CN102171343A - Fgfr细胞外结构域酸性区突变蛋白 - Google Patents

Abstract

本发明提供成纤维细胞生长因子受体(FGFR)细胞外结构域(ECD)酸性区突变蛋白，其通过增加D1-D2接头区内的酸性氨基酸残基数目而被改造为表现出减少的组织结合。还提供了编码FGFR ECD酸性区突变蛋白的多核苷酸。还提供了制备FGFR ECD酸性区突变蛋白的方法，和使用所述分子治疗增生性病症的方法，所述增生性病症包括癌症、生血管病症和黄斑变性。

Description

FGFR细胞外结构域酸性区突变蛋白

本申请依据35 U.S.C.§119(e)要求于2008年8月4日提交的美国临时申请号61/086,121的优先权益，将其通过引用完全结合于此。

技术领域

本发明涉及通过增加D1-D2接头区内的酸性氨基酸残基数目而被改造为表现出减少的组织结合的成纤维细胞生长因子受体(FGFR)细胞外结构域(ECDs)。本发明还涉及包括或编码所述分子的多肽和多核苷酸序列、载体、宿主细胞、组合物、和试剂盒。本发明还涉及制备和使用FGFR ECD酸性区突变蛋白来治疗增生性病症的方法，所述增生性病症包括癌症、生血管病症和黄斑变性。

背景技术

成纤维细胞生长因子(FGFs)及其受体(FGFRs)是一组高度保守的蛋白，其在血管生成、血管发生和伤口愈合中以及在胚胎发育中的组织模式发育和肢体形成中具有帮助性作用。FGFs和FGFRs影响细胞迁移、增殖、和存活，对健康和疾病提供宽泛的影响。

FGFR家族包括4种主要类型的受体，即FGFR1，FGFR2，FGFR3，和FGFR4。这些受体是跨膜蛋白，其具有细胞外结构域(ECD)，跨膜结构域，和细胞质内酪氨酸激酶结构域。每个细胞外结构域包含两个或三个免疫球蛋白(Ig)结构域。当存在三个Ig结构域时，它们被称为D1，D2，和D3。具有两个Ig结构域的受体典型地缺少D1。酸性基序，被称为酸性盒，在FGFR细胞外结构域中位于D1和D2之间的接头区中。FGFRs的D2结构域包含肝素结合位点。FGFR4还在D1中包含肝素结合位点。认为所述酸性盒与D2结构域中的肝素结合位点相互作用。此外，已经表明，FGFR1和FGFR3 D1结构域能够与D2和D3结构域相互作用。已经假设，FGFR1酸性盒-介导的与D2结构域的相互作用，FGFR1 D1结构域-介导的与D2和D3结构域的相互作用起自身抑制作用，其在不存在FGF配体条件下防止受体寡聚化。最后，通过FGF配体与FGFR结合激活细胞外FGFR起始细胞内的信号传导事件的级联，其以受体的寡聚化和受体酪氨酸激酶活性的激活为开始。

迄今为止，存在22种已知的FGFs，每种具有结合一种或多种FGFRs的能力。参见，例如，Zhang等，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)281：15，694-15,700(2006)。一些FGFs可以结合并且激活一种或多种FGFRs中的任一种，通常在其针对不同FGFRs的亲和性方面具有很大差异。在某些情况下，FGFs与FGFRs的结合需要硫酸肝素蛋白聚糖(“肝素”)。参见，例如，Ornitz等，Mol.Cell Biol.(分子细胞生物学)12：240(1992)。例如，由FGFR1介导的针对FGF2(还称为碱性FGF(basic FGF)(bFGF))的促有丝分裂响应已经显示依赖于肝素的存在。参见，例如，Ornitz等，Mol.CellBiol.(分子细胞生物学)12：240(1992)。

概述

特别地，FGFR4细胞外结构域(“ECD”)以高亲和力结合FGF2和FGF19配体。使用FGFR4 ECD作为进行结合的‘配体阱(ligand trap)’，例如，游离的FGF2和FGF19，人们可以有效地治疗增生性病症，包括癌症、生血管病症和黄斑变性。使用纯化的野生型FGFR4ECD Fc融合体(“FGFR4ECD Fc融合体”)进行的实验表明，当使用静脉内(IV)方法施用给小鼠时，它们表现出很低的生物利用率和短的血清半衰期，这至少部分是由于过多的组织结合。参见图4和表5。相反，FGFR1 ECD的Fc融合体表现出较高的生物利用率和血清半衰期。此外，FGFR4 ECD Fc融合体表现出与细胞外基质(ECM)成分的高水平的体外结合，而FGFR1，FGFR2，或FGFR3 ECD的Fc融合体表现出最小或不可检测的ECM结合水平。参见图5。

如上文所示，FGFRs典型地在D1和D2结构域之间包含酸性基序，其称为酸性盒。D1结构域和包含酸性盒的D1-D2接头区，与FGFR4和另外三种FGFRs之间的D2和D3结构域相比，更加趋异。此外，与FGFR4酸性盒相比，FGFR1，FGFR2，和FGFR3酸性盒均包含更多数量的酸性氨基酸残基。分别参见图11A，11B，和11C。基于本文所述的实验，我们假设相对“弱”的FGFR4酸性盒，其包含比FGFR1，FGFR2，和FGFR3酸性盒少的酸性氨基酸残基，可能在防止组织结合方面效果较弱，因此可能是造成在体外观察到的较多的FGFR4ECD Fc融合体的ECM结合的原因。

我们已经改造了FGFR4ECDs，称为FGFR4ECD酸性区突变蛋白，其在D1-D2接头内的酸性残基总数增加，因此具有“更强的”酸性盒区以减少ECM结合，并且潜在地减少体内的组织结合和增加FGFR4 ECD融合蛋白的生物利用率。我们已经发现，在D1-D2接头内包含增多数量的酸性残基的FGFR4ECD酸性区突变蛋白表现出减少的ECM结合。我们还发现某些FGFR4ECD酸性区突变蛋白表现出减少的组织结合和增加的生物利用率。因此，通过增加D1-D2接头内的酸性残基总数，由此“加强”FGFR4酸性盒，我们改造了具有改善特性的FGFR4ECD酸性区突变蛋白，包括减少的ECM结合和减少的组织结合，其又可以引起FGFR4ECD融合蛋白的提高的生物利用率。

在一种产生“更强的”FGFR4 ECD酸性区突变蛋白的方法中，我们已经用酸性氨基酸残基置换某些非酸性氨基酸残基，以致相对于野生型FGFR4 ECD长酸性盒，在FGFR4 ECD长酸性盒内的酸性残基总数增加。这种FGFR4 ECD酸性区突变蛋白在本文中称为“FGFR4 ECD长酸性盒变体”。我们发现，与野生型FGFR4 ECD长酸性盒相比，多包含两个酸性氨基酸残基的FGFR4 ECD长酸性盒变体表现出减少的ECM结合。参见图14。在长酸性盒内多包含4个酸性氨基酸残基的FGFR4 ECD长酸性盒变体表现出甚至进一步减少的ECM结合。参见id。

在另一种产生“更强的”FGFR4 ECD酸性区突变蛋白的方法中，我们已经用FGFR1，FGFR2，或FGFR3的D1-D2接头区的全部或部分替换FGFR4D1-D2接头区的全部或部分，以产生FGFR4 ECD酸性区突变蛋白种类中的多肽，在本文中称为“FGFR4 ECD酸性区嵌合体”。FGFR4 ECD酸性区嵌合体包括FGFR4 ECD D1-D2接头嵌合体，FGFR4 ECD外显子4嵌合体，FGFR4 ECD酸性盒嵌合体，FGFR4 ECD长酸性盒嵌合体，和FGFR4 ECD短酸性盒嵌合体。我们发现，至少某些FGFR4 ECD D1-D2接头嵌合体，FGFR4 ECD外显子4嵌合体，和FGFR4 ECD酸性盒嵌合体保留结合FGF2和FGF19二者的能力，但是当与母体FGFR4 ECD Fc融合体相比较时，表现出减少的体外ECM结合水平。参见表3和4，以及图6和12。此外，当与母体FGFR4 ECD Fc融合体相比较时，FGFR4 ECD酸性区嵌合体表现出减少的与肝细胞表面的结合。参见图7。通过邻近FGFR4ECD D1-D2接头的氨基端或在D2肝素结合位点处引入N-多糖突变，进一步减少FGFR4酸性区嵌合体的体外ECM结合。参见图15。

在体内研究中，相对于母体FGFR4 ECD Fc融合体，FGFR4 ECD酸性区突变蛋白表现出基本上提高的生物利用率和血清半衰期。参见图8。与对照组相比较，在某些肿瘤模型中，注射了FGFR4ECD酸性区突变蛋白的小鼠在肿瘤负荷方面表现出统计学显著的减少，这表明FGFR4 ECD酸性区突变蛋白在体内具有与所施用的FGFR4 ECDs相似的抗肿瘤活性。参见图9。因此，例如，FGFR4 ECD酸性区突变蛋白可以用于治疗增生性病症，包括癌症、生血管病症和黄斑变性。

与母体FGFR4 ECD-Fc相比，FGFR2 ECD-Fc和FGFR3 ECD-Fc两种融合蛋白均表现出显著更低的ECM结合水平，然而，与较高蛋白浓度的FGFR1 ECD-Fc融合蛋白相比，它们表现出稍高的ECM结合水平。参见图5。尽管FGFR2和FGFR3酸性盒包含比FGFR4酸性盒更多数量的酸性氨基酸残基，它们均包含比FGFR1酸性盒更少的酸性氨基酸残基。分别见图11D和11E。体外ECM结合实验表明，相对于母体FGFR2和FGFR3ECDs，在FGFR2和FGFR3长酸性盒内的酸性残基总数增加的FGFR2和FGFR3 ECD酸性区突变蛋白表现出减少的ECM结合。分别参见图17A和17B。

在某些实施方案中，可以改造FGFR1，FGFR2，和FGFR3 ECDs以使D1-D2接头内的酸性残基总数减少，由此产生“较弱的”酸性盒，从而增加FGFR1，FGFR2，和FGFR3 ECD融合蛋白的体内组织结合，并且减少其生物利用率。所述“弱化的”FGFR1，FGFR2，和FGFR3 ECDs可以有效用于，例如，当局部递送时，防止可能随系统施用发生的毒性和/或副作用。

在某些实施方案中，提供了包含FGFR4 ECD酸性区突变蛋白的多肽。在某些实施方案中，提供包含FGFR4 ECD酸性区突变蛋白的分离的多肽。在某些实施方案中，FGFR4 ECD酸性区突变蛋白是FGFR4ECD D1-D2接头嵌合体。在某些实施方案中，FGFR4 ECD D 1-D2接头嵌合体包含替代FGFR4 D1-D2接头的D1-D2接头，所述D1-D2接头选自FGFR1 D1-D2接头，FGFR2 D1-D2接头，和FGFR3 D1-D2接头。在某些实施方案中，所述FGFR4 ECD D1-D2接头嵌合体包含选自SEQ ID NOs：22，26，28，和32的氨基酸序列，以替代选自SEQ ID NOs：16和17的FGFR4 D1-D2接头。在某些实施方案中，FGFR4 ECD D1-D2接头嵌合体包含选自SEQ ID NOs：35-38的氨基酸序列。

在某些实施方案中，FGFR4 ECD酸性区突变蛋白是FGFR4 ECD外显子4嵌合体。在某些实施方案中，FGFR4 ECD外显子4嵌合体包含替代FGFR4外显子4的外显子4，所述替代的FGFR4外显子4的外显子4选自FGFR1外显子4，FGFR2外显子4，和FGFR3外显子4。在某些实施方案中，FGFR4 ECD外显子4嵌合体包含选自SEQ ID NOs：23，92，29，和33的氨基酸序列以替代选自SEQ ID NOs：18和19的FGFR4 D1-D2接头。在某些实施方案中，FGFR4 ECD外显子4嵌合体包含选自SEQ ID NOs：39-42的氨基酸序列。

在某些实施方案中，FGFR4 ECD酸性区突变蛋白是FGFR4 ECD酸性盒嵌合体。在某些实施方案中，FGFR4 ECD酸性盒嵌合体包含选自FGFR1酸性盒，FGFR2酸性盒，和FGFR3酸性盒的酸性盒以替代FGFR4酸性盒。在某些实施方案中，FGFR4 ECD酸性盒嵌合体包含选自SEQ ID NOs：24，30，和34的氨基酸序列以替代氨基酸序列为SEQ ID NO：20的FGFR4酸性盒。在某些实施方案中，FGFR4 ECD酸性盒嵌合体包含选自FGFR1酸性盒区，FGFR2酸性盒区，和FGFR3酸性盒区的酸性盒区以替代FGFR4酸性盒。在某些实施方案中，FGFR4 ECD酸性盒嵌合体包含选自SEQ ID NOs：56-65的氨基酸序列，以替代具有氨基酸序列SEQ ID NO：20的FGFR4酸性盒。在某些实施方案中，FGFR4 ECD酸性盒嵌合体包含选自FGFR1酸性盒区，FGFR2酸性盒区，和FGFR3酸性盒区的酸性盒区以替代FGFR4酸性盒区。在某些实施方案中，FGFR4 ECD酸性盒嵌合体包含选自SEQ ID NOs：56-65的氨基酸序列以替代具有选自SEQ ID NOs：46-55的氨基酸序列的FGFR4酸性盒区。在某些实施方案中，FGFR4 ECD酸性盒嵌合体包含氨基酸序列为SEQ ID NO：56的FGFR1酸性盒区以替代氨基酸序列为SEQ ID NO：51的FGFR4酸性盒区。在某些实施方案中，FGFR4 ECD酸性盒嵌合体包含选自FGFR1酸性盒，FGFR2酸性盒，和FGFR3酸性盒的酸性盒以替代FGFR4酸性盒区。在某些实施方案中，FGFR4ECD酸性盒嵌合体包含选自SEQ ID NOs：24，30，和34的氨基酸序列以替代具有选自SEQ ID NOs：46-55的氨基酸序列的FGFR4酸性盒区。在某些实施方案中，FGFR4ECD酸性盒嵌合体包含选自SEQ ID NOs：43-45和157的氨基酸序列。

在某些实施方案中，FGFR4ECD酸性区嵌合体是FGFR4 ECD长酸性盒嵌合体。在某些实施方案中，所述FGFR4ECD长酸性盒嵌合体包括选自FGFR1长酸性盒，FGFR2长酸性盒，和FGFR3长酸性盒的长酸性盒以替代FGFR4长酸性盒。在某些实施方案中，FGFR4长酸性盒嵌合体包括选自SEQ ID NOs：98-100的氨基酸序列以替代选自SEQ ID NOs：96和97的FGFR4长酸性盒。在某些实施方案中，FGFR4长酸性盒嵌合体包括选自SEQ ID NOs：105-107的氨基酸序列。

在某些实施方案中，FGFR4 ECD酸性区突变蛋白是FGFR4 ECD短酸性盒嵌合体。在某些实施方案中，所述FGFR4 ECD短酸性盒嵌合体包括选自FGFR1短酸性盒，FGFR2短酸性盒，和FGFR3短酸性盒的短酸性盒以替代FGFR4短酸性盒。在某些实施方案中，FGFR4 ECD短酸性盒嵌合体包括选自SEQ ID NOs：102-104的氨基酸序列以替代氨基酸序列为SEQ ID NO：101的FGFR4短酸性盒。在某些实施方案中，FGFR4 ECD短酸性盒嵌合体包括选自SEQ ID NOs：108-110的氨基酸序列。

在某些实施方案中，FGFR4 ECD酸性区突变蛋白是FGFR4 ECD长酸性盒变体。在某些实施方案中，所述FGFR4 ECD长酸性盒变体包括FGFR4 ECD的变体，其相对于FGFR4野生型长酸性盒在长酸性盒中具有增加数量的酸性氨基酸残基。在某些这样的实施方案中，在FGFR4 ECD的长酸性盒中的至少两个、三个、或四个非酸性残基每一个独立地用选自Glu(E)和Asp(D)的酸性残基替代。在某些这样的实施方案中，将至少一个酸性残基插入到SEQ ID NOs：1和2的氨基酸103和104之间。在某些实施方案中，将两个酸性残基插入到SEQ ID NOs：1和2的氨基酸103和104之间。在某些这样的实施方案中，FGFR4长酸性盒中酸性残基的数目是至少7个。在某些这样的实施方案中，FGFR4 ECD残基104-114(SEQ ID NO：145)用FGFR1 ECD残基106-117(SEQ ID NO：149)替代；FGFR4 ECD残基104-114(SEQ ID NO：145)用FGFR1ECD残基107-117(SEQ ID NO：150替代)；FGFR4 ECD残基104-110(SEQ ID NO：146)用FGFR1 ECD残基105-113(SEQ ID NO：151)替代；FGFR4 ECD残基113-116(SEQ ID NO：147)用FGFR1 ECD残基116-119(SEQ ID NO：152)替代；或FGFR4 ECD残基109-113(SEQ ID NO：148)用FGFR1 ECD残基112-116(SEQ ID NO：153)替代。在某些这样的实施方案中，FGFR4 ECD残基104-114(SEQ ID NO：145)用FGFR1 ECD残基106-117(SEQ ID NO：149)替代；FGFR4 ECD残基104-114(SEQ ID NO：145)用FGFR1ECD残基107-117(SEQ ID NO：150)替代；FGFR4 ECD残基104-110(SEQ ID NO：146)用FGFR1 ECD残基105-113(SEQ ID NO：151)替代；FGFR4 ECD残基113-116(SEQ ID NO：147)用FGFR1 ECD残基116-119(SEQ ID NO：152)替代；或FGFR4 ECD残基109-113(SEQ ID NO：148)用FGFR1 ECD残基112-116(SFQ ID NO：153)替代。

在某些实施方案中，提供FGFR4ECD融合分子，其包括FGFR4ECD酸性区突变蛋白和融合配偶体。在某些实施方案中，提供分离的FGFR4 ECD融合分子，其包括FGFR4 ECD酸性区突变蛋白和融合配偶体。在某些实施方案中，提供这样的FGFR4 ECD融合分子，其包括选自SEQ ID NOs：35-45，105-121，和157的氨基酸序列。在某些实施方案中，提供这样的分离的FGFR4 ECD融合分子，其包括选自SEQ ID NOs：35-45，105-121，和157的氨基酸序列。在某些实施方案中，提供包括氨基酸序列SEQ ID NO：35的FGFR4 ECD融合分子。在某些实施方案中，提供包括氨基酸序列SEQ ID NO：35的分离的FGFR4 ECD融合分子。在某些实施方案中，所述融合配偶体选自Fc，白蛋白，和聚乙二醇。在某些实施方案中，所述融合配偶体是Fc。在某些实施方案中，提供这样的FGFR4 ECD融合分子，其包括选自SEQ ID NOs：86-88，124-140，143，144，和158的氨基酸序列。在某些实施方案中，提供这样的分离的FGFR4 ECD融合分子，其包括选自SEQ ID NOs：86-88，124-140，143，144，和158的氨基酸序列。在某些实施方案中，提供包括氨基酸序列SEQ ID NO：86的FGFR4 ECD融合分子。在某些实施方案中，提供包括氨基酸序列SEQ ID NO：86的分离的FGFR4ECD融合分子。在某些实施方案中，提供由氨基酸序列SEQ ID NO：86组成的FGFR4ECD融合分子。在某些实施方案中，提供由氨基酸序列SEQ ID NO：86组成的分离的FGFR4 ECD融合分子。

在某些实施方案中，提供包括FGFR4 ECD酸性区突变蛋白和药用载体的药物组合物。在某些实施方案中，提供包括编码FGFR4 ECD酸性区突变蛋白的核酸序列的多核苷酸。

在某些实施方案中，提供治疗患者中的生血管病症的方法，所述方法包括向所述患者施用包括FGFR4 ECD酸性区突变蛋白的药物组合物。在某些实施方案中，提供治疗患者中的癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用包括FGFR4ECD酸性区突变蛋白的药物组合物。在某些实施方案中，所述癌症选自结肠癌、肝癌、肺癌、乳腺癌和前列腺癌。在某些实施方案中，提供治疗患者中的黄斑变性的方法，所述方法包括向所述患者施用包括FGFR4ECD酸性区突变蛋白的药物组合物。

在某些实施方案中，所述FGFR4酸性区突变蛋白包括至少一个抑制糖基化的点突变。在某些实施方案中，所述至少一个抑制糖基化的点突变选自N91A，N156A，N237A，N269A，N290A，和N301A。在某些实施方案中，所述FGFR4酸性区突变蛋白包括选自SEQ ID NOs：120，121，和168的氨基酸序列。

在某些实施方案中，提供FGFR2 ECD酸性区突变蛋白。在某些实施方案中，所述FGFR2 ECD酸性区突变蛋白是FGFR2 ECD短酸性盒嵌合体。在某些实施方案中，所述FGFR2 ECD短酸性盒嵌合体包括至少所述FGFR1短酸性盒以替代至少所述FGFR2短酸性盒。在某些这样的实施方案中，FGFR2 ECD残基111-118(SEQ ID NO：155)用FGFR1 ECD残基105-112(SEQ ID NO：154)替代。在某些实施方案中，所述FGFR2 ECD短酸性盒嵌合体包括氨基酸序列SEQ ID NO：122。

