CN111315777A - 抗-fgfr4的单克隆抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及抗FGFR4的单克隆抗体及其作为药物和诊断剂的用途。特别地，本发明涉及与FGFR4的酸性盒结构域及其特定部分特异性结合的抗体。编码所述抗体的核酸，用于其表达和生产的载体和宿主细胞，抗体‑药物偶联物和包含所述抗体的药物组合物也在本发明的范围内。本发明还涉及用于检测，杀死，影响或抑制结肠癌干细胞的发育和/或分化的抗FGFR4抗体。

Description

抗-FGFR4的单克隆抗体
技术领域
本发明涉及单克隆抗体领域，尤其涉及抗FGFR4的单克隆抗体及其作为药物和诊断剂的用途。
发明背景
癌症是西方世界上最常见的疾病之一，其数量在不断增加，它代表着全世界日益严重的社会经济负担。尽管我们对癌症生物学的理解有了很大的改善，但是实体转移性肿瘤患者基本上是无法治愈的，其生活质量通常会由于治疗而受到明显影响。2012年，全球新增癌症病例1410万，死亡例820万，估计到2035年，每年新增2400万，癌症仍然是世界上重要的公共卫生问题(Ferlay等人，2015)。
我们无法有效地治疗晚期癌症的治疗方法最近获得了新的理论基础。有力的证据支持在不同的血液和实体瘤以及许多正常组织中，存在一个细胞分级组织，其基础是具有高致瘤潜力的未分化细胞的独特子集，能够产生分化的癌细胞后代并有效地在其原始位置和远处繁殖肿瘤(Bonnet&Dick,1997；Brittan&Wright,2004；Barker等人,2007；Lapidot等人,1994；Reya等人,2001；Singh等人,2003；Al-Hajj等人,2003)。这些常用的癌症干细胞(CSC)是根据特定表面标记的表达进行鉴定的，并根据它们的自我更新和不对称分裂产生两种不同子细胞的能力进行定义，一种子细胞保留了干细胞特征，且一种子细胞从瞬时扩增祖细胞逐渐分化以最终分化为癌细胞(Valent等人,2012)。另外，分离出的CSC被证明对常规化学疗法和放射疗法具有高度抗性(Maugeri-Saccà等人,2011；Bao等人,2006；Diehn等人,2009)。被定义为所有肿瘤细胞的主要来源，它们对于持续的原发性肿瘤生长，复发和转移是必不可少的，并且代表了治疗抗性的关键机制。作为直接的临床结果，有效的治疗方法也应针对CSC，因为通过作用于分化的祖细胞而不影响干细胞区室来消除肿瘤的大部分只会产生暂时的成功，然后复发和/或转移。
大肠癌(CRC)是全世界发病率和死亡率的主要原因。它占所有癌症发病率的13％以上，是第三大最常被诊断出的恶性肿瘤，并且是与癌症相关的死亡的第四大主要原因，全球每年约有140万例新病例和700,000例死亡。此外，到2030年，其全球负担预计将增加60％，达到220万以上的新病例和110万例癌症死亡(Arnold等人,2017)。虽然早期CRC可以通过单独手术或通过手术和化学疗法的组合来治愈，但转移性疾病几乎总是不可治愈，代表着巨大的医学挑战以及医疗保健系统的负担。大约30％的患者在首次诊断时出现转移性疾病，而25％的诊断为局部性疾病的患者将在几年后发生转移(美国癌症协会)。因此，开发消除肿瘤的新治疗策略最终至关重要。
一些本申请发明人是最早从CRC肿瘤标本中分离出CSC的人(Ricci-Vitiani等人,2007；Dalerba等人,2007)，并且开发了用于其分离以及体外培养、表征和体内繁殖的标准方案。特别地，这些细胞显示出在免疫缺陷小鼠中形成异种移植物的能力，从组织学和遗传学方面对最初分离出它们的肿瘤进行了表型检查(Baiocchi等人,2010)。
目前，尚无药物选择性靶向结肠CSC，也没有可靠的测定方法可以在临床样品中检测到它们(Zeuner等人,2014)。
现在，我们发现结肠CSC表达酪氨酸激酶成纤维细胞生长因子受体4(FGFR4)，并且该蛋白控制结肠CSC的几个重要功能。
随后，本发明人使用已知的遗传免疫技术产生了针对该抗原的单克隆抗体(参见例如以下参考文献：Bioprocessing-Genetic Immunization for AntibodyProduction.Tutorial:Genovac's Technological Shortcut From Gene to Antibody.ByJohn Thompson博士和Stefan Lang博士,发表于Genetic Engineering News,2002年10月1日，第22卷第17期；Custom-made antibodies produced by genetic immunisation:Applications in drug development,therapy and diagnosis.By Stefan Lang和JohnThompson,发表于Global Outsourcing Review,2003年春季，第5卷第1期；A shortcutfrom genomics todrug development.By Jens Lohrmann,Stefan Lang和John Thompson,发表于Current Drug Discovery,2003年10月)。
这些抗体可用于检测患者标本中的结肠CSC，并发现了旨在测量新颖CRC治疗对CSC群体的影响的在临床级测定中的应用。
更重要的是，已发现能够影响CSC存活和增殖的抗体，因此具有治疗价值。
在作为肿瘤发生的关键因素出现的生长因子信号传导途径中，FGF最近在肿瘤发育，进展和转移中受到了高度关注(Dienstmann等人,2014；Hierro等人,2015)。有22种人类FGF和4种类型的FGF受体(FGFR)充当受体酪氨酸激酶(RTK)(Goetz&Mohammadi，2013)。一旦激活，FGF/FGFR信号传导便通过多个下游途径进行，例如RAS-MAPK(其调节细胞增殖)或PI3K-AKT(其控制细胞存活)(Beenken&Mohammadi，2009)。
原型FGFR的胞外区域由通过柔性接头(linker)连接的三个免疫球蛋白(Ig)样结构域(Ig I，Ig II和IgIII)组成。FGFR的独特特征是位于Ig I-Ig II接头(称为酸性盒(AB))中的富含谷氨酸、天冬氨酸和丝氨酸的序列。AB/接头的缺失增强了FGFR对FGF的亲和力，并增加了FGFR的信号传导能力，这表明受体的这一部分控制了FGFR自抑制(Kalinina等人,2012)。酸性盒的柔性特性有助于分子内相互作用，使FGFR保持“封闭”低活性状态，从而降低了FGFR对其配体的亲和力(Olsen等人,2004)。该区域的缺失与癌症有关(Onwuazor等人,2003)。
越来越多的最新发表的数据表明FGFR4在大量赘生物中的作用，表明该受体和/或其配体FGF19在不同实体赘生物(包括肝细胞癌(HCC)，横纹肌肉瘤和结直肠癌，前列腺肿瘤，乳腺肿瘤，垂体肿瘤，肺(NSCLC)肿瘤，胃肿瘤和卵巢肿瘤)的子集中过表达(Lin&Desnoyers,2012；Wu&Li,2012；Katoh&Nakagama,2014；Crose等人,2012；Li等人,2014；Sahadevan等人,2007；André&Cortés,2015；Abbass等人,1997；Huang等人,2015；Chen H等人,2015；Zaid等人,2013)。在某些这些类型肿瘤中，FGFR4已被鉴定为不利的预后生物标志物，并且在其基因中具有多种多态性，其中研究最多的是rs351855(Gly388Arg)，与肿瘤的进展和不良的预后均呈正相关(Spinola等人,2005a,2005b；Taylor等人,2009；Cho等人,2016；Xu等人,2011；Streit等人,2004；Yang等人,2012；Frullanti等人,2011)。临床前研究强调了FGF19-FGFR4轴的肿瘤启动子在诱导细胞增殖(肝癌，结直肠癌，卵巢癌和前列腺癌)(Ho等人,2009；Wu等人,2010；Desnoyers等人,2008；Pai等人,2008；Peláez-García等人,2013；Zaid等人,2013；Yu等人,2011)，细胞存活(横纹肌肉瘤和肝癌，结肠直肠癌，乳腺癌，胃癌)，以及细胞多药耐药性(结肠直肠癌和乳腺癌)(Ho等人,2009；Turkington等人,2014；Zaid等人,2013；Ye等人,2013；Roidl等人,2009)中的作用。此外，在CRC中也强调了FGFR4在促进细胞运动性，侵袭性和上皮向间充质转化(EMT)中的作用(Peláez-García等人,2013；Liu等人,2013)。
