这些免疫测定技术时，则例如夹心法包括：将作为抗原使用的上述多肽固定在固相，使其与诸如血清的样本反应，洗涤，与适当的第二抗体反应，洗涤，然后测定与固相结合的第二抗体。可通过将抗原多肽固定至固相中，从而容易地除去未结合的第二抗体。因此，其优选作为本发明的癌检测方法的方案。作为第二抗体，如果样本源自犬，则可以使用抗犬IgG抗体。通过用上述示例的标记物质事先标记第二抗体，可以测定结合于固相的第二抗体。这样测定得到的第二抗体量相应于血清样本中的上述抗体量。当使用酶作为标记物质时，通过加入在酶作用下分解以显色的底物，然后通过光学方法测定底物的分解量，由此测定抗体量。使用放射性同位素作为标记物质时，可以通过闪烁计数器(Scintillation Counter)等测定来自放射性同位素的放射线量。
在本发明的第2种方法中，测定可包含在从活体得到的样本中的CAPRIN-1。如上所述，在癌患者中，与犬或人等的CAPRIN-1进行抗原抗体反应的抗体的量明显很高。这表示在癌细胞中作为抗原积累的CAPRIN-1的量显著很高。还可通过直接测定CAPRIN-1检测癌，如下述实施例中的具体记载所示。因此，可以与上述第1种方法类似地，通过测定CAPRIN-1本身而体内检测癌。
可以通过公知的免疫测定技术容易地测定样本中的多肽。具体而言，例如制备与CAPRIN-1进行抗原抗体反应的抗体或者其抗原结合片段，使用该抗体或者其抗原结合片段进行免疫测定，然后由此可以测定可能存在于样本中的CAPRIN-1。如上所述，抗体具有交叉反应性。因此，例如通过使用与SEQ ID NO：6的犬CAPRIN-1进行抗原抗体反应的抗体或者其抗原结合片段，不仅可以测定SEQ ID NO：6的犬CAPRIN-1，还可以测定其他哺乳动物中的同源物(例如，SEQ ID NO：2或4的人CAPRIN-1，或猫CAPRIN-1)。如上所述，免疫测定技术本身为公知的常用方法。
这一检查揭示了CAPRIN-1是在癌细胞表面表达的细胞膜蛋白。患癌活体含有多种蛋白酶。具体地，在患癌活体中，CAPRIN-1序列的细胞外表达部分通过降解而从癌细胞中分离出来，因而此部分以比CAPRIN-1序列的细胞内表达部分更高的水平存在。因此，当使用与癌细胞表面结合的、针对这一测定中使用的CAPRIN-1的抗体或其抗原结合片段时，可在较高的水平检测到CAPRIN-1并且可以较高的灵敏度诊断癌。因此，在本发明中，优选使用与癌细胞表面上存在的CAPRIN-1蛋白的部分结合的抗体。在癌细胞表面上存在的CAPRIN-1的部分肽的实例是，包含序列表中除SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：18之外的偶数编号的SEQ ID NO：2-30所示氨基酸序列中氨基酸残基编号(aa)50-98或氨基酸氨基编号(aa)233-305内7个或更多个连续氨基酸残基的多肽。其特定的实例是SEQ ID NO：43或SEQ ID NO：61所示的氨基酸序列(在SEQ ID NO：61所示氨基酸序列中，优选为SEQ ID NO：62或SEQ ID NO：63所示的氨基酸序列区域)，或与相关氨基酸序列具有80％或更多、优选85％或更多、更优选90％或更多、更优选95％或更多序列同一性的氨基酸序列。本发明使用的抗体的实例包括所有与这些肽结合的抗体。抗体的特定实例包括与SEQ ID NO：43结合的抗体或其抗原结合片段，具有SEQ ID NO：44和45的氨基酸序列的单克隆抗体或其抗原结合片段，具有SEQ ID NO：44和46的氨基酸序列的单克隆抗体或其抗原结合片段，具有SEQ ID NO：44和47的氨基酸序列的单克隆抗体或其抗原结合片段，具有SEQ ID NO：44和48的氨基酸序列的单克隆抗体或其抗原结合片段，具有SEQ ID NO：49和50的氨基酸序列的单克隆抗体或其抗原结合片段，具有SEQ ID NO：51和52的氨基酸序列的单克隆抗体或其抗原结合片段，具有SEQ ID NO：53和54的氨基酸序列的单克隆抗体或其抗原结合片段，具有SEQ ID NO：55和56的氨基酸序列的单克隆抗体或其抗原结合片段，具有SEQ ID NO：57和58的氨基酸序列的单克隆抗体或其抗原结合片段，具有SEQ ID NO：59和60的氨基酸序列的单克隆抗体或其抗原结合片段。
本文中所使用的术语“抗原结合片段”是指能与抗原结合的抗体片段，诸如抗体分子中含有的Fab片段及F(ab’)2片段。本发明使用的抗体可以为多克隆抗体或单克隆抗体。对于免疫测定等，优选为重现性高的单克隆抗体。以多肽作为免疫原的多克隆抗体及单克隆抗体的制备方法是公知的，并且可通过常用方法容易地进行。例如，将CAPRIN-1与诸如匙孔血蓝蛋白(KLH)、酪蛋白和血清白蛋白等的载体蛋白结合，然后将所得物作为免疫原与佐剂一起对动物进行免疫，由此可诱发针对该多肽的抗体。将从经免疫的动物中收集的诸如脾细胞或淋巴细胞的产抗体细胞与骨髓瘤细胞融合，从而制备杂交瘤，然后选择产生与CAPRIN-1结合的抗体的杂交瘤，然后进行培养，由此可以从培养上清液中得到以CAPRIN-1作为对应抗原的单克隆抗体。上述方法为公知的常用方法。
在本发明的第3种方法中，测定可包含在获自活体的样本中的编码CAPRIN-1的mRNA。如以下实施例所详细描述的那样，编码SEQ ID NO：6、8、10、12或14的犬CAPRIN-1或SEQ ID NO：2或4的人CAPRIN-1的mRNA在癌细胞中以显著高的水平表达。因此，可通过测定样本中此类mRNA而体内检测癌。
样本中的mRNA例如可以通过应用该mRNA作为模板的诸如实时检测RT-PCR的常用方法定量确定。此类mRNA可基于作为常用方法的RNA印迹中的染色强度大概地进行定量。编码偶数编号的SEQ ID NO：2-30的CAPRIN-1多肽的cDNA序列分别如奇数编号的SEQ ID NO：1-29所示。因此，以所述序列作为基础，制备与奇数编号的SEQ ID NO：1-29任一项所示的核苷酸序列中的部分区域特异性杂交的多核苷酸(以下称作“癌检测用多核苷酸”)，并且然后使用该多核苷酸作为探针或核酸扩增法中的引物，可测定试样中的mRNA量。如下所述，如果其为与奇数编号的SEQ ID NO：1-29任一项所示的核苷酸序列中的部分区域特异性杂交的多核苷酸，还可检测编码除犬和人之外的哺乳动物中的CAPRIN-1的mRNA。此外，在本发明中，多核苷酸可以为RNA或DNA。
本文所示使用的术语“特异性杂交”是指在通常杂交的条件下，对象仅与靶部分区域杂交，而与其他区域基本上不杂交。
本文所使用的术语“(在)通常杂交的条件下”，是指通常PCR的退火或应用探针进行检测时使用的条件。例如在利用了Taq聚合酶的PCR时，该术语指使用诸如50mM KCl、10mM Tris-HCl(pH8.3-9.0)和1-5mM MgCl2的通常缓冲液，在约54℃-60℃的适当的退火温度下进行反应。另外例如在Northern杂交的情况下，该术语是指使用诸如5×SSPE、50％甲酰胺、5×Denhardt’s溶液和0.1-0.5％SDS；或者0.1-5×SSC和0.1-0.5％SDS的通常的杂交溶液，在约42℃-65℃适当的杂交温度下进行反应。此外，杂交后，例如用0.1-0.2×SSC和0.1％SDS洗涤。但是，适当的退火温度或者杂交温度不限定于上述实例，可以基于作为引物或者探针使用的癌检测用多核苷酸的Tm值及实验者的经验确定。本领域技术人员可容易地确定此类温度范围。
本文所使用的表达“基本上不杂交”是指对象不与靶部分区域真正杂交；或者即使与靶部分区域杂交，对象也以显著低的量与靶部分区域杂交，即，相对而言可以忽略不计的量。在此类条件下特异性杂交的多核苷酸的实例是：与靶部分区域的核苷酸序列具有一定水平或更多序列同一性的多核苷酸。此类多核苷酸的特定实例具有70％或更多、优选80％或更多、85％或更多、更优选90％或更多、更优选93％或更多、更优选95％或更多、进一步更优选98％或更多的序列同一性。最优选该多核苷酸具有与靶部分区域的核苷酸序列同一的核苷酸序列。序列同一性的定义与上述氨基酸序列的序列同一性的定义方式相同。即使癌检测用多核苷酸的末端含有与对象不杂交的区域，在作为探针的情况下，只要杂交的区域占整个探针的约一半或更多则也可以用于检测。另外，在作为引物的情况下，只要杂交的区域占整个引物的约一半或更多且处于3’末端侧，则由于可以发生正常退火和延伸反应，所以也可以用于检测。如上所述，当癌检测用多核苷酸的末端含有不杂交的区域时，计算与对象的核苷酸序列的序列同一性时，仅着眼于杂交的区域进行计算，不考虑不杂交的区域。
本发明中使用的术语“部分序列”是指奇数编号的SEQ ID NO：1-29所示的核苷酸序列中的一部分序列，特别地为连续15个或更多个核苷酸、优选连续18个或更多个核苷酸、更优选连续20个或更多个、或25个或更多个核苷酸、以及更优选连续30、40或50个或更多个核苷酸的部分序列。本发明中所使用的术语“SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列”是指，除SEQID NO：5实际显示的核苷酸序列之外，还包含与其互补的序列。因此，例如，表达“具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的多核苷酸”是指包含具有SEQ ID NO：5实际显示的核苷酸序列的单链多核苷酸、具有SEQ IDNO：5所示序列互补的核苷酸序列的单链多核苷酸、以及包含它们的双链多核苷酸。制备本发明使用的多核苷酸时、或制备编码本发明使用的多肽的多核苷酸时，选择适当的任一种核苷酸序列，并且本领域技术人员可以容易地进行这一选择。