在某些实施方案中，提供FGFR3 ECD酸性区突变蛋白。在某些实施方案中，所述FGFR3 ECD酸性区突变蛋白是FGFR3 ECD短酸性盒嵌合体。在某些实施方案中，所述FGFR3 ECD短酸性盒嵌合体包括至少所述FGFR1短酸性盒以替代至少所述FGFR3短酸性盒。在某些这样的实施方案中，FGFR3 ECD残基110-117(SEQ ID NO：156)用FGFR1 ECD残基105-112(SEQ ID NO：154)替代。在某些实施方案中，所述FGFR3 ECD短酸性盒嵌合体包括氨基酸序列SEQ ID NO：123。

附图简述

图1显示具有17个氨基酸C端缺失的FGFR4的细胞外结构域(ECD)氨基酸序列，其与母体FGFR4 ECD-Fc中的Fc结构域融合(在本文中也称为“R4Mut4”)。图1中的氨基酸序列包括信号肽，其在成熟的融合蛋白中被裂解掉。数字是指氨基酸位置，并且在ECD内的某些结构域在氨基酸数字上以灰色表示。信号肽内的氨基酸位置表示为负值，这是因为它们在成熟的融合蛋白中被裂解掉。成熟的融合蛋白的第一氨基酸残基被指定为氨基酸位置1。第一和第二Ig结构域之间的接头(在本文中可互换地称为“接头结构域”、“接头区”“D1-D2接头”和“D1-D2接头区”)以深灰色表示。

图2显示来自FGFR1和FGFR4的接头结构域的序列比对和称为FGFR4ECD(ABMut1：△17)-Fc(ABMut1)，FGFR4ECD(ABMut2：△17)-Fc(ABMut2)，和FGFR4ECD(ABMut3：△17)-Fc(ABMut3)的三种变体交换区(swapped region)的边界和序列。D1-D2接头内的酸性残基用下划线和粗体字表示。

图3显示如在实施例5中所述通过流式细胞术检测的R1Mut4，三种不同R4Mut4制备物，R4Mut4加肝素，和IgG对照与肝细胞的结合。细胞(计数)的数目显示在Y轴上，X轴显示以对数单位表示的相对荧光信号。

图4是如在实施例6中所述与或不与肝素一起施用的R4Mut4在小鼠中的血浆浓度(ng/ml)的图示。血浆浓度显示在Y轴上，并且使用FGF2-结合ELISA确定。X轴表示在施用后经过的时间。虚线表示ELISA中可重复的R4Mut4检测性的下限(约156ng/ml)。每个数据点表示来自5只动物的平均值，误差条表示平均值的标准误差。

图5显示如在实施例7中所示的商购FGFR1 ECD-Fc，FGFR2 ECD-Fc，FGFR3 ECD-Fc，和FGFR4 ECD-Fc与基质胶板的结合。X轴表示Fc融合蛋白的浓度，Y轴表示在用OPD底物温育结合的Fc融合蛋白后在450nm处的吸光度。所有的结合反应一式三份进行，并且数据点表示获得的平均值。

图6显示如在实施例9中所述的R1Mut4，R4Mut4，以及FGFR4 ECD酸性区嵌合体ABMut1，ABMut2，和ABMut3与基质胶板的结合。X轴表示Fc融合蛋白的浓度，Y轴表示在用OPD底物温育结合的Fc融合蛋白后在450nm处的吸光度。所有的结合反应一式三份进行，并且数据点表示获得的平均值。

图7显示如在实施例10中所述的通过流式细胞术检测的R1Mut4，R4Mut4，FGFR4ECD酸性区嵌合体ABMut1，ABMut2，和ABMut3，以及IgG对照与肝细胞的结合。细胞数目(计数)显示在Y轴上，X轴显示以对数单位表示的相对荧光信号。

图8是在将R4Mut4和ABMut1施用给小鼠后它们的血浆浓度(ng/ml)的图示，如实施例11所述。血浆浓度显示在Y轴上，并且使用FGF2-结合ELISA确定。X轴显示施用后经过的时间。虚线表示在ELISA中可重复的R4Mut4检测性的下限(约8ng/ml)。在图中包括每个时间点来自5只单位的数据。

图9显示在实施例12中所述的异种移植实验的结果。将小鼠接种肿瘤细胞，并且在施用R4Mut4，ABMut1，或单独的赋形剂后测量肿瘤生长。肿瘤的尺寸显示在Y轴上，并且在肿瘤接种后的天数显示在X轴上。每个治疗组的给药时间方案显示在表9中，并且在第14和21天每个治疗组的p值显示在表10中。

图10显示FGFR4ECD酸性区的氨基酸序列，以及在所述FGFR4 ECD酸性区内的如本文定义的某些区域的位置。

图11显示(A)FGFR4 ECD酸性区和FGFR1 ECD酸性区，(B)FGFR4ECD酸性区和FGFR2 ECD酸性区，(C)FGFR4 ECD酸性区和FGFR3 ECD酸性区，(D)FGFR1 ECD酸性区和FGFR2ECD酸性区，以及(E)FGFR1ECD酸性区和FGFR3 ECD酸性区之间的氨基酸序列比对。

图12显示在CHO或293-T细胞中表达的高浓度R4Mut4和ABMut1融合蛋白与基质胶板的结合，如在实施例13中所述。X轴显示Fc融合蛋白的浓度，Y轴显示在用OPD底物温育所结合的Fc融合蛋白后在450nm处的吸光度。

图13显示R1Mut4，R4Mut4，ABMut1，R4Mut4(N104D)，R4Mut4(P109D)，R4Mut4(R113E)，和R4Mut4(S116E)融合蛋白与基质胶板的结合，如在实施例14中所述。X轴显示Fc融合蛋白的浓度，Y轴显示在用OPD底物温育所结合的Fc融合蛋白后在450nm处的吸光度。

图14显示R1Mut4，R4Mut4，ABMut1，R4(104-114):R1(106-117)，R4(104-114):R1(107-117)，R4(104-110):R1(105-113)，R4(113-116):R1(116-119)，和R4(109-113):R1(112-116)融合蛋白与基质胶板的结合，如在实施例15中所述。X轴显示Fc融合蛋白的浓度，Y轴显示在用OPD底物温育所结合的Fc融合蛋白后在450nm处的吸光度。

图15显示R4Mut4，ABMut1，ABMut1(N91A)，和ABMut1(N159A)融合蛋白与基质胶板的结合，如在实施例16中所述。X轴显示Fc融合蛋白的浓度，Y轴显示在用OPD底物温育所结合的Fc融合蛋白后在450nm处的吸光度。

图16显示R1Mut4，R4Mut4，ABMut1，R4(D1-D2):R2(D1-D2)，和R4(D1-D2):R3(D1-D2)融合蛋白与基质胶板的结合，如在实施例17中所述。X轴显示Fc融合蛋白的浓度，Y轴显示在用OPD底物温育所结合的Fc融合蛋白后在450nm处的吸光度。

图17显示FGFR2ECD-Fc，FGFR3ECD-Fc，R2(111-118):R1(105-112)，和R3(110-117):R1(105-112)融合蛋白与基质胶板的结合，如在实施例18中所述。X轴显示Fc融合蛋白的浓度，Y轴显示在用OPD底物温育所结合的Fc融合蛋白后在450nm处的吸光度。

某些实施方案详述

本文所用的部分标题仅是用于组织目的，不应该解释为限制所述的主题。

定义

除非另外定义，与本发明联系使用的科学技术术语应该具有本领域普通技术人员通常所理解的意思。此外，除非上下文另外需要，单数术语应该包括复数，并且复数术语应该包括单数。

与重组DNA、寡核苷酸合成、组织培养和转化(例如，电穿孔、脂质转染)、酶学反应、和纯化技术相联系所用的某些技术是本领域中已知的。例如，许多这样的技术和步骤特别记述在Sambrook等Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)(第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(冷泉港实验室出版社)，Cold Spring Harbor，纽约(1989))中。另外，关于化学合成、化学分析、药物制备、配制、和递送以及患者的治疗的某些技术在本领域中也是已知的。

在本申请中，除非另外指明，使用“或”意指“和/或”。在多项从属权利要求的情形中，使用“或”是指以择一方式引用多于一项前述独立或从属权利要求。此外，术语如“要素”或“成分”包括包含一个单位的要素和成分以及包括多于一个亚单位的要素和成分，除非特别另外指明。

如依据本公开内容所使用的，下述术语，除非另外指明，应该理解为具有下述意思：

术语“核酸分子”和“多核苷酸”可以互换使用，并且是指核苷酸的聚合物。所述核苷酸的聚合物可以包含天然和/或非天然的核苷酸，并且包括，但不限于，DNA，RNA，和PNA。

术语“多肽”和“蛋白”互换使用，并且是指氨基酸残基的聚合物。所述氨基酸残基的聚合物可以包含天然的和/或非天然的氨基酸残基，并且包括，但不限于，肽，寡肽，氨基酸残基的二聚体、三聚体、和多聚体。术语“多肽”和“蛋白”包括天然和非天然的氨基酸序列，以及全长蛋白及其片段。这些术语还包括翻译后修饰的多肽和蛋白，包括，例如，糖基化的，唾液酸化的，乙酰化的，和/或磷酸化的多肽和蛋白。

术语“酸性氨基酸，”“酸性氨基酸残基，”和“酸性残基”在本文中互换使用，并且是指在生理pH下带负电荷的氨基酸残基。酸性氨基酸包括，但不限于，天冬氨酸(Asp，D)和谷氨酸(Glu，E)。

术语“非-酸性氨基酸，”“非-酸性氨基酸残基，”和“非-酸性残基”互换使用并且是指在生理pH下不带负电荷的氨基酸残基。

术语“FGFR细胞外结构域”和“FGFR ECD”包括FGFR1 ECDs，FGFR2 ECDs，FGFR3 ECDs，和FGFR4 ECDS，如本文定义。

术语“FGFR1细胞外结构域”和“FGFR1 ECD”包括天然的FGFR1ECDs，FGFR1 ECD片段，和FGFR1 ECD变体。当用在本文时，术语“天然FGFR1 ECD”是指具有选自SEQ ID NOs：21和25的氨基酸序列的FGFR1ECD。当用在本文时，术语“FGFR1 ECD片段”是指具有选自SEQ ID NOs：21和25的氨基酸序列的多肽，但是其中已从氨基端和/或羧基端删除氨基酸残基，其中所述片段能够结合FGF2。当用在本文时，术语“FGFR1 ECD变体”是指延伸到细胞外空间的FGFR1多肽的部分的变体和其包括D1，D2，和D3的片段的变体，其中所述变体能够结合FGF2。所述变体可以包含氨基酸添加，缺失，和置换，条件是所述FGFR1 ECD变体保持能够进行配体结合。

在某些实施方案中，FGFR1 ECD缺少信号肽。在某些实施方案中，FGFR1 ECD包括至少一个信号肽，其可以选自天然FGFR1信号肽和/或异源信号肽。

术语“FGFR2细胞外结构域”和“FGFR2 ECD”包括天然的FGFR2ECDs，FGFR2 ECD片段，和FGFR2 ECD变体。当用在本文时，术语“天然的FGFR2 ECD”是指具有SEQ ID NO：27的氨基酸序列的FGFR2 ECD。当用在本文时，术语“FGFR2 ECD片段”指具有选自SEQ ID NO：27的氨基酸序列的多肽，但是其中已从氨基端和/或羧基端删除了氨基酸残基，其中所述片段能够结合FGF2。非限制性的示例性FGFR2 ECD片段具有SEQ IDNO：160的氨基酸序列，其与氨基酸序列SEQ ID NO：27相对应，但是具有最后三个删除的羧基端氨基酸残基，YLE。当用在本文时，术语“FGFR2ECD变体”是指延伸到细胞外空间的FGFR2多肽的部分的变体以及其包括D1，D2，和D3的片段的变体，其中所述变体能够结合FGF2。所述变体可以包含氨基酸添加，缺失，和置换，条件是所述FGFR2 ECD变体保持能够进行配体结合。FGFR2 ECD变体可以包括在FGFR2 ECD内抑制N-糖基化的氨基酸替换，在本文中可互换地称为“FGFR2 ECD糖基化突变体”和“FGFR2 ECD N-多糖突变体”。在某些实施方案中，将在FGFR2 ECD内的至少一个氨基酸突变，以防止在所述多肽内在该位点处的糖基化。可以被糖基化的非限制性的示例性FGFR2ECD氨基酸包括在SEQ ID NO：27中的N62，N102，N207，N220，N244，N276，N297，和N310。在FGFR4ECD糖基化突变体中的非限制性的示例性的氨基酸突变包括在SEQ IDNO：27中的N62A，N102A，N207A，N220A，N244A，N276A，N297A，和N310A。

在某些实施方案中，FGFR2ECD缺少信号肽。在某些实施方案中，FGFR2ECD包括至少一个信号肽，其可以选自天然FGFR2信号肽和/或异源信号肽。

术语“FGFR3细胞外结构域”和“FGFR3 ECD”包括天然的FGFR3ECDs，FGFR3 ECD片段，和FGFR3 ECD变体。当用在本文时，术语“天然FGFR3 ECD”是指具有SEQ ID NO：31的氨基酸序列的FGFR3 ECD。当用在本文时，术语“FGFR3 ECD片段”是指具有选自SEQ ID NO：31的氨基酸序列的多肽，但是其中已从氨基端和/或羧基端删除氨基酸残基，其中所述片段能够结合FGF2。非限制性的示例性FGFR3 ECD片段具有氨基酸序列SEQ ID NO：161，其与氨基酸序列SEQ ID NO：31相对应，但是具有最后三个删除的羧基端氨基酸残基，YAG。当用在本文时，术语“FGFR3 ECD变体”是指延伸到细胞外空间的FGFR3多肽的部分的变体及其包括D1，D2，和D3的片段的变体，其中所述变体能够结合FGF2。所述变体可以包含氨基酸添加，缺失，和置换，条件是所述FGFR3 ECD变体保持能够进行配体结合。FGFR3 ECD变体可以在FGFR3 ECD内包括抑制N-糖基化的氨基酸置换，在本文中可互换地称为“FGFR3 ECD糖基化突变体”和“FGFR3 ECD N-多糖突变体”。在某些实施方案中，将在FGFR3 ECD内的至少一个氨基酸突变，以防止在所述多肽内在该位点处的糖基化。可以被糖基化的非限制性的示例性FGFR3 ECD氨基酸包括在SEQ ID NO：31中的N76，N203，N240，N272，N293，和N306。在FGFR3 ECD糖基化突变体中的非限制性的示例性的氨基酸突变包括在SEQ ID NO：31中的N76A，N203A，N240A，N272A，N293A，和N306A。

在某些实施方案中，FGFR3 ECD缺少信号肽。在某些实施方案中，FGFR3ECD包括至少一个信号肽，其可以选自天然FGFR3信号肽和/或异源信号肽。

术语“FGFR4细胞外结构域”和“FGFR4 ECD”包括天然的FGFR4ECDs，FGFR4 ECD片段，和FGFR4 ECD变体。当用在本文时，术语“天然FGFR4 ECD”是指具有选自SEQ ID NOs：1，2，3，和93的氨基酸序列的FGFR4ECD。当用在本文时，术语“FGFR4 ECD片段”是指具有选自SEQID NOs：1，2，3，和93的氨基酸序列的多肽，但是其中已从氨基端删除序列LEASEEVE(SEQ ID NO：70)的全部或一部分和/或已从多肽的羧基端删除序列LPEEDPTWTAAAPEARYTD(SEQ ID NO：71)的全部或一部分，其中所述片段能够结合FGF2和/或FGF19。非限制性的示例性FGFR4 ECD片段具有SEQ ID NOs：6-10和76-81所示的氨基酸序列。当用在本文时，术语“FGFR4ECD变体”是指延伸到细胞外空间的FGFR4多肽的部分的变体及其包括D1，D2，和D3的片段的变体，其中所述变体能够结合FGF2和/或FGF19。所述变体可以包含氨基酸添加，缺失，和置换，条件是所述FGFR4ECD变体保持能够结合FGF2和/或FGF19(参见下文FGFR细胞外结构域的结构/功能关系的讨论)。

FGFR4 ECD变体可以在FGFR4 ECD内包括抑制糖基化的氨基酸置换，在本文可互换地称为“FGFR4ECD糖基化突变体”和“FGFR4 ECDN-多糖突变体”。在某些实施方案中，将在FGFR4ECD内的一个或多个氨基酸突变，以防止在所述多肽内在该位点处的糖基化。可以被糖基化的非限制性的示例性FGFR4 ECD氨基酸包括在SEQ ID NOs：1和2中的N91，N156，N237，N269，N290，和N301。在FGFR4 ECD糖基化突变体中的非限制性的示例性的氨基酸突变包括在SEQ ID NOs：1和2中的N91A，N156A，N237A，N269A，N290A，和N301A。

在某些实施方案中，FGFR4 ECD缺少信号肽。在某些实施方案中，FGFR4 ECD包括至少一个信号肽，其可以选自天然FGFR4信号肽和/或异源信号肽。

术语“FGFR4 2Ig细胞外结构域”和“FGFR4 2Ig ECD”包括FGFR42Ig ECDs，FGFR4 2Ig ECD片段，和FGFR4 2Ig ECD变体。当用在本文时，术语“FGFR4 2Ig ECD”是指包括酸性盒和结构域D2和D3的多肽，其中所述多肽具有选自SEQ ID NOs：1，2，3，和93的氨基酸序列，但是至少一部分D1被删除。示例性的FGFR4 2Ig ECDs具有氨基酸序列SEQ ID NO：94。当用在本文时，术语“FGFR4 2Ig ECD片段”是指FGFR4 2Ig ECD多肽，其中已从多肽的羧基端删除序列LPEEDPTWTAAAPEARYTD(SEQ ID NO：71)的全部或一部分。当用在本文时，术语“FGFR4 2Ig ECD变体”是指上文讨论的FGFR4 2Ig ECDs和FGFR4 2Ig ECD片段的变体，其中所述变体能够结合FGF2和/或FGF19。所述变体可以包含氨基酸添加，缺失，和置换，条件是所述FGFR4 2Ig ECD变体保持能够结合FGF2和/或FGF19(参见下文FGFR细胞外结构域的结构/功能关系的讨论)。

“FGFR4 ECD D1-D2接头嵌合体”是指选自天然FGFR4 ECDs，FGFR4ECD片段，和FGFR4ECD变体的FGFR4ECD，其中在免疫球蛋白样结构域I(D1)和免疫球蛋白样结构域II(D2)之间的所述接头区(在本文可互换地称为“接头结构域，”“接头区”“D1-D2接头，”和“D1-D2接头区”)已用来自FGFR1，FGFR2，或FGFR3的D1-D2接头区替换。所述FGFR4 ECD的D1-D2接头具有序列DSLTSSNDDEDPKSHRDPSNRHSYPQQ(SEQ ID NO：16)，其是SEQ ID NO：1的氨基酸98-124，包括端点在内(inclusive)；或具有序列DSLTSSNDDEDPKSHRDLSNRHSYPQQ(SEQ ID NO：17)，其是SEQ ID NO：2的氨基酸98-124，包括端点在内。FGFR1的D1-D2接头具有序列DALPSSEDDDDDDDSSSEEKETDNTKPNPV(SEQ ID NO：22)，其是SEQ ID NO：21的氨基酸99-128，包括端点在内；或具有序列DALPSSEDDDDDDDSSSEEKETDNTKPNRMPV(SEQ ID NO：26)，其是SEQ ID NO：25的氨基酸99-130，包括端点在内。FGFR2的D1-D2接头具有序列DAISSGDDEDDTDGAEDFVSENSNNKR(SEQ ID NO：28)，其是SEQ ID NO：27的氨基酸105-131，包括端点在内。FGFR3的D1-D2接头具有序列DAPSSGDDEDGEDEAEDTGVDTG(SEQ ID NO：32)，其是SEQ ID NO：31的氨基酸105-127，包括端点在内。某些示例性的FGFR4 ECD D1-D2接头嵌合体包括，但不限于，具有氨基酸序列SEQ ID NOs：35-38的FGFR4 ECD D1-D2接头嵌合体。

“FGFR4 2Ig ECD D1-D2接头嵌合体”是指选自FGFR4 2Ig ECDs，FGFR4 2Ig ECD片段，和FGFR4 2Ig ECD变体的FGFR4 2Ig ECD，其中在免疫球蛋白样结构域I(D1)和免疫球蛋白样结构域II(D2)之间的所述接头区(在本文可互换地称为“接头结构域，”“接头区”“D1-D2接头，”和“D1-D2接头区”)已用来自FGFR1，FGFR2，或FGFR3的D1-D2接头区替换，如上文关于FGFR4 ECD D1-D2接头嵌合体所述。

术语“相对应的氨基酸残基”和“相对应的残基”在本文中互换使用，是指在序列比对中显示的与第二FGFR ECD D1-D2接头区的氨基酸残基或氨基酸序列中的缺口(如用“-”表示)排列的第一FGFR ECD D1-D2接头区的氨基酸残基或氨基酸序列中的缺口(如用“-”表示)。如本文定义，在FGFR4和FGFR1之间的相对应的氨基酸残基显示在图11A中。如本文定义，FGFR4和FGFR2之间相对应的氨基酸残基显示在图11B中。如本文定义，FGFR4和FGFR3之间相对应的氨基酸残基显示在图11C中。如本文定义，FGFR1和FGFR2之间相对应的氨基酸残基显示在图11D中。如本文定义，FGFR1和FGFR3之间相对应的氨基酸残基显示在图11E中。在某些实施方案中，第一FGFR ECD的氨基酸残基用第二FGFR ECD的相对应的氨基酸残基替换。在某些这样的实施方案中，当第二FGFR ECD的相对应的氨基酸是缺口时，第一FGFR ECD的氨基酸残基缺失。在某些这样的实施方案中，当第一FGFR ECD的氨基酸是缺口时，第二FGFR ECD的相对应的氨基酸残基插入到第一FGFR ECD中。