基于该证据，最近对FGF19-FGFR4轴的抑制已被考虑作为针对不同肿瘤类型，特别是针对肝细胞癌(HCC)的新治疗策略。
肝癌是世界上第五大最常见的恶性肿瘤，但由于高病死率而位居第二(Ferlay等人,2015)。肝癌很难治疗，因为它通常在早期无症状，当它引起症状时，通常已经达到晚期(Fong等人,2001；Bruix&Sherman 2005)。尽管已经实施了手术切除和肝移植，但5年生存率并未显示出任何显著改善，部分原因是大多数患者在诊断时都处于晚期(Trovato等人,2015)。此外，许多HCC患者对标准放疗和化疗的敏感性较低(Llovet等人,2015；
Figure BDA0002385150140000041
&Galle，2014)。
因此，一个共同的观点是，迫切需要靶向在HCC中异常激活的分子途径的非细胞毒性药物(Hoofnagle 2004)。
即使在同一肿瘤内，HCC进展的分子基础也是高度异质的(El-Serag&Rudolph，2007；Thorgeirsson&Grisham，2002)。近年来，一些证据表明某些基因和细胞信号传导途径在肝癌的发育和进展中起着关键作用(Chen&Wang，2015)。此外，一些生长因子信号传导途径，例如表皮生长因子(EGF)，肝细胞生长因子(HGF)，胰岛素样生长因子(IGF)，转化生长因子(TGF)，血小板衍生生长因子(PDGF)和成纤维细胞生长因子(FGF)在包括肝癌在内的肿瘤发生过程中起着至关重要的作用(Enguita-Germán&Fortes，2014；Yoshida等人,2014；
Figure BDA0002385150140000051
等人,2008)。在FGF受体中，FGFR4是人肝细胞中普遍存在的同工型，并且在人HCC和HCC细胞系中过表达(Lin等人,2007；Ho等人,2009)。此外，已经证明FGFR4是肝癌发生所必需的，因为易于发展自发性HCC的FGF19转基因小鼠在与FGFR4基因敲除小鼠杂交后未能发育为肝肿瘤(French等人,2012)。另外，已经显示，在临床相关的小鼠模型中，内源性回肠FGF15有助于与纤维化相关的肝细胞癌变(Uriarte等人,2015)。
在正常肝细胞中，FGF19通过抑制编码Cyp7a1的基因(胆汁酸合成的第一个限速步骤)来调节肝胆汁酸代谢(Inagaki等人,2005；Chiang等人,2009)。肠道分泌的FGF19(及其鼠类同源物FGF15)通过与肝细胞上的FGFR4结合而充当内分泌激素，从而阻止Cyp7a1的活化并从而抑制胆汁酸的合成。FGFR4 KO小鼠具有更大的胆汁酸池，胆汁酸的排泄增加，并且具有胆汁酸耗尽的胆囊，表明胆固醇和胆汁酸的合成受到负调控(Xie等人,1999；Yu等人,2000)。Klotho beta(KLB)是一种没有预测的激酶活性的跨膜蛋白，已被确定为FGF19肝特异性活性所需的辅因子(Lin等人,2007)，并且已经描述了在klotho beta缺陷型小鼠中胆汁酸合成的负反馈抑制功能受损(Ito等人,2005)。
先前的研究表明，在FGF19转基因小鼠中使用抗FGF19抗体治疗减少了结肠肿瘤异种移植物的生长并预防了肝细胞癌(Desnoyers等人,2008)。然而，在对食蟹猴的重复剂量安全性研究中，抗FGF19治疗(3-100mg/kg)显示了剂量相关的肝毒性，并伴有严重的腹泻和低食物消耗(Pai等人,2012)。
因此，仍然需要能够有效抑制FGFR4与其配体的相互作用的抗体或治疗剂，该抗体或治疗剂是有效的并且具有良好的治疗指数，即具有低或至少可接受的毒性。
关于治疗性抗体和靶向FGFR4的小分子的抗肿瘤作用的最新研究已证明在动物模型中具有抗HCC和其他肿瘤同种型的功效，并且目前正在临床试验中对其进行评估。
本发明的根本问题是提供抗FGFR4抗体，其可用于诊断，预防和/或治疗与FGFR4表达，过表达和/或过度活跃有关的疾病。
许多抗FGFR4单克隆抗体在具有激活的FGFR4途径的HCC和其他肿瘤类型的小鼠模型中显示出治疗功效(French等人,2012；Bumbaca等人,2011；Bartz等人,2016；US 9266955B2；WO 2014/105849 A1；WO 2016/023894A1)。此外，对于晚期实体瘤和肝癌患者，正在进行这些抗体中的一种抗体(U3-1784，U3/Daiichi Sankyo，NCT02690350)的I期研究。
此外，对FGFR4高度特异性的新一代酪氨酸激酶受体抑制剂已经在HCC的小鼠模型中得到验证(Hagel等人,2015；WO 2014/011900 A2；WO 2016/151499 A1；US 2016/0244450A1)，目前正在临床I/II期评估其中的两种在HCC和胆管癌患者中的耐受性和疗效(BLU-554，Blueprint，NCT02508467)，以及在以FGFR4和KLB表达阳性为特征的HCC和实体瘤中的耐受性和有效性(FGF401，Novartis，NCT02325739)。
与FGF受体靶向相关的其他专利文献如下：US20050147612，US20070248605，US8263074，US20140301946，US20110212091，US20160017027，US9284379，US20100143386，US7531304，WO2010004204，WO2015107171。
然而，对于上述文献中公开的抗体或抑制剂，没有显示出对结肠癌干细胞的活性。
因此，强烈感到需要一种能够靶向结肠癌干细胞(结肠CSC)并杀死它们或至少基本上抑制其生长，增殖和分化的试剂。
还强烈需要能够检测结肠CSC以在诊断测定中揭示它们的试剂。
现已发现并在体外和体内均证实FGFR4是结肠癌干细胞的治疗靶标，而FGFR4在CSC中的存在已与更高的增殖速率和克隆形成效率以及更高的迁移倾向相关。
因此，抗FGFR4并能够抑制其活性的试剂可以有利地用于结肠癌中以杀死或抑制结肠癌干细胞的活性。因为已经发现在结肠CSC上存在FGFR4，所以针对该抗原的试剂也可以有利地用于检测和识别所述细胞。
还强烈需要选择性抗FGFR4的单克隆抗体，其能够有效地抑制其与配体的相互作用并充当有效的抗肿瘤剂。
还需要对结肠CSC有效的抗FGFR4单克隆抗体。
另外特别强烈需要抗FGFR4单克隆抗体，用于治疗FGFR4依赖性肿瘤，例如但不限于肝细胞癌(HCC)。
现已发现一种单克隆抗体，在本文中也称为BMK-3B6-E4及其嵌合(ch3B6)和人源化(hu3B6)形式，对培养的细胞和体内均显示出高抗增殖活性，同时在相同细胞中高效调节FGFR4信号传导成分。
已经显示该抗体在体外抑制配体与FGFR4的结合。
令人惊讶地发现，本发明的所述抗体与FGFR4的自抑制酸性盒结构域内的表位结合，该自抑制酸性盒结构域是已知不参与配体结合的细胞外区域(Kalilina等人,2012)。相反，已知该结构域对FGFR4具有自抑制作用，实际上，已知该区域的缺失增强了受体与其配体的结合。因此，已经发现本发明的抗体以独特的方式结合FGFR，该方式构象上影响配体相互作用和受体激活。
还已经发现能够特异性识别并结合FGFR4的称为“酸性盒”的结构域的抗体抑制受体与配体的相互作用并且具有抗肿瘤作用。
这些意外的特征在针对结肠CSC的人源化抗体、糖工程化抗体和抗体-药物偶联物的临床开发中以及对于FGFR4依赖性癌症的治疗中具有重要价值。
发明概述
本发明的一个目的是用于检测和/或杀死和/或影响和/或抑制结肠癌干细胞的发育和/或分化的抗FGFR4单克隆抗体。
本发明的一个目的是一种单克隆抗体，其特异性结合在人FGFR4的氨基酸119至156之间的表位，优选在人FGFR4的氨基酸127至154之间的表位，并且抑制FGF19与FGFR4的结合。
特别地，所述抗体特异性结合FGFR4的酸性盒结构域。
优选地，抗体将具有SEQ ID N.27的氨基酸序列特异性识别为表位。