从确保特异性的观点考虑，癌检测用多核苷酸的核苷酸数优选为18个或更多个核苷酸。在作为探针使用时，多核苷酸的大小优选为18个或更多个核苷酸、更优选为20个或更多个核苷酸，以及编码区域的全长或更少。作为引物使用时，该多核苷酸大小优选为18个或更多个核苷酸，以及50个或更少核苷酸。癌检测用多核苷酸的优选实例是包含奇数编号的SEQ IDNO：1-29任一项所示的核苷酸序列中连续18个或更多个核苷酸的多核苷酸。
本领域技术人员在参考了这一说明书之后可显而易见地得知：与SEQID NO：5、7、9、11或13中的部分区域特异性杂交的多核苷酸分别用于测定编码SEQ ID NO：6、8、10、12或14的犬CAPRIN-1的mRNA量；以及与SEQ ID NO：1或3中的部分区域特异性杂交的多核苷酸分别用于测定编码SEQ ID NO：2或4的人CAPRIN-1的mRNA量。然而，来自哺乳动物的蛋白与来自另一哺乳动物的其同源物通常甚至在碱基序列水平上共享很高的序列同一性。因此，奇数编号的SEQ ID NO：1-13的序列间的序列同一性高达94％至100％。因此，与SEQ ID NO：5序列的部分区域特异性杂交的多核苷酸还可与奇数编号的SEQ ID NO：1-29任一项相关部分区域相对应的部分区域杂交。
如以下实施例所描述的那样，分别具有SEQ ID NO：33和34所示核苷酸序列的引物对与奇数编号的SEQ ID NO：1-29任一序列的部分区域、以及SEQ ID NO：5的部分区域两者杂交，因此例如可检测编码SEQ IDNO：6的犬CAPRIN-1的mRNA，以及编码其同源物的mRNA。因此，例如，利用与SEQ ID NO：5的部分区域特异性杂交的多核苷酸，不仅可检测编码SEQ ID NO：6的犬CAPRIN-1的mRNA，还可检测编码SEQ IDNO：2或4的人CAPRIN-1的mRNA。类似地，还可检测编码另一哺乳动物(诸如猫)的CAPRIN-1的mRNA。设计癌检测用多核苷酸时，期望选择在SEQ ID编号(奇数编号的SEQ ID NO：1-29)之间具有特别高的序列同一性(优选核苷酸序列相同)的部分区域。如果犬和人之间存在具有特别高的序列同一性的部分区域，则可以预测在其他动物种的同源基因中也存在与该区域具有非常高的序列同一性的区域。通过选择此类部分区域，则可以提高测定mRNA的精度，其中所述mRNA编码除犬及人之外的动物种的CAPRIN-1。
使用与受试核酸的部分区域特异性杂交的多核苷酸作为诸如PCR的核酸扩增法的引物或者探针来测定受试核酸的方法是公知的。除下述实施例中具体描述的RT-PCR之外，此类方法的实例还包括RNA印迹和原位杂交。本发明中测定mRNA量时，可以采用所有的这些公知测定方法。
诸如PCR的核酸扩增法本身在本领域是公知的，并且因此其使用的试剂盒及装置也可商购，因此可以容易地进行该方法。具体地，例如可以如下进行：应用作为模板的受试核酸(例如编码下述蛋白质的基因的cDNA，所述蛋白质具有偶数编号的SEQ ID NO：2-30任一项所示的氨基酸序列)和一对癌检测用多核苷酸(引物)，在公知的缓冲液中、在热稳定DNA聚合酶(诸如Taq聚合酶或Pfu聚合酶)及dNTP(此处，N＝A、T、C或G)存在下，通过改变反应液的温度进行变性、退火和延伸各步骤。通常，变性步骤在90-95℃进行，退火步骤在模板和引物的Tm或者其附近(优选在±4℃以内)进行，延伸步骤在热稳定DNA聚合酶(诸如Taq聚合酶或Pfu聚合酶)最适温度即72℃或该最适温度附近进行。各步骤进行约30秒至2分钟，可适当选择。例如将该热循环重复约25-40次，由此扩增引物对之间的模板核酸的区域。核酸扩增法不限定于PCR，本文还可以使用本领域公知的其他核酸扩增法。如上所述，使用一对癌检测用多核苷酸作为引物、使用受试核酸作为模板进行核酸扩增法时，受试核酸被扩增。然而，当试样中不含受试核酸时不引起扩增。因此通过检测扩增产物可以确认试样中是否存在受试核酸。扩增产物可以过如下方法进行检测，所述方法包括将扩增后的反应溶液进行电泳，然后将条带用溴化乙锭等染色，或所述方法包括在所述电泳后将扩增产物固定在诸如尼龙膜的固相中，与和受试核酸特异性杂交的标记探针进行杂交，洗涤，并且然后检测该标记。另外，可应用猝灭荧光染料和报告荧光染料，进行所谓实时检测PCR，并由此定量试样中受试核酸的量。由于实时检测PCR用试剂盒可商购，所以可以容易地进行实时检测PCR。此外，还可以基于电泳条带的强度对受试核酸进行半定量。受试核酸可以为mRNA，或由mRNA逆转录产生的cDNA。作为受试核酸扩增mRNA时，也可以采用使用了上述引物对的NASBA法(3SR法、或TMA法)。NASBA法本身是公知的，用于该方法的试剂盒也可商购，所以可以使用上述引物对容易地进行该方法。
作为探针，可以使用用荧光标记、放射标记、生物素标记等对癌检测用多核苷酸进行了标记的标记探针。多核苷酸的标记方法本身是公知的。可通过如下方法检查试样中是否存在受试核酸：固定受试核酸或者其扩增物，与标记探针进行杂交，洗涤，以及然后测定与固相结合的标记。备选地，还可固定癌检测用多核苷酸，使受试核酸与其杂交，然后应用标记探针等检测结合于固相上的受试核酸。在这种情况下，结合于固相上的癌检测用多核苷酸也称为探针。使用多核苷酸探针测定受试核酸的方法在本领域也是公知的。可以如下进行该方法：在缓冲液中使多核苷酸探针与受试核酸在Tm或者其附近(优选在±4℃以内)接触用于杂交，洗涤，然后测定杂交的标记探针或者与固相探针结合的模板核酸。此类方法的实例包括诸如RNA印迹、原位杂交、DNA印迹法的公知方法。在本发明中，可以使用任一种公知方法。
本发明的检测方法基于如上所述测定的CAPRIN-1的表达水平，判断对象动物是否患癌。癌的检测可以仅通过测定对象动物中CAPRIN-1的表达。但从提高检测精度的观点考虑，优选如下方案：检查1位或多位健康受试者样本中CAPRIN-1的表达水平(抗体水平、多肽水平或者mRNA水平)，由此取得健康受试者基准值，然后将对象动物的测定值与从健康受试者获得的该基准值进行比较。为进一步提高检测精度，还可以检测从多位已知患癌的患者体内取得的样本中的CAPRIN-1表达水平，由此获得癌患者基准值，然后可将对象动物的测定值与健康受试者基准值及癌患者基准值两者进行比较。上述基准值例如可以通过量化各样本中的CAPRIN-1表达水平、并然后计算其平均值来确定。可以通过检查对多位健康受试者及癌患者的CAPRIN-1表达水平，从而事先确定健康受试者基准值与癌患者基准值。因此，本发明的方法中与基准值进行比较时，可以使用预先确定的基准值。
在本发明的检测方法中，可以组合使用基于其他癌抗原或癌标记物的诊断。因此，可以进一步提高癌的检测精度。例如，当通过本发明的方法测定特异存在于癌患者中的抗体时，可以与上述多肽类似地组合使用癌组织中通常表达的其他多肽作为抗原。另外，也可以组合地进行本发明的方法和利用已知的癌标记物的诊断。
根据本发明的检测方法，可以体内地检测癌。特别是，如下述实施例所描述的那样，根据本发明的方法可以检测甚至小到肉眼看不见的大小的肿瘤或体内深部的肿瘤。因此，本发明的方法对癌的早期检测有用。另外，通过对处于癌治疗后追踪观察中的患者使用本发明的检测方法，则如果癌复发时可以早期检测出该癌。
另外，在带癌活体中，如果表达本发明所测定的CAPRIN-1的癌细胞数增加，则该活体内积累的该蛋白及其mRNA的量升高，并且血清中产生较多针对CAPRIN-1的抗体。同时，如果癌细胞数减少，体内积累的该蛋白及其mRNA的量减少，血清中的针对CAPRIN-1的抗体减少。因此，当CAPRIN-1的表达量比对照更高时，可以确定肿瘤增大或发生癌转移，即癌的进展程度有所进展。实际上，如以下实施例详细描述的那样，伴随着诸如肿瘤增大及转移的癌发展(恶化)，可以观察到带癌活体中上述血清抗体水平的上升。如上所述，还可通过本发明的方法检测癌的进展程度。
另外，如下述实施例所述，在相同种类的肿瘤中，恶性肿瘤中的上述抗体水平显著高于良性肿瘤中的上述抗体量。因此，当CAPRIN-1的表达水平高时，可以确定癌的恶性程度较高。具体地，还可通过本发明的方法检测出癌的恶性程度。
可根据本发明的癌检测方法进行检查的癌是表达CAPRIN-1的癌。此类癌包括，但不限于：脑肿瘤，头、颈、肺、子宫或食管的鳞状细胞癌，黑素瘤、肺或子宫的腺癌、肾癌、恶性混合瘤、肝细胞癌、基底细胞癌、棘皮瘤样牙龈瘤、口腔瘤、肛门周围腺癌、肛囊瘤、肛囊顶泌腺癌、Sertoli细胞癌、阴道前庭癌、皮脂腺瘤、皮脂腺上皮瘤、脂腺腺瘤、汗腺癌、鼻腔内腺癌、鼻腺癌、甲状腺癌、大肠癌、支气管腺癌、腺癌、腺管癌、乳腺癌、复合型乳腺癌、乳腺恶性混合瘤、乳管内乳头状腺癌、纤维肉瘤、血管外皮瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、软组织肉瘤、组织细胞肉瘤、粘液肉瘤、未分化肉瘤、肺癌、肥大细胞瘤、皮肤平滑肌瘤、腹膜内平滑肌瘤、平滑肌瘤、慢性淋巴细胞性白血病、淋巴瘤、胃肠淋巴瘤、消化器型淋巴瘤、小细胞至中细胞淋巴瘤、肾上腺髓质瘤、颗粒细胞瘤和嗜铬细胞瘤。此外，应用本发明方法的活体是哺乳动物，优选为人、狗或猫。
用于本发明方法的样本的实例包括诸如血液、血清、血浆、腹水、胸水的体液，组织和细胞。特别地，在上述第1种方法及第2种方法中，可以优选使用血清、血浆、腹水及胸水，以及在测定mRNA的上述第3种方法中优选组织样本及细胞样本。
在第1方法中用作免疫测定的抗原的上述多肽(即，SEQ ID NO：2的犬CAPRIN-1或其同源物、特异反应性部分多肽、特异反应性修饰多肽、以及特异反应性加成多肽)可以作为用于检测癌的试剂提供。该试剂可以仅由上述多肽组成，或可以含有各种添加剂等，例如用于稳定该多肽。另外，该试剂还可以以在诸如板或膜的固相中固定的形式提供。多肽的优选实例如上所述。