术语“相对应的氨基酸序列”和“相对应的序列”在本文中互换使用，是指在FGFR ECD特定区域内的氨基酸残基序列。

“FGFR4 ECD外显子4嵌合体”是指选自天然FGFR4 ECDs，FGFR4ECD片段，和FGFR4 ECD变体的FGFR4 ECD，其中由外显子4编码的氨基酸序列(在本文可互换地称为“外显子4”或“外显子4区”)已用由来自FGFR1，FGFR2，或FGFR3的外显子4编码的氨基酸序列替换。FGFR4 ECD的外显子4编码序列DSLTSSNDDEDPKSHRDPSNRHSYPQ(SEQ ID NO：18)，其是SEQ ID NO：1的氨基酸98-123，包括端点在内；或编码序列DSLTSSNDDEDPKSHRDLSNRHSYPQ(SEQ ID NO：19)，其是SEQ ID NO：2的氨基酸98-123，包括端点在内。FGFR1的外显子4编码序列DALPSSEDDDDDDDSSSEEKETDNTKPN(SEQ ID NO：23)，其是SEQ ID NO：21的氨基酸99-126，包括端点在内；或编码序列DALPSSEDDDDDDDSSSEEKETDNTKPNRM(SEQ ID NO：92)，其是SEQ ID NO：25的氨基酸99-128，包括端点在内。FGFR2的外显子4编码序列DAISSGDDEDDTDGAEDFVSENSNNK(SEQ ID NO：29)，其是SEQ ID NO：27的氨基酸105-130，包括端点在内。FGFR3的外显子4编码序列DAPSSGDDEDGEDEAEDTGVDT(SEQ ID NO：33)，其是SEQ ID NO：31的氨基酸105-126，包括端点在内。某些示例性的FGFR4 ECD外显子4嵌合体包括，但不限于，具有氨基酸序列SEQ ID NOs：39-42的FGFR4 ECD外显子4嵌合体。

“FGFR4 2Ig ECD外显子4嵌合体”是指选自FGFR4 2Ig ECDs，FGFR4 2Ig ECD片段，和FGFR4 2Ig ECD变体的FGFR4 2Ig ECD，其中由外显子4编码的氨基酸序列(在本文可互换地称为“外显子4”或“外显子4区”)已用来自FGFR1，FGFR2，或FGFR3的由外显子4编码的氨基酸序列替换，如上述关于FGFR4 ECD外显子4嵌合体所述。

“FGFR4 ECD酸性盒嵌合体”是指选自天然FGFR4 ECDs，FGFR4 ECD片段，和FGFR4 ECD变体的FGFR4 ECD，其中至少所述酸性盒已被来自FGFR1，FGFR2，或FGFR3的至少所述酸性盒替换。如本文定义，FGFR4的酸性盒具有序列DDEDPKSHR(SEQ ID NO：20)。如本文定义，FGFR1的酸性盒具有序列EDDDDDDDSS SE(SEQ ID NO：24)。如本文定义，FGFR2的酸性盒具有序列DDEDDTD(SEQ ID NO：30)。如本文定义，FGFR3的酸性盒具有序列DDEDGE(SEQ ID NO：34)。

“FGFR4 2Ig ECD酸性盒嵌合体”是指选自FGFR4 2Ig ECDs，FGFR4 2Ig ECD片段，和FGFR4 2Ig ECD变体的FGFR4 ECD，其中至少所述酸性盒已被来自FGFR1，FGFR2，或FGFR3的至少所述酸性盒替换，如上文关于FGFR4ECD酸性盒嵌合体所述。

当用在本文时，术语“酸性盒区”意指FGFR ECD的这样的区域，其包括上述定义的酸性盒，以及在所述酸性盒的氨基端、羧基端或在氨基端和羧基端两端的来自FGFR ECD序列的另外的氨基酸，多至且包括在如上文所述的FGFR ECD的D1-D2接头中存在的全部另外的氨基酸。如本文定义，术语FGFR4 ECD酸性盒嵌合体包括这样的多肽，其中FGFR4的酸性盒用来自FGFR1，FGFR2，或FGFR3的酸性盒区替换。术语FGFR4 ECD酸性盒嵌合体还包括这样的多肽，其中FGFR4的酸性盒区用来自FGFR1，FGFR2，或FGFR3的酸性盒区替换。术语FGFR4ECD酸性盒嵌合体还包括这样的多肽，其中FGFR4的酸性盒区用来自FGFR1，FGFR2，或FGFR3的酸性盒替换。某些示例性的FGFR4ECD酸性盒嵌合体包括，但不限于，具有氨基酸序列SEQ ID NOs：43-45和157的FGFR4ECD酸性盒嵌合体。

“长酸性盒”是指包括酸性盒和在所述酸性盒的氨基端和/或羧基端的某些另外的氨基酸残基的FGFR ECD区域。如本文定义，FGFR4 ECD的长酸性盒具有序列NDDEDPKSHRDPSNR(SEQ ID NO：96)，其是SEQ ID NO：1的氨基酸104-118，包括端点在内；或具有序列NDDEDPKSHRDLSNR(SEQ ID NO：97)，其是SEQ ID NO：2的氨基酸104-118，包括端点在内。如本文定义，FGFR1 ECD的长酸性盒具有序列EDDDDDDDSSSEEKETD(SEQ ID NO：98)，其是SEQ ID NOs：21和25的氨基酸105-121，包括端点在内。如本文定义，FGFR2 ECD的长酸性盒具有序列DDEDDTDGAEDFVSE(SEQ ID NO：99)，其是SEQ ID NO：27的氨基酸111-125，包括端点在内。如本文定义，FGFR3 ECD的长酸性盒具有序列GDDEDGEDEAED(SEQ ID NO：100)，其是SEQ ID NO：31的氨基酸110-121，包括端点在内。

术语“FGFR4 ECD长酸性盒嵌合体”是指选自天然FGFR4 ECDs，FGFR4 ECD片段，和FGFR4 ECD变体的FGFR4 ECD，其中至少所述长酸性盒，但不超出D1-D2接头区，已用来自FGFR1，FGFR2，或FGFR3的至少所述长酸性盒，但不超出D1-D2接头区替换。

术语“FGFR4 2Ig ECD长酸性盒嵌合体”是指选自天然FGFR4 2IgECDs，FGFR4 2Ig ECD片段，和FGFR4 2Ig ECD变体的FGFR4 ECD，其中至少所述长酸性盒，但不超出D1-D2接头区，已用来自FGFR1，FGFR2，或FGFR3的至少所述长酸性盒，但不超出D1-D2接头区替换。

术语“短酸性盒”是指在所述酸性盒内具有一段连续的酸性氨基酸残基的序列的FGFR ECD区域。如本文定义，FGFR4 ECD的短酸性盒具有序列DDED(SEQ ID NO：101)，其是SEQ ID NOs：1和2的氨基酸105-108，包括端点在内。如本文定义，FGFR1 ECD的短酸性盒具有序列EDDDDDDD(SEQ ID NO：102)，其是SEQ ID NOs：21和25的氨基酸105-112，包括端点在内。如本文定义，FGFR2 ECD的短酸性盒具有序列DDEDD(SEQ ID NO：103)，其是SEQ ID NO：27的氨基酸111-115，包括端点在内。如本文定义，FGFR3 ECD的短酸性盒具有序列DDED(SEQ ID NO：104)，其是SEQ ID NO：31的氨基酸111-114，包括端点在内。

术语“FGFR4 ECD短酸性盒嵌合体”是指选自天然FGFR4 ECDs，FGFR4 ECD片段，和FGFR4 ECD变体的FGFR4 ECD，其中来自FGFR4的至少所述短酸性盒，但不超出D1-D2接头区，已用来自FGFR1，FGFR2，或FGFR3的至少所述短酸性盒但不超出D1-D2接头区替换。

术语“FGFR4 2Ig ECD短酸性盒嵌合体”是指选自天然FGFR4 2IgECDs，FGFR4 2Ig ECD片段，和FGFR4 2Ig ECD变体的FGFR4 ECD，其中来自FGFR4的至少所述短酸性盒，但不超出D1-D2接头区，已用来自FGFR1，FGFR2，或FGFR3的至少所述短酸性盒但不超出D1-D2接头区替换。

术语“FGFR2 ECD短酸性盒嵌合体”是指选自天然FGFR2 ECDs，FGFR2 ECD片段，和FGFR2 ECD变体的FGFR2 ECD，其中来自FGFR2的至少所述短酸性盒，但不超出D1-D2接头区，已用来自FGFR1的至少所述短酸性盒但不超出D1-D2接头区替换。在FGFR2ECD短酸性盒嵌合体的某些实施方案中，至少所述FGFR2酸性盒，但不超出D1-D2接头区，已用FGFR1短酸性盒替换。

术语“FGFR3 ECD短酸性盒嵌合体”是指选自天然FGFR3 ECDs，FGFR3 ECD片段，和FGFR3 ECD变体的FGFR3 ECD，其中来自FGFR3的至少所述短酸性盒，但不超出D1-D2接头区，已用来自FGFR1的至少所述短酸性盒但不超出D1-D2接头区替换。在FGFR3 ECD短酸性盒嵌合体的某些实施方案中，至少所述FGFR3酸性盒，但不超出D1-D2接头区，已用FGFR1短酸性盒替换。

术语“FGFR4 ECD酸性区嵌合体”在本文中便利地用于指下述5种类型的分子：FGFR4 ECD D1-D2接头嵌合体，FGFR4 ECD外显子4嵌合体，FGFR4 ECD酸性盒嵌合体，FGFR4 ECD长酸性盒嵌合体，和FGFR4 ECD短酸性盒嵌合体。

术语“FGFR4 2Ig ECD酸性区嵌合体”在本文中便利地用于指下述5种类型的分子：FGFR4 2Ig ECD D1-D2接头嵌合体，FGFR4 2Ig ECD外显子4嵌合体，FGFR4 2Ig ECD酸性盒嵌合体，FGFR4 2Ig ECD长酸性盒嵌合体，和FGFR4 2Ig ECD短酸性盒嵌合体。

术语“FGFR4 ECD长酸性盒变体”是指选自天然FGFR4 ECDs，FGFR4 ECD片段，和FGFR4 ECD变体的FGFR4 ECD的变体，其相对于FGFR4野生型长酸性盒在所述长酸性盒中具有增加的酸性。在FGFR4 ECD长酸性盒变体的某些实施方案中，在FGFR4 ECD长酸性盒内的至少两个非酸性残基分别独立地用酸性残基替换。在FGFR4 ECD长酸性盒变体的某些实施方案中，在FGFR4 ECD的长酸性盒内的至少一个残基用来自FGFR1，FGFR2，或FGFR3的相对应的氨基酸残基替换。在FGFR4 ECD长酸性盒变体的某些实施方案中，在FGFR4 ECD长酸性盒内的至少一个酸性残基用不同的酸性残基替换。在FGFR4 ECD长酸性盒变体的某些实施方案中，将一个或两个酸性残基插入到SEQ ID NOs：1和2的氨基酸103和104之间。在FGFR4ECD长酸性盒变体的某些实施方案中，从FGFR4ECD的长酸性盒删除至多三个非酸性残基。在FGFR4 ECD长酸性盒变体的某些实施方案中，在FGFR4 ECD酸性区变体长酸性盒内的酸性残基总数，包括在SEQ ID NOs：1和2的氨基酸103和104之间插入的任何酸性残基，至少为7。

术语“FGFR4 2Ig ECD长酸性盒变体”是指选自天然FGFR4 2IgECDs，FGFR4 2Ig ECD片段，和FGFR4 2Ig ECD变体的FGFR4 ECD的变体，其相对于FGFR4野生型长酸性盒在所述长酸性盒中具有增加的酸性。在FGFR4 2Ig ECD长酸性盒变体的某些实施方案中，在FGFR4 2Ig ECD长酸性盒内的至少两个非酸性残基用酸性残基替换。在FGFR4 2Ig ECD长酸性盒变体的某些实施方案中，在FGFR4 2Ig ECD长酸性盒内的至少一个残基用来自FGFR1，FGFR2，或FGFR3的相对应的氨基酸残基替换。在FGFR42Ig ECD长酸性盒变体的某些实施方案中，在FGFR4 2Ig ECD长酸性盒内的至少一个酸性残基用不同的酸性残基替换。在FGFR4 2Ig ECD长酸性盒变体的某些实施方案中，将一个或两个酸性残基插入到SEQ ID NO：94的氨基酸15和16中，其是示例性的FGFR4 2Ig ECD。在FGFR4 2Ig ECD长酸性盒变体的某些实施方案中，从FGFR4 ECD的长酸性盒删除至多三个非酸性残基。在FGFR4 2Ig ECD长酸性盒变体的某些实施方案中，在FGFR42Ig ECD酸性区变体长酸性盒内的酸性残基总数，包括在SEQ ID NO：94的氨基酸15和16之间插入的任何酸性残基，至少为7。

“FGFR4 ECD酸性区突变蛋白”是选自天然FGFR4 ECDs，FGFR4 ECD片段，和FGFR4 ECD变体的FGFR4 ECD，其在D1-D2接头区中具有比野生型FGFR4ECD更多数目的酸性残基。术语FGFR4ECD酸性区突变蛋白在本文中用于指下述类型的分子：FGFR4ECD酸性区嵌合体，其包括FGFR4ECD D1-D2接头嵌合体，FGFR4ECD外显子4嵌合体，FGFR4 ECD酸性盒嵌合体，FGFR4ECD长酸性盒嵌合体，和FGFR4ECD短酸性盒嵌合体；以及FGFR4ECD长酸性盒变体。

“FGFR4 2Ig ECD酸性区突变蛋白”是选自天然FGFR4 2Ig ECDs，FGFR4 2Ig ECD片段，和FGFR4 2Ig ECD变体的FGFR4 2Ig ECD，其在D1-D2接头区中具有比野生型FGFR4 2Ig ECD更多数目的酸性残基。术语FGFR4 2Ig ECD酸性区突变蛋白在本文中用于指下述类型的分子：FGFR4 2Ig ECD酸性区嵌合体，其包括FGFR4 2Ig ECD D1-D2接头嵌合体，FGFR4 2Ig ECD外显子4嵌合体，FGFR4 2Ig ECD酸性盒嵌合体，FGFR4 2Ig ECD长酸性盒嵌合体，和FGFR4 2Ig ECD短酸性盒嵌合体；以及FGFR4 2Ig ECD长酸性盒变体。

“FGFR2 ECD酸性区突变蛋白”是选自天然FGFR2 ECDs，FGFR2ECD片段，和FGFR2 ECD变体的FGFR2 ECD，其在D1-D2接头区中具有比野生型FGFR2 ECD更多数目的酸性残基。

“FGFR3 ECD酸性区突变蛋白”是选自天然FGFR3 ECDs，FGFR3 ECD片段，和FGFR3 ECD变体的FGFR3 ECD，其在D1-D2接头区中具有比野生型FGFR3 ECD更多数目的酸性残基。

术语“FGFR4 ECD融合分子”是指包括选自FGFR4 ECD和FGFR4ECD酸性区突变蛋白的多肽和融合配偶体的分子。术语“FGFR4 2Ig ECD融合分子”是指包括选自FGFR4 2Ig ECD和FGFR4 2Ig ECD酸性区突变蛋白的多肽和融合配偶体的分子。术语“FGFR2 ECD融合分子”是指包括选自FGFR2 ECD和FGFR2 ECD酸性区突变蛋白的多肽和融合配偶体的分子。在某些实施方案中，FGFR2 ECD融合分子在FGFR2 ECD或FGFR2ECD酸性区突变蛋白和所述融合配偶体之间包含“GS”接头。术语“FGFR3ECD融合分子”是指包括选自FGFR3 ECD和FGFR3 ECD酸性区突变蛋白的多肽和融合配偶体的分子。在某些实施方案中，FGFR3 ECD融合分子在FGFR3 ECD或FGFR3 ECD酸性区突变蛋白和所述融合配偶体之间包含“GS”接头。所述融合配偶体可以连接在多肽的氨基端或羧基端。在某些实施方案中，多肽和融合配偶体共价连接。如果所述融合配偶体也是多肽(“融合配偶体多肽”)，则所述多肽和融合配偶体多肽可以是连续的氨基酸序列的一部分。在所述情形中，所述多肽和所述融合配偶体多肽可以由编码所述多肽和所述融合配偶体多肽二者的编码序列翻译成单一多肽。在某些实施方案中，所述多肽和所述融合配偶体通过其他方式共价连接，诸如，例如，除肽键之外的化学连接。将多肽与其他分子(例如，融合配偶体)共价连接的多种方法在本领域中是已知的。本领域技术人员可以基于要共价连接的具体多肽和融合配偶体选择适当的共价连接方法。

在某些实施方案中，所述多肽和所述融合配偶体非共价连接。在某些这样的实施方案中，例如，它们可以使用结合对连接。示例性的结合对包括，但不限于，生物素和抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白，抗体及其抗原等。

某些示例性的融合配偶体包括，但不限于，免疫球蛋白Fc结构域，白蛋白，和聚乙二醇。某些示例性的Fc结构域的氨基酸序列显示在SEQ ID NOs：72-74中。

术语“信号肽”是指促使哺乳动物细胞分泌多肽的氨基酸残基序列。信号肽典型地在所述多肽由哺乳动物细胞输出时裂解下来。某些示例性的信号肽包括，但不限于，FGFR1，FGFR2，FGFR3，和FGFR4的信号肽，诸如，例如，氨基酸序列SEQ ID NOs：66-69，和75。某些示例性的信号肽还包括来自异源蛋白的信号肽。“信号序列”是指编码信号肽的多核苷酸序列。

“载体”是指用于在宿主细胞中表达目的多肽的多核苷酸。载体可以包括下述元件中的一种或多种：复制起点，一个或多个调节目的多肽表达的调控序列(诸如，例如，启动子和/或增强子)，和/或一个或多个选择标记基因(诸如，例如，抗生素抗性基因和可以用于比色测定的基因，例如β-半乳糖苷酶)。本领域技术人员可以针对具体的宿主细胞和即将进行的应用选择适当的载体元件。

“宿主细胞”是指可以是载体或分离的多核苷酸的受体的细胞或已经成为载体或分离的多核苷酸的受体的细胞。宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞。示例性的真核细胞包括哺乳动物细胞，诸如灵长类或非灵长类动物细胞；真菌细胞；植物细胞；和昆虫细胞。某些示例性的哺乳动物细胞包括，但不限于，293和CHO细胞。

术语“分离的”当用在本文时是指已经典型地与其在天然状态下发现相关的至少部分成分分离的分子。例如，当多肽与产生所述多肽的细胞的至少一些成分分离时，认为所述多肽是“分离的”。当多肽在表达后由细胞分泌时，从产生所述多肽的细胞物理分离包含所述多肽的上清被认为是“分离”所述多肽。类似地，当多核苷酸不是在自然中典型发现其的较大多核苷酸(在DNA多核苷酸的情形中，诸如，例如，基因组DNA或线粒体DNA)的一部分时，或是与所述多核苷酸所产生的细胞的至少一些成分分离时，例如，在RNA多核苷酸的情形中，认为所述多核苷酸是“分离的”。因此，在宿主细胞中在载体中包含的DNA多核苷酸可以认为是“分离的”，只要所述多核苷酸在自然中不存在于所述载体中。

术语“受试者”和“患者”在本文中互换使用，是指哺乳动物，包括但不限于，啮齿动物，猿猴，人，猫科动物，犬科动物，马，牛，猪，绵羊，山羊，哺乳动物实验室动物，哺乳动物农场动物，哺乳动物竞技动物，和哺乳动物宠物。

术语“血管生成”是指发育新血管，包括毛细血管。其可以在健康组织或患病组织中发生，所述患病组织诸如，例如，癌症和黄斑变性。该术语包括新血管形成，血管再形成，血管形成，和血管发生。新血管生长典型地由生血管因子对内皮细胞的刺激所导致，所述生血管因子可以在增生性病症中如在癌症或黄斑变性中是有活性的。“生血管因子”是促使血管形成的因子。

术语“生血管病症”是指其中存在不适当的新血管发育的病症。

“治疗，”当用在本文时，涵盖在哺乳动物(包括人)中用于疾病的治疗剂的任何施用或使用，并且包括抑制疾病，使其发展停滞，或减轻疾病，例如，通过引起恢复，或恢复或者修复失去、缺少或缺陷的功能；或刺激无效的过程。治疗可以使用手术、放射、和/或施用一种或多种分子获得，所述分子包括但不限于，小分子和聚合物，如多肽。

“药用载体”是指无毒的固体、半固体、或液体填充剂、稀释剂、包封物质、配制助剂、或在本领域中便利地与治疗剂一起使用施用给受试者的载体。药用载体在所用的剂量和浓度对接受体是无毒的，并且与制剂的其他成分相容。药用载体对于所用的制剂是适用的。例如，如果治疗剂需要口服施用，载体可以是凝胶胶囊。如果治疗剂需要皮下施用，则载体理想地对皮肤无刺激性且不引起注射部位反应。