在一特定的实施方案中，该抗体特异性识别在具有SEQ ID N.27的氨基酸序列中的以下氨基酸：D127，P130，K131，P136，S137，R139，H140，S141，Q144，Y148，W149，T150，Q153，R154。氨基酸编号是指人FGFR4前体，包括信号肽(NCBI登录号NP_001341913)。
本发明特别优选的抗体能够将FGF19配体与人FGFR4的结合阻断至少60％，优选至少70％，更优选至少80％或87％。特别优选的是本发明的那些抗体，其将FGF19与人FGFR4的结合阻断至少80％，更优选至少85％或至少90％。配体与人FGFR4结合的阻断导致抑制FGFR4信号传导。
在一优选的实施方案中，本发明的抗体还能够将其他FGFR4配体(包括例如FGF1，FGF8，FGF17，FGF18，FGF21，FGF23(Zhang等人,2006))的结合阻断至少60％，优选至少70％，更优选至少80％或87％。
本发明的一个目的是一种抗体或其抗原结合片段，其包含本文公开的抗体的高变区的氨基酸，该抗体的高变区的氨基酸对于特异性结合本文公开的单克隆抗体所结合的表位是必需的。
在本文中，对于“高变区”，是指衍生自氨基酸序列(CDR)的非连续可变区的三联体的三级结构。
本发明的一个目的是结合本文公开的单克隆抗体所识别的抗原或表位(特别是由结肠癌干细胞表达的抗原或表位)的抗体。例如，在某些实施方案中，提供了与抗FGFR4抗体结合相同表位的抗体，所述抗FGFR4抗体包含如SEQ ID NO：1-4的重链可变区(VH)序列和SEQ ID NO：10-13的轻链可变区(VL)序列或一或多个如下文公开的CDR。
本发明的一个目的是与FGFR4的酸性盒或其一部分结合的抗体或其抗原结合片段，其包含：(i)包含如SEQ ID NO：5-6的氨基酸序列的重链CDR1，和/或(ii)包含如SEQ IDNO：7-8的氨基酸序列的重链CDR2，和/或(iii)包含如SEQ ID NO：9的氨基酸序列的重链CDR3，和/或(iv)包含如SEQ ID NO：14-15的氨基酸序列的轻链CDR1，和/或(v)包含如SEQID NO：16的氨基酸序列的轻链CDR2，和/或(vi)包含如SEQ ID NO：17的氨基酸序列的轻链CDR3，其中所述CDR的任一个与上述序列的至少一个相比可以有一个或两个氨基酸不同，条件是抗体保持其结合特异性。
本发明的一个目的是与FGFR4的酸性盒结合的抗体或其抗原结合片段，其中其重链可变区由与序列SEQ ID NO：18-22或SEQ ID NO：92-96具有至少80％同一性的核苷酸序列编码，并且其轻链可变区由与序列SEQ ID NO：23-26或SEQ ID NO：97-99具有至少80％同一性的核苷酸序列编码，条件是抗体保持其结合特异性。
在本申请的一优选实施方案中，本发明的抗体能够识别并结合FGFR4的“酸性盒”结构域，并且同时抑制该受体与配体FGF19的相互作用并损害配体依赖性FGFR4信号传导。
已经发现，本发明的抗FGFR4抗体能够有效地抑制FGF配体(特别是FGF19)与FGFR4的结合，并且能够干扰FGFR4依赖性信号传导途径，特别是在HCC细胞系中。
这使得它特别有利于治疗依赖于FGFR4的肿瘤，例如肝细胞癌。
特别地，本发明的抗体显示出有效的肿瘤细胞抑制，特别是在表达FGFR4的肿瘤中。
此外，本发明的抗体对结肠CSC显示出高结合活性，因此对于治疗结肠癌特别有用。
同样，本发明的抗体对FGFR4具有高的且特异性的结合亲和力，而它不与其他FGF受体结合。这是有利的，因为其减少了由于对不参与癌症病理学的其他FGF受体的活性而引起的副作用的可能性。
在本发明的一特定实施方案中，抗体是在本文中表示为BMK-3B6-E4的抗体，以及其嵌合(ch3B6)和人源化(hu3B6)形式。该抗体对具有高FGFR4表达水平的癌症干细胞和肿瘤细胞系(特别是对肝细胞癌(HCC)细胞系)均表现出高的剂量依赖性反应性。
相对于对照组，在用这种抗体治疗的小鼠中观察到肿瘤体积的减小。
另外，本发明的抗体也有效地与在MDA-MB453细胞中过表达的FGFR4 Y367C突变体有效结合。该突变受体已被描述为对已知拮抗抗体的抑制不敏感的显性、不依赖配体的组成型活化变体(Roidl等人,2010)。这提供了优点，即根据本发明的抗体也可以用于具有所述突变的受试者，所述受试者对已知的拮抗抗体的治疗不反应。
在本发明的另一实施方案中，抗体是人源化抗体。
在本发明的另一实施方案中，抗体是人抗体。
本发明的抗体显示出对FGFR4酸性盒的结合特异性，并抑制了配体与受体的结合。由于上面已经提到的事实，即酸性盒已知不参与配体的结合，这是出乎意料的。相反，已知酸性盒参与受体的自动抑制。
本发明还提供了包含如本文所述抗体的偶联物。特别地，抗体药物偶联物是本发明的优选主题。
本发明的另一个目的是任选地可操作连接于表达控制序列的编码抗体的核酸分子。
所述分离的核酸通常包含编码重链的序列和编码轻链的序列，均包含可变区和恒定区。所述编码重链的序列优选选自SEQ ID N.28-31的序列或与所述序列具有至少80％同一性的序列，并且所述编码轻链的序列优选选自SEQ ID N.32-34的序列或与所述序列具有至少80％同一性的序列。
本发明的另一个目的是包含如本文公开的一或多个核酸序列的载体，优选它是表达载体。例如，所述载体可以包含编码抗体或其轻链和/或重链、恒定区和/或可变区或其CDR的核酸序列。
本发明的另一方面是宿主，特别是包含核酸分子的重组细胞。该细胞可以用于抗体的制备。
本发明的另一方面是用于诊断，预防和/或治疗与FGFR4表达、过表达和/或过度活跃有关的疾病的本发明的抗体。
优选地，所述疾病是癌症疾病，更优选地，其是结肠癌或肝细胞癌(HCC)。
在一更优选的实施方案中，本发明的抗体用于杀死或影响或抑制结肠癌干细胞的发育和/或分化。
本发明的一个目的是包含如本文公开的抗FGFR4单克隆抗体的药物组合物。
本发明的一个目的是包含如本文公开的单克隆抗体的抗体-药物偶联物(ADC)，包含其的药物组合物及其作为药物的用途，特别是用于治疗肿瘤的用途。
下面还将参考附图和实施例详细描述本发明的这些和其他目的。
附图简要说明
图1.基因选择漏斗(funnel)
图2(A-B).通过使用特定的市售一抗的蛋白质印迹法分析，选择的蛋白质抗原相对于ATCC肿瘤细胞系和正常结肠组织，在CSC中的优先表达。
图3.用5种不同的CSC系上的所有上清液获得的FACS分析数据总结。倍数变化(FC)是用每种上清液测得的平均荧光强度(MFI)与阴性对照(骨髓瘤细胞条件培养基)之比。根据每种CSC系的FC值分配一个分数(3A)，并通过将各个分数相加来计算最终等级(rank)(3B)。为简单起见，仅显示了使用抗FGFR4上清液获得的数据。
图4.在流式细胞术细胞分选之前和之后进行对CSC系CTSC85的FACS分析，以分离具有不同FGFR4表面表达水平的两个亚群。
图5.通过CellTiter-BlueTM分析(n＝3)评估的对照(模拟分选(mock sorted)，正方形)，FGFR4High(三角形)和FGFR4Low(倒三角形)CTSC85细胞群的生长曲线。数据归一化为第0天。
图6.计算出的三个CTSC85细胞群体的软琼脂集落数。显示了三个不同实验的平均值±StDev。FGFR4High和FGFR4Low细胞亚群之间的集落数差异具有统计学显著性(***p＝0.001)，以及FGFR4High和模拟分选群体之间的差异(**p＝0.007)以及FGFR4Low和模拟分选群体之间的差异(****p＝0.00015)也具有统计学显著性。
图7.48小时后，通过转板迁移测定法(transwell migration assay)和钙黄绿素AM荧光染色评估了FGFR4High，FGFRLow和模拟分选的CTSC85细胞群(n＝3)的迁移效率。上图片，借助ImageJ软件对三个群体中每个群体进行计数的平均荧光细胞数。下图片，与三个群体中每一群体的迁移细胞相关的平均荧光强度值，以相对荧光单位(RLU)表示。(*)p<0.04；(**)p<0.004；(***)p＜0.001。