在第2种方法中用于对CAPRIN-I本身进行免疫测定的、与CAPRIN-1进行抗原抗体反应的抗体或其抗原结合片段也可以作为用于检测癌的试剂提供。这种情况下，用于检测癌的试剂可以仅由上述抗体或者抗原结合片段组成，或可以含有对该抗体或者抗原结合片段的稳定等有用的各种添加剂等。另外，该抗体或其抗原结合片段也可以是结合有金属的形式，所述金属诸如锰或铁等。将这种金属结合抗体或其抗原结合片段施与活体内时，该金属结合抗体或其抗原结合片段在抗原蛋白质以较高水平存在的部位中以升高的水平积聚。因此，通过MRI等测定金属，由此可以检测出产生抗原蛋白质的癌细胞的存在。
此外，第3种方法中用于mRNA测定的上述癌检测用多核苷酸也可以作为用于检测癌的试剂提供。在这种情况下，癌检测用试剂可以仅由该多核苷酸组成，或可含有对该多核苷酸的稳定等有用的各种添加剂等。该试剂中含有的癌检测用多核苷酸优选为引物或者探针。癌检测用多核苷酸的条件及优选实例如上所述。
实施例
本发明将参考以下实施例来更详细地描述本发明，不过本发明的技术范围不限于此。
实施例1：通过SEREX方法获得新的癌抗原蛋白
(1)cDNA文库的构建
通过酸胍-酚-氯仿方法从健康犬的睾丸组织提取总RNA，并且使用Oligotex-dT30mRNA纯化试剂盒(Takara Shuzo Co.，Ltd.)，根据其中包含的说明书纯化polyA RNA。
使用如此获得的mRNA(5μg)合成犬睾丸cDNA噬菌体文库。使用cDNA合成试剂盒、ZAP-cDNA合成试剂盒和ZAP-cDNA GigapackIIIGold Cloning试剂盒(STRATAGENE)，根据各试剂盒中所包含的各份说明书构建cDNA噬菌体文库。由此构建的cDNA噬菌体文库的大小是7.73×105pfu/ml。
(2)使用血清筛选cDNA文库
使用上述构建的犬睾丸cDNA噬菌体文库实施免疫筛选。具体地，在NZY琼脂糖平板(Φ90x15mm)上用噬菌体感染宿主大肠杆菌(XL1-BlueMRF’)，由此获得2210个克隆。在42℃培养大肠杆菌细胞3至4小时以形成噬斑。平板以IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)浸透的硝化纤维素膜(Hybond C Extra：GE Healthcare Bio-Science)在37℃覆盖4小时，从而诱导并表达蛋白质，然后将蛋白质转移到该膜上。随后，回收该膜，浸泡在含有0.5％粉末脱脂乳的TBS(10mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH 7.5)中并在4℃振摇过夜以封闭非特异性反应。使该滤膜与500倍稀释的患病犬血清在室温反应2至3小时。
就上述患病犬的血清而言，使用从患有乳腺癌的犬中收集的血清。这些血清贮藏在-80℃并在即将使用前预处理。预处理血清样品的方法如下。具体而言，宿主大肠杆菌(XL1-BLue MRF’)用其中未插入外来基因的λZAP表达噬菌体感染，并且随后在NZY平板培养基上于37℃培养过夜。随后，添加含有0.5M NaCl的缓冲液(0.2M NaHCO3，pH 8.3)至该平板，使该平板在4℃静置15小时，然后收集上清液作为大肠杆菌/噬菌体提取物。随后，使由此收集的大肠杆菌/噬菌体提取物流经NHS-柱(GEHealthcare Bio-Science)，由此固定衍生自大肠杆菌/噬菌体的蛋白质。使患病犬的血清流经固定有蛋白质的柱以与其反应，并且从血清中除去已经吸附至大肠杆菌和噬菌体的抗体。将已经流过该柱的血清级分用含有0.5％粉末脱脂乳的TBS稀释500倍。将所得物用作免疫筛选材料。
膜上已经转印上经处理的血清和上述融合蛋白的膜用TBS-T(0.05％吐温20/TBS)洗涤4次，然后使已经用含有0.5％粉末脱脂乳的TBS稀释5000倍作为第二抗体的山羊抗犬IgG(山羊抗犬IgG-h+I HRP缀合的(BETHYL Laboratories))与该膜在室温反应1小时。检测通过使用NBT/BCIP反应溶液(Roche)的酶显色反应实施。从NZY琼脂糖平板(Φ90x15mm)收集与显色反应阳性的位点相对应的菌落，并将其悬浮于500μlSM缓冲液(100mM NaCl，10mM MgClSO4，50mM Tris-HCl，0.01％明胶，pH 7.5)。以与上文所述相似的方法重复第二和第三筛选，从而筛选30,940个与血清IgG反应的噬菌体克隆，直至显色反应阳性菌落单一化。由此分离了5个阳性克隆。
(3)分离的抗原基因的同源性搜索
为了对通过上述方法分离的5个阳性克隆进行核苷酸序列分析，实施将噬菌体载体转变成质粒载体的操作。具体地，制备200μl吸光度OD600为1.0的含宿主大肠杆菌(XL1-Blue MRF’)溶液。将其与250μl纯化的噬菌体溶液混合，并随后和1μlExAssist辅助噬菌体(STRATAGENE)混合，随后在37℃反应15分钟。添加3ml LB培养基，在37℃培养2.5至3小时。培养后，立即通过水浴将溶液温度保持在70℃，持续20分钟，4℃和1000×g离心15分钟，并且然后收集上清液作为噬菌粒溶液。随后，制备200μl吸光度OD600为1.0的含噬菌粒宿主大肠杆菌(SOLR)溶液。将该溶液与10μl纯化的噬菌体溶液混合，随后在37℃反应15分钟。将溶液(50μl)接种于含有氨苄青霉素(终浓度：50μg/ml)的LB琼脂培养基，并且在37℃培养过夜。收集转化的SOLR单菌落并且在含有氨苄青霉素(终浓度：50μg/ml)的LB培养基中在37℃培养。应用QIAGEN质粒小量制备试剂盒(QIAGEN)纯化含有目的插入物的质粒DNA。
使用SEQ ID NO：31的T3引物和SEQ ID NO：32的T7引物，通过引物步行法，对纯化的质粒进行插入物全长序列的分析。作为序列分析的结果，获得SEQ ID NO：5、7、9、11和13的基因序列。使用所述基因的核苷酸序列以及由该基因编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：6、8、10、12和14)来实施同源性搜索程序BLAST搜索(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)。作为这个用已知基因进行的同源性检索的结果，发现获得的5个基因均编码CAPRIN-1。就待翻译为蛋白质的区域而言，这五个基因之间的序列同一性为100％的核苷酸序列同一性和99％的氨基酸序列同一性。此外，就待翻译为蛋白质的区域而言，所述基因与编码人同源物的基因的序列同一性为：94％的核苷酸序列同一性和98％的氨基酸序列同一性。人同源物的核苷酸序列显示于SEQ ID NO：1和3，并且其氨基酸序列显示于SEQ ID NO：2和4。此外，就待翻译为蛋白质的区域而言，由此获得的犬基因与编码牛同源物的基因的序列同一性为：94％的核苷酸序列同一性和97％的氨基酸序列同一性。牛同源物的核苷酸序列显示于SEQ ID NO：15，并且其氨基酸序列显示于SEQ ID NO：16。就待翻译为蛋白质的区域而言，编码人同源物的基因与编码牛同源物的基因之间的序列同一性为：94％的核苷酸序列同一性，以及93％至97％的氨基酸序列同一性。此外，就待翻译为蛋白质的区域而言，所获得的犬基因与编码马同源物的基因的序列同一性为：93％的核苷酸序列同一性和97％的氨基酸序列同一性。马同源物的核苷酸序列显示于SEQ ID NO：17，并且其氨基酸序列显示于SEQ ID NO：18。就待翻译为蛋白质的区域而言，编码人同源物的基因与编码马同源物的基因之间的序列同一性为：93％的核苷酸序列同一性和96％的氨基酸序列同一性。此外，就待翻译为蛋白质的区域而言，所获得的犬基因与编码小鼠同源物的基因的序列同一性为：87％至89％的核苷酸序列同一性和95％至97％的氨基酸序列同一性。小鼠同源物的核苷酸序列如SEQ ID NO：19、21、23、25和27所示并且其氨基酸序列如SEQ ID NO：20、22、24、26和28所示。就待翻译为蛋白质的区域而言，编码人同源物的基因与编码小鼠同源物的基因之间的序列同一性为：89％至91％的核苷酸序列同一性和95％至96％的氨基酸序列同一性。此外，就待翻译为蛋白质的区域而言，所获得的犬基因与编码鸡同源物的基因的序列同一性为：82％的核苷酸序列同一性和87％的氨基酸序列同一性。鸡同源物的核苷酸序列显示于SEQ ID NO：29，并且其氨基酸序列显示于SEQ ID NO：30。就待翻译为蛋白质的区域而言，编码人同源物的基因与编码鸡同源物的基因之间的序列同一性为：81％至82％的核苷酸序列同一性和86％的氨基酸序列同一性。
(4)每一组织中的基因表达分析
通过RT-PCR(逆转录PCR)方法通过上述方法在犬和人正常组织及多种细胞系中获得的基因的表达。逆转录按照以下方式实施。具体地，使用TRIZOL试剂(Invitrogen)，按照其中包含的方案从每一组织(50mg至100mg)和各细胞株(5至10x 106个细胞)中提取总RNA。使用用于RT-PCR的Superscript第一链合成系统(Invitrogen)按照其中包含的方案，利用提取的总RNA合成cDNA。使用对所获得基因特异的引物(根据SEQ ID NO：33和34)，按照以下方式实施PCR。具体地，如下实施PCR：通过添加诸试剂(0.25μl通过逆转录反应制备的样品，上述引物(每种2μM)，dNTP(每种0.2mM)和0.65U ExTaq聚合酶(Takara Shuzo Co.，Ltd.))和附带的缓冲液以调节至25μl总体积制备反应溶液，然后应用Thermal Cycler(BIORAD)，对所述溶液进行以下30个循环：94℃/30秒，60℃/30秒和72℃/30秒。上述基因特异性引物用来扩增SEQ ID NO：5的核苷酸序列(犬CAPRIN-1基因)第206至632位核苷酸之间的区域和SEQ ID NO：1的核苷酸序列(人CAPRIN-1基因)第698至1124位核苷酸的区域。作为对照，同时使用GAPDH特异性引物(SEQ ID NO：35和36)。作为结果，如图1中显示，在健康犬的睾丸组织中观察到强表达，同时在犬乳腺癌及腺癌组织中观察到表达。此外，还证实了与所获得基因同源的人同源物的表达。作为结果，如犬CAPRIN-1基因的情况类似，在正常组织的情况下，仅在睾丸中证实了其表达。然而，在癌细胞的情况下，在许多类型的癌细胞系诸如乳腺癌、脑肿瘤、白血病、肺癌和食道癌细胞系中检测到表达。尤其在许多乳腺癌细胞系中证实了其表达。基于这些结果，证实了在除睾丸组织之外的正常组织中观察不到CAPRIN-1表达，然而，CAPRIN-1在许多癌细胞中并且尤其在乳腺癌细胞系中表达。