FGFR4细胞外结构域

某些示例性的FGFR4 ECDs包括天然的FGFR4 ECDs，FGFR4 ECD片段，和FGFR4 ECD变体。如上文所述，FGFR4 ECD片段可以具有由多肽的氨基端删除的序列LEASEEVE(SEQ ID NO：70)的全部或一部分和/或具有由多肽的羧基端删除的序列LPEEDPTWTAAAPEARYTD(SEQ ID NO：71)的全部或一部分。示例性的FGFR4 ECDs包括，但不限于，具有选自SEQ ID NOs：1，2，3，93，6-10，和76-81的氨基酸序列的FGFR4 ECDs。

基于关于FGFRs的结构/功能关系的可获得的大量数据，本领域技术人员可以产生能够结合FGF2和/或FGF19的FGFR4 ECD变体。

在某些实施方案中，FGFR4 ECD是分离的。

FGFR4 ECD酸性区嵌合体

FGFR4 ECD酸性区嵌合体是这样的FGFR4 ECD，所述FGFR4 ECD选自天然FGFR4 ECDs，FGFR4 ECD片段，和FGFR4 ECD变体，其在D1-D2接头区中具有比野生型FGFR4 ECD更多数目的酸性残基。FGFR4 ECD酸性区嵌合体包括FGFR4 ECD D1-D2接头嵌合体，FGFR4 ECD外显子4嵌合体，FGFR4 ECD酸性盒嵌合体，FGFR4 ECD长酸性盒嵌合体，和FGFR4ECD短酸性盒嵌合体。在某些实施方案中，FGFR4 ECD酸性区嵌合体是分离的。

示例性的FGFR4 ECD D1-D2接头嵌合体包括，但不限于，FGFR4ECDs，其中FGFR4的D1-D2接头，DSLISSNDDEDPKSHRDPSNRHSYPQQ或DSLTSSNDDEDPKSHRDLSNRHSYPQQ(分别为SEQ ID NO：16或17)已经替换为FGFR1的D1-D2接头，DALPSSEDDDDDDDSSSEEKETDNTKPNPV或DALPSSEDDDDDDDSSSEEKETDNTKPNRMPV(分别为SEQ ID NO：22或26(分别统称为“FGFR4 ECD R1D1-D2接头嵌合体”和“FGFR4 ECDR1 RM D1-D2接头嵌合体，”)，FGFR2的D1-D2接头，DAISSGDDEDDTDGAEDFVSENSNNKR(SEQ ID NO：28)(统称为“FGFR4 ECD R2 D1-D2接头嵌合体”)，或FGFR3的D1-D2接头，DAPSSGDDEDGEDEAEDTGVDTG(SEQ ID NO：32)(统称为“FGFR4ECD R3 D1-D2接头嵌合体”)。

如上述关于FGFR4 ECDs所讨论的，FGFR4 ECD D1-D2接头嵌合体可以包括信号肽或缺少信号肽。FGFR4 ECD D1-D2接头嵌合体可以具有从所述多肽的氨基端删除的序列LEASEEVE(SEQ ID NO：70)的全部或一部分和/或从所述多肽的羧基端删除的序列LPEEDPTWTAAAPEARYTD(SEQ ID NO：71)的全部或一部分。示例性的FGFR4 ECD D1-D2接头嵌合体包括，但不限于，FGFR4 ECD D1-D2接头嵌合体，其具有选自SEQ ID NOs：35-38的氨基酸序列。在某些实施方案中，FGFR4 ECD D1-D2接头嵌合体包括至少一个FGFR4 ECD糖基化突变。包括糖基化突变的示例性的FGFR4 ECD D1-D2接头嵌合体包括，但不限于，具有N91A糖基化突变，N159A糖基化突变，或N91A和N159A两种糖基化突变的SEQ ID NO：35的FGFR4 ECD D1-D2接头嵌合体。在某些实施方案中，FGFR4 ECD D1-D2接头嵌合体糖基化突变体包括选自SEQ ID NOs：120，121，和168的氨基酸序列。

示例性的FGFR4 ECD外显子4嵌合体包括，但不限于，FGFR4 ECDs，其中FGFR4外显子4氨基酸序列，DSLTSSNDDEDPKSHRDPSNRHSYPQ或DSLTSSNDDEDPKSHRDLSNRHSYPQ(分别为SEQ ID NOs：18和19)，已被替换为FGFR1外显子4氨基酸序列，DALPSSEDDDDDDDSSSEEKETDNTKPN(SEQ ID NO：23)或DALPSSEDDDDDDDSSSEEKETDNTKPNRM(SEQ ID NO：92)(统称为“FGFR4 ECD R1外显子4嵌合体”)，FGFR2外显子4氨基酸序列，DAISSGDDEDDTDGAEDFVSENSNNK(SEQ ID NO：29)(统称为“FGFR4 ECD R2外显子4嵌合体”)，或FGFR3外显子4氨基酸序列，DAPSSGDDEDGEDEAEDTGVDT(SEQ ID NO：33)(统称为“FGFR4 ECD R3外显子4嵌合体”)。

如上文关于FGFR4ECDs所讨论的，FGFR4ECD外显子4嵌合体可以包括信号肽或缺少信号肽。FGFR4ECD外显子4嵌合体可以具有从所述多肽的氨基端删除的序列LEASEEVE(SEQ ID NO：70)的全部或一部分和/或从所述多肽的羧基端删除的序列LPEEDPTWTAAAPEARYTD(SEQ ID NO：71)的全部或一部分。示例性的FGFR4ECD外显子4嵌合体包括，但不限于，FGFR4 ECD外显子4接头嵌合体，其具有选自SEQ ID NOs：39-42的氨基酸序列。在某些实施方案中，FGFR4 ECD外显子4嵌合体包括SEQ ID NO：39的氨基酸序列。在某些实施方案中，FGFR4ECD外显子4嵌合体包括至少一个FGFR4ECD糖基化突变。

示例性的FGFR4ECD酸性盒嵌合体包括，但不限于，FGFR4ECDs，其中至少在本文中定义为DDEDPKSHR(SEQ ID NO：20)的FGFR4酸性盒，已被替换为在本文中定义为EDDDDDDDSSSE(SEQ ID NO：24)的FGFR1酸性盒(统称为“FGFR4 ECD R1酸性盒嵌合体”)，替换为至少在本文中定义为DDEDDTD(SEQ ID NO：30)的FGFR2酸性盒(统称为“FGFR4 ECD R2酸性盒嵌合体”)，或替换为至少在本文中定义为DDEDGE(SEQ ID NO：34)的FGFR3酸性盒(统称为“FGFR4 ECD R3酸性盒嵌合体”)。

在某些实施方案中，上文所示的酸性盒序列两侧连接的其他氨基酸也在FGFR4ECD中被替换和/或也从FGFR1，FGFR2，或FGFR3 ECD插入。所述包括其他氨基酸的酸性盒称为“酸性盒区”。在某些实施方案中，包括来自FGFR1，FGFR2，或FGFR3酸性盒区的其他氨基酸直到下一个酸性氨基酸，并且包括所述下一个酸性氨基酸。因此，例如，FGFR4酸性盒或FGFR4酸性盒区(例如，选自SEQ ID NOs：20和46-55的氨基酸序列)可以被替换为具有选自下列各项的氨基酸序列的FGFR1酸性盒或FGFR1酸性盒区：EDDDDDDDSSSE(SEQ ID NO：24)，EDDDDDDDSSSEE(SEQ ID NO：56)，EDDDDDDDSSSEEKE(SEQ ID NO：57)，和EDDDDDDDSSSEEKETD(SEQ ID NO：58)。类似地，FGFR4酸性盒或FGFR4酸性盒区可以被替换为具有选自下列各项的氨基酸序列的FGFR2酸性盒或FGFR2酸性盒区：DDEDDTD(SEQ ID NO：30)，DDEDDTDGAE(SEQ ID NO：59)，DDEDDTDGAED(SEQ ID NO：60)，和DDEDDTDGAEDFVSE(SEQ ID NO：61)。最后，FGFR4酸性盒或FGFR4酸性盒区可以被替换为具有选自下列各项的氨基酸序列的FGFR3酸性盒或FGFR3酸性盒区：DDEDGE(SEQ ID NO：34)，DDEDGED(SEQ ID NO：62)，DDEDGEDE(SEQ ID NO：63)，DDEDGEDEAE(SEQ ID NO：64)，和DDEDGEDEAED(SEQ ID NO：65)。在某些实施方案中，其他氨基酸也可以被替换，直到并且包括D1-D2接头中的所有氨基酸，例如，以保持所述酸性盒区的特定的间隔或结构。

作为非限制性实例，具有SEQ ID NO：21的氨基酸序列的FGFR4酸性盒或具有选自SEQ ID NOs：46-55的氨基酸序列的FGFR4酸性盒区可以被替换为：(1)具有SEQ ID NO：24的氨基酸序列的FGFR1酸性盒或具有选自SEQ ID NOs：56-58的氨基酸序列的FGFR1酸性盒区；(2)具有SEQ ID NO：30的氨基酸序列的FGFR2酸性盒或具有选自SEQ ID NOs：59-61的氨基酸序列的FGFR2酸性盒区；或(3)具有SEQ ID NO：34的氨基酸序列的FGFR3酸性盒或具有选自SEQ ID NOs：62-65的氨基酸序列的FGFR3酸性盒区。在某些实施方案中，SEQ ID NO：51的FGFR4酸性盒区被替换为SEQ ID NO：56的FGFR1酸性盒区。

如上文关于FGFR4 ECDs所讨论的，FGFR4 ECD酸性盒嵌合体可以包括信号肽或缺少信号肽。FGFR4 ECD酸性盒嵌合体可以具有从所述多肽的氨基端删除的序列LEASEEVE(SEQ ID NO：70)的全部或一部分和/或从所述多肽的羧基端删除的序列LPEEDPTWTAAAPEARYTD(SEQ ID NO：71)全部或一部分。示例性的FGFR4 ECD酸性盒嵌合体包括，但不限于，具有选自SEQ ID NOs：44-45和157的氨基酸序列的FGFR4ECD酸性盒嵌合体。在某些实施方案中，FGFR4 ECD酸性盒嵌合体包括至少一个FGFR4 ECD糖基化突变。

示例性的FGFR4 ECD长酸性盒嵌合体包括，但不限于，FGFR4 ECDs，其中至少FGFR4的长酸性盒，NDDEDPKSHRDPSNR或NDDEDPKSHRDLSNR(分别为SEQ ID NO：96或97)，但不超出D1-D2接头区，被下列各项替换：至少FGFR1的长酸性盒，EDDDDDDDSSSEEKETD(SEQ ID NO：98)，而不超出D1-D2接头区(统称为“FGFR4 ECD R1长酸性盒嵌合体”)；至少FGFR2的长酸性盒，DDEDDTDGAEDFVSE(SEQ ID NO：99)，而不超出D1-D2接头区(统称为“FGFR4 ECD R2长酸性盒嵌合体”)；或至少FGFR3的长酸性盒，GDDEDGEDEAED(SEQ ID NO：100)，而不超出D1-D2接头区(统称为“FGFR4 ECD R3长酸性盒嵌合体”)。

如上文关于FGFR4ECDs所讨论的，FGFR4ECD长酸性盒嵌合体可以包括信号肽或缺少信号肽。FGFR4ECD长酸性盒嵌合体可以具有从所述多肽的氨基端删除的序列LEASEEVE(SEQ ID NO：70)的全部或一部分和/或从所述多肽的羧基端删除的序列LPEEDPTWTAAAPEARYTD(SEQ ID NO：71)的全部或一部分。示例性的FGFR4 ECD长酸性盒嵌合体包括，但不限于，具有选自SEQ ID NOs：105-107的氨基酸序列的FGFR4 ECD长酸性盒嵌合体。在某些实施方案中，FGFR4 ECD长酸性盒嵌合体包括至少一个FGFR4 ECD糖基化突变。

示例性的FGFR4 ECD短酸性盒嵌合体包括，但不限于，FGFR4 ECDs，其中至少FGFR4的短酸性盒，DDED(SEQ ID NO：101)，而不超出D1-D2接头区，被下列各项替换：至少FGFR1的短酸性盒，EDDDDDDD(SEQ ID NO：102)，而不超出D1-D2接头区(统称为“FGFR4 ECD R1短酸性盒嵌合体”)；至少FGFR2的短酸性盒，DDEDD(SEQ ID NO：103)，而不超出D1-D2接头区(统称为“FGFR4 ECD R2短酸性盒嵌合体”)；或至少FGFR3的短酸性盒，DDED(SEQ ID NO：104)，而不超出D1-D2接头区(统称为“FGFR4 ECD R3短酸性盒嵌合体”)。

如上文关于FGFR4 ECDs所讨论的，FGFR4ECD短酸性盒嵌合体可以包括信号肽或缺少信号肽。FGFR4 ECD短酸性盒嵌合体可以具有从所述多肽的氨基端删除的序列LEASEEVE(SEQ ID NO：70)的全部或一部分和/或从所述多肽的羧基端删除的序列LPEEDPTWTAAAPEARYTD(SEQ ID NO：71)的全部或一部分。示例性的FGFR4 ECD短酸性盒嵌合体包括，但不限于，具有选自SEQ ID NOs：108-110的氨基酸序列的FGFR4ECD短酸性盒嵌合体。在某些实施方案中，FGFR4 ECD短酸性盒嵌合体包括至少一个FGFR4 ECD糖基化突变。

FGFR4 ECD长酸性盒变体

FGFR4 ECD长酸性盒变体包括FGFR4 ECD的变体，其相对于FGFR4野生型长酸性盒在长酸性盒中具有增加数量的酸性氨基酸残基。示例性的FGFR4 ECD长酸性变体包括，但不限于，FGFR4 ECD的变体，其中在FGFR4 ECD长酸性盒中的至少两个非酸性残基分别被替换为酸性残基；FGFR4 ECD的变体，其中FGFR4 ECD长酸性盒中的至少一个残基被替换为来自FGFR1，FGFR2，或FGFR3的相应的氨基酸残基；FGFR4 ECD的变体，其中在FGFR4 ECD长酸性盒中的至少一个酸性残基被替换为另一个酸性残基；FGFR4 ECD的变体，其中从FGFR4 ECD的长酸性盒删除至多三个非酸性残基；和FGFR4长酸性盒的变体，其中在FGFR4 ECD长酸性盒中的酸性残基总数为至少7个，这包括在SEQ ID NOs：1和2的氨基酸103和104中之间插入的任何酸性残基。

作为FGFR4 ECD长酸性盒变体的非限制性实例，FGFR4 ECD残基N104被替换为相应的FGFR1的D107残基；FGFR4 ECD残基P109被替换为相应的FGFR1的D112残基；FGFR4ECD残基R113被替换为相应的FGFR1 E116残基；并且FGFR4 ECD残基S116被替换为相应的FGFR1的E119残基。作为FGFR4 ECD长酸性盒变体的非限制性实例，FGFR4 ECD残基104-114，NDDEDPKSHRD(SEQ ID NO：145)，被替换为FGFR1 ECD残基106-117，DDDDDDDSSSEE(SEQ ID NO：149)；FGFR4 ECD残基104-114，NDDEDPKSHRD(SEQ ID NO：145)，被替换为FGFR1 ECD残基107-117，DDDDDDSSSEE(SEQ ID NO：150)；FGFR4 ECD残基104-110，NDDEDPK(SEQ ID NO：146)，被替换为FGFR1 ECD残基105-113，EDDDDDDDS(SEQ ID NO：151)；FGFR4 ECD残基113-116，RDPS(SEQ ID NO：147)，被替换为FGFR1 ECD残基116-119，EEKE(SEQ ID NO：152)；并且FGFR4 ECD残基109-113，PKSHR(SEQ ID NO：148)，被替换为FGFR1 ECD残基112-116，DSSSE(SEQ ID NO：153)。

如上述关于FGFR4ECDs所讨论的，FGFR4ECD长酸性盒变体可以包括信号肽或缺少信号肽。FGFR4 ECD长酸性盒变体可以具有从所述多肽的氨基端删除的序列LEASEEVE(SEQ ID NO：70)的全部或一部分和/或从所述多肽的羧基端删除的序列LPEEDPTWTAAAPEARYTD(SEQ ID NO：71)的全部或一部分。示例性的FGFR4ECD长酸性盒突变蛋白包括，但不限于，具有选自SEQ ID NOs：111-119的氨基酸序列的FGFR4ECD长酸性盒变体。在某些实施方案中，FGFR4 ECD长酸性盒变体包括至少一个FGFR4 ECD糖基化突变。

FGFR2ECD短酸性盒嵌合体

示例性的FGFR2ECD短酸性盒嵌合体包括，但不限于，FGFR2 ECDs，其中至少FGFR2酸性盒被替换为FGFR1短酸性盒。作为短酸性盒嵌合体的非限制性实例，FGFR2 ECD残基111-118，DDEDDTDG(SEQ ID NO：155)，被替换为FGFR1 ECD残基105-112，EDDDDDDD(SEQ ID NO：154)。

如上文关于FGFR4 ECDs所讨论的，FGFR2 ECD短酸性盒嵌合体可以包括信号肽或缺少信号肽。此外，FGFR2 ECD短酸性盒嵌合体包括这样的FGFR2 ECD短酸性盒嵌合体，其中从所述ECD的氨基端和/或羧基端删除一个或多个氨基酸残基，并且其中所述FGFR2 ECD短酸性盒嵌合体能够结合FGF2。非限制性的示例性的FGFR2 ECD短酸性盒嵌合体包括，但不限于，具有选自SEQ ID NOs：122和164的氨基酸序列的FGFR2 ECD短酸性盒嵌合体。

FGFR3 ECD短酸性盒嵌合体

示例性的FGFR3 ECD短酸性盒嵌合体包括，但不限于，FGFR3 ECDs，其中至少FGFR3酸性盒被替换为FGFR1短酸性盒。作为短酸性盒嵌合体的非限制性实例，FGFR3 ECD残基110-117，GDDEDGED(SEQ ID NO：156)，被替换为FGFR1 ECD残基105-112，EDDDDDDD(SEQ ID NO：154)。

如上文关于FGFR4 ECDs所讨论的，FGFR3 ECD短酸性盒嵌合体可以包括信号肽或缺少信号肽。此外，FGFR3ECD短酸性盒嵌合体包括这样的FGFR3ECD短酸性盒嵌合体，其中从所述ECD的氨基端和/或羧基端删除一个或多个氨基酸残基，并且其中所述FGFR3ECD短酸性盒嵌合体能够结合FGF2。非限制性的示例性的FGFR3 ECD短酸性盒嵌合体包括，但不限于，具有选自SEQ ID NOs：123和165的氨基酸序列的FGFR3ECD短酸性盒嵌合体。

FGFR ECD融合分子

提供了包括FGFR ECD和融合配偶体的FGFR ECD融合分子。在某些实施方案中，FGFR ECD融合分子是分离的。

融合配偶体和缀合物

在某些实施方案中，选择赋予所述FGFR ECD融合分子有利的药物代谢动力学和/或药效学的融合配偶体。例如，在某些实施方案中，选择这样的融合配偶体，其相对于无该融合配偶体的相对应的FGFR ECD增加FGFR ECD融合分子的半衰期。通过增加分子的半衰期，在治疗性治疗中可以需要更低的剂量和/或较不频繁的给药。此外，导致的FGFR ECD血清水平的减少的波动可以提高基于FGFR ECD的治疗剂的安全性和耐受性。

本领域已知多种不同类型的融合配偶体。本领域的技术人员可以根据目的应用选择合适的融合配偶体。非限制性的示例性的融合配偶体包括聚合物，多肽，亲脂性结构部分，和琥珀酰基。示例性的多肽融合配偶体包括血清白蛋白和抗体Fc结构域。示例性的聚合物融合配偶体包括，但不限于，聚乙二醇，其包括具有支链和/或直链的聚乙二醇。

寡聚结构域融合配偶体

在不同实施方案中，寡聚化为融合蛋白提供了某些功能性优点，其包括，但不限于，多价性，增加的结合强度，和不同结构域的组合功能。因此，在某些实施方案中，融合配偶体包括寡聚结构域，例如，二聚化结构域。示例性的寡聚结构域包括，但不限于，卷曲螺旋结构域，包括α螺旋卷曲螺旋结构域；胶原蛋白结构域；胶原蛋白样结构域，和某些免疫球蛋白结构域。某些示例性的卷曲螺旋多肽融合配偶体包括四联蛋白卷曲螺旋结构域；软骨寡聚基质蛋白的卷曲螺旋结构域；血管生成素卷曲螺旋结构域；和亮氨酸拉链结构域。某些示例性的胶原蛋白或胶原蛋白样寡聚结构域包括，但不限于，在下列各项中存在的那些：胶原蛋白、甘露糖结合凝集素、肺表面活性蛋白A和D、脂联蛋白、ficolin、胶固素、巨噬细胞清除剂受体、和弹联蛋白。

抗体Fc免疫球蛋白结构域融合配偶体

许多可以用作融合配偶体的Fc结构域在本领域中是已知的。本领域技术人员可以根据目的应用而选择适当的Fc结构域融合配偶体。在某些实施方案中，融合配偶体是Fc免疫球蛋白结构域。Fc融合配偶体可以是在天然存在的抗体中存在的野生型Fc，其变体，或其片段。非限制性的示例性的Fc融合配偶体包括这样的Fcs：其包括人IgG的铰链和CH2与CH3恒定结构域，例如，人IgG1，IgG2，IgG3，或IgG4。某些其它的Fc融合配偶体包括，但不限于，人IgA和IgM。在某些实施方案中，Fc融合配偶体包括C237S突变。在某些实施方案中，Fc融合配偶体包括人IgG2的铰链，CH2，和CH3结构域，并且具有P331S突变，如在美国专利号6,900,292中所述。某些示例性的Fc结构域融合配偶体显示在SEQ ID NOs：72-74，170，和171中。