图8.分选后收集的来自两个CTSC85细胞亚群的异种移植物的不同肿瘤生长。显示了FGFR4High(正方形)和FGFR4Low(三角形)肿瘤生长曲线。数据表示为中等肿瘤体积±StDev。
图9.BFG-2F7-B9抗体对HCT116结肠肿瘤细胞异种移植物的抗肿瘤作用。数据表示为平均肿瘤体积±StDev；相对于载体(vehicle)对照，(*)p<0.05；(**)p＜0.01。
图10.BFG-2F7-B9抗体对结肠CTSC85异种移植物的抗肿瘤作用。在上图片中，曲线代表在治疗期间平均肿瘤体积的增加±StDev；在下图片中，显示了相对于第-1天平均肿瘤体积增量±StDev。相对于载体(vehicle)对照，(*)p<0.05；(**)p<0.01。
图11.从固相FGF19-FGFR4结合测定(n＝3)获得的在450nm处的吸光度值推导得出的，FGF19与FGFR4的残留结合随每个所指示的上清液体积的变化而变化的剂量-响应曲线。基于在不断增加的上清液体积下在450nm处的残留吸光度(条件培养基对照的％)，使用KaleidaGraph软件对实验数据进行4P logistic拟合获得抑制曲线。
图12.用不同的抗FGFR4抗体处理的HCC HepG2细胞的qRT-PCR测定分析。一些新抗体抑制HepG2细胞中CYP7A1表达的阻抑(上图片)和CTGF表达的诱导(下图片)，这两者均依赖于FGF19介导的FGFR4激活。这两个基因的mRNA水平分别以在FGF19不存在(CYP7A1)或存在(CTGF)时PBS对照值的百分比表示。虚线柱表示活性mAb；点线柱表示失活的mAb。
图13.通过蛋白质印迹法分析的用不同的抗FGFR4抗体处理的Hep3B细胞中FGF19依赖性FRS2磷酸化的抑制。(*)活性抗体。
图14.抗FGFR4抗体对HCC Huh7细胞的集落形成效率的抑制作用。在存在或不存在(在PBS或DMSO中的阴性对照)浓度为50μg/mL和100μg/mL的所指示抗体的情况下，或与所指示的不断增加的浓度的化合物BLU9931一起，将300个细胞/孔的24孔板在37℃、5％CO2下孵育10天。每两天用含有抗体、BLU9931或载体的新鲜培养基补充培养物。在倒置光学显微镜下监测集落，并在实验结束时用在20％甲醇中的0.5％结晶紫溶液染色。确定每个实验一式四份中的集落数，并将平行测定的平均值表示为那些载体对照(用于抗体的PBS和用于BLU9931的DMSO)的百分比。
图15(A-C).编码人类-大鼠嵌合抗体ch3B6，ch6C9和ch5B5的重链和轻链的表达载体。对于其他抗体，获得了相似的表达载体。
图16.抗体ch3B6的质量控制。左：SDS-PAGE；右：HPLC-SEC。抗体ch6C9和ch5B5获得了相似的结果。
图17.通过FACS分析HCC细胞系HepG2和Huh7以及乳腺癌细胞系MDA-MB453上的嵌合mAbs ch3B6、ch6C9和ch5B5所获得的FC值随抗体浓度的变化而变化的曲线图。实线是实验的，而虚线是通过将实验数据拟合到“一个位点结合”方程("one site binding"equation)获得的那些。
图18.从FGFR-Fc依赖性固相结合测定获得的在450nm处的吸光度值随抗FGFR4抗体浓度的变化而变化的曲线图。在FGFR1α IIIc、、FGFR1β IIIc、、FGFR2α IIIb、FGFR2αIIIc、FGFR2β IIIb、FGFR2β IIIc、与人Fc融合的FGFR3和与人Fc融合的FGFR4的细胞外区域一式三份测试以1：3连续稀释的每种抗体(从0.0014μg/mL至9μg/mL的9个实验点)。作为阴性对照，包括与人Fc融合的IL17B受体的细胞外区域。实线是实验的，而虚线是通过将实验数据拟合到“一个位点结合”方程获得的那些。
图19.从固相FGF19-FGFR4结合测定(n＝3)获得的在450nm处吸光度值推导得出的，FGF19与FGFR4的残留结合随ch3B6和ch6C9浓度的变化而变化的剂量-响应曲线。基于在不断增加的抗体浓度(以1：3连续稀释，从0.014至30μg/mL)下在450nm处的残留吸光度(PBS对照的％)，使用KaleidaGraph软件对实验数据进行4P logistic拟合获得抑制曲线。
图20.抗FGFR4嵌合抗体对HCC Huh7细胞的集落形成效率的抑制作用。在存在或不存在(在PBS或DMSO中的阴性对照)浓度为30μg/mL和100μg/mL的所指示抗体的情况下，或与所指示的不断增加的浓度的化合物BLU9931一起，将600个细胞/孔的24孔板于37℃、5％CO2下孵育10天。每两天用含有抗体、BLU9931或载体的新鲜培养基补充培养物。在倒置光学显微镜下监测集落，并在实验结束时用在20％甲醇中的0.5％结晶紫溶液染色。确定每个实验一式四份中的集落数，并将平行测定的平均值表示为那些载体对照(用于抗体的PBS和用于BLU9931的DMSO)的百分比。
图21.在用蛋白质印迹法分析的用抗FGFR4嵌合抗体处理的Huh7细胞中对FGF19依赖性FGFR4和FRS2磷酸化的抑制。在实施例8中所述的实验条件下，在添加FGF19/肝素之前，用100或200μg/mL的每种抗体，或用0.1μM或1μM的BLU9931或用PBS处理细胞。使用抗磷酸-FRS2抗体(Tyr196，Cell Signalling)，抗FRS2抗体(LSBio)，抗磷酸-FGFR4抗体(FGFR4[磷酸-Tyr642]抗体，Biorbyt)，抗-FGFR4抗体BFG-2F7-B9和抗GAPDH抗体(Sigma-Aldrich)进行蛋白质印迹法分析。
图22.三种抗FGFR4嵌合抗体对Huh7肝肿瘤细胞异种移植物的抗肿瘤作用。数据表示为相对于第11天的平均肿瘤体积的增量±StDev；相对于载体对照，(*)p＜0.05。
图23.相对于载体治疗的肿瘤，用抗FGFR4嵌合抗体体内治疗Huh7异种移植物，下调了CYP7A1表达(左图片)并抑制了CTGF表达(右图片)。显示了单个肿瘤中的mRNA水平表示为2^(-△△c-t)的点图。将β葡萄糖醛酸酶(GUS)的人类基因用作归一化因子(normalizer)，并选择与一组对照组小鼠相对应的△△Ct值作为相对参考，并设置为等于1。CYP7A1(*p≤0.05)和CTGF(**p＝0.003)数据的t检验分析显示处理小鼠和对照组小鼠之间的统计学显著性差异。
图24.用抗体ch3B6或用PBS处理的Huh7异种移植物中FGFR4(上图片)和ERK1/2磷酸化的抑制。使用抗磷酸-FGFR4抗体(FGFR4[磷酸-Tyr642]抗体，Biorbyt)，抗FGFR4抗体BFG-2F7-B9，抗磷酸-p44/42MAPK(Erk1/2)(Thr202/Tyr204)抗体(Cell Signalling)，抗p44/42MAPK(Erk1/2)抗体(Cell Signalling)和抗GAPDH抗体(Sigma-Aldrich)进行肿瘤蛋白提取物的蛋白质印迹法分析。
图25.通过FACS分析在BOSC23报告细胞中测量的嵌合抗体对FL FGFR4和FGFR4缺失突变体d1，d2和d3的反应性。如实施例8所述进行测定。
图26.不同抗FGFR4抗体的表位作图。在图片A中，显示了代表2个独立ELISA实验的直方图，其中分析了抗体ch5B5(阳性，实心柱)和ch6C9(阴性，虚线柱)与Ig II结构域肽集合的结合。还显示了从该分析推断出的ch5B5结合序列。在图片A中，图26按出现顺序分别公开了SEQ ID NO：35-57。在图片B中，显示了代表3个独立ELISA实验的直方图，其中分析了抗体ch3B6(阳性，实心柱)和ch6C9(阴性，虚线柱)与酸性盒肽集合的结合。还显示了从该分析推断出的ch3B6结合序列。带下划线的是有助于结合的残基；粗体字是与最高峰相对应的残基。在图片B中，图26按出现顺序分别公开了SEQ ID NO：58-83和27。在图片C中，显示了在酸性盒区域内人FGFR4蛋白序列(SEQ ID NO：100)(NCBI登录号NP_001341913)和小鼠直系同源序列(SEQ ID NO：101)(NCBI登录号NP_032037)的比对，并指示了人受体上实验鉴定的ch3B6结合区(SEQ ID NO：102)。带下划线的是有助于结合的残基；粗体字是人类和小鼠之间的保守残基。