此外，在图1中，纵轴上的参考编号1显示上文所鉴定的每一基因的表达模式并且相同轴上的参考编号2显示了用于对照的GAPDH基因的表达模式。
(5)免疫组织化学染色
(5)-1：正常小鼠和犬组织中的CAPRIN-1表达
小鼠(Balb/c，雌性)和犬(比格犬，雌性)在乙醚麻醉下和在氯胺酮/异氟烷麻醉下放血。剖腹手术后，将器官(胃、肝、眼球、胸腺、肌肉、骨髓、子宫、小肠、食道、心脏、肾、唾液腺、大肠、乳腺、脑、肺、皮肤、肾上腺、卵巢、胰腺、脾脏和膀胱)分别转移至含有PBS的10-cm平皿中。在PBS中切开每一器官并用含有4％多聚甲醛(PFA)的0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7.4)回流固定过夜。弃去回流液，用PBS漂洗每一器官的组织表面，将含有10％蔗糖的PBS溶液添加入50-ml微离心管。然后将每一组织置于每一管中，然后使用转子在4℃振摇2小时。用含有20％蔗糖的PBS溶液更换每一溶液，然后使其在4℃静置直至组织沉降。用含有30％蔗糖的PBS溶液更换每一溶液，并使其在4℃静置直至组织沉降。取出每一组织并使用手术刀切下所需的区域。随后，将OCT化合物(Tissue Tek)施加至每一组织表面并铺展开，并随后将组织置于Cryomold上。将Cryomold置于干冰上以迅速冷冻。使用冷冻切片机(LEICA)将组织切成厚度10μm至20μm，并且用电吹风对载玻片上的组织切片风干30分钟，由此制备其上置有组织切片的载玻片。随后，将每一载玻片置于充满PBS-T(含有0.05％吐温20的生理盐水)的染色瓶，每隔5分钟更换PBS-T，更换3次。使用Kimwipes纸巾擦掉每一切片周围的多余水分，用DAKOPEN(DAKO)圈定切片。将MOM小鼠Ig封闭试剂(VECTASTAIN)施用于小鼠组织上作为封闭液，并将含有10％胎牛血清的PBS-T溶液置于犬组织上作为封闭液。使这些产物置于保湿室中在室温静置1小时。随后，用封闭液制备10μg/ml抗CAPRIN-1的单克隆抗体(单克隆抗体#8)溶液，其中所述的抗体是实施例3制备的具有SEQ ID NO：55的重链可变区和SEQ ID NO：56的轻链可变区，并与癌细胞表面反应，将该溶液施加于每一载玻片，并且然后在保湿室中于4℃静置过夜。在用PBS-T洗涤3次，每次10分钟后，向每一载玻片中施加用封闭液稀释250倍的MOM生物素标记的抗IgG抗体(VECTASTAIN)，随后使之在保湿室中于室温静置1小时。在用PBS-T洗涤3次，每次10分钟后，向载玻片上施加抗生物素蛋白-生物素ABC试剂(VECTASTAIN)，并随后使之在保湿室中于室温静置5分钟。在用PBS-T洗涤3次，每次10分钟后，向载玻片上施加DAB染色溶液(10mg DAB+10μl 30％H2O2/0.05M Tris-HCl(pH 7.6)，50ml)，并随后使之在保湿室中于室温静置30分钟。载玻片用蒸馏水淋洗，然后施加苏木精试剂(DAKO)。使载玻片于室温静置1分钟后，用蒸馏水淋洗。载玻片依次地浸在70％、80％、90％、95％和100％乙醇溶液中，每次1分钟，并随后使其在二甲苯中静置过夜。取出载玻片，用Glycergel封片介质(DAKO)封片，并且随后观察。作为结果，在所有唾液腺、肾、结肠和胃组织的细胞内观察到微弱程度的CAPRIN-1表达；然而在细胞的表面上没有观察到CAPRIN-1表达。此外，在来自其它器官的组织中完全没有观察到表达。
(5)-2：犬乳腺癌组织中的CAPRIN-1表达
使用通过病理诊断法诊断为患有恶性乳腺癌的犬的108份冷冻犬乳腺癌组织样品，通过与上述类似的方法制备冷冻切片载玻片，并且用实施例3制备的单克隆抗体#8进行免疫组织化学染色。作为结果，在108份样品的100份(92.5％)中证实了CAPRIN-1表达。CAPRIN-1在异型度高的癌细胞表面上是特别强烈地表达。
(5)-3：人乳腺癌组织中的CAPRIN-1表达
应用石蜡包埋的人乳腺癌组织阵列(BIOMAX)的188份乳腺癌组织样品实施免疫组织化学染色。在60℃处理3小时后，将该人乳腺癌组织阵列加入到充满二甲苯的染色瓶中，然后每5分钟更换二甲苯，更换3次。随后，使用乙醇和PBS-T替代二甲苯重复相似流程。将人乳腺癌组织阵列浸入充满含有0.05％吐温20的10mM柠檬酸缓冲液(pH 6.0)的染色瓶中，在125℃处理5分钟，并且在室温静置40分钟或更长时间。使用Kimwipes纸巾从该阵列中擦掉每一切片周围的多余水分，用DAKOPEN圈定每一切片，并且向该阵列逐滴添加足够量的过氧化物酶阻断剂(DAKO)。使该阵列在室温静置5分钟后，然后浸入充满PBS-T的染色瓶。每5分钟更换PBS-T，更换3次。将含有10％FBS的PBS-T溶液施加在该阵列上作为封闭液，并且使该阵列置于保湿室中在室温持续1小时。随后，施与应用含5％FBS的PBS-T溶液调节为10μg/ml浓度的实施例3中制备的单克隆抗体#8，并且然后在保湿室中于4℃静置过夜。在用PBS-T洗涤3次，每次10分钟后，逐滴添加合适量的Peroxidase Labelled Polymer Conjugated(DAKO)至阵列，并且随后使该阵列在保湿室中于室温静置30分钟。在用PBS-T洗涤3次，每次10分钟后，施加DAB染色液(DAKO)至该阵列，并且在室温静置约10分钟。从阵列中弃去DAB染色液，然后用PBS-T洗涤3次，每次10分钟。用蒸馏水淋洗载阵列，然后依次地浸在70％、80％、90％、95％和100％乙醇溶液中，每次1分钟，并随后使其在二甲苯中静置过夜。取出阵列，用Glycergel封片介质(DAKO)封片，并且随后观察。作为结果，在全部188份乳腺癌组织样品的138份(73％)中观察到强烈的CAPRIN-1表达。
(5)-4：人恶性脑肿瘤中的CAPRIN-1表达
用实施例3制备的单克隆抗体#8如上文(5)-3中类似的方式对石蜡包埋的人恶性脑肿瘤组织阵列(BIOMAX)的247份恶性脑肿瘤组织样品实施免疫组织化学染色。作为结果，在全部247份恶性脑肿瘤组织样品的227份(92％)中观察到强烈的CAPRIN-1表达。
(5)-5：人乳腺癌转移的淋巴结中的CAPRIN-1表达
用实施例3制备的单克隆抗体#8以如上文(5)-3中类似的方式对石蜡包埋的人乳腺癌转移的淋巴结组织阵列(BIOMAX)的150份人乳腺癌转移的淋巴结组织样品实施免疫组织化学染色。作为结果，在全部150份人乳腺癌转移的淋巴结组织样品的136份(90％)中观察到强烈的CAPRIN-1表达。特别地，揭示了CAPRIN-1在转移自乳腺癌的癌组织中也强烈地表达。
实施例2：制备新的犬和人癌抗原蛋白
(1)重组蛋白的制备
基于实施例1中获得的SEQ ID NO：5的基因以下文所述方式制备重组蛋白。通过添加试剂(1μl从实施例1中获得的噬菌粒溶液制备并经过序列分析的载体、含有NdeI和KpnI限制性位点的两种类型的引物(每种0.4μM，根据SEQ ID NO：37和38)、0.2mM dNTP和1.25U PrimeSTAR HS聚合酶(Takara Shuzo Co.，Ltd.))和附带的缓冲液调节至达到总体积50μl从而制备反应溶液，然后使用Thermal Cycler(BIO RAD)，使所得物重复30个循环98℃/10秒和68℃/1.5分钟的反应，从而进行PCR。使用上述两种引物来扩增编码SEQ ID NO：6的全长氨基酸序列的区域(P47)。PCR后，将扩增的DNA在1％琼脂糖凝胶上电泳，然后使用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN)纯化约1.4kbp的DNA片段。
将纯化的DNA片段连接入pCR-Blunt克隆载体(Invitrogen)。将改载体转化到大肠杆菌中，然后收集质粒。通过测序证实扩增的基因片段匹配目的序列。用NdeI和KpnI限制性酶处理目的序列匹配的质粒，然后用QIAquick凝胶提取试剂盒纯化所得物。然后将目的基因序列插入用NdeI和KpnI限制性酶处理的大肠杆菌pET30b表达载体(Novagen)。使用这种载体能够产生融合有His标签的重组蛋白。将所述质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，然后用1mM IPTG诱导表达，由此在大肠杆菌中表达目的蛋白。
另外，基于SEQ ID NO：7的基因以下文所述方式制备犬同源基因的重组蛋白。通过添加试剂(1μl实施例1中所制备的组织和/或细胞cDNA(通过RT-PCR可证实其表达)、含有NdeI和KpnI限制性位点的两种类型的引物(每一种0.4μM，根据SEQ ID NO：39和40)、0.2mM dNTP和1.25UPrimeSTAR HS聚合酶(Takara Shuzo Co.，Ltd.))和附带的缓冲液以调节至达到总体积50μl从而制备反应溶液，使用Thermal Cycler(BIO RAD)，使该溶液进行30个循环98℃/10秒和68℃/2.5分钟的反应。使用上述两种引物来扩增编码SEQ ID NO：8的全长氨基酸序列的区域。PCR后，扩增的DNA在1％琼脂糖凝胶上电泳，然后使用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN)纯化约2.2kbp的DNA片段。