某些示例性的包括FGFR4ECD的FGFR4ECD融合分子包括，但不限于，具有SEQ ID NOs：5和11-15的氨基酸序列的多肽。某些示例性的包括FGFR4ECD酸性区嵌合体的FGFR4ECD融合分子包括，但不限于，具有SEQ ID NOs：86-88和158的氨基酸序列的多肽。在某些实施方案中，FGFR4ECD融合分子包括SEQ ID NO：86的氨基酸序列。在某些实施方案中，FGFR4ECD融合分子由SEQ ID NO：86的氨基酸序列组成。

白蛋白融合配偶体和白蛋白-结合分子融合配偶体

在某些实施方案中，融合配偶体是白蛋白。某些示例性的白蛋白包括，但不限于，人血清白蛋白(HSA)和HSA的能够提高与其所融合的多肽的血清半衰期和/或生物利用率的片段。在某些实施方案中，融合配偶体是白蛋白-结合分子，诸如，例如，结合白蛋白的肽或与结合白蛋白的脂质或其它分子缀合的分子。在某些实施方案中，包括HSA的融合分子按照例如在美国专利号6,686,179中所述制备。

聚合物融合配偶体

在某些实施方案中，融合配偶体是聚合物，例如，聚乙二醇(PEG)。PEG可以包括支链和/或直链。在某些实施方案中，融合配偶体包括具有至少一个附着的PEG结构部分的化学衍生的多肽。多肽的聚乙二醇化可以通过本领域已知的任何方法进行。本领域技术人员可以考虑特定多肽的目的应用而选择适当的使所述多肽聚乙二醇化的方法。某些示例性的PEG附着方法包括，例如，EP 0 401 384；Malik等，Exp.Hematol.(血液学实验)，20：1028-1035(1992)；Francis，Focus on Growth Factors(关注生长因子)，3：4-10(1992)；EP 0 154 316；EP 0 401 384；WO 92/16221；和WO 95/34326。作为非限制性的实例，聚乙二醇化可以通过酰化反应或烷化反应进行，导致通过酰基或烷基的一个或多个PEG结构部分的附着。在某些实施方案中，PEG结构部分通过一个或多个氨基酸的α-或ε-氨基附着到多肽上，尽管也考虑本领域已知的任何其它的附着点。

通过酰化的聚乙二醇化典型地包括使PEG结构部分的活化酯衍生物与多肽反应。非限制性的示例性的活化PEG酯是与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯化的PEG。当用在本文时，认为酰化包括，但不限于，下述类型的在多肽和PEG之间的连接：酰胺，氨基甲酸酯，和氨基甲酸乙酯。参见，例如，Chamow，Bioconjugate Chem.(生物缀合物化学)，5：133-140(1994)。通过烷化聚乙二醇化典型地包括在存在还原剂的条件下使PEG结构部分的末端醛衍生物与多肽反应。非限制性的示例性反应PEG醛包括PEG丙醛，其是水溶性的，和其单C1-C10烷氧基或烷氧基衍生物。参见，例如，美国专利号5,252,714。

在某些实施方案中，聚乙二醇化反应导致多-聚乙二醇化的多肽。在某些实施方案中，聚乙二醇化反应导致单-、二-和/或三-聚乙二醇化的多肽。本领域技术人员可以选择适当的聚乙二醇化化学和反应条件来获得需要的聚乙二醇化水平。此外，可以使用本领域已知的各种纯化技术，其中包括透析、盐析(salting out)、超滤、离子交换层析、凝胶过滤层析、和电泳，从包含其它聚二乙醇化种类和/或未反应的起始物质的混合物中分离所需要的聚乙二醇化种类。

示例性的融合配偶体的附着

融合配偶体可以共价或非共价地附着到FGFR ECD的氨基端或羧基端。附着也可以发生在FGFR ECD内除氨基端或羧基端之外的位置，例如，通过氨基酸侧链(诸如，例如，半胱氨酸、赖氨酸、组氨酸、丝氨酸、或苏氨酸的侧链)。

在共价或非共价附着实施方案中，在所述融合配偶体和FGFR ECD之间可以包括接头。所述接头可以包括氨基酸和/或化学结构部分。本领域技术人员可以根据所用的附着方法、FGFR ECD融合分子的目的应用和在所述FGFR ECD和所述融合配偶体之间的需要的间隔而选择适当的接头。

示例性的将融合配偶体共价附着到FGFR ECD的方法包括，但不限于，将所述融合配偶体和FGFR ECD翻译为单一氨基酸序列，和将所述融合配偶体化学附着到FGFR ECD上。当将所述融合配偶体和FGFR ECD翻译为单一氨基酸序列时，在所述融合配偶体和FGFR ECD之间可以包括其它氨基酸作为接头。在某些实施方案中，所述接头是甘氨酸-丝氨酸(“GS”)。在某些实施方案中，所述接头基于编码其的多核苷酸序列进行选择，从而有助于将融合配偶体和/或FGFR ECD克隆到单一表达构建体中(例如，包含特定限制性位点的多核苷酸可以置于编码融合配偶体的多核苷酸和编码FGFR ECD的多核苷酸之间，其中包含限制性位点的多核苷酸编码短氨基酸接头序列)。

当所述融合配偶体和FGFR ECD通过化学方式共价偶联时，典型地可以在偶联反应过程中包含不同大小的接头。例如，本领域技术人员可以依据所述融合配偶体的特性(identity)和FGFR ECD融合分子意欲进行的特定应用，来选择将融合配偶体共价附着到FGFR ECD上的适当的方法。本领域技术人员还可以选择合适的接头类型和长度，如果其是合乎需要的。

示例性的将融合配偶体非共价附着到FGFR ECD上的方法包括，但不限于，通过结合对附着。示例性的结合对包括，但不限于，生物素和抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白，抗体及其抗原等。同样地，例如，本领域技术人员可以依据所述融合配偶体的特性和FGFR ECD融合分子意欲进行的特定应用，来选择将融合配偶体非共价附着到FGFR ECD上的适当的方法。所选择的非共价附着的方法应该适用于使用所述FGFR ECD融合分子的条件，例如，考虑pH，盐浓度和温度。

编码本发明的多肽的核酸分子

提供了包括编码本发明的多肽的多核苷酸的核酸分子。还提供了包括编码FGFR ECD融合分子的多核苷酸的核酸分子，其中FGFR ECD和融合配偶体被翻译为单一多肽。所述核酸分子可以由本领域技术人员使用本领域常规的重组DNA技术构建。

在某些实施方案中，编码本发明的多肽的多核苷酸包括编码信号肽的核苷酸序列，其在翻译时将融合到本发明的FGFR多肽的氨基端。如上文所讨论，信号肽可以是天然的信号肽，FGFR1，FGFR2，FGFR3，或FGFR4的信号肽，或可以是另一种异源信号肽。例如，关于某些示例性的FGFR信号肽的氨基酸序列显示在SEQ ID NOs：66-69和75中。某些示例性的信号肽在本领域中是已知的，并且例如，记述在由新加坡国立大学生物化学系(Department of Biochemistry，National University of Singapore)支持的在线信号肽数据库(online Signal Peptide Database)，http://proline.bic.nus.edu.sg/spdb/index.html(还参见Choo等，BMC Bioinformatics(BMC生物信息学)，6：249(2005))；和在PCT公布号WO 2006/081430中。

在某些实施方案中，包括编码目的基因的多核苷酸的核酸分子是适于在所选择的宿主细胞中进行表达的表达载体。

本发明的蛋白的表达和生产

载体

提供了包括编码本发明的多肽的多核苷酸的载体。所述载体包括，但不限于，DNA载体，噬菌体载体，病毒载体，反转录病毒载体等。本领域技术人员可以依据待表达的多肽和选择用于表达的宿主细胞来选择适当的载体。

在某些实施方案中，选择最优化用于在CHO-S或CHO-S-来源的细胞中表达多肽的载体。例如，示例性的所述载体记述在Running Deer等，Biotechnol.Prog.(生物技术进展)20：880-889(2004)中。

在某些实施方案中，选择用于在动物包括人中体内表达本发明的多肽的载体。在某些这样的实施方案中，多肽的表达处在以组织特异性方式起作用的启动子的控制下。例如，肝特异性启动子记述在，例如，PCT公布号WO 2006/076288中。

宿主细胞

在不同的实施方案中，本发明的多肽可以在原核细胞如细菌细胞中表达；或真核细胞如真菌细胞、植物细胞、昆虫细胞、和哺乳动物细胞中表达。例如，所述表达可以按照本领域已知的方法进行。某些示例性的可以用来表达多肽的真核细胞包括，但不限于，Cos细胞，其包括Cos 7细胞；293细胞，其包括293-6E和293-T细胞；CHO细胞，其包括CHO-S和DG44细胞；和NS0细胞。本领域技术人员可以依据待表达多肽、所述多肽的目的应用、和生产的规模(例如，用于实验室应用的少量，或用于制药应用的较大量)来选择适当的宿主细胞。在某些实施方案中，基于真核细胞对本发明的多肽进行某些需要的翻译后修饰的能力，而选择特定的真核宿主细胞。例如，在某些实施方案中，CHO细胞生产FGFR4ECD酸性区突变蛋白和/或FGFR4ECD融合分子，其比在293细胞中生产的相同多肽具有更高的糖基化和/或唾液酸化水平。

将核酸引入到需要的宿主细胞中可以通过本领域中已知的任何方法实现，所述方法包括，但不限于，磷酸钙转染，DEAE-葡聚糖介导的转染，阳离子脂质-介导的转染，电穿孔，转导，感染等。例如，某些示例性方法记述在Molecular Cloning，A Laboratory Manual(分子克隆，实验室手册)，第3版.Cold Spring Harbor Laboratory Press(冷泉港实验室出版社)(2001)中。按照本领域已知的方法，核酸可以被瞬时或稳定转染到需要的宿主细胞中。

在某些实施方案中，按照本领域已知的方法，多肽可以在动物中体内产生，所述动物已经被改造或转染了编码所述多肽的核酸分子。

FGFR ECD多肽的纯化

本发明的多肽可以通过本领域已知的多种方法纯化。所述方法包括，但不限于，应用亲和基质，离子交换层析，和/或疏水性相互作用层析。合适的亲和配体包括FGFR ECD的任何配体或融合配偶体的任何配体，或其抗体。例如，可以使用蛋白质A，蛋白质G，蛋白质A/G，或抗体亲和柱来结合Fc融合配偶体从而纯化本发明的多肽。针对本发明的多肽的抗体也可以用来纯化本发明的多肽。疏水性相互作用层析，例如，丁基或苯基柱，也可以适用于纯化某些多肽。本领域中已知多种纯化多肽的方法。本领域技术人员可以依据待纯化的多肽或分子的特性和依据纯化的规模(即，所生产的多肽或分子的量)来选择适当的方法。

治疗剂组合物

施用途径和载体

在多个实施方案中，本发明的多肽可以通过本领域已知的多种途径体内施用，所述途径包括，但不限于，静脉内，动脉内，皮下，肠胃外，鼻内，肌内，心内，心室内，气管内，口腔，直肠，腹膜内，皮内，局部，经皮，和鞘内，或另外通过植入或吸入进行。所述组合物可以配制成固体、半固体、液体、或气体形式的制剂；包括，但不限于，片剂，胶囊，粉剂，粒剂，药膏，溶液剂，栓剂，灌肠剂，注射剂，吸入剂，和气雾剂。编码本发明的多肽的核酸分子可以包被到金微粒上并且通过粒子轰击(particle bombardment)装置或“基因枪”皮内递送，如在文献中所述(参见，例如，Tang等，Nature(自然)356：152-154(1992))。本领域技术人员可以依据目的应用选择合适的制剂和施用途径。

在多个实施方案中，将包括本发明的多肽的组合物提供在具有药用载体的制剂中，本领域已知宽泛范围的所述药用载体(参见，例如，Gennaro，Remington：The Science and Practice of Pharmacy with Facts and Comparisons：Drugfacts Plus(雷明顿：制药科学和实践，事实与比较：药物+)，第20版.(2003)；Ansel等，Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems(药物剂型和药物递送系统)，第7版，Lippencott Williams和Wilkins(2004)；Kibbe等，Handbook of Pharmaceutical Excipients(制药专家手册)，第3版，Pharmaceutical Press(2000))。多种药用载体是公众可获得的，其包括赋形剂，佐剂，载体，和稀释剂。此外，多种药用辅助物质，如pH调节和缓冲剂，张力调节剂，稳定剂，湿润剂等，也是公众可获得的。某些非限制性示例性的载体包括盐水，缓冲盐水，右旋糖，水，甘油，乙醇，以及它们的组合。本领域技术人员可以依据目的应用选择适当的载体。

在多个实施方案中，包括本发明的多肽的组合物可以通过将其溶解、混悬，或乳化在水性溶剂或非水性溶剂中而配制成注射液，所述非水性溶剂如植物油或其它油、合成的脂肪酸甘油酯、高级脂肪酸酯、或丙二醇；并且如果需要，具有常规的添加剂，如增溶剂，等张剂，混悬剂，乳化剂，稳定剂和防腐剂。在多个实施方案中，所述组合物可以配制成用于吸入，例如，使用加压适用的推进剂，如二氯二氟甲烷，丙烷，氮气等。在多个实施方案中，所述组合物还可以配制成缓释微胶囊，如使用生物可降解的或非生物可降解的聚合物配制。非限制性的示例性生物可降解的制剂包括聚乳酸-羟基乙酸聚合物。非限制性的示例性的非生物可降解的制剂包括聚甘油脂肪酸酯。例如，制备所述制剂的某些方法记述在EP 1 125 584 A1中。本领域技术人员可以依据目的施用途径，使用本领域已知的技术和成分来选择适当的制剂。

还提供了包括一个或多个容器的药物包装和试剂盒，每个容器包含一剂或多剂的本发明的多肽。在某些实施方案中，提供单位剂量，其中所述单位剂量包含预定量的包含本发明的多肽的组合物，其具有或不具有一种或多种另外的试剂。在某些实施方案中，将所述单位剂量提供在单次使用的预先填充的注射用注射器中。在不同实施方案中，单位剂量中所包含的组合物可以包括盐水，蔗糖等；缓冲剂，如磷酸盐等；和/或在稳定且有效的pH范围内配制。备选地，在某些实施方案中，所述组合物可以提供为冻干的粉剂，其可以在添加适当的液体如无菌水时重构。在某些实施方案中，所述组合物包括一种或多种抑制蛋白聚集的物质，其包括但不限于，蔗糖和精氨酸。在某些实施方案中，本发明的组合物包括肝素和/或蛋白聚糖。

药物组合物以有效用于治疗和/或预防具体适应症的量施用。所述有效量典型地取决于被治疗的受试者的体重、其身体或健康状况，待治疗的病症的广泛性，和/或被治疗的受试者的年龄。通常，本发明的多肽应该以每剂量约50ug/kg体重至约30mg/kg体重的范围内的量施用。任选地，本发明的多肽可以以每剂量约100ug/kg体重至约20mg/kg体重的范围内的量施用。更任选地，本发明的多肽可以以每剂量约0.5mg/kg体重至约20mg/kg体重的范围内的量施用。

包含本发明的多肽的组合物可以按需要施用给受试者。施用频率的确定可以由本领域熟练的技术人员如由主治医师基于被治疗的病症的考虑、被治疗的受试者的年龄、被治疗病症的严重性、被治疗受试者的整体健康状态等而确定。在某些实施方案中，将有效剂量的本发明的多肽一次或多次施用给受试者。在多个实施方案中，有效剂量的本发明的多肽以每月至少两次、每周一次、每周两次、或每周三次施用给受试者。在不同实施方案中，有效剂量的本发明的多肽施用给受试者至少一周、至少一个月、至少三个月、至少六个月、或至少一年。

联合治疗

本发明的多肽可以单独施用或与其它治疗模式一起施用。其可以在其它治疗模式之前、基本上同时、或之后提供，所述其它治疗模式例如手术、化疗、放射治疗、或施用生物制剂，如治疗性抗体。

使用FGFR ECD多肽治疗疾病的方法

本文所述的实验的结果表明，FGFR4 ECD酸性区突变蛋白保留FGFR4结合FGF2和/或FGF19的能力。参见，例如，实施例8，包括表3和4。因此，这些嵌合体可以以与天然FGFR4 ECD相似的方式(参见，例如，美国公布号US 2008/0171689)在各种治疗方法中进行使用。

例如，本发明的多肽可以在体内用作配体阱(ligand traps)来治疗与FGFR家族的一种或多种配体如FGF2和/或FGF19相关的疾病。例如，FGFRECD多肽配体阱可以用来治疗多种癌症和/或生血管病症。在某些实施方案中，FGFR ECD多肽配体阱包括融合配偶体，如Fc，白蛋白，或聚乙二醇(上文讨论)。

在某些实施方案中，FGFR4 ECD酸性区突变蛋白可以用来治疗结肠癌。已经在原发性结肠肿瘤和多种结肠肿瘤细胞系中检测到FGFR4和FGF19的表达(参见，例如，Desnoyers，Oncogene(癌基因)，27：85-97(2008)；美国专利申请号20070248604)。在两种人结肠癌细胞系异种移植模型(HCT116和Colo201；参见Desnoyers)中，施用针对FGF19的单克隆抗体显著减少肿瘤生长。本文的实验表明，在HCT116异种移植模型中，FGFR4 ECD酸性区嵌合体ABMut1减少肿瘤生长。在Colo201模型中，在施用ABMut1后也观察到减少的肿瘤生长(数据未显示)。因此，在某些实施方案中，本发明的FGFR4ECD酸性区突变蛋白可以例如按上述施用给患有结肠癌的患者。在某些实施方案中，所述FGFR4ECD酸性区突变蛋白可以与至少一种其它治疗方案和/或药剂一起施用给结肠癌患者。

也已经在肝和肺肿瘤中检测到FGFR4和FGF19表达(参见，例如，Desnoyers，Oncogene(癌基因)，27：85-97(2008)；美国专利公布号2007/0248604)。在FGF19-转基因小鼠肝细胞癌模型中，针对FGF19的单克隆抗体减少肿瘤负担(参见Desnoyers)。FGFR4表达也已经参与乳腺癌(参见，例如，美国专利号7,297,774)。在雌激素受体阳性乳腺癌中，高FGFR4mRNA水平与患者中对作为第一线治疗的他莫昔芬的极低的临床益处相关(Meijer等，Endocr.Relat.Cancer.(内分泌相关的癌症)，15(1)：101-11(2008))。因此，FGFR4ECD酸性区突变蛋白也可以用来治疗肝癌，乳腺癌(包括浸润性管癌(infiltrating ductal carcinoma)和腺癌)，和肺癌(包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌)。

也已经在前列腺癌中检测到FGFR1和FGFR4过量表达，在5级癌症中，比在1-3级癌症中具有更大频率的高蛋白表达水平(Sahadevan等，J.Pathol.(病理学杂志)，213(1)：82-90(2007))。通过RNA干扰抑制FGFR4在体外阻断前列腺癌细胞增殖(参见id.)。因此，FGFR4ECD酸性区突变蛋白可以用来治疗前列腺癌。

FGFR配体，诸如FGF2，已知为血管生成的刺激剂。因此，FGFR ECD多肽可以施用给患有生血管病症的患者以抑制血管生成，所述生血管病症如癌症和/或黄斑变性。可以用本发明的FGFR ECD多肽治疗的其他癌症包括，例如，肉瘤和癌症，其包括但不限于，纤维肉瘤(fibrosarcomas)，粘液肉瘤(myxosarcomas)，脂肪肉瘤(liposarcomas)，软骨肉瘤(chondrosarcomas)，骨肉瘤(osteogenic sarcomas)，脊索瘤(chordomas)，血管肉瘤(angiosarcomas)，内皮肉瘤(endotheliosarcomas)，淋巴管肉瘤(lymphangiosarcomas  )，淋巴管内皮肉瘤(lymphangioendotheliosarcomas)，滑膜瘤(synoviomas)，间皮瘤(mesotheliomas)，尤因瘤(Ewing’s tumors)，平滑肌肉瘤(leiomyosarcomas)，横纹肌肉瘤(rhabdomyosarcomas)，胃癌(gastic cancers)，胰腺癌(pancreatic cancers)，卵巢癌(ovarian cancers)，前列腺癌(prostate cancers)，鳞状细胞癌(squamous cell carcinomas)，基细胞癌(basal cell carcinomas)，腺癌(adenocarcinomas)，汗腺癌(sweat gland carcinomas)，皮脂腺癌(sebaceous gland carcinomas)，乳头癌(papillary carcinomas)，乳头腺癌(papillary adenocarcinomas)，囊腺癌(cystadenocarcinomas)，骨髓癌(medullary carcinomas)，支气管癌(bronchogenic carcinomas)，肾细胞癌(renal cell carcinomas)，肝细胞瘤(hepatomas)，肝转移瘤(liver metastases)，胆管癌(bile duct carcinomas)，肝细胞瘤(choriocarcinomas)，精原细胞瘤(seminomas)，胚胎癌(embryonal carcinomas)，甲状腺癌(thyroid carcinomas)诸如未分化甲状腺癌(anaplastic thyroid cancers)，肾母细胞瘤(Wilms’tumors)，宫颈癌(cervical cancers)，睾丸瘤(testicular tumors)，膀胱癌(bladder carcinomas)，上皮癌(epithelial carcinomas)，神经胶质瘤(gliomas)，星形细胞瘤(astrocytomas)，髓母细胞瘤(medulloblastomas)，颅咽管瘤(craniopharyngiomas)，室管膜瘤(ependymomas)，松果体瘤(pinealomas)，血管母细胞瘤(hemangioblastomas)，听觉神经瘤(acoustic neuromas)，少突神经胶质瘤(oligodendrogliomas)，脑膜瘤(meningiomas)，黑素瘤(melanomas)，成神经细胞瘤(neuroblastomas)，成胶质细胞瘤(glioblastomas)，和视网膜母细胞瘤(retinoblastomas)。下列也在本发明范围内的癌症中：恶性血液病(hematologic malignancies)；前列腺癌(prostate cancer)；膀胱癌(bladder cancer)；胰腺癌(pancreatic cancer)；卵巢癌(ovarian cancer)，唾液腺癌(salivary cancer)；垂体癌(pituitary cancer)；肾细胞癌；黑素瘤；成胶质细胞瘤；和视网膜母细胞瘤。