图27.抗FGFR4抗体3B6人源化。(A)3B6人源化策略方案。(B)所选人胚系IgG的3D模型。被大鼠残基取代的胚系残基显示在左图片中，而需要实验确定最佳解决方案(人或大鼠氨基酸)的位置显示在右图片中。
图28.编码3B6人源化重链和轻链变体的表达载体。
图29.在还原(顶部)和非还原(底部)条件下用指示的表达载体转染的293F细胞上清液的蛋白质印迹分析。
图30.从固相FGF19-FGFR4结合测定(n＝3)获得的在450nm处的吸光度值推导得出的，FGF19与FGFR4的残留结合随六个人源化3B6变体浓度的变化而变化的剂量-响应曲线。基于在不断增加的抗体浓度(以1：3连续稀释，从0.01到30μg/mL)下450nm处的残留吸光度(PBS对照的％)，使用KaleidaGraph软件对实验数据进行4P logistic拟合获得抑制曲线。(A)从相应的抑制曲线推断出，Hu3B6a，Hu3B6b和Hu3B6c的IC50值分别为0.13μg/mL(0.87nM)，0.4μg/mL(2.7nM)和0.07μg/mL(0.47nM)。(B)从相应的抑制曲线推断出，Hu3B6d，Hu3B6e和Hu3B6f的IC50值分别为0.03μg/mL(0.2nM)，0.16μg/mL(1nM)和0.09μg/mL(0.6nM)。(C)从相应的抑制曲线推断，ch3B6和阳性对照抗体hLD1.v22的IC50值分别为0.09μg/mL(0.6nM)和0.2μg/mL(1.3nM)。用同种型对照未获得抑制曲线。
图31.ch3B6与市售抗体ab41948的比较分析。(A)从FGFR4-Fc依赖的固相结合测定中获得的在450nm处吸光度值随ab41948浓度的变化而变化的曲线图。在与人Fc融合的FGFR4细胞外区域一式三份测试了1：3连续稀释(从0.00005μg/mL至1μg/mL的10个实验点)。实线是实验的，而虚线是通过将实验数据拟合到“一个位点结合”方程而获得的。(B)从固相FGF19-FGFR4结合测定(n＝3)获得的在450nm处的吸光度值推导得出的，FGF19与FGFR4的残留结合随ch3B6和ab41948的浓度的变化而变化的剂量-响应曲线。基于在不断增加的抗体浓度(以1：3连续稀释，从0.001到10μg/mL)下在450nm处的残留吸光度(PBS对照的％)，使用KaleidaGraph软件对实验数据进行4P logistic拟合获得抑制曲线。(C)通过蛋白质印迹法分析的，在用ch3B6或ab41948处理的Huh7细胞中FGF19依赖性FRS2磷酸化的抑制。在实施例8中所述的实验条件下，在添加FGF19/肝素之前，先用100μg/mL的每种抗体或PBS处理细胞。使用抗磷酸-FRS2抗体(Tyr-436，Cell Signalling)和抗GAPDH抗体(Sigma-Aldrich)进行蛋白质印迹法分析。
图32.ch3B6抗体对结肠CTSC85异种移植物的抗肿瘤作用。在上图片中，曲线表示治疗期间平均肿瘤体积的增加±StDev；在下图片中，显示了相对于第-1天平均肿瘤体积增量±StDev。相对于载体对照，(**)p<0.01；(***)p<0.005；(****)p<0.0005。
图33.ch3B6和ch6C9抗体对结肠CTSC85来源的肝转移的抗肿瘤作用。曲线表示在治疗期间和随后的观察期中平均光子计数的增加。相对于载体对照，(*)p＜0.05。
发明详述
定义
在本发明的含义内，“抗体”通常是指包含至少一个抗原结合位点的分子，该抗原结合位点免疫特异性地结合特定的目的抗原靶标。因此，术语“抗体”包括但不限于天然抗体及其变体，天然抗体的片段及其变体，肽体及其变体，以及模拟抗体或特定片段或其部分的结构和/或功能的抗体模拟物，包括单链抗体及其片段。因此，术语“抗体”包括全长抗体和/或其变体，以及其片段。抗体与至少一种靶抗原的结合可引起多种作用，例如但不限于这种结合在体外、原位和/或体内调节，减少，增加，拮抗，激动，减轻，缓解，阻断，抑制，消除和/或干扰至少一种靶抗原活性(特别是靶受体活性)的作用。因此，本发明包括能够结合生物分子(例如抗原或受体)或其部分的抗体片段，包括但不限于Fab，Fab'和F(ab')2，facb，pFc'，Fd，Fv或scFv片段(参见，例如，Colligan等人编辑,John Wiley&Sons,Inc.,NY,1994-2001)；双抗体；线性抗体(Zapata等人,(1995)Protein Eng.8(10):1057)；单链抗体分子；由抗体片段形成的多特异性抗体。因此，抗体以最广泛的意义使用，并且具体地包括，例如，单一抗FGFR4单克隆抗体(包括激动剂，拮抗剂和中和抗体)，具有多表位特异性的抗FGFR4抗体组合物，单链抗FGFR4抗体和抗FGFR4抗体的片段。本发明还包括抗体衍生物。本发明的单克隆抗体的衍生物是例如抗体片段，放射性标记的单克隆抗体，以及单克隆抗体与酶、荧光标记、细胞毒性药物等的偶联物。术语“衍生物”还包括抗体构建体的任何突变体，其区别在于至少一个氨基酸的添加，缺失和/或取代。抗体的片段或衍生物结合表位的能力可以通过直接ELISA确定，例如，如以下部分所述。
在本发明的含义内，“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体中获得的抗体，即，除了可能以少量存在的可能的天然突变以外，构成该群体的各个抗体是相同的。单克隆抗体可以缩写为“mAb”。
在本发明的含义内，术语“嵌合抗体”是指这样的抗体，其中恒定区或其一部分被改变，替换或交换，使得可变区连接不同物种的恒定区，或属于另一个抗体类别或亚类。术语“嵌合抗体”也指这样的抗体，其中可变区或其一部分被改变，替换或交换，使得恒定区连接不同物种的可变区，或属于另一种抗体类别或亚类。产生嵌合抗体的方法是本领域技术人员已知的。参见，例如，Morrison,1985,Science,229:1202；Oi and al.,1986,BioTechniques,4:214；Gillies and al.,1989,J.Immunol.Methods,125:191-202；U.S.Pat.Nos.5,807,715；4,816,567；和4,816,397。抗体的这些嵌合形式可以包含鼠的VL和VH可变区与人源的CL(κ)和CH(IgG1)恒定结构域的融合，以产生嵌合单克隆抗体。
在本发明的含义内，“人源化抗体”意指来自非人类物种的抗体，其蛋白质序列已被修饰以增加其与人类天然产生的抗体变体的相似性。“人源化”过程通常应用于开发用于向人给药的单克隆抗体。
在本发明的含义内，“人抗体”意指可以天然存在于人中的抗体。术语“人抗体”通常包括完全人或人源化的抗体。
在本发明的含义内，抗体的术语“结合”或“结合的”是指与靶抗原的至少暂时相互作用或与靶抗原的缔合。
在本发明的含义内，“抑制”(inhibit)或“抑制”(inhibition)旨在限制，预防和/或阻断生物剂的作用或功能。“阻断”在本文中也用作同义词。
在本发明的含义内，癌症干细胞(CSC)是具有与正常干细胞相关的特征的癌细胞，特别是具有分化成在特定癌症样品中发现的所有细胞类型并无限期自我更新的能力。
在本发明的含义内，“治疗”，“处理”旨在获得所需的药理和/或生理作用。就部分或完全治愈疾病和/或归因于该疾病的副作用而言，该作用可以是治疗性的。如本文所用，“治疗”包括施用本发明的化合物以治疗哺乳动物，特别是人类的疾病或病症，并且包括：(a)抑制疾病，即阻止其进展；(b)提供姑息治疗，即减少和预防患者的痛苦；(c)缓解疾病，即引起疾病或病症的消退或减轻其症状或并发症。可以调整剂量方案以提供最佳的期望反应。
在本发明的含义内，“表位”是指抗原分子的一部分，可产生抗体并且抗体与之结合。“FGFR4表位”包含抗FGFR4单克隆抗体特异性结合的FGFR4蛋白的部分。表位可包含线性氨基酸残基(即，表位内的残基以线性方式一个接一个地顺序排列)，非线性氨基酸残基，或线性和非线性氨基酸残基两者。通常，线性表位通常是短的氨基酸序列(例如，长度约为5个氨基酸)。
在本发明的含义内，“药物组合物”是指这样的组合物，其中将有效量的本发明的抗体与至少一种药学上可接受的载体和/或至少一种药学上可接受的辅料混合，以适合用于向受试者给药。
在本发明的含义内，“基本上”是指很大和/或显著的程度。