将纯化的DNA片段连接入pCR-Blunt克隆载体(Invitrogen)。将所得物转化到大肠杆菌中，然后回收质粒。通过测序证实扩增的基因片段匹配目的序列。用NdeI和KpnI限制性酶处理与目的序列匹配的质粒，然后用QIAquick凝胶提取试剂盒纯化所得物。然后将目的基因序列插入用NdeI和KpnI限制性酶处理的大肠杆菌pET30b表达载体(Novagen)。使用这种载体能够产生融合有His标签的重组蛋白。将所述质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，然后用1mM IPTG诱导表达，由此在大肠杆菌中表达目的蛋白。
使用SEQ ID NO：1的基因以下文所述方式制备人同源基因的重组蛋白。通过添加试剂(在实施例1中制备的组织或细胞cDNA(1μl)(通过RT-PCR可证实其表达)、含有SacI和XhoI限制性位点的两种类型的引物(每种0.4μM，根据SEQ ID NO：41和42)、0.2mM dNTP和1.25UPrimeSTAR HS聚合酶(Takara Shuzo Co.，Ltd.))和附带的缓冲液以调节至达到总体积50μl制备反应溶液，使用Thermal Cycler(BIO RAD)，使所得物进行30个循环98℃/10秒和68℃/2.5分钟的反应，从而进行PCR。使用上述两种引物来扩增编码SEQ ID NO：2的全长氨基酸序列的区域。PCR后，扩增的DNA在1％琼脂糖凝胶上电泳，并且使用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN)纯化约2.1kbp的DNA片段。
将纯化的DNA片段连接入pCR-Blunt克隆载体(Invitrogen公司)。将所得物转化到大肠杆菌中，回收质粒。通过测序证实扩增的基因片段匹配目的序列。用SacI和XhoI限制性酶处理与目的序列匹配于的质粒，用QIAquick凝胶提取试剂盒纯化所得物。然后将目的基因序列插入用SacI和XhoI限制性酶处理的大肠杆菌表达载体(pET30a，Novagen)。使用这种载体能够产生融合有His标签的重组蛋白。将所述质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，然后用1mM IPTG诱导表达，由此在大肠杆菌中表达目的蛋白。
(2)重组蛋白的纯化
上述表达SEQ ID NO：1、5或7的基因的重组大肠杆菌在含有30μg/ml卡那霉素的LB培养基中在37℃培养直至在600nm的吸光度达到约0.7。然后添加异丙基-β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷至终浓度1mM，随后在37℃培养4小时。此后，以4800rpm离心10分钟收获细胞。将细胞沉淀悬浮在磷酸盐缓冲的生理盐水中，然后以4800rpm离心10分钟，用于洗涤细胞。
将细胞悬浮在磷酸盐缓冲的生理盐水中，然后在冰上超声破碎。超声破碎的大肠杆菌溶液以6000rpm离心20分钟。将所得的上清液用作可溶性级分，并且所得沉淀用作不溶性级分。
将可溶级分添加至根据常规技术制备的镍螯合柱(载体：ChelateingSepharose(商标)Fast Flow(GE Health Care)；柱体积：5ml；50mM盐酸缓冲液(pH 8.0)作为平衡缓冲液)。用约10倍柱体积的50mM盐酸缓冲液(pH 8.0)和含有20mM咪唑的20mM磷酸盐缓冲液(pH 8.0)洗去未吸附的级分。洗涤之后，立即用含有100mM咪唑的20mM磷酸盐缓冲液(pH8.0)洗脱6个床。在通过考马斯染色法证实了目的蛋白的洗脱之后，将含有100mM咪唑的20mM磷酸盐缓冲液(pH 8.0)的洗脱级分添加至强阴离子交换柱(载体：Q Sepharose(商标)Fast Flow(GE Health Care)；柱体积：5ml；以及20mM磷酸盐缓冲液(pH 8.0)作为平衡缓冲液)。用10倍柱体积的20mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)和含有200mM氯化钠的20mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)洗去未吸附的级分。洗涤后，立即用含有400mM氯化钠的20mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)洗脱5个床。由此，获得了各个具有SEQ IDNO：2、6或8所示氨基酸序列的蛋白质的纯化级分。然后将这些纯化的级份用作用于施用试验的材料。图2显示了通过电泳分离并通过考马斯染色检测的SEQ ID NO：2的蛋白。
将200μl通过上述方法获得的每一纯化制备物分散到1ml的反应缓冲液(20mM Tris-HCl，50mM NaCl，2mM CaCl2，pH 7.4)中，然后添加2μl肠激酶(Novagen)。使制备物在室温静置过夜进行反应，切除His标签，并且然后使用肠激酶切割捕获试剂盒(Novagen)根据随附的说明书进行纯化。随后，使用超滤法NANOSEP 10K OMEGA(PALL)，用生理磷酸盐缓冲液(Nissui Pharmaceutical Co.，Ltd.)置换1.2ml由上述方法获得的每一纯化制备物。应用0.22μm HT Tuffryn Acrodisc(PALL)实施无菌过滤，并且所得物用于以下实验。
实施例3：制备抗CAPRIN-1抗体
(1)制备抗CAPRIN-1衍生肽的多克隆抗体
为获得与CAPRIN-1结合的抗体，合成了CAPRIN-1衍生肽(Arg-Asn-Leu-Glu-Lys-Lys-Lys-Gly-Lys-Leu-Asp-Asp-Tyr-Gln(SEQ IDNO：43))。将作为抗原的1mg所述肽和与肽等量的不完全弗氏佐剂(IFA)溶液混合。每两周一次地将该混合物皮下施与兔4次。随后，收集血液，由此获得含有多克隆抗体的抗血清。此外，应用蛋白G载体(GE HealthcareBio-Sciences)纯化该抗血清，并且获得抗CAPRIN-1衍生肽的多克隆抗体。接下来，检查所获得的多克隆抗体与乳腺癌细胞表面的反应性。具体地，106个MDA-MB-231V人乳腺癌细胞系在1.5ml微离心管中离心。将含有该多克隆抗体的补充有0.1％胎牛血清(FBS)的PBS溶液加入该管。使该溶液在冰上静置1小时。用PBS洗涤后，往溶液中加入用含有0.1％FBS的PBS稀释500倍的FITC-标记的山羊抗-兔IgG抗体(InvitrogenCorporation)，然后使溶液在冰上静置1小时。用PBS洗涤后，应用FACSCalibur(Becton，Dickinson and Company)测量荧光强度。同时，通过添加含0.1％FBS的PBS替代多克隆抗体，进行上述类似的步骤，由此制备对照。结果，发现在经多克隆抗体处理的细胞中的荧光强度比对照细胞中的强度更强。因此，证实了所获得的多克隆抗体与乳腺癌细胞表面结合。
(2)抗CAPRIN-1蛋白单克隆抗体的制备
将实施例2中制备的SEQ ID NO：2所示抗原蛋白(人CAPRIN-1)(100μg)与等量的MPL+TDM佐剂(Sigma)混合。将该混合物用作每只小鼠的抗原溶液。将该抗原液腹膜内地施用至6周龄的Balb/c小鼠(Japan SLCInc.)，并且以每周为间隔再施用该溶液3次。最后免疫3日后取出脾脏，然后将其在两片无菌的载玻片之间研磨。用PBS(-)(Nissui)洗涤所得物，然后以1500rpm离心10分钟，并因此重复3次移除上清液的程序。由此，获得脾脏细胞。将由此获得的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0(购自ATCC)以10∶1的比例混合。添加PEG溶液至细胞，其中所述的PEG溶液通过使在37℃加热的200μl含有10％FBS的RPMI 1640培养基与800μl PEG1500(Boehringer)混合而制得。使溶液静置5分钟以进行细胞融合。以1700rpm离心5分钟，以移除上清液。将细胞悬浮于150ml已经添加2％等量HAT溶液(Gibco)的含有15％FBS的RPMI 1640培养基(HAT选择培养基)中，并且以每孔100μl铺种于15块96孔平板(Nunc)中。在37℃和5％CO2的条件下培养细胞7天，由此获得因脾脏细胞与骨髓瘤细胞的融合而产生的杂交瘤。
使用由这样制备的杂交瘤产生的抗体对CAPRIN-1蛋白的结合亲和力作为指标，选择杂交瘤。将实施例2中制备的CAPRIN-1蛋白溶液(1μg/ml)以每孔100μl的量添加至96孔平板，并使该平板在4℃静置18小时。各孔用PBS-T洗涤3次，以每孔400μl的量添加0.5％牛血清白蛋白(BSA)溶液(Sigma)，并且然后使该平板在室温静置3小时。移除该溶液，用400μl的PBS-T洗涤各孔3次。以每孔100μl的量添加上文获得的每个杂交瘤的培养上清液，并且使该平板在室温静置2小时。用PBS-T洗涤各孔3次，以每孔100μl的量添加用PBS稀释5000倍的HRP标记的抗小鼠IgG(H+L)抗体(Invitrogen Corporation)，并且在室温静置1小时。用PBS-T洗涤各孔3次，以每孔100μl的量添加TMB底物溶液(Thermo)，并且静置15至30分钟，由此进行显色反应。在颜色显现后，以每孔100μl的量添加1N硫酸以终止该反应。使用吸光度计测定在450nm的吸光度和在595nm的吸光度。结果，选出了具有高吸光度值的产生抗体的多株杂交瘤。