包括增殖异常变化(如增生、转化、和发育异常)的肿瘤也可以用FGFRECD多肽治疗、调节或预防，诸如在上皮组织中存在的那些，例如，所述上皮组织包括宫颈、食道和肺。增生是一种受控的细胞增殖形式，其包括在组织或器官中的细胞数量的增加，在结构或功能上没有显著改变。例如，子宫内膜增生通常发生在子宫内膜癌之前。转化是一种受控的细胞生长形式，其中一种类型的成年或完全分化的细胞替代另一种类型的成年细胞。转化可以发生在上皮或结缔组织细胞中。非典型的转化包括略微无序的转化的上皮。发育异常通常是癌症的前兆，并且主要存在于上皮细胞中；其是一种无序形式的非赘生性细胞生长，包括个体细胞一致性的丧失和细胞结构取向的丧失。发育异常特征性地存在于存在慢性刺激或炎症的位置，并且通常存在于子宫颈、呼吸道、口腔和胆囊中。可以按照本发明治疗、调节或预防的其他良性肿瘤的实例包括动静脉(arteriovenous)(AV)畸形，特别是在颅内部位和myoleomas中。

由于FGFs有助于正常的骨形成，并且在骨基质环境中局部表达，其可以在骨转移瘤的接种、生长和存活中起作用。FGFs已经参与骨形成，影响骨原细胞复制，成骨细胞分化和凋亡。因此，阻断FGF/FGFR相互作用的试剂，包括FGFR ECD多肽，可以用来治疗癌症中的骨转移瘤，所述癌症如前列腺癌和乳腺癌。所述试剂不但抑制局部成骨细胞转化事件，而且抑制癌症骨转移瘤的最初的接种、生长和存活。

实施例

下述讨论的实施例意欲单纯地示例本发明，并且不应该被认为是以任何方式限制本发明。所述实施例不意欲表示下述实验是所有的或仅是进行的实验。已经努力确保关于所用数字(例如，量，温度等)的准确性，但是应该能够解释一些实验误差和偏差。除非另外指明，份是重量份，分子量是重均分子量，温度是摄氏度，压力是处于或接近大气压。

实施例1：构建特定的FGFR4ECD-Fc融合分子。

先前已经描述了这些实施例中所用的R1Mut4融合蛋白的克隆、表达和纯化(WO 2007/014123)。也已经描述了在这些实施例中所用的母体FGFR4ECD-Fc融合蛋白的克隆(WO 2007/014123，称为“R4Mut4”)。对于在293-6E细胞中的瞬时表达，将R4Mut4克隆到载体pTT5(Biotechnology Research Institute(生物技术研究所)，Montreal，加拿大)中并且由该载体表达。利用PCR和常规诱变技术构建R4Mut4融合蛋白的嵌合体。R4Mut4嵌合体先克隆到哺乳动物表达载体pcDNA3.1(Invitrogen)中用于在293-6E细胞中瞬时表达。

将母体R4Mut4构建体中的FGFR4结构部分的一级序列和结构域结构显示在图1中。在第一和第二免疫球蛋白(Ig)结构域(氨基酸98-124)之间的氨基酸序列在本文中可互换地表示为“接头结构域”“接头区，”“D1-D2接头，”和“D1-D2接头区”(参见图1)。在接头结构域中是称为“酸性盒”(“AB”)的较小的区域，其存在于FGFR家族中。构建了三种母体R4Mut4嵌合体，其中在R4Mut4接头结构域内的区域用来自FGFR1接头结构域的相对应的序列替换。图2显示来自FGFR1和FGFR4的接头结构域和边界的序列比对以及在所构建的称为ABMut1，ABMut2，和ABMut3的三种变体中的交换区的序列(见表1)。表1以名称和简要描述列出在这些实施例中所用的各种FGFR-Fc融合蛋白。

表1.FGFR-Fc融合蛋白

当与293-6E宿主细胞比较时，CHO-S宿主细胞可以提供重组蛋白的较高的产量和/或不同的糖基化模式。对于在CHO-S宿主细胞中的融合蛋白表达，我们使用pTT5和pDEF38(ICOS Corporation(ICOS公司)，Bothell，WA)载体。利用PCR和常规亚克隆技术，将R4Mut4和FGFR4ECD-Fc酸性区突变蛋白亚克隆到pTT5和pDEF38载体中。

DG44(Invitrogen，Carlsbad，CA)是CHO-S细胞系的衍生细胞系，我们已经发现其可以提供较高的重组蛋白产量。对于在DG44宿主细胞中的融合蛋白表达，我们使用载体pDEF38。

实施例2：融合蛋白在293-6E和CHO-S宿主细胞中的瞬时表达

在此处的特定实施方案中，融合蛋白在293-6E细胞中瞬时表达。设计在实施例1中记述的R4Mut4/pTT5表达载体提供在293-6E宿主细胞中的瞬时表达。用于表达的293-6E宿主细胞先前适合在Free-Style培养基(Invitrogen)中进行无血清悬浮培养。将细胞在对数生长期(对数生长)以9×10⁵/ml-1.2×10⁶/ml的细胞密度转染所述表达载体。

为了转染500ml 293-6E细胞混悬液，通过将500微克(ug)表达载体DNA在25ml无菌磷酸缓冲盐水(PBS)中混合而制备转染混合物，所述无菌磷酸缓冲盐水在25ml无菌PBS中具有1mg聚氮丙啶(来自无菌水中1mg/ml的溶液)。将该转染混合物在室温温育15分钟。在温育之后，将转染混合物加入到处于对数期生长的293-6E细胞中进行转染。然后，将细胞和转染混合物在37℃在5％CO₂中温育24小时。在温育之后，加入Trypton-N1(Organotechnie S.A.，La Courneuve，法国；在无菌FreeStyle培养基中20％的溶液)至终浓度0.5％(v/v)。将混合物在37℃和5％CO₂保持约6-8天，直到细胞达到约3-4×10⁶细胞/ml的密度且显示＞80％的存活力。为了从细胞培养基中收集融合蛋白，将细胞在4℃以400x g沉淀15分钟，并且轻轻倒出上清。上清通过在4℃以3，315x g离心15分钟清除细胞碎片。然后将包含所述融合蛋白的澄清的上清用于纯化。

为了提供小批次(1-2mg)的R4Mut4用于在短时间内进行体内研究，使用质粒构建体R4Mut4/pDEF38进行由悬浮的CHO-S宿主细胞的瞬时生产。简言之，将悬浮的CHO-S细胞(Invitrogen)在补充了L-谷氨酰胺(Invitrogen)的Freestyle CHO表达培养基中培养。在转染前那天，将CHO-S细胞以约5×10⁵/ml的密度接种在摇瓶中，然后在转染之日达到约1×10⁶/ml的密度。为了转染125ml的细胞混悬液，将156.25ug表达载体DNA与2.5ml OptiPro无血清培养基混合。将156.25ul FreestyleMax转染试剂(Invitrogen)独立地与2.5ml OptiPro无血清培养基混合。通过将DNA/OptiPro培养基混合物和FreestyleMax/Optipro培养基混合物在室温下组合10分钟而制备转染混合物。温育后，将转染混合物添加到CHO-S细胞中。然后，将细胞和转染混合物在37℃在5％CO₂温育6天。在温育后，细胞密度为约3.3-3.7×10⁶/ml，存活力为约82-88％。通过离心将培养物上清与细胞分离，并且收集上清进行纯化。利用该方法，可以在约1周内从400ml瞬时转染的细胞培养物中制备1mg的R4Mut4。

当如下所示时，使用实施例1所述的pDEF38表达载体通过在CHO-S细胞中瞬时表达而类似地生产R4Mut4变体ABMut1，ABMut2，和ABMut3。

实施例3：纯化表达的蛋白

利用蛋白质A亲和层析的第一纯化步骤，然后是丁基疏水相互作用层析的第二纯化步骤，由细胞培养物上清纯化由重组宿主细胞表达的FGFRECD-Fc融合蛋白。对于蛋白质A亲和层析步骤，培养物的成分在Mabselect蛋白质A琼脂糖柱(GE Healthcare Bio-Sciences(GE卫生保健生物科学)，Piscataway，NJ)上分离，该柱将结合融合分子的Fc区。将该柱用10个柱体积的无菌缓冲液10mM Tris，100mM NaCl，pH 8.0平衡；然后，将细胞培养物上清应用到柱上。将柱用8个柱体积的无菌10mM Tris，100mM NaCl缓冲液，pH 8.0洗涤。然后使用7个柱体积的洗脱缓冲液(100mM甘氨酸，100mM NaCl，pH 2.7)用一步洗脱以10ml/min的流速洗脱结合的物质，其包括R4Mut4。将10ml级分收集在含有1ml1M Tris pH 8.0(Ambion，Austin，TX)的管中以中和洗脱物。将包含R4Mut4的级分通过凝胶电泳进行鉴定并且合并。

对于丁基疏水相互作用层析的第二纯化步骤，使用GE卫生保健Akta纯化器100(GE Healthcare Akta Purifier 100)(GE Healthcare Bio-Sciences(GE卫生保健生物科学)，Piscataway，NJ)，将合并的蛋白质A柱洗脱物进一步在丁基琼脂糖柱上纯化。将该柱首先用5个柱体积的无菌10mM Tris，1M硫酸铵，pH 8.0平衡。然后将半体积的3M硫酸铵添加到洗脱物中，然后将其应用到平衡的丁基琼脂糖柱上。将该柱用4个柱体积的平衡缓冲液洗涤，并且结合的物质用起始于50％平衡缓冲液/50％洗脱缓冲液(10mMTris pH 8.0)且终止于90％洗脱缓冲液/10％平衡缓冲液的线性梯度以20个柱体积的总体积以5ml/min的流速进行洗脱。最后，使用另外2个柱体积的100％洗脱缓冲液。收集14ml级分。用约40-60％的洗脱缓冲液洗脱R4Mut4。通过凝胶电泳鉴定包含大部分R4Mut4的级分并且合并。

在纯化后，通过鲎变形细胞溶解物实验(limulus amoebocyte lysate)(LAL)测定(Cambrex，Walkersville，MD)检验内毒素水平。证实内毒素水平小于或等于1内毒素单位(EU)/mg R4Mut4。

实施例4：在DG44细胞中稳定生产

将在实施例1中所述的表达载体R4Mut4/pDEF38用来转染DG44宿主细胞，从而用于稳定生产R4Mut4。未转染的DHFR-阴性CHO细胞系DG44在补充了8mM L-谷氨酰胺，1x次黄嘌呤/胸苷(HT；Invitrogen)，和18ml/L多聚醇-68(Pluronic-68)(Invitrogen)的CHO-CD无血清培养基(Irvine Scientific，Irvine，CA)中培养。将约50ug R4Mut4/pDEF38质粒DNA通过用限制性酶PvuI消化而线性化，然后通过加入乙醇沉淀，简单在空气中晾干，然后重悬在400ul无菌蒸馏水中。在转染前日，将DG44细胞以约4×10⁵/ml的密度接种在摇瓶中，并且在转染之日达到约0.8×10⁶/ml的密度。通过离心收集细胞，每次转染使用约1×10⁷细胞。

对于转染，将每个细胞沉淀物重悬在0.1ml Nucleofector V溶液中，并且转移到Amaxa Nucleofector小杯(Amaxa，Cologne，德国)中。加入约5ug重悬的线性化质粒DNA并且与小杯中悬浮的DG44细胞混合。然后，将细胞用Amaxa Nucleofector Device II使用程序U-024进行电穿孔。将电穿孔的细胞在CHO-CD培养基中培养两天，然后转移到选择性培养基(补充了8mM L-谷氨酰胺和18ml/L多聚醇-68的CHO-CD无血清培养基)。选择性培养基每周更换一次。约12天后，将1ug/ml R3Long IGF I生长因子(Sigma，St.Louis，MO)加入到培养基，继续再培养一周直到汇合。通过夹心R4Mut4ELISA测定来自稳定转染的细胞系的合并物的上清，以确定产物滴度。这一转染方法由稳定转染的细胞合并物产生约30ug/ml R4Mut4的表达水平。

实施例5：在体外与肝细胞的结合

预备实验表明，当注射到小鼠尾静脉中时，R4Mut4在异种移植模型中具有抗肿瘤特性，但是表现出非常快速的起始血清浓度下降。(数据未显示)随后的实验表明，与FGFR1ECD融合蛋白R1Mut4不同，R4Mut4在体外以浓度依赖性方式结合细胞外基质基质胶。参见，例如，图6和实施例9。为了确定R4Mut4是否在体内与肝脏结合，进行进一步的体外结合实验，以确定R4Mut4和R1Mut4是否结合肝细胞，并且还确定所述结合的肝素-敏感性。

如在实施例2和3中所述，在CHO-S细胞中表达R4Mut4和R1Mut4并进行纯化。对于该实验，检测三个不同批次的R4Mut4；每个批次独立地表达和纯化。从Caltag(现今为Invitrogen的一部分)获得人IgG1对照蛋白。

肝细胞分离自成年大鼠。将大鼠用异氟烷麻醉，用加热器尽可能将动物保持在接近37℃。进行中线切口，并且从腔中取出器官，以接近门静脉。门静脉插入以动脉夹(bulldog clamp)固定的蝶形导管。泵以8ml/min起始Hanks平衡盐溶液，该Hanks平衡盐溶液无Ca²⁺或Mg²⁺，具有10mM Hepes，0.5mM EGTA，50ug/ml庆大霉素，pH 7.38。然后在肝脏下切下约2cm的下腔静脉(IVC)，并且通过切割心脏产生出口。调整流速为40ml/min，并且一旦观察到清楚的灌注迹象，在肝脏和IVC的后切口之间夹持IVC。4分钟后，将肝脏消化介质(Liver Digest Media)(Invitrogen)加入到灌注线路中。两种溶液一起灌注30秒，然后停止Hanks平衡盐溶液。然后，将肝脏消化介质的流速减少至20ml/min，并且灌注持续约10分钟。然后切下肝脏，并且将在每个肝叶的被膜中进行小切口。将肝脏置于黏附在烧杯顶部的无菌纱布上，并且轻轻旋转，同时继续用肝脏消化介质将肝细胞润洗到烧杯中。

将包含肝细胞的介质倾倒到50ml锥形管中，并且以400rpm离心约2分钟。吸除介质，并且加入25ml培养基(Williams培养基E(Sigma)，100IU/ml青霉素(Cellgro)，100ug/ml链霉素(Cellgro)，1X ITS(胰岛素，运铁蛋白和亚硒酸钠，来自Sigma(西格玛))和10％FBS(Cellgro))至管的一半，并且重悬细胞。然后，将重悬的细胞轻轻倒入其余的管中，并且每个管中培养基的体积达到50ml。将管再次如上述离心，重复倾析步骤。然后，将细胞以500,000细胞/ml的浓度重悬在冰冷的染色缓冲液(无Ca²⁺和Mg²⁺的PBS(Invitrogen)，其补充了1％牛血清白蛋白(BSA；w/v)和0.1％NaN₃(w/v)，二者均来自Sigma)中。然后，将肝细胞用5ug/ml R1Mut4，R4Mut4，或对照人IgG1温育30分钟。在存在肝素的样品中，在与肝细胞混合前，将R1Mut4，R4Mut4，或对照人IgG1用10倍摩尔过量的肝素钠(来自猪肠黏膜，Catalog#086K2231，Sigma)预先温育。

在用融合蛋白或对照IgG1(有或无肝素)温育后，在染色缓冲液中洗涤细胞，并且在冰上用5ug/ml生物素化的山羊抗人Fc(Becton Dickinson)温育细胞30分钟。然后，在染色缓冲液中洗涤细胞，并且在冰上用1ug/ml链霉抗生物素蛋白-APC缀合物(Becton Dickinson)温育30分钟。将细胞再次用染色缓冲液洗涤，然后用0.5ug/ml碘化丙啶(Sigma)染色。吸附碘化丙啶的不存活细胞被排除(gate out)，以致仅有的存活细胞包含在流式细胞术分析中。关于APC荧光定量存活细胞。如在图3中所示，在该实验中，与对照IgG1或R1Mut4相比，R4Mut4表现出10倍更多的与大鼠肝细胞的结合。另外，所有三个批次的R4Mut4以相似的亲和性结合大鼠肝细胞，这表明R4Mut4对大鼠肝细胞的高亲和性不是由于不寻常的表达或纯化条件。最后，在该实验中，加入肝素防止R4Mut4与肝细胞结合。

实施例6：在体内肝素增加R4Mut4在血浆中的Cmax

实施例5中所讨论的实验表明，R4Mut4结合肝细胞，并且肝素可能干扰所述结合。为了检测肝素在体内是否能够增加血清中存在的R4Mut4的量，将R4Mut4与外源肝素或不与外源肝素一起施用给小鼠，并且在注射后的不同时间点通过ELISA分析血清中R4Mut4的量。在本实验中注射的R4Mut4如在实施例2和3中所述由CHO-S细胞表达和纯化。

将30只雄性Balb/C小鼠(Jackson Laboratories，Bar Harbor，ME)称重并且基于随机的体重分布将其分成两组，每组15只小鼠。第一组中的小鼠给与在总体积为0.5ml的PBS(Cellgro，Herndon，VA)中的3mg/kg R4Mut4的静脉内注射(通过尾静脉)。第二组中的小鼠给与在IV给药前已与5mg/kg肝素钠(来自猪肠黏膜，Sigma)预先混合30分钟-2小时的3mg/kg R4Mut4的静脉内注射(通过尾静脉)。

在IV施用后的6个不同时间点，在约2分钟，2小时，8小时，1天，4天和6天，收集小鼠的血液。每只小鼠仅采血两次，第一次是通过眼眶后采血，第二次最终通过心脏穿刺采血。将每个IV组的15只小鼠进一步分成三个小组，每小组5只小鼠。将第一小组用于在2分钟和2小时采集血液。将第二小组用于在24小时和4天采集血液。将第三小组用于在8小时和6天采集血液。

将眼眶后采血通过肝素-包被的毛细管(Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)收集到K2-EDTA包被的管(BD Biosciences；San Jose，CA)中，置于湿冰上约30分钟，然后在微量离心机中以10,621x g(10,000rpm)离心8分钟。第二次最终采血通过未包被的注射器收集到K₂-EDTA包被的管(BDBiosciences(BD生物科学))中，然后如上述处理。在离心后，取出血浆，并且冷冻在-80℃直到用于通过ELISA分析。

为了检测血浆样品中的R4Mut4，使用直接ELISA检测FGF2结合活性。简言之，将Maxisorp 96孔板(Nunc，Rochester，NY)用在PBS(Mediatech，Herndon，VA)中的1ug/ml重组人FGF2(PeproTech，Rocky Hill，NJ)在4℃包被过夜。然后，将所述板用封闭缓冲液(在PBS中的1％BSA(Sigma))在室温下封闭2-3小时。将所述板用洗涤缓冲液(在PBS中的0.05％吐温-20(v/v；Sigma))洗涤6次。制备检测样品和R4Mut4标准品的各种稀释液，每份样品中血浆的恒定终浓度为5％。将100ul检测样品加入到每个孔中，然后在室温下温育约90分钟。将所述板用洗涤缓冲液洗涤6次，然后向每个孔中加入在测定稀释剂(在PBS中的1％BSA和0.05％吐温-20)中1∶60,000稀释的过氧化物酶-缀合的AffiPure山羊抗人IgG-Fc抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories(Jackson免疫研究实验室)，West Grove，PA)并且在室温下温育约1小时。将所述板用洗涤缓冲液洗涤6次，然后，每孔加入100ul TMB底物(Pierce Biotechnology，Chicago，IL)，并且温育10分钟。反应用50ul终止溶液(2N H₂SO₄)猝灭。然后，在SPECTRAmax PLUS微量培养板读数仪(Molecular Devices(分子装置)，Sunnyvale，CA)上读取450nm处的吸光度。