在本发明的含义内，“抗体药物偶联物”或“ADC”意指其中单克隆抗体与药物(通常是高度细胞毒性的药物)连接的化合物。
本发明涉及抗FGFR4或其功能片段或功能衍生物的抗体，特别是人抗体。
术语“抗体”特别是指包含至少一条免疫球蛋白重链和至少一条免疫球蛋白轻链的分子。每条重链和轻链可包含可变结构域和恒定结构域。抗原结合位点可以由重链和轻链的可变结构域形成。可变区(也称为可变结构域)包括互补决定区(CDR)，例如CDR1，CDR2和CDR3区域以及CDR侧翼的框架区(FR)。术语“互补决定区”是本领域技术人员容易理解的(参见例如Harlow和Lane(编辑)，Antibodies:A Laboratory Manual,CSHL press,ColdSpring Harbor,N.Y.,1988)，并且是指抗体可变域内的氨基酸片段，其主要与抗原接触并确定抗体特异性。源自非连续CDR的三联体的三级结构也称为高变区。
本发明的一个目的是抗FGFR4的抗体，其用于检测和/或杀死和/或影响和/或抑制结肠癌干细胞的发育和/或分化。
抗FGFR4单克隆抗体是本领域已知的，可以通过常规方法购买或合成。参见例如以上背景介绍中引用的参考文献，例如French等人,2012；Bumbaca等人,2011；Bartz等人,2016；US 9266955 B2；WO 2014/105849A1；WO 2016/023894 A1，U3-1784(U3/DaiichiSankyo,NCT02690350)。还可以使用已知的基因免疫技术获得抗FGFR4的单克隆抗体。基因免疫是本领域众所周知的，并且是本领域普通技术人员通常使用的。该技术的参考可以在JTang DC,DeVit M,Johnston SA.Nature.1992,356(6365):152-154中找到。
根据本发明，抗FGFR4的抗体可用于检测和识别结肠癌干细胞。特别地，它们可以有利地用于检测临床样品中的结肠癌干细胞，因此发现了在诊断测定中的应用。更特别地，它们可以有利地用于旨在测量新颖CRC治疗对CSC群体的影响的临床级测定中。
根据本发明，抗FGFR4的抗体也可以用于杀死结肠癌干细胞或用于影响或抑制其发育或分化。
特别地，抗FGFR4的抗体可以以用于杀死结肠癌干细胞以治疗结肠癌的药物组合物的形式施用于有需要的受试者。也可以将其施用于需要其的受试者以抑制所述细胞的发育或分化，以预防或改善结肠癌病状。
药物组合物和给药方式是常规的，并且在本领域技术人员(例如医师)的能力和知识范围内。
关于治疗应用的更多细节可以在下文的“药物组合物和药物治疗”段落中找到。
本申请的发明人还发现针对人FGFR4或其功能片段或功能衍生物的氨基酸119至156之间的表位的抗体对于治疗和诊断应用特别有用。FGFR4的这个表位也称为“酸性盒”结构域。
在一优选的实施方案中，本发明的抗体针对人FGFR4的氨基酸127至154之间的表位。实际上，已经发现与该特定表位的结合有利于抑制FGFR4活性。
根据一特别优选的实施方案，本发明的抗体针对一种表位，该表位包含，基本上由以下组成或由以下组成：被包含在人FGFR4的氨基酸119至156之间的氨基酸序列，优选在人FGFR4的氨基酸127至154之间的氨基酸序列。优选地，所述氨基酸序列具有SEQ ID N.27的序列(DEDPKSHRDPSNRHSYPQQAPYWTHPQR)。
在本发明的另一实施方案中，抗体结合由以下公开的单克隆抗体识别的抗原或表位。
在另一实施方案中，本发明的抗体包含以下所公开的抗体的高变区的氨基酸，所述抗体的高变区的氨基酸对于特异性结合如以下结合中所公开的单克隆抗体所结合的表位是必需的。
可以通过在合适的单细胞或其他宿主中，使用标准重组DNA程序，克隆编码所述高变区的DNA并表达DNA来获得这种抗体。此外，可以通过化学方法使用众所周知的用于合成多肽的技术来合成多肽。
本发明的主题不限于本文公开的具有可变轻链和重链以及CDR的抗体。本发明还涵盖包含能够特异性结合本文公开的抗体所结合的相同表位的氨基酸序列或基本上由其组成的多肽。获得这种多肽的一种方法是选择性地替代所述抗体的高变区的氨基酸，以便鉴定在被替代时影响或不影响多肽与抗原结合的氨基酸。
所有这些技术在本领域中是众所周知的并且在本领域技术人员的知识范围内。
例如，可以参考图26B所示的包含在127至154之间的氨基酸的酸性盒内的结合位点。基于该结合位点，技术人员可鉴定出特异性结合表位所必需的下文中公开的抗体的高变区的氨基酸。
本发明的抗体可以是各种免疫球蛋白(Ig)类型，例如IgA-，IgD-，IgE-，IgG-或IgM-类型，优选IgG-或IgM-类型，包括但不限于lgG1-，IgG2-，IgG3-，IgG4-，IgM1-和IgM2-类型。在一优选的实施方案中，该抗体是IgG1类型的。
同样，轻链的恒定部分可以是κ型或λ型，优选它是κ型。
在一些实施方案中，本发明的抗体是单克隆抗体。
在一些实施方案中，它是人抗体，人源化抗体或嵌合抗体。
在本发明的某些实施方案中，抗体包含如下文所述的特异性重链互补决定区CDRH1，CDRH2和/或CDRH3。
在一实施方案中，抗体包含重链互补决定区1(CDRH1)，其具有如SEQ ID NO：5-6中任一个所示的氨基酸序列，或与其有1或2个不同的氨基酸的氨基酸序列。
在另一实施方案中，所述抗体包含重链互补决定区2(CDRH2)，其具有如SEQ IDNO：7-8中任一个所示的氨基酸序列，或与其有1或2个不同的氨基酸的氨基酸序列。
在又一实施方案中，抗体包含重链互补决定区3(CDRH3)，其具有如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列，或与其有1或2个不同的氨基酸的氨基酸序列。
根据本发明的抗体还可包含特异性轻链互补决定区CDRL1，CDRL2和/或CDRL3。
因此，在一实施方案中，该抗体包含轻链互补决定区1(CDRL1)，其具有如SEQ IDNO：14-15中任一个所示的氨基酸序列，或与其有1或2个不同的氨基酸的氨基酸序列。
在另一实施方案中，该抗体包含轻链互补决定区2(CDRL2)，其具有如SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列，或与其有1或2个不同的氨基酸的氨基酸序列。
在又一实施方案中，该抗体包含轻链互补决定区3(CDRL3)，其具有如SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列，或与其有1或2个不同的氨基酸的氨基酸序列。
本发明的抗体优选在一条重链内包含CDR(即CDRH1，CDRH2和CDRH3)的特异性组合。
因此，在一优选的实施方案中，该抗体包括包含互补决定区CDRH1、CDRH2和CDRH3的重链，其中CDRH1选自如SEQ ID NO：5-6所示的序列，或与其有1或2个不同的氨基酸的氨基酸序列，CDRH2选自如SEQ ID NO：7-8所示的序列，或与其有1或2个不同的氨基酸的氨基酸序列，且CDRH3如SEQ ID NO：9所示，或与其有1或2个不同的氨基酸的氨基酸序列。
最优选地，本发明的抗体包括包含三个CDR的重链，其中CDRH1，CDRH2和CDRH3的组合选自表1中所示的那些。应当理解，该表的每一行代表CDRH1，CDRH2和CDRH3的一种特定组合。
表1
Figure BDA0002385150140000221
根据本发明，进一步优选的是，抗体包含在一条轻链内CDR(即CDRL1，CDRL2和CDRL3)的特定组合。因此，在一优选的实施方案中，抗体包括包含互补决定区CDRL1，CDRL2和CDRL3的轻链，其中CDRL1具有如SEQ ID NO：14-15中任一个所示的氨基酸序列，或者与其有1或2个不同的氨基酸的氨基酸序列，CDRL2具有如SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列，或与其有1或2个不同的氨基酸的氨基酸序列，且CDRL3具有如SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列，或与其有1或2个不同的氨基酸的氨基酸序列。