将由此选出的杂交瘤以每孔0.5个杂交瘤的量添加至96孔平板并培养。1周后，观察到在孔中形成单个集落杂交瘤。进一步培养这些孔中的细胞。使用从克隆的杂交瘤产生的抗体对CAPRIN-1蛋白的结合亲和力作为指标，选择杂交瘤。将实施例2中制备的CAPRIN-1蛋白溶液(1μg/ml)以每孔100μl的量添加至96孔平板，并使该平板在4℃静置18小时。各孔用PBS-T洗涤3次。以每孔400μl的量添加0.5％BSA溶液，并且然后使该平板在室温静置3小时。移除该溶液，用400μl的PBS-T洗涤各孔3次。以每孔100μl的量添加上文获得的每个杂交瘤的培养上清液，并且使该平板在室温静置2小时。用PBS-T洗涤各孔3次，以每孔100μl的量添加用PBS稀释5000倍的HRP标记的抗小鼠IgG(H+L)抗体(InvitrogenCorporation)，并且在室温静置1小时。用PBS-T洗涤各孔3次，以每孔100μl的量添加TMB底物溶液(Thermo)，并且静置15至30分钟，由此进行显色反应。在颜色显现后，以每孔100μl的量添加1N硫酸以终止该反应。使用吸光度计测定在450nm的吸光度和在595nm的吸光度。结果，获得了多个杂交瘤细胞系，这些细胞系产生显示出与CAPRIN-1蛋白的反应性的单克隆抗体。应用蛋白G载体纯化杂交瘤培养上清液，由此获得与CAPRIN-1蛋白结合的150个单克隆抗体。
接下来，在这些单克隆抗体当中选出显示了与表达CAPRIN-1的乳腺癌细胞的表面的反应性的单克隆抗体。具体地，在1.5ml微量离心管中离心106个MDA-MB-231V人乳腺癌细胞系细胞。添加上文制备的每一杂交瘤上清液(100μl)，并且在冰上静置1小时。在用PBS洗涤后，添加用含有0.1％胎牛血清的PBS稀释500倍的FITC标记的山羊抗小鼠IgG抗体(Invitrogen Corporation)，并在冰上静置1小时。在用PBS洗涤后，使用FACSCalibur(Becton，Dickinson and Company)测量荧光强度。同时，应用用培养基代替抗体实施类似程序，由此制备对照。结果，选出了10个(#1至#10)具有比对照更强的荧光强度的单克隆抗体；即，选出了与乳腺癌细胞表面反应的单克隆抗体。这些单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区显示于SEQ ID NO：44-60。上述单克隆抗体#1包含SEQ ID NO：44的重链可变区和SEQ ID NO：45的轻链可变区，单克隆抗体#2包含SEQ ID NO：44的重链可变区和SEQ ID NO：46的轻链可变区，单克隆抗体#3包含SEQID NO：44的重链可变区和SEQ ID NO：47的轻链可变区，单克隆抗体#4包含SEQ ID NO：44的重链可变区和SEQ ID NO：48的轻链可变区，单克隆抗体#5包含SEQ ID NO：49的重链可变区和SEQ ID NO：50的轻链可变区，单克隆抗体#6包含SEQ ID NO：51的重链可变区和SEQ ID NO：52的轻链可变区，单克隆抗体#7包含SEQ ID NO：53的重链可变区和SEQ IDNO：54的轻链可变区，单克隆抗体#8包含SEQ ID NO：55的重链可变区和SEQ ID NO：56的轻链可变区，单克隆抗体#9包含SEQ ID NO：57的重链可变区和SEQ ID NO：58的轻链可变区，单克隆抗体#10包含SEQ IDNO：59的重链可变区和SEQ ID NO：60的轻链可变区。
(3)：鉴定CAPRIN-1蛋白中的肽，其中与癌细胞表面反应的抗CAPRIN-1抗体结合所述肽
应用上面获得的与癌细胞表面反应的抗CAPRIN-1单克隆抗体#1至#10，鉴定了由这些单克隆抗体识别的CAPRIN-1蛋白中的部分序列。
首先，将重组CAPRIN-1蛋白溶液用PBS调节为含有1μg/μl浓度蛋白质的溶液，将DTT(Fluka)添加到100μl该溶液中至10mM终浓度，随后在95℃反应5分钟，由此使CAPRIN-1蛋白内的二硫键还原。接下来，以20mM的终浓度加入碘乙酰胺(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)，然后在遮光条件下在37℃对硫醇基进行烷基化反应30分钟。将50μg每一种抗CAPRIN-1单克隆抗体#1至#10加入到40μg如此获得的还原的烷基化的CAPRIN-1蛋白中。将混合物体积调节至1mL 20mM的磷酸盐缓冲液(pH 7.0)，然后在搅拌混合每一混合物的同时使该混合物在4℃反应过夜。
然后，添加胰蛋白酶(Promega)至0.2μg的终浓度。在37℃反应1小时、2小时、4小时和12小时后，将所得物与在1mM碳酸钙及NP-40缓冲液(20mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)、5mM EDTA、150mM NaCl和1％NP-40)中的蛋白A-玻璃珠(GE)混合，然后反应30分钟，其中所述的蛋白A-玻璃珠在此之前用含1％BSA(Sigma)的PBS进行封闭并然后用PBS洗涤。
用25mM碳酸铵缓冲液(pH 8.0)洗涤每一反应混合物，然后用100μl0.1％甲酸洗脱抗原-抗体复合物。应用Q-TOF Premier(Waters-MicroMass)根据该仪器所附说明对洗脱物进行LC-MS分析。
结果，鉴定出了SEQ ID NO：61的多肽作为CAPRIN-1的部分序列，其被所有抗CAPRIN-1单克隆抗体#1至#10识别。此外，鉴定了SEQ ID NO：62的肽，其作为上述SEQ ID NO：61多肽中的部分序列，被单克隆抗体#1-#4、#5-#7和#9识别。还揭示了单克隆抗体#1至#4识别SEQ ID NO：63的肽，其为SEQ ID NO：62肽中的部分序列肽。
实施例4：应用CAPRIN-1多肽诊断癌
(1)犬癌诊断
从被确认患有恶性或良性肿瘤的342只患病犬和6只健康犬采集血液，分离血清。使用实施例2制备的犬CAPRIN-1多肽(SEQ ID NO：8)和抗犬IgG抗体，通过ELISA法测定与该多肽特异性反应的血清IgG抗体滴度。
如下固定所制备的多肽：按100μl/孔将用磷酸盐缓冲生理盐水稀释为5μg/mL的重组蛋白质溶液添加到96孔固定氨基板(immobilizer aminoplates)(Nunc)中，在4℃静置过夜。如下进行封闭：按100μL/孔加入含有0.5％BSA(牛血清白蛋白)(Sigma Aldrich Japan)的50mM碳酸氢钠缓冲溶液(pH8.4)(以下称为封闭溶液)，室温下振荡1小时。按100μL/孔添加用封闭溶液稀释1000倍的稀释血清，然后在室温下振荡3小时进行反应。用含有0.05％Tween20(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)的磷酸盐缓冲生理盐水(以下称为PBS-T)洗涤反应溶液3次。按100μL/孔加入用封闭溶液稀释3000倍的HRP修饰犬IgG抗体(山羊抗狗IgG-h+I HRP缀合的：BETHYL Laboratories)，随后室温下振荡溶液反应1小时。用PBS-T洗涤3次后，按照100μl/孔添加HRP底物TMB(1-Step Turbo TMB(四甲基联苯胺)，PIERCE)，然后在室温下进行酶底物反应30分钟。之后，按100μl/孔加入0.5M硫酸溶液(Sigma Aldrich Japan)终止反应。用微孔板读数仪测定450nm处的吸光度。作为对照，用未固定所制备的重组蛋白质的样品，以及没有使带癌犬血清与之反应的样品进行上述同样地处理并进行比较。
使用被摘除的肿瘤组织进行病理诊断，最终上述癌诊断中使用的全部342个样品中有215个样品被确诊为恶性。
具体而言，上述样品被诊断为具有以下癌，诸如：恶性黑素瘤、恶性混合瘤、肝细胞癌、基底细胞癌、棘皮瘤样牙龈瘤、口腔瘤、肛门周围腺癌、肛囊瘤、肛囊顶泌腺癌、Sertoli细胞癌、阴道前庭癌、皮脂腺瘤、皮脂腺上皮瘤、脂腺腺瘤、汗腺癌、鼻腔内腺癌、鼻腺癌、甲状腺癌、大肠癌、支气管腺癌、腺癌、腺管癌、乳腺癌、复合型乳腺癌、乳腺恶性混合瘤、乳管内乳头状腺癌、纤维肉瘤、血管外皮瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、软组织肉瘤、组织细胞肉瘤、粘液肉瘤、未分化肉瘤、肺癌、肥大细胞瘤、皮肤平滑肌瘤、腹膜内平滑肌瘤、平滑肌瘤、鳞状细胞癌、慢性淋巴细胞性白血病、淋巴瘤、胃肠淋巴瘤、消化器型淋巴瘤、小细胞至中细胞淋巴瘤、肾上腺髓质瘤、颗粒细胞瘤和嗜铬细胞瘤。
发现来自这些带癌犬生物体的血清中具有显著高的针对重组蛋白质的抗体滴度，如图3所示。当将该诊断方法的恶性肿瘤的参考值确定为健康犬平均值的2倍或更多时，证实有108个样品被诊断为恶性，其为所有样品的50.2％。这些108个样品的癌的种类如下所述。尽管某些样品患有多种类型的癌，但以下所示的数值为每种癌的累计总值。
6例恶性黑素瘤、11例淋巴瘤、1例化脓性炎症、1例颗粒细胞瘤，4例肝细胞癌，3例恶性睾丸瘤，3例口腔瘤，7例肛门周围腺癌、12例肉瘤、35例乳腺癌、1例肺癌、6例腺管癌、2例皮脂腺癌、5例肥大细胞瘤、1例平滑肌肉瘤、3例鳞状细胞癌、2例恶性混合肿瘤、1例血管外皮瘤、1例移行上皮细癌、1例血管外皮瘤、1例血管外皮细胞瘤和1例皮脂腺上皮瘤。
使用从末期癌患病犬采集的胸腔积液和腹水，进行相同的诊断，结果可以检测出与通过使用血清的本诊断方法所得的结果相同的值，可以诊断为癌。
另外，证实了采用本诊断方法可以进行肉眼不可见部位的癌诊断、癌进展程度诊断、恶性程度诊断、或癌术后的追踪诊断、复发诊断、转移诊断等诊断。以下描述了图4所示的详细诊断的几个具体例。
(2)-1肉眼不可见肿瘤的癌诊断
患病犬1(平毛寻回猎犬(flat-coated retriever))在2007年6月7日时间点未确认有肿瘤。但在约20日后即2007年6月24日在该患病犬1左上颌犬齿根的牙龈处发现了蒂状的直径2mm的肿瘤。在发现之日将蒂部结扎并切除。在可以肉眼确认到肿瘤以前，可以确认在450nm处的吸光度为0.06，并且该值与发现肿瘤时确定的0.04几乎一样。由该结果也可证明，通过使用本方法可以诊断肉眼不可见部分的癌，诸如腹腔内癌。