来自所述实验的关于所有6个时间点的结果显示在表2中，前4个时间点图示在图4中。

表2.R4Mut4血清水平

这些结果表明，在该实验中，与单独施用R4Mut4相比，肝素与R4Mut4共同施用在2分钟的时间点增加血浆中的最大R4Mut4浓度(C_max)约9倍，在2小时的时间点增加约7倍。两个曲线在8小时的时间点合并。这些数据表明，在该实验中，肝素增加血清中没有的R4Mut4的量，但是至8小时时该保护作用丧失。先前的报道已表明，肝素具有短的体内半衰期(～45-60分钟；参见Bjornsson和Levy，J.Pharmacol.Exp.Ther.(1979)210：243-246)，在该实验中，这可能在肝素的保护作用的持续中起作用。

实施例7：FGFR ECD-Fc在体外与细胞外基质成分的结合

进行体外结合研究来表征4种FGFR ECD-Fc融合蛋白中的每一种与细胞外基质成分(ECM)的结合的能力。对于该研究，野生型FGFR1 ECD-Fc，FGFR2 ECD-Fc，FGFR3 ECD-Fc和FGFR4 ECD-Fc融合蛋白购自R&D系统(R&D Systems)(Minneapolis，MN)。

将96孔基质胶板(Becton-Dickinson)用1％(w/v)BSA溶液(Sigma)封闭。将FGFR ECD-Fc融合蛋白连续稀释，转移到基质胶板中，并且允许在室温下结合1小时。通过用PBS(EMD Biosciences(EMD生物科学)；La Jolla，CA)和0.5％吐温(v/v；Sigma)洗涤3次去除未结合的融合蛋白。结合的融合蛋白用过氧化物酶-缀合的抗人Fc抗体(Bethel Laboratories(Bethel实验室)，Montgomery，TX)和OPD  (邻苯二胺二盐酸盐(o-phenylenediamine dihydrochloride))底物(Sigma)依据供应商的说明书所述进行检测。在该实验中，FGFR4ECD-Fc以约300ng/mL的EC₅₀紧密结合基质胶板。参见图5。FGFR1 ECD-Fc，FGFR2 ECD-Fc，和FGFR3 ECD-Fc均显示出比FGFR4 ECD-Fc显著更弱的与基质胶板的结合，在该实验中甚至在10,000ng/ml的浓度也没有观察到半最大结合。参见图5。

实施例8：FGFR4 ECD酸性区嵌合体-Fc融合蛋白结合FGF2和FGF19。

为了减少组织结合并且提高药物代谢动力学模式，将三种FGFR4ECD酸性区嵌合体融合到Fc上，在293-6E细胞中表达，并且纯化。另外，构建、表达并且纯化两种FGFR4 2Ig ECD-Fc融合蛋白，其中D1或D1+酸性盒区已被删除。

使用

X表面等离振子共振(SPR)技术(Uppsala，瑞典)，确定母体R4Mut4和5种不同的FGFR4 ECD-Fc融合蛋白(统称为“R4蛋白”)的FGF2和FGF19配体结合亲和性和动力学。选择FGF2，因为其在成年组织中广泛表达，并且参与癌症进展和血管生成。选择FGF19，因为在不存在其它蛋白辅因子的条件下，其特异性结合FGFR4。简言之，按照供应商的使用说明，蛋白质A与CM5芯片共价连接。R4蛋白在实施例2所述的293-6E宿主细胞中生产，并且如实施例3所述进行纯化，然后通过Fc结构域与蛋白质A相互作用而与芯片结合。R4蛋白被捕获到流动通道2-4上，而通道1作为参照。FGF2购自Peprotech(Rocky Hill，NJ)，FGF19购自R&D系统(R&D Systems)。每种FGF配体以5种浓度(100nM，25nM，6.25nM，1.56nM，和0nM)注射2分钟，并且监测解离4分钟。在运行缓冲液中包含50uM肝素。使用Biacore T100评估软件包，利用1∶1的结合模型，计算每种R4蛋白对于FGF2和FGF19的缔合常数、解离常数、亲和性、和结合能力。

该实验的结果显示在表3和4中。

表3.FGF2配体结合

表4.FGF19配体结合

如在表3和4中所示，在该实验中，如通过平衡解离常数(K_D)所测量的，与母体R4Mut4关于FGF2和FGF19的亲和性相比，三种嵌合体ABMut1，ABMut2，和ABMut3具有相等的或更大的关于FGF2和FGF19的亲和性。

另外，在该实验中，如通过平衡解离常数(K_D)所测量的，删除了D1的FGFR4ECD-Fc融合蛋白，在存在(R4(2Ig+L))或不存在(R4(2Ig-L))D1-D2接头区的条件下，以与母体R4Mut4相等或更大的亲和性结合FGF2。在该实验中，在存在D1-D2接头区(R4(2Ig+L))的条件下，D1的删除将与FGF19的结合减少约10倍，并且在不存在D1-D2接头区(R4(2Ig-L))的条件下，将与FGF19的结合减少约5倍。

这些结果表明，所有检测的R4蛋白保持与FGF2和/或FGF19结合的能力，尽管在所述实验中，与母体或酸性区嵌合体相比，D1缺失的蛋白表现出较弱的与FGF19的结合。

实施例9：FGFR4 ECD酸性区嵌合体-Fc融合蛋白在体外结合细胞外基质(ECM)成分。

进行体外结合研究来表征FGFR4 ECD酸性区嵌合体结合ECM的能力。如实施例2所述，FGFR4-Fc酸性区嵌合体-Fc融合蛋白在293-6E细胞中表达，并且均如实施例3中所述进行纯化。如实施例2所述，母体R4Mut4在CHO细胞中表达，并且也如实施例3中所述进行纯化。

如实施例7中所述进行结合实验，并且结果的图示显示在图6中。在该实验中，母体R4Mut4以约100ng/ml的EC₅₀结合基质胶板。在该实验中，所有三种FGFR ECD酸性区嵌合体-Fc融合蛋白表现出多至10,000ng/ml的浓度的与基质胶板的最小结合。因此，在该实验中，FGFR1 D1-D2接头，FGFR1外显子4，或FGFR1酸性盒区对FGFR4 ECD相对应区域的替换消除了FGFR4 ECD的体外细胞外基质结合。

实施例10：FGFR4 ECD酸性区嵌合体-Fc融合蛋白在体外结合肝细胞。

检测FGFR4 ECD酸性区嵌合体-Fc融合蛋白ABMut1，ABMut2和ABMut3结合肝细胞的能力。如实施例2中所述，所述融合蛋白在293-6E细胞中表达，并且如实施例3中所述进行纯化。如实施例2中所述，R1Mut4和R4Mut4蛋白在CHO-S细胞中表达，并且如实施例3中所述进行纯化。人IgG1对照蛋白获自Caltag。

如实施例5中所述进行肝细胞结合实验，并且结果的图示显示在图7中。在该实验中，所有三种FGFR4ECD酸性区嵌合体-Fc融合蛋白均表现出与R1Mut4相等的肝细胞结合，并且与母体R4Mut4相比极大减少。

实施例11：FGFR4ECD酸性区嵌合体-Fc融合蛋白在小鼠中的药物代谢动力学。

在体内将ABMut1的药物代谢动力学性质与母体R4Mut4进行比较。如在实施例2中所述，两种蛋白均在CHO-S细胞中表达，并且如实施例3中所述进行纯化。

将40只雌性Balb/C小鼠(Charles River Laboratories(查理斯河实验室)，Wilmington，MA)称重，并且基于随机的体重分布将其分成两组，每组20只小鼠。在第一组中的小鼠接受R4Mut4，并且第二组的小鼠接受ABMut1。每只小鼠通过经由尾静脉的静脉内注射接受在总体积0.2ml的PBS(Cellgro)中的5mg蛋白/kg体重。

在IV施用后的9个不同时间点，在约2分钟，30分钟，2小时，7小时，1天，2天，3天，5天和7天，收集血浆。从每只小鼠收集血液二或三次，第一次或第二次收集通过眼框后采血，最后一次最终通过心脏穿刺采血。将每个治疗组的20只小鼠进一步分成4个小组，每小组5只小鼠。每个组在表5所示的时间采血。

表5.样品收集时间和方法

收集血浆血清，并且通过实施例7所述的直接FGF2结合ELISA确定R4Mut4和ABMut1蛋白水平。将结果显示在图8中，特定的药物代谢动力学参数提供在表6中。结果表明，用FGFR1 D1-D2接头替换FGFR4 ECD的D1-D2接头增加所施用的蛋白的半衰期(t_1/2)126％，增加最大观察到的血浆浓度(C_max)183％，并且增加清除时间(CL)302％。改善的ABMut1药物代谢动力学模式表明，与母体R4Mut4分子相比，其以治疗浓度在血液中存在更久。

表6.R4Mut4和ABMut1的药物代谢动力学参数

实施例12：在HCT116sc癌症异种移植模型中的活性。

使用人结肠癌HCT116sc细胞，在异种移植结肠癌模型中检测母体R4Mut4和ABMut1的抗癌活性。HCT116sc细胞系是HCT116结肠癌细胞系(ATCC，Manassas，VA)的亚系，所述HCT116结肠癌细胞系分离自皮下HCT116肿瘤，并且利用标准细胞培养和异种移植技术针对更加一致的体内生长进行选择。为了准备用于异种移植实验的HCT116sc细胞，将细胞在补充了10％FBS(vol/vol)，2mM L-谷氨酰胺，100IU/ml青霉素和100ug/ml链霉素(均购自Cellgro)的RPMI 1640培养基中在37℃在具有5％CO₂的潮湿气氛中培养5代。将半汇合的细胞(～80％)以1×10⁸细胞/ml的浓度重悬在无钙和镁的PBS(Cellgro)中。加入基质胶基底膜基质(BD Biosciences(BD生物科学))至50％(vol/vol)，以产生5×10⁷细胞/ml的终浓度，并且在植入小鼠中之前将混合物保存在冰上。

对于异种移植实验，使用60只CB17 SCID小鼠(Charles River Laboratories)。在第1天，测量每只小鼠的体重。将小鼠基于其体重随机分成6组，每组10只小鼠。一旦指定了治疗组，将小鼠在右后胁剃毛，然后皮下接种前述制备的5×10⁶个(100ul)HCT116sc细胞。

次日，对动物按照表7所示的给药方案给药检测制品(test article)。如实施例2和3所述，将R4Mut4和ABMut1分别在CHO-S细胞中表达并且纯化。

表7.HCT116sc异种移植给药组

在肿瘤细胞接种那天后的7，14和21天，对每只小鼠测量肿瘤尺寸。使用测径器测量每个肿瘤的长和宽，并且按照下式计算肿瘤尺寸：

肿瘤尺寸(mm³)＝宽²(mm)x长(mm)x(π/6)

图9显示该实验结果。与赋形剂治疗的动物相比较，接受R4Mut4或ABMut1的所有组的小鼠均表现出肿瘤生长的减少。表8显示与赋形剂治疗组相比较，在14和21天，对每个治疗组的肿瘤生长的平均百分比抑制，和相对应的p-值。使用ANOVA分析然后通过Bonferonni t-检验计算p-值。参见，例如，MathematicalStatisticsandData Analysis(数学统计学和数据 分析)，1988，Wadsworth & Brooks，Pacific Grove，CA。这一分析表明，在该实验中，与母体R4Mut4相比，ABMut1以相似或更大的程度减少肿瘤生长。

表8.HCT116sc异种移植结果

实施例13：增加FGFR4ECD酸性区嵌合体浓度在体外导致可检测的ECM结合。

如在实施例9中所述和在图6中所示，先前的体外结合实验表明，当多至10,000ng/ml纯化的蛋白与基质胶板温育时，三种FGFR4ECD酸性区嵌合体-Fc融合蛋白(ABMut1，ABMut2，和ABMut3)与ECM成分的最小结合。进行实验来确定，在相同的体外ECM结合测定中，更高浓度(至多1mg/ml)的ABMut1融合蛋白是否能够表现出增加水平的ECM结合。

在这些实验中，使用R1Mut4，R4Mut4，和ABMut1融合蛋白。将R1Mut4融合蛋白作为ECM结合的阴性对照(数据未显示)，并且将R4Mut4融合蛋白作为ECM结合的阳性对照。如实施例2所述，所有三种融合蛋白在CHO细胞中表达，并且如实施例3所述进行纯化。R4Mut4和ABMut1融合蛋白还在293-T细胞中瞬时表达。对于在293-T细胞中的瞬时表达，将0.5-0.65×10⁶个细胞接种在6孔板的每个孔(有或物聚赖氨酸包被)中，每个孔中有2ml补充了10％FBS的DMEM。通过组合93.5ul Optimem与6.5ul Fugene^TM，然后温育5分钟，制备Fugene^TM(Roche)储液。通过组合1.3ug DNA与Optimem至终体积100ul，而制备DNA储液。将Fugene^TM储液(100ul)加入到DNA储液(100ul)中，并且将该组合的溶液(200ul)加入到6孔板的一个孔中。将溶液轻轻搅动，并且允许与所述细胞在室温下温育30分钟。将细胞在具有5％CO₂的潮湿培养箱中温育。40小时后，去除培养基，洗涤细胞，并且向每个孔中加入1.5ml Optimem。更换培养基后49小时，收集上清，以1,400rpm离心10分钟，并且转移到新鲜的管中。除了仅利用蛋白质A亲和层析的第一纯化步骤之外，如实施例3所述从培养基中纯化融合蛋白。使用α筛选(hu IgG AlphaLISA；Perkin-Elmer#AL205C)确定蛋白水平。除了在体外ECM结合测定中使用至多1mg/ml每种FGFR ECD-Fc融合蛋白之外，如实施例7所述进行ECM结合实验。将结果的图示显示在图12中。如图12所示，对于ABMut1融合蛋白在较高的浓度观察到可检测的ECM结合水平，尽管ABMut1融合蛋白的ECM结合仍比R4Mut4融合蛋白的ECM结合低得多。

实施例14：用来自FGFR1的相对应的酸性残基替换FGFR4ECD长酸性盒中的特定的单个非酸性残基不足以在体外抑制ECM结合。

进行实验来确定用来自FGFR1的相对应的酸性残基替换FGFR4ECD长酸性盒中的单个非酸性残基是否能够在体外抑制ECM结合。该实验使用4种FGFR4ECD长酸性盒变体，其中来自R4Mut4的FGFR4ECD的单个非酸性残基用来自FGFR1的相对应的酸性残基替换。利用常规的克隆和位点定向诱变方法在pTT5载体中产生编码R4Mut4(N104D)，R4Mut4(P109D)，R4Mut4(R113E)，和R4Mut4(S116E)融合蛋白的克隆。R4Mut4(N104D)，R4Mut4(P109D)，R4Mut4(R113E)，和R4Mut4(S116E)长酸性盒变体分别对应于SEQ ID NOs：130，131，132，和133。R4Mut4(N104D)，R4Mut4(P109D)，R4Mut4(R113E)，和R4Mut4(S116E)变体中的每一个分别在SEQ ID NOs：1和2中包含在氨基酸104，109，113，和116处的单个氨基酸改变。将4种具有单个氨基酸取代的FGFR4ECD长酸性盒变体的体外ECM结合与R1Mut4，R4Mut4，和ABMut1融合蛋白进行比较。

如实施例1所述，所有的融合蛋白，包括R1Mut4，R4Mut4，ABMut1，R4Mut4(N104D)，R4Mut4(P109D)，R4Mut4(R113E)，和R4Mut4(S116E)，在293-T细胞中瞬时表达，并且纯化。利用α筛选(hu IgG AlphaLISA；Perkin-Elmer#AL205C)确定蛋白水平。纯化的R4Mut4(N104D)和R4Mut4(S116E)的浓度太低而不能可靠地确定ECM结合。纯化的R4Mut4(P109D)和R4Mut4(R113E)融合蛋白的浓度低于纯化的R1Mut4，R4Mut4，和ABMut1融合蛋白的浓度，并且不允许在最高的浓度分析其ECM结合。除了在体外ECM结合测定中对所检测的大部分融合蛋白使用较高的蛋白水平之外，如实施例7所述进行ECM结合实验。将结果的图示显示在图13中。如在图13中所示，具有单个氨基酸取代的R4Mut4变体(即，R4Mut4(P109D)和R4Mut4(R113E))，其以充分的水平表达足以确定ECM结合，相对于R4Mut4，并不表现出减少的ECM结合。

实施例15：包含至少两个另外的酸性残基的FGFR4ECD长酸性盒变体表现出减少的ECM结合。

实施例14中所述的实验表明，人们增加FGFR4ECD酸性区突变蛋白长酸性盒中的酸性氨基酸残基总数不足以在体外抑制ECM结合。因此，进行实验来确定FGFR4ECD酸性区突变蛋白长酸性盒中酸性氨基酸残基数目的进一步增加，包括在SEQ ID NOs：1和2的氨基酸103和104之间插入的任何酸性氨基酸残基，是否能够在体外抑制ECM结合。

在这些实验中使用五种FGFR4ECD长酸性盒变体融合分子，称为R4(104-114):R1(106-117)，R4(104-114):R1(107-117)，R4(104-110):R1(105-113)，R4(113-116):R1(116-119)，和R4(109-113):R1(112-116)，其分别对应于SEQ.ID.NOs：134，135，136，137，和138。在R4(104-114):R1(106-117)FGFR4ECD长酸性盒变体中，FGFR1ECD的氨基酸106-117替代FGFR4ECD的氨基酸104-114。在R4(104-114):R1(107-117)FGFR4ECD长酸性盒变体中，FGFR1 ECD的氨基酸107-117替代FGFR4 ECD的氨基酸104-114。在R4(104-110):R1(105-113)FGFR4 ECD长酸性盒变体中，FGFR1 ECD的氨基酸105-113替代FGFR4 ECD的氨基酸104-110。在R4(113-116):R1(116-119)FGFR4 ECD长酸性盒变体中，FGFR1 ECD的氨基酸116-119替代FGFR4 ECD的氨基酸113-116。在R4(109-113):R1(112-116)FGFR4ECD长酸性盒变体中，FGFR1 ECD的氨基酸112-116替代FGFR4 ECD的氨基酸109-113。使用R4Mut4母体克隆作为模板，利用常规的克隆和位点定向诱变在pTT5载体中产生编码R4(104-114):R1(106-117)，R4(104-114):R1(107-117)，R4(104-110):R1(105-113)，R4(113-116):R1(116-119)，和R4(109-113):R1(112-116)融合蛋白的克隆。将4种FGFR4 ECD长酸性盒变体的体外ECM结合与R1Mut4，R4Mut4，和ABMut1融合蛋白进行比较。

如在实施例11中所述，所有的融合蛋白，包括R1Mut4，R4Mut4，ABMut1，R4(104-114):R1(106-117)，R4(104-114):R1(107-117)，R4(104-110):R1(105-113)，R4(113-116):R1(116-119)，和R4(109-113):R1(112-116)在293-T细胞中瞬时表达并且进行纯化。利用α筛选(hu IgG AlphaLISA；Perkin-Elmer#AL205C)确定蛋白水平。除了在体外ECM结合测定中使用至多1mg/ml FGFR ECD-Fc融合蛋白之外，如实施例7所述进行ECM结合实验。将结果的图示显示在图14中。如在图14中所示，至少R4(104-114):R1(106-117)和R4(104-110):R1(105-113)FGFR4 ECD长酸性盒变体表现出介于R4Mut4和ABMut1融合蛋白之间的ECM结合水平。

实施例16：缺少单个N-多糖位点的FGFR4ECD酸性区嵌合体表现出减少的ECM结合。

如通过质谱确定的，FGFR4ECD包含5个N-多糖位点。(数据未显示)在SEQ.ID.NOs：1和2的氨基酸N91和N156处的FGFR4ECD N-多糖位点分别位于邻近FGFR4D1-D2接头的氨基端和位于D2肝素结合结构域中，在SEQ ID NO：25的ABMut1FGFR4ECD D1-D2接头嵌合体中，那些N-多糖位点位于氨基酸N91和N159处。进行实验以确定引入N91A或N159A N-多糖突变是否能够进一步减少ABMut1融合蛋白的体外ECM结合。利用常规克隆和位点定向诱变方法在pTT5载体中产生编码具有N91A或N159AN-多糖突变的ABMut1融合蛋白的克隆，将其在本文中分别称为ABMut1(N91A)和ABMut1(N159A)。ABMut1(N91A)和ABMut1(N159A)融合蛋白分别对应于SEQ ID NOs：139和140。