另外，由于在用肉眼可确认肿瘤以前可以确认前述值上升，因此认为成功地检测出了肿瘤发生的前兆。因此，证实了该技术对诸如定期健康检查的体检也有用。
(2)-2癌的进展程度诊断
癌的进展程度基于肿瘤的大小、肿瘤深度、肿瘤如何影响周围组织、转移的存在与否进行判断。已揭示了当发生转移或癌发展时可以检测出更高的值。
(2)-3癌的恶性程度诊断
基底细胞瘤包括恶性基底细胞瘤和良性基底细胞瘤。近年来，根据新WHO，倾向于将恶性基底细胞瘤归类为基底细胞癌的实例，将良性基底细胞瘤归类为毛芽瘤的实例。
诊断为患有基底细胞癌(恶性)的患病犬2(比格犬)在手术时进行血清诊断，结果450nm处的吸光度为0.04。同时，诊断为患有毛芽瘤(良性)的患病犬3(杂种)在手术时进行血清诊断，结果450nm处的吸光度为0，即检测不到。因此，证实了即使均归类为基底细胞瘤的肿瘤也可以被诊断出不同类型的基底细胞瘤，即恶性基底细胞癌和良性毛芽瘤。
接下来，举出乳腺肿瘤的例子。可将乳腺肿瘤分类为诸如乳腺癌或乳腺恶性混合肿瘤的恶性肿瘤、以及未表现出恶性症状的良性乳腺肿瘤。
患病犬4(喜乐蒂牧羊犬(Shetland Sheepdog))于2007年7月17日接受了乳腺癌摘除手术。患病犬4患有3个肿瘤。应用分离的组织进行的病理诊断得出了相同的诊断。强非典型性和侵袭性乳腺组织经历了比较宽范围的乳头状-腺样生长，并且在样品中也证实了血管侵袭。因此，患病犬4被诊断为患有高度恶性乳腺癌。应用手术时收集的血液进行血清学诊断，结果发现450nm的吸光度为0.41。
同时，患病犬5(玩具贵宾犬(toy poodle))于2007年10月9日接受了乳腺癌摘除手术。在这时应用分离的组织进行的病理诊断揭示：尽管肿瘤在乳腺上皮细胞和肌上皮细胞生长的地方形成，但肌上皮细胞的成分是均一的纺锤形细胞，并且没有检测到恶性生长；并且乳腺上皮细胞成分呈现出轻度大小差异，以及观察到核异形。因此，患病犬5诊断为患有良性乳腺癌，因为没有检测到恶性生长。手术时收集血液并进行血清诊断的结果发现，450nm处的吸光度为0。
上述两个样本的结果揭示了高度恶性肿瘤的值比良性的低恶性肿瘤更高。
此外，还检查了54个恶性肿瘤(乳腺癌)样品，诸如乳腺癌或乳腺恶性混合肿瘤样品，以及21个没有显示出恶性的良性乳腺肿瘤样品的诊断分布。虽然良性乳腺肿瘤样品显示出与健康犬类似的分布，但乳腺癌样品显示出很高值的分布。
(2)-4术后追踪诊断
患病犬6(杂种犬)由于肥大细胞瘤而于2005年5月23日入院并进行了摘除手术。此时进行的血清诊断的结果为，450nm处的吸光度为0.10。当肥大细胞是未完全切除时会反复复发或转移的肿瘤。因此，通过手术是否能达到完全的肿瘤摘除是很重要的。在2006年12月19日的追踪观察中，发现450nm处的吸光度为0.05，由此证实了降低的抗体滴度。这一时间，没有证实复发。因此，在患病犬6的情况中，可认为由于肿瘤能被完全切除，因此血清诊断结果比手术时更低。
患病犬7(比格犬)于2008年2月14日由于肥大细胞肿瘤而进行了摘除手术。此时进行的血清诊断的结果为，发现450nm处的吸光度为0.17。应用切除的组织进行组织学诊断，结果观察到了侵袭增生，并且患病犬7被诊断为患有向应用中度分化型(Patnaik II型)的肥大细胞瘤。患病犬7于2008年3月10日入院追踪观察，并再次进行血清诊断。结果，发现450nm处的吸光度为0.07。这一时间，没有证实转移，也没有证实复发。因此，在患病犬7的情况中，可认为由于肿瘤能被完全切除，因此血清诊断结果比手术时更低。
(2)-5复发诊断
患病犬8(雪橇犬(Husky))于2007年5月8日进行乳腺癌摘除手术。此时进行的血清诊断的结果为，发现450nm处的吸光度为0.05。使用摘除的组织进行病理诊断，发现异型性强的上皮细胞增生主要形成腺管结构。因此，患病犬8被诊断为患有乳腺原发性腺癌。此时，已经证实淋巴管内存在许多癌细胞，表明向淋巴结及远位部的转移或复发的风险高。2007年6月28日(自手术约一个半月后)，在相同部位确认到复发。到此时血清诊断的结果为0.09，确认了值升高。在患病犬8的情况下，揭示了由于肿瘤未被完全切除或复发，所以6月下旬的诊断结果比5月上旬更高。
(2)-6转移诊断
患病犬9(苏格兰梗(Scottish terrier))经历了多次转移和复发，包括2003年2月的乳腺肿瘤、2003年8月口腔内恶性黑色素瘤、2005年1月嘴唇恶性黑色素瘤、2005年4月13日口腔内黑色素瘤。上述肿瘤均已通过手术被切除。患病犬9于2005年4月口腔内黑色素瘤复发后，因追踪观察于2006年12月17日再次入院，并进行血清诊断。结果，在450nm处的吸光度为0.09。半年后，患病犬9于2007年6月20日由于颈部淋巴和膝后窝淋巴肥大再次入院。如果为淋巴瘤，则全身淋巴结均肿。患病犬9只有2处淋巴结肿。因此临床诊断患病犬9很可能是因转移引起的淋巴瘤。通过本技术的的诊断，发现450nm处的吸光度升高至0.10，表明该淋巴瘤是由以前的肿瘤发生转移引起的。
患病犬10(Shiba inu)于2006年3月11日因右嘴唇部口腔恶性黑色素瘤进行了肿瘤摘除。患病犬10具有自2006年6月10日至同年9月26日给与抗癌剂(环磷酰胺)的治疗史，以及自2006年5月23日给与有机锗为主成分的Biremo S。于2007年3月20日移除了认为从之前的肿瘤转移所致的肿瘤，此时进行血清诊断，结果为发现450nm处的吸光度约为0.03，几乎检测不到。使用此时摘除的组织进行病理诊断，诊断为转移性恶性黑色素瘤。但是，在手术切除转移的黑色素瘤3个月后，即2007年6月27日再次发生转移。2007年3月20日在右颈部产生了肿瘤，但在2007年6月27日在该位置对侧产生了另一肿瘤。肿瘤的形状也形成与前次类似的黑色块。肿瘤大小为3.1×3.2×0.8cm，经临床诊断也为转移。此时进行血清诊断，结果证实450nm处的吸光度升高至0.23，提示为以前存在的肿瘤的转移。
(2)-7使用人CAPRIN-1衍生多肽的癌诊断
应用实施例2制备的人CAPRIN-1的多肽(SEQ ID NO：2)，以与上述类似的方式测定与该多肽反应的犬血清IgG抗体的滴度。应用健康犬的血清检查的结果表明，在450nm处几乎没有检测到吸光度，与上述情况类似。
另一方面，患病犬11(Shih tzu)于2007年6月21日进行了乳腺癌摘除手术。应用切除的组织进行病理诊断，结果患病犬11被诊断为患有中等恶性的乳腺癌，其中除了存在纤维结缔组织某种程度的弥漫性增生外，强异型性且侵袭性的乳腺组织进行腺-管状-乳头状增殖，从而形成大和小块。患病犬11在450nm处的吸光度为0.26。
(3)猫的诊断
接下来，进行带癌猫及健康猫的诊断。使用犬CAPRIN-1的多肽(如上使用)和抗猫IgG抗体，以与上述同样的方法测定与该多肽特异性反应的猫血清中IgG抗体滴度。作为第二抗体，将HRP修饰的抗猫IgG抗体(PEROXIDASE-CONJUGATED GOAT IgG FRACTION TO CAT IgG(WHOLE MOLECULE)：CAPPEL RESERCH REAGENTS)用封闭溶液稀释8000倍，然后使用。
患病猫1(杂种)于2007年5月8日因乳腺癌进行了肿瘤摘除手术。患病猫1在450nm处的吸光度为0.21。另外，2006年10月17日因腺管癌接受了摘除手术的患病猫2(Himalayans)在450nm处的吸光度为0.18。而在健康猫中没有检测到吸光度。
此外，应用实施例2制备的人CAPRIN-1的多肽(SEQ ID NO：2)，以与上述类似的方式测定与该多肽反应的猫血清IgG抗体的滴度。结果，在健康猫的情况下，当固定该多肽时，在450nm处几乎没有检测吸光度。另一方面，患病猫3(American Shorthair)于2008年4月15日进行了乳腺癌摘除手术。应用切除的组织进行病理诊断，结果患病猫3被诊断为患有伴有大和小坏死组织的高度恶性乳腺癌，其中强异型性和侵袭性乳腺组织进行片状生长成大和小块。在患病猫3的情况下，450nm处的吸光度为0.12。
因此，这证实了可与犬类似地通过这一技术诊断猫的癌，因为从患癌猫的样品中检测到值，但是在健康猫的样品中未检测到。
(4)人的癌诊断
应用实施例2制备的人CAPRIN-1的多肽(SEQ ID NO：2)和抗人IgG抗体，测定与该多肽特异性反应的健康人血清IgG抗体的滴度。如下固定所制备的多肽：按100μl/孔将用磷酸盐缓冲生理盐水稀释为100μg/mL的重组蛋白质溶液添加到96孔固定氨基板(immobilizer amino plates)(Nunc)中，在4℃下静置过夜。如下进行封闭。将4克Block Ace粉(DS PHARMABIOMEDICAL Co.，Ltd.)溶解于100ml纯水中，然后该溶液用纯水稀释4倍。然后按100μl/孔添加该溶液(以下称为封闭溶液)，室温下振荡1小时。按100μL/孔添加用封闭溶液稀释1000倍的稀释血清，然后在室温下振荡3小时进行反应。用含有0.05％Tween20(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)的磷酸盐缓冲生理盐水(以下称为PBS-T)洗涤反应溶液3次后，按100μL/孔加入用封闭溶液稀释10000倍的HRP修饰的抗人IgG抗体(HRP-山羊抗人IgG(H+L)缀合物：Zymed Laboratories)，随后室温下振荡溶液反应1小时。用PBS-T洗涤3次后，按照100μl/孔添加HRP底物TMB(1-Step Turbo TMB(四甲基联苯胺)，PIERCE)，然后在室温下进行酶底物反应30分钟。之后，按100μl/孔加入0.5M硫酸溶液(Sigma AldrichJapan)终止反应，然后用微孔板读数仪测定450nm处的吸光度。固定用磷酸盐缓冲生理盐水调节至50μg/ml的白蛋白抗原，然后用作阳性对照。结果，在白蛋白抗原的情况下，7个健康受试者的结果为450nm处的吸光度平均高达0.45，但是在上述多肽的情况下，没有检测到吸光度。