在这些实验中使用R4Mut4，ABMut1，ABMut1(N91A)，和ABMut1(N159A)融合蛋白。所有4种融合蛋白在CHO-S细胞中瞬时表达。简言之，通过将0.5×10⁶细胞/ml接种在包含8mM L-谷氨酰胺的新鲜的37℃Freestyle CHO培养基(Invitrogen)中而建立500ml CHO-S细胞(Invitrogen)培养物。将细胞生长在2L塑料瓶中，并且来自连续保持至多20代的种株(seed strain)。次日，计数细胞，并且如果需要，在37℃Freestyle CHO培养基(Invitrogen)中稀释至1×10⁶细胞/ml，细胞存活性大于95％。通过将10ml包含8mM L-谷氨酰胺的37℃OptiPRO SFM培养基(稀释培养基)转移到两个50ml管中，而转染细胞。向第一个管(A)中，加入625ulFreestyleMax转染试剂(Invitrogen)。向第二个管(B)中，加入625ug DNA。将两个管通过颠倒轻轻混合，并且将管A的内容物立即加入到管B中，然后通过颠倒而轻轻混合。将混合物在室温下温育10-20分钟，然后在缓慢搅拌烧瓶的同时逐滴滴入到在2L培养瓶中的500ml细胞培养物中。然后，将培养物转移到培养箱中，在37℃，5％CO₂，125rpm。6天后，细胞存活力大于80％，并且将培养物上清收集到离心瓶中。将上清以1,000xg离心10分钟，转移到新的离心瓶中，并且以4,000xg离心10分钟。将上清收集到新瓶中，通过0.2um滤器过滤。在纯化步骤之前将上清保存在37℃。除了使用Q琼脂糖阴离子交换层析作为第二纯化步骤，按实施例3所述由培养物上清纯化融合蛋白。将蛋白质A洗脱物应用到用5个柱体积的无菌缓冲液(10mM Tris，50mM NaCl，pH 8.0)平衡的Q琼脂糖HP柱(GE Healthcare17-1014-01)上。将该柱用5个柱体积的相同的缓冲液洗涤，并且用15个柱体积的洗脱缓冲液(10mM Tris，2M NaCl，pH 8.0)的线性梯度，然后用5个柱体积的100％洗脱缓冲液以5ml/min的流速洗脱结合的物质。收集14ml级分，并且通过凝胶电泳鉴定包含FGFR ECD-Fc的级分并合并。将FGFRECD-Fc融合蛋白用约10-25％的洗脱缓冲液洗脱。

基于在280nm的吸光度测量确定蛋白水平。除了在体外ECM结合测定中使用至多1mg/ml融合蛋白之外，如实施例7所述进行ECM结合实验。结果的图示显示在图15中。如在图15所示，具有N91A或N159A N-多糖突变的ABMut1融合蛋白在体外ECM结合中表现出进一步的减少，这也将预测在C_max和生物利用率中的进一步提高。

进行FGF2竞争ELISA测定，以确定ABMut1(N91A)和ABMut1(N159A)融合蛋白是否能够抑制FGF2或FGF19与表面结合的FGFR4ECD-Fc(R4Mut4)的结合。在这些测定中，ABMut1是参照标准，ABMut1(N91A)和ABMut1(N159A)是检测样品。将纯化的ABMut1，ABMut1(N91A)，和ABMut1(N159A)在样品稀释剂(包含1％BSA(级分V；Sigma#A3059)，0.05％吐温-20,200ng/ml FGF2(PreproTech#100-18B)或50ng/ml FGF19(PeproTech#100-32)，和20ug/ml肝素(Sigma#H3149)的PBS)中连续稀释至范围在1.5ng/ml-90,000ng/ml的浓度。将蛋白混合物温育60分钟。将96孔板用100ul 5ug/ml R4Mut4在4℃温育过夜，洗涤三次，在室温下在封闭缓冲液(包含1％BSA的PBS)中封闭1-2小时，并且洗涤3次。然后，将蛋白混合物(100ul)转移到96孔板的孔中，并且在室温下摇动条件下温育1小时。

在该测定中，在最初的温育步骤过程中不结合检测样品或参照标准物的FGF2或FGF19将自由与表面结合的R4Mut4结合。将孔用板洗液洗涤三次，然后用VECTASTAIN ABC试剂盒(Vector Laboratories(载体实验室)#PK-4000)用生物素化的抗FGF2抗体(R&D Systems#BAM233)或生物素化的抗FGF19抗体(R&D Systems#BAF969)检测。将生物素化的抗FGF2抗体或生物素化的抗FGF19在测定稀释剂(包含1％BSA和0.05％吐温-20的PBS)中稀释至1ug/ml，并且向每孔中加入100ul，然后在室温下在摇动条件下温育1小时。通过将3滴溶液A与3滴溶液B在15ml PBS中混合，重构ABC溶液，并且允许该溶液在室温下静置30分钟。将板用板洗液洗涤6次，并且向每个孔中加入100ul新鲜重构的ABC溶液，然后在室温下温育45分钟-1小时。向每个孔中加入TMB底物(100ul)，然后在室温下在暗处在轻摇条件下温育6-8分钟。向每孔加入100微升终止液，并且通过轻敲使板混合。在450nm处读取板的光学密度(OD)，减去570nm处的光学密度。

然后，相对于对数量级的蛋白浓度绘制OD值，以产生标准曲线。每个孔的OD值与结合的FGF2或FGF19的量成正比，并且与检测溶液中的活性FGFR4ECD-Fc融合蛋白的量成反比。使用4参数算法(4-parameter logistic)拟合关于检测样品和参照标准物的浓度曲线。通过将关于标准参照的IC₅₀值除以关于检测样品的IC₅₀值然后乘以100％而计算每个检测样品的相对结合活性(％生物活性)。在该测定中，ABMut1(N91A)和ABMut1(N159A)的相对FGF2结合活性分别为44％和42％。在该测定中，ABMut1(N91A)和ABMut1(N159A)的相对FGF19结合活性分别为51％和56％。

实施例17：具有FGFR2或FGFR3D1-D2接头的FGFR4ECD D1-D2接头嵌合体在体外表现出减少的ECM结合。

进行实验以确定其中FGFR4D1-D2接头被替换为FGFR2D1-D2接头(“R4(D1-D2):R2(D1-D2)”)或FGFR3D1-D2接头(“R4(D1-D2):R3(D1-D2)”)的FGFR4ECD D1-D2接头嵌合体是否在体外表现出与ECM成分的减少的结合。与FGFR4D1-D2接头相比，FGFR2D1-D2接头和FGFR3D1-D2接头包含更多的酸性残基。利用常规克隆技术在pTT5载体中产生编码R4(D1-D2):R2(D1-D2)和R4(D1-D2):R3(D1-D2)融合蛋白的克隆。R4(D1-D2):R2(D1-D2)和R4(D1-D2):R3(D1-D2)分别对应于SEQ ID NOs：143和144。

在这些实验中使用R1Mut4，R4Mut4，ABMut1，R4(D1-D2):R2(D1-D2)，和R4(D1-D2):R3(D1-D2)融合蛋白。如实施例11所述，在293-T细胞中表达所有的融合蛋白。使用α筛选(hu IgG AlphaLISA；Perkin-Elmer#AL205C)确定蛋白水平。纯化的R4(D1-D2):R3(D1-D2)融合蛋白的浓度低于纯化的R1Mut4，R4Mut4，ABMut1，和R4(D1-D2):R2(D1-D2)融合蛋白的浓度，并且不允许以更高的浓度分析其ECM结合。除了在体外ECM结合测定中使用至多几乎为1mg/ml的FGFR ECD-Fc融合蛋白之外，如实施例7所述进行ECM结合实验。结果的图示显示在图16中。如图16中所示，R4(D1-D2):R2(D1-D2)和R4(D1-D2):R3(D1-D2)两种融合蛋白表现出与ABMut1融合蛋白的ECM结合水平相似的ECM结合水平。

实施例18：具有FGFR1短酸性盒的FGFR2和FGFR3短酸性盒嵌合体在体外表现出减少的ECM结合

进行实验，以确定FGFR2和FGFR3的长酸性盒内的酸性残基总数的增加是否能够在体外进一步减少其ECM结合。产生FGFR2和FGFR3短酸性盒嵌合体，其中FGFR1短酸性盒的氨基酸残基替代在FGFR2和FGFR3长酸性盒中的相对应的氨基酸残基，其分别称为R2(111-118):R1(105-112)和R3(110-117):R1(105-112)。利用常规克隆技术在pTT5载体中产生编码R2(111-118):R1(105-112)和R3(110-117):R1(105-112)融合蛋白的克隆。R2(111-118):R1(105-112)和R3(110-117):R1(105-112)分别对应SEQ ID NOs：166和167。

在这些实验中使用FGFR2ECD-Fc，FGFR3ECD-Fc，R2(111-118):R1(105-112)，和R3(110-117):R1(105-112)融合蛋白。如在实施例16中所述，在CHO-S细胞中瞬时表达FGFR2ECD-Fc，FGFR3ECD-Fc融合蛋白，R2(111-118):R1(105-112)，和R3(110-117):R1(105-112)融合蛋白并进行纯化。利用在280nm处的吸光度测量确定蛋白质水平。除了在体外ECM结合测定中使用至多1mg/ml的每种融合蛋白之外，如实施例7所述进行ECM结合实验。结果的图示显示在图17A-B中。如在图17A和图17B中所示，相对于FGFR2ECD-Fc和FGFR3ECD-Fc融合蛋白，R2(111-118):R1(105-112)和R3(110-117):R1(105-112)融合蛋白分别在体外表现出略少的ECM结合。

工业适用性

本文所述的FGFR ECD酸性区突变蛋白和FGFR ECD融合分子有效用于治疗增生性疾病和涉及血管生成的疾病，所述疾病包括癌症和黄斑变性。它们可以用来诊断、预防和治疗这些疾病。

序列的表格

表11提供本文讨论的某些序列。显示所有的无信号肽的FGFR序列，除非另外指明。

表11：序列和描述

Claims (80)

1.一种多肽，其包含FGFR4细胞外结构域(ECD)酸性区突变蛋白。

2.权利要求1的多肽，其中所述FGFR4ECD酸性区突变蛋白是FGFR4ECD酸性区嵌合体。

3.权利要求2的多肽，其中所述FGFR4 ECD酸性区嵌合体是FGFR4ECD D1-D2接头嵌合体。

4.权利要求3的多肽，其中所述FGFR4 ECD D1-D2接头嵌合体包含替代FGFR4 D1-D2接头的D1-D2接头，所述D1-D2接头选自FGFR1 D1-D2接头，FGFR2 D1-D2接头，和FGFR3 D1-D2接头。

5.权利要求4的多肽，其中所述FGFR4 ECD D1-D2接头嵌合体包含选自SEQ ID NOs：22，26，28，和32的氨基酸序列，以替代选自SEQ ID NOs：16和17的FGFR4 D1-D2接头。

6.权利要求3的多肽，其中所述FGFR4 ECD D1-D2接头嵌合体包含选自SEQ ID NOs：35-38的氨基酸序列。

7.权利要求2的多肽，其中所述FGFR4 ECD酸性区嵌合体是FGFR4ECD外显子4嵌合体。

8.权利要求7的多肽，其中所述FGFR4 ECD外显子4嵌合体包含替代FGFR4外显子4的外显子4，所述外显子4选自FGFR1外显子4，FGFR2外显子4，和FGFR3外显子4。

9.权利要求8的多肽，其中所述FGFR4 ECD外显子4嵌合体包含替代选自SEQ ID NOs：18和19的FGFR4外显子4的选自SEQ ID NOs：23，92，29，和33的氨基酸序列。

10.权利要求7的多肽，其中所述FGFR4 ECD外显子4嵌合体包含选自SEQ ID NOs：39-42的氨基酸序列。

11.权利要求2的多肽，其中所述FGFR4 ECD酸性区嵌合体是FGFR4ECD酸性盒嵌合体。

12.权利要求11的多肽，其中所述FGFR4 ECD酸性盒嵌合体包含替代FGFR4酸性盒的选自FGFR1酸性盒，FGFR2酸性盒，和FGFR3酸性盒的酸性盒。

13.权利要求12的多肽，其中所述FGFR4 ECD酸性盒嵌合体包含替代具有SEQ ID NO：20的氨基酸序列的FGFR4酸性盒的选自SEQ ID NOs：24，30，和34的氨基酸序列。

14.权利要求11的多肽，其中所述FGFR4 ECD酸性盒嵌合体包含替代FGFR4酸性盒的选自FGFR1酸性盒区，FGFR2酸性盒区，和FGFR3酸性盒区的酸性盒区。

15.权利要求14的多肽，其中所述FGFR4 ECD酸性盒嵌合体包含替代具有SEQ ID NO：20的氨基酸序列的FGFR4酸性盒的选自SEQ ID NOs：56-65的氨基酸序列。

16.权利要求11的多肽，其中所述FGFR4 ECD酸性盒嵌合体包含替代FGFR4酸性盒区的选自FGFR1酸性盒区，FGFR2酸性盒区，和FGFR3酸性盒区的酸性盒区。

17.权利要求16的多肽，其中所述FGFR4 ECD酸性盒嵌合体包含替代具有选自SEQ ID NOs：46-55的氨基酸序列的FGFR4酸性盒区的选自SEQ ID NOs：56-65的氨基酸序列。

18.权利要求11的多肽，其中所述FGFR4 ECD酸性盒嵌合体包含替代FGFR4酸性盒区的选自FGFR1酸性盒，FGFR2酸性盒，和FGFR3酸性盒的酸性盒。

19.权利要求18的多肽，其中所述FGFR4 ECD酸性盒嵌合体包含替代具有选自SEQ ID NOs：46-55的氨基酸序列的FGFR4酸性盒区的选自SEQ ID NOs：24，30，和34的氨基酸序列。

20.权利要求11的多肽，其中所述FGFR4 ECD酸性盒嵌合体包含选自SEQ ID NOs：43-45和157的氨基酸序列。

21.权利要求2的多肽，其中所述FGFR4 ECD酸性区嵌合体是FGFR4ECD长酸性盒嵌合体。

22.权利要求21的多肽，其中所述FGFR4ECD长酸性盒嵌合体包含替代FGFR4长酸性盒的选自FGFR1长酸性盒，FGFR2长酸性盒，和FGFR3长酸性盒的长酸性盒。

23.权利要求22的多肽，其中所述FGFR4长酸性盒嵌合体包含替代选自SEQ ID NOs：96和97的FGFR4长酸性盒的选自SEQ ID NOs：98-100的氨基酸序列。

24.权利要求21的多肽，其中所述FGFR4长酸性盒嵌合体包含选自SEQ ID NOs：105-107的氨基酸序列。

25.权利要求2的多肽，其中所述FGFR4 ECD酸性区突变蛋白是FGFR4ECD短酸性盒嵌合体。

26.权利要求25的多肽，其中所述FGFR4 ECD短酸性盒嵌合体包含替代FGFR4短酸性盒的选自FGFR1短酸性盒，FGFR2短酸性盒，和FGFR3短酸性盒的短酸性盒。

27.权利要求26的多肽，其中所述FGFR4 ECD短酸性盒嵌合体包含替代具有SEQ ID NO：101的氨基酸序列的FGFR4短酸性盒的选自SEQ ID NOs：102-104的氨基酸序列。

28.权利要求25的多肽，其中所述FGFR4ECD短酸性盒嵌合体包含选自SEQ ID NOs：108-110的氨基酸序列。

29.权利要求1的多肽，其中所述FGFR4ECD酸性区突变蛋白是FGFR4ECD长酸性盒变体。

30.权利要求29的多肽，其中所述FGFR4ECD长酸性盒变体包括这样的FGFR4ECD的变体，所述变体相对于FGFR4野生型长酸性盒在长酸性盒中具有增加数量的酸性氨基酸残基。

31.权利要求30的多肽，其中在FGFR4ECD长酸性盒内的至少两个非酸性残基分别独立地被选自Glu(E)和Asp(D)的酸性残基替代。

32.权利要求31的多肽，其中在FGFR4ECD长酸性盒内的至少三个非酸性残基分别独立地被选自Glu(E)和Asp(D)的酸性残基替代。

33.权利要求31的多肽，其中在FGFR4ECD长酸性盒内的至少四个非酸性残基分别独立地被选自Glu(E)和Asp(D)的酸性残基替代。

34.权利要求31的多肽，其中在SEQ ID NOs：1和2的氨基酸103和104之间插入至少一个酸性残基。

35.权利要求34的多肽，其中在SEQ ID NOs：1和2的氨基酸103和104之间插入至少两个酸性残基。

36.权利要求31的多肽，其中在FGFR4长酸性盒中的酸性残基的数目为至少7。

37.权利要求31的多肽，其中：

FGFR4 ECD残基104-114(SEQ ID NO：145)被替换为FGFR1 ECD残基106-117(SEQ ID NO：149)；

FGFR4 ECD残基104-114(SEQ ID NO：145)被替换为FGFR1 ECDn残基107-117(SEQ ID NO：150)；

FGFR4 ECD残基104-110(SEQ ID NO：146)被替换为FGFR1 ECD残基105-113(SEQ ID NO：151)；

FGFR4 ECD残基113-116(SEQ ID NO：147)被替换为FGFR1 ECD残基116-119(SEQ ID NO：152)；或

FGFR4 ECD残基109-113(SEQ ID NO：148)被替换为FGFR1 ECD残基112-116(SEQ ID NO：153)。

38.权利要求29的多肽，其中所述FGFR4 ECD长酸性盒变体包含选自SEQ ID NOs：111-119的氨基酸序列。

39.一种FGFR4 ECD融合分子，其包含权利要求1-38中任一项的多肽和融合配偶体。

40.权利要求39的FGFR4 ECD融合分子，其中所述融合配偶体选自Fc，白蛋白，和聚乙二醇。

41.权利要求40的FGFR4 ECD融合分子，其中所述融合配偶体是Fc。

42.一种FGFR4 ECD融合分子，其包含选自SEQ ID NOs：35-45，105-121，和157的氨基酸序列。

43.一种FGFR4 ECD融合分子，其包含选自SEQ ID NOs：86-88，124-140，143，144，和158的氨基酸序列。

44.一种FGFR4 ECD融合分子，其包含多肽和融合配偶体，其中所述多肽包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列。

45.权利要求44的FGFR4 ECD融合分子，其中所述融合配偶体为Fc。

46.权利要求45的FGFR4 ECD融合分子，其中所述FGFR4 ECD融合分子具有SEQ ID NO：86的氨基酸序列。

47.一种药物组合物，其包含权利要求1，2，3，6，7，10，11，20，21，24，25，28，29，和38中任一项的多肽和药用载体。

48.一种药物组合物，其包含权利要求39的FGFR4 ECD融合分子。

49.一种药物组合物，其包含权利要求42或权利要求43的FGFR4 ECD融合分子。

50.一种多核苷酸，其包括编码权利要求1-38中任一项的多肽的核酸序列或编码权利要求42-46中任一项的FGFR4 ECD融合分子的核酸序列。

51.治疗患者中的生血管病症的方法，其包括向所述患者施用权利要求47的药物组合物。

52.治疗患者中的生血管病症的方法，其包括向所述患者施用权利要求48的药物组合物。

53.治疗患者中的生血管病症的方法，其包括向所述患者施用权利要求49的药物组合物。

54.治疗患者中的癌症的方法，其包括向所述患者施用权利要求47的药物组合物。

55.治疗患者中的癌症的方法，其包括向所述患者施用权利要求48的药物组合物。

56.治疗患者中的癌症的方法，其包括向所述患者施用权利要求49的药物组合物。

57.权利要求54的方法，其中所述癌症选自结肠癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、和前列腺癌。

58.权利要求55的方法，其中所述癌症选自结肠癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、和前列腺癌。

59.权利要求56的方法，其中所述癌症选自结肠癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、和前列腺癌。

60.治疗患者中的黄斑变性的方法，其包括向所述患者施用权利要求47的药物组合物。

61.治疗患者中的黄斑变性的方法，其包括向所述患者施用权利要求48的药物组合物。

62.治疗患者中的黄斑变性的方法，其包括向所述患者施用权利要求49的药物组合物。

63.一种分离的多肽，其包含FGFR4细胞外结构域(ECD)酸性区嵌合体。

64.一种分离的FGFR4 ECD融合分子，其包含权利要求1-38中任一项的多肽和融合配偶体。

65.一种分离的FGFR4 ECD融合分子，其包含选自SEQ ID NOs：35-45，105-121，和157的氨基酸序列。

66.一种分离的FGFR4 ECD融合分子，其包含选自SEQ ID NOs：86-88，124-140，143，144，和158的氨基酸序列。

67.一种分离的FGFR4 ECD融合分子，其包含多肽和融合配偶体，其中所述多肽包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列。

68.权利要求1的多肽，其中所述FGFR4酸性区突变蛋白包含至少一个抑制糖基化的点突变。

69.权利要求68的多肽，其中所述抑制糖基化的至少一个点突变选自N91A，N156A，N237A，N269A，N290A，和N301A。

70.权利要求68的多肽，其中所述FGFR4酸性区突变蛋白包含选自SEQ ID NOs：120，121，和168的氨基酸序列。

71.一种多肽，其包含FGFR2 ECD酸性区突变蛋白。

72.权利要求71的多肽，其中所述FGFR2 ECD酸性区突变蛋白是FGFR2ECD短酸性盒嵌合体。

73.权利要求72的多肽，其中所述FGFR2 ECD短酸性盒嵌合体包含替代至少FGFR2短酸性盒的至少FGFR1短酸性盒。

74.权利要求73的多肽，其中FGFR2ECD残基111-118(SEQ ID NO：155)被替换为FGFR1 ECD残基105-112(SEQ ID NO：154)。

75.权利要求72的多肽，其中所述FGFR2 ECD短酸性盒嵌合体包含SEQ ID NO：122的氨基酸序列。

76.一种多肽，其包含FGFR3 ECD酸性区突变蛋白。

77.权利要求76的多肽，其中所述FGFR3 ECD酸性区突变蛋白是FGFR3ECD短酸性盒嵌合体。

78.权利要求77的多肽，其中所述FGFR3 ECD短酸性盒嵌合体包含替代至少FGFR3短酸性盒的至少FGFR1短酸性盒。

79.权利要求78的多肽，其中FGFR3 ECD残基110-117(SEQ ID NO：156)被替换为FGFR1 ECD残基105-112(SEQ ID NO：154)。

80.权利要求77的多肽，其中所述FGFR3 ECD短酸性盒嵌合体包含SEQ ID NO：123的氨基酸序列。

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