以与上述类似的方法，对来自恶性乳腺癌患者的17份血清样品(购自ProMedDx)进一步进行测定，测定与人来源癌抗原蛋白(SEQ ID NO：3的氨基酸序列)特异性反应的血清IgG抗体滴度。结果，在上述多肽的情况下，450nm处的吸光度高达0.48，这是17例乳腺癌患者的结果平均值。
此外，应用实施例2制备的犬CAPRIN-1多肽(SEQ ID NO：8)和抗人IgG抗体，以与上述类似的方法测定了与该多肽特异性反应的人血清IgG抗体的滴度。结果，7个健康受试者的结果平均值为0.04，而17例乳腺癌患者的结果平均值高达0.55。
基于上述结果，证实了也可通过这一技术检测人的癌。
实施例5：通过测定抗原多肽的癌诊断
联合使用实施例3(1)获得的抗CAPRIN-1-衍生肽(SEQ ID NO：43)的多克隆抗体，以及实施例3(2)中获得的每一个抗CAPRIN-1蛋白的单克隆抗体，通过夹心ELISA法检测样品(来自带癌活体的血清)中含有的该抗原多肽本身，其中所述的样品在实施例4(1)-(3)应用CAPRIN-1多肽进行癌诊断时，反应阳性。该多克隆抗体用作第一抗体，并且每一单克隆抗体用作第二抗体。测定了与每一上述抗体特异性反应的蛋白的血清蛋白水平。
如下固定第一抗体：将用磷酸盐缓冲生理盐水稀释至5μg/ml浓度的多克隆抗体按100μL/孔添加到96孔固定氨基板(Immobilizer Amino Plate)(Nunc)中，室温下振荡2小时。如下进行封闭：按照100μl/孔加入含有0.5％BSA(牛血清白蛋白，Sigma Aldrich Japan)的50mM碳酸氢钠缓冲溶液(pH8.4)(以下称为封闭溶液)，室温下振荡1小时。之后，按100μL/孔添加用封闭溶液稀释的来自带癌活体的血清，然后在室温下振荡3小时进行反应。此时将稀释倍率调整为10倍系列稀释(10-1000倍)。用含有0.05％Tween20(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)的磷酸盐缓冲生理盐水(以下称为PBS-T)清洗3次，按照100μL/孔加入用封闭溶液稀释至1μg/ml的作为第二抗体的每一单克隆抗体，室温下振荡1小时进行反应。用PBS-T清洗3次后，按照100μL/孔加入用封闭溶液稀释5000倍的HRP标记的抗小鼠IgG(H+L)抗体(Invitrogen Corporation)作为第三抗体，室温下静置1小时。用PBS-T清洗3次，按照100μl/孔添加TMB底物溶液(Thermo)，然后静置15-30分钟用于颜色反应。颜色显现后，按100μl/孔加入1N硫酸终止反应，然后用吸收分光计测定450nm处的吸光度。
结果，当使用与癌细胞表面反应的#1-#10单克隆抗体作为第二抗体时，对所有来自患有乳腺癌、恶性黑素瘤等的带癌犬和带癌猫的样品检测到0.3或更高的吸光值(多肽水平)，然而在健康犬和健康猫中没有检测到吸光度。另一方面，当将与CAPRIN-1蛋白本身反应，但不与癌细胞表面反应的单克隆抗体用作第二抗体时，对所有样品检测到多肽水平，但吸光值均为0.05或以下，其比联合使用与癌细胞表面反应的抗体时得到的结果更低。
因此，通过这一包括应用抗CAPRIN-1抗体检测抗原多肽的技术，可诊断癌。
工业实用性
本发明在工业上可用于诊断或检测癌。
本说明书包括日本专利申请号2008-202320的说明书和/或附图的全部或部分公开内容，其中所述申请为本申请的优先权文件。此外，本文中引用的全部出版物、专利和专利申请也通过引用的方式完整并入本文中。
序列表独立文本
SEQ ID NO：31-42：引物
Claims (22)
1.用于检测癌的方法，其包括测定从生物体分离的样本中通过抗原抗体反应而与抗CAPRIN-1蛋白抗体具有结合反应性的多肽的表达，其中所述的CAPRIN-1蛋白具有序列表中偶数编号的SEQ ID NO：2-30所示的任一氨基酸序列。
2.根据权利要求1的方法，其中待测定的多肽是具有偶数编号的SEQID NO：2-30所示任一氨基酸序列的CAPRIN-1蛋白，或与所述CAPRIN-1蛋白具有85％或更多序列同一性的多肽。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所述的生物体是人、狗或猫。
4.根据权利要求3的方法，其中所述的生物体是狗，并且所述待测定的多肽具有偶数编号的SEQ ID NO：2-30任一项所示的氨基酸序列。
5.根据权利要求4的方法，其中所述的生物体是狗，并且所述待测定的多肽具有SEQ ID NO：6、8、10、12或14所示的氨基酸序列。
6.根据权利要求3的方法，其中所述的生物体是人，并且所述待测定的多肽具有SEQ ID NO：2或4所示的氨基酸序列。
7.根据权利要求1-6任一项的方法，其中通过抗体的免疫测定法测定所述多肽的表达，其中所述抗体可包含于样本中并且是在体内针对待测多肽而被诱导的。
8.根据权利要求1-7任一项的方法，其中所述的样本是血清、血浆、腹水或胸腔积液。
9.根据权利要求1-6任一项的方法，其中通过测定样本中所包含的编码该多肽的mRNA来测定所述多肽的表达。
10.根据权利要求9的方法，包括应用与所述mRNA核苷酸序列中15个或更多个核苷酸的部分序列特异性杂交的多核苷酸检测样本中所述mRNA的存在量。
11.根据权利要求10的方法，其中所述生物体是狗，并且所述多核苷酸是与SEQ ID NO：5、7、9、11或13所示核苷酸序列中15个或更多个核苷酸的部分序列特异性杂交的多核苷酸。
12.根据权利要求10的方法，其中所述生物体是人，并且所述多核苷酸是与SEQ ID NO：1或3所示核苷酸序列中15个或更多个核苷酸的部分序列特异性杂交的多核苷酸。
13.根据权利要求9-12任一项的方法，其中所述样本是组织或细胞。
14.根据权利要求1-13任一项的方法，其中所述的癌是选自以下的至少一种类型：脑肿瘤，头、颈、肺、子宫或食管的鳞状细胞癌，黑素瘤、肺或子宫的腺癌、肾癌、恶性混合瘤、肝细胞癌、基底细胞癌、棘皮瘤样牙龈瘤、口腔瘤、肛门周围腺癌、肛囊瘤、肛囊顶泌腺癌、Sertoli细胞癌、阴道前庭癌、皮脂腺瘤、皮脂腺上皮瘤、脂腺腺瘤、汗腺癌、鼻腔内腺癌、鼻腺癌、甲状腺癌、大肠癌、支气管腺癌、腺癌、腺管癌、乳腺癌、复合型乳腺癌、乳腺恶性混合瘤、乳管内乳头状腺癌、纤维肉瘤、血管外皮瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、软组织肉瘤、组织细胞肉瘤、粘液肉瘤、未分化肉瘤、肺癌、肥大细胞瘤、皮肤平滑肌瘤、腹膜内平滑肌瘤、平滑肌瘤、慢性淋巴细胞性白血病、淋巴瘤、胃肠淋巴瘤、消化器型淋巴瘤、小细胞至中细胞淋巴瘤、肾上腺髓质瘤、颗粒细胞瘤和嗜铬细胞瘤。
15.根据权利要求1-14任一项的方法，包括基于当所述多肽的表达水平比对照高时则癌恶性程度高这一事实来进一步检测癌的恶性程度。
16.根据权利要求1-15任一项的方法，包括基于当所述多肽的表达水平比对照高时则癌进展程度是进展的这一指示来进一步检测癌的进展程度。
17.用于检测癌的试剂，其包含与针对CAPRIN-1蛋白在体内诱导的抗体通过抗原抗体反应具有结合反应性的多肽，其中所述的CAPRIN-1蛋白具有序列表中偶数编号的SEQ ID NO：2-30所示的任一氨基酸序列。
18.用于检测癌的试剂，其包含与多肽进行抗原抗体反应的抗体或其抗原结合片段，其中所述多肽通过抗原抗体反应与抗CAPRIN-1蛋白抗体具有结合反应性并且所述多肽是在体内产生的，其中所述CAPRIN-1蛋白具有序列表中偶数编号的SEQ ID NO：2-30所示的任一氨基酸序列。
19.根据权利要求18的用于检测癌的试剂，其中所述的与多肽进行抗原抗体反应的抗体或其抗原结合片段是与癌细胞表面结合的抗体或其抗原结合片段。
20.根据权利要求18或19的用于检测癌的试剂，其中所述的与多肽进行抗原抗体反应的抗体或其抗原结合片段与下述多肽具有免疫学反应性，
包含除SEQ ID NO：6和18之外偶数编号的SEQ ID NO：2至30所示任一氨基酸序列的氨基酸残基编号50-98或氨基酸残基编号233-305的区域中7个或更多个连续氨基酸残基的氨基酸序列的多肽，或
包含上述多肽为部分序列的多肽。
21.根据权利要求18-20任一项的用于检测癌的试剂，其中所述的与多肽进行抗原抗体反应的抗体或其抗原结合片段是与SEQ ID NO：43结合的抗体或其抗原结合片段，具有SEQ ID NO：44和45的氨基酸序列的单克隆抗体或其抗原结合片段，具有SEQ ID NO：44和46的氨基酸序列的单克隆抗体或其抗原结合片段，具有SEQ ID NO：44和47的氨基酸序列的单克隆抗体或其抗原结合片段，具有SEQ ID NO：44和48的氨基酸序列的单克隆抗体或其抗原结合片段，具有SEQ ID NO：49和50的氨基酸序列的单克隆抗体或其抗原结合片段，具有SEQ ID NO：51和52的氨基酸序列的单克隆抗体或其抗原结合片段，具有SEQ ID NO：53和54的氨基酸序列的单克隆抗体或其抗原结合片段，具有SEQ ID NO：55和56的氨基酸序列的单克隆抗体或其抗原结合片段，具有SEQ ID NO：57和58的氨基酸序列的单克隆抗体或其抗原结合片段，或具有SEQ ID NO：59和60的氨基酸序列的单克隆抗体或其抗原结合片段。
22.用于检测癌的试剂，其包含与序列表中奇数编号的SEQ ID NO：1-29所示任一核苷酸序列中15个或更多个核苷酸的部分序列特异性杂交的多核苷酸。
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