最优选地，本发明的抗体包括包含三个CDR的轻链，其中CDRL1，CDRL2和CDRL3的组合选自表2中所示的那些。应当理解，该表的每一行代表CDRL1、CDRL2和CDRL3的一种特定组合。
表2
Figure BDA0002385150140000231
如上所述，抗体的互补决定区(CDR)可以位于框架区的侧翼。包含三个CDR的抗体的重链或轻链包含例如四个框架区域。
这些抗体的功能片段和功能衍生物也在本发明的范围内。
另外，本发明还涵盖与以上述重链和/或轻链CDR为特征的特异性抗体识别在人FGFR4上的相同表位的那些抗体。
为了确定抗体识别的FGFR4上的表位，可以使用化学制备的源自人FGFR4胞外域氨基酸序列的短肽阵列来定位和鉴定抗体表位(Reinicke W.,Methods Mol.Biol.2004,248:443-63)。映射由本发明的抗体结合的FGFR4细胞外结构域中的表位的另一种方法包括Snaps/SELDI(Wang等人，Int.J.Cancer,2001,June 15；92(6):871-6)或可以进行常规的交叉阻断测定，如在Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Ed Harlow和David Lane(1988)中所描述。
根据一特别优选的实施方案，本发明的抗体包含重链和/或轻链，所述重链包含选自以下的至少一个CDR：
(a)如SEQ ID NO：5-6所示的CDRH1，或与其有1或2个不同氨基酸的CDRH1序列，
(b)如SEQ ID NO：7-8所示的CDRH2，或与其有1或2个不同氨基酸的CDRH2序列，和
(c)如SEQ ID NO：9所示的CDRH3，或与其有1或2个不同氨基酸的CDRH3序列，
所述轻链包含选自以下的至少一个CDR：
(d)如SEQ ID NO：14-15所示的CDRL1，或与其有1或2个不同氨基酸的CDRL1序列，
(e)如SEQ ID NO：16所示的CDRL2，或与其有1或2个不同氨基酸的CDRL2序列，和
(f)如SEQ ID NO：17所示的CDRL3，或与其有1或2个不同氨基酸的CDRL3序列。
在本发明的一优选实施方案中，该抗体包含如SEQ ID N.1-4或SEQ ID N.84-88中任一个所示的重链可变区(VH)或与所述序列具有至少85％同一性的序列。此外，本发明的人抗体优选包含如SEQ ID N.10-13或SEQ ID N.89-91中任一个所示的轻链可变区(VL)，或与所述序列具有至少85％同一性的序列。至少85％同一性是指包含在85％至100％之间的氨基酸同一性百分比，优选为90％，95％或99％。
本文公开了具有SEQ ID N.1-4的上述序列；在每个序列中，CDR在可变链中的位置标有下划线：
EVQLVESGGGLVQPGRSLKLSCAASGFTFSNYYMAWVRQAPKKGLEWVATINPSGTRTYYPDSVKGRFTLSRDSAKSSLYLQMNSLKSEDTATFYCARLYNNYAFDYWGQGVMVTVSS
SEQ ID N.1–可变重链
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYYMSWVRQAPGKGLEWVATINPSGTRTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLYNNYAFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID N.2–可变重链
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYYMSWVRQAPGKGLEWVANINPSGTRTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLYNNYAFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID N.3–可变重链
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYYMSWVRQAPGKGLEWVATINPSGTRTYYPDSVKGRFTISRDSAKSSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLYNNYAFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID N.4–可变重链
本文公开了具有SEQ ID N.84-88的上述序列；在每个序列中，CDR在可变链中的位置标有下划线：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYYMSWVRQAPGKGLEWVATINPSGTRTYYPDSVKGRFTLSRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLYNNYAFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID N.84-可变重链
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYYMAWVRQAPGKGLEWVATINPSGTRTYYPDSVKGRFTLSRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTATFYCARLYNNYAFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID N.85-可变重链
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYYMAWVRQAPGKGLEWVATINPSGTRTYYPDSVKGRFTLSRDSAKSSLYLQMNSLRAEDTATFYCARLYNNYAFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID N.86-可变重链
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYYMSWVRQAPGKGLEWVATINPSGTRTYYPDSVKGRFTLSRDSAKSSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLYNNYAFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID N.87-可变重链
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYYMAWVRQAPGKGLEWVATINPSGTRTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTATYYCARLYNNYAFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID N.88-可变重链
本文公开了具有SEQ ID N.10-13的上述序列；在每个序列中，CDR在可变链中的位置标有下划线：
DVQMTQSPALAVSPGERVSISCRASESVSTLMHWYQQKPGQQPKLLIYGTSNLESGVPA RFSGSGSGTDFTLNIDPVEADDTATYFCQQSWNDPPTFGGGTKLEVK
SEQ ID N.10–可变轻链
DVQMTQSPALAVSPGERVSISCRASESVSTLMHWYQQKPGQQPKLLIYGTSNLESGVPA RFSGSGSGTDFTLNIDPVEADDTATYFCQQSWNDPPTFGGGTKLELK
SEQ ID N.11–可变轻链
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESISTLLHWYQQKPGKAPKLLIYGTSNLESGVPSR FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSWNDPPTFGGGTKVEIK
SEQ ID N.12–可变轻链
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVSTLMHWYQQKPGKAPKLLIYGTSNLESGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSWNDPPTFGGGTKVEIK
SEQ ID N.13–可变轻链
本文公开了具有SEQ ID N.89-91的上述序列；在每个序列中，CDR在可变链中的位置标有下划线：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESISTLLHWYQQKPGKQPKLLIYGTSNLESGVPSR FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQSWNDPPTFGGGTKVEIK
SEQ ID N.89–可变轻链
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVSTLMHWYQQKPGKQPKLLIYGTSNLESGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQSWNDPPTFGGGTKVEIK
SEQ ID N.90–可变轻链
DVQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESISTLLHWYQQKPGKAPKLLIYGTSNLESGVPSR FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQSWNDPPTFGGGTKVEIK
SEQ ID N.91–可变轻链
特别优选的是人抗体，其包含如SEQ ID NO：2至4中任一个所示的重链可变区和如SEQ ID NO：12-13中任一个所示的轻链可变区。
结合至FGFR4酸性盒的抗体或其抗原结合片段，其中其重链可变区由与序列SEQID NO：18-22或SEQ ID NO：92-96具有至少80％同一性的核苷酸序列编码，且其轻链可变区由与序列SEQ ID NO：23-26或SEQ IDNO：97-99具有至少80％同一性的核苷酸序列编码，所述抗体或其抗原结合片段仍然在本发明的范围内，条件是抗体保持其结合特异性。至少80％同一性是指包含在80％至100％之间的核苷酸同一性百分比，优选为90％，95％或99％。
特别优选的是包含重链和轻链的人抗体(hu3B6a和hu36Bc)，该重链包含如SEQ IDNO：6所示的CDRH1，如SEQ ID NO：7所示的CDRH2和如SEQ ID NO：9所示的CDRH3链，该轻链包含如SEQ ID NO：15所示的CDRL1，如SEQ ID NO：16所示的CDRL2和如SEQ ID NO：17所示的CDRL3。还包括人抗体，其中所述CDR中的一或多个的区别是1或2个氨基酸不同，或者识别人FGFR4上相同表位的抗体。在一特别优选的实施方案中，人抗体包含根据SEQ ID NO：2的重链可变区和根据SEQ ID NO：12的轻链可变区(hu3B6a)。在另一特别优选的实施方案中，人抗体包含根据SEQ ID NO：4的重链可变区和根据SEQ ID NO：12的轻链可变区(hu3B6c)。还包括人抗体，其中重链和/或轻链的可变区的序列与SEQ ID NO：2,4和12所示的序列具有至少85％的同一性。
特别优选的是人抗体(hu3B6b)，其包含重链和轻链，所述重链包含如SEQ ID NO：6所示的CDRH1，如SEQ ID NO：8所示的CDRH2和如SEQ ID NO：9所示的CDRH3，且所述轻链包含如SEQ ID NO：15所示的CDRL1，如SEQ ID NO：16所示的CDRL2和如SEQ ID NO：17所示的CDRL3。还包括人抗体，其中CDR中的一或多个的区别在于1或2个氨基酸不同，或识别人FGFR4上相同表位的抗体。在一特别优选的实施方案中，人抗体包含根据SEQ ID NO：3的重链可变区和根据SEQ ID NO：12的轻链可变区。还包括人抗体，其中重链可变区的序列和/或轻链可变区的序列与如SEQ ID NO：3和12所示的序列具有至少85％同一性。
特别优选的是包含重链和轻链的人抗体(hu3B6d和hu3B6f)，该重链包含如SEQ IDNO：6所示的CDRH1，如SEQ ID NO：7所示的CDRH2和如SEQ ID NO：9所示的CDRH3链，该轻链包含如SEQ ID NO：14所示的CDRL1，如SEQ ID NO：16所示的CDRL2和如SEQ ID NO：17所示的CDRL3。还包括人抗体，其中CDR中的一或多个的区别在于1或2个氨基酸不同，或识别人FGFR4上相同表位的抗体。在一特别优选的实施方案中，人抗体包含根据SEQ ID NO：2的重链可变区和根据SEQ ID NO：13的轻链可变区(hu3B6d)。在另一特别优选的实施方案中，人抗体包含根据SEQ ID NO：4的重链可变区和根据SEQ ID NO：13的轻链可变区(hu3B6f)。还包括人抗体，其中重链可变区的序列和/或轻链可变区的序列与如SEQ ID NO：2、4和13所示的序列具有至少85％的同一性。
特别优选的是人抗体(hu3B6e)，其包含重链和轻链，所述重链包含如SEQ ID NO：6所示的CDRH1，如SEQ ID NO：8所示的CDRH2和如SEQ ID NO：9所示的CDRH3，所述轻链包含如SEQ ID NO：14所示的CDRL1，如SEQ ID NO：16所示的CDRL2和如SEQ ID NO：17所示的CDRL3。还包括人抗体，其中CDR中的一或多个的区别在于1或2个氨基酸不同，或识别人FGFR4上相同表位的抗体。在一特别优选的实施方案中，人抗体包含根据SEQ ID NO：3的重链可变区和根据SEQ ID NO：13的轻链可变区。还包括人抗体，其中重链可变区的序列和/或轻链可变区的序列与如SEQ ID NO：3和13所示的序列具有至少85％的同一性。
另一种优选的抗体是大鼠单克隆抗体(BMK-3B6-E4-C3)，其包含重链和轻链，该重链包含如SEQ ID NO：5所示的CDRH1，如SEQ ID NO：7所示的CDRH2和如SEQ ID NO：9所示的CDRH3，所述轻链包含如SEQ ID NO：14所示的CDRL1，如SEQ ID NO：16所示的CDRL2和如SEQID NO：17所示的CDRL3。还包括人抗体，其中CDR中的一或多个的区别在于1或2个氨基酸不同，或识别人FGFR4上相同表位的抗体。在一特别优选的实施方案中，该抗体包含根据SEQID NO：1的重链可变区和根据SEQ ID NO：10的轻链可变区。还包括人抗体，其中重链可变区的序列和/或轻链可变区的序列与如SEQ ID NO：1和10所示的序列具有至少85％的同一性。
另一优选的抗体是嵌合抗体(ch3B6)，其包含重链和轻链，该重链包含如SEQ IDNO：5所示的CDRH1，如SEQ ID NO：7所示的CDRH2和如SEQ ID NO：9所示的CDRH3，以及该轻链包含如SEQ ID NO：14所示的CDRL1，如SEQ ID NO：16所示的CDRL2和如SEQ ID NO：17所示的CDRL3。还包括抗体，其中CDR中的一或多个的区别在于1或2个氨基酸不同，或识别人FGFR4上相同表位的抗体。在一特别优选的实施方案中，该抗体包含根据SEQ ID NO：1的重链可变区和根据SEQ ID NO：11的轻链可变区。还包括人抗体，其中重链可变区的序列和/或轻链可变区的序列与如SEQ ID NO：1和11所示的序列具有至少85％的同一性。
在本发明的实施方案中，本发明的抗体包含轻链和重链，其中重链可变区具有选自具有SEQ ID N.1-4、84-88的序列中任一者的序列，和轻链可变区具有选自具有SEQ IDN.10-13、89-91的序列中任一者的序列。
在本发明的实施方案中，本发明的抗体包含轻链和重链，其中重链可变区由选自具有SEQ ID N.18-22、92-96的序列中任一者的核苷酸序列编码，并且轻链可变区由选自具有SEQ ID N.23-26、97-99的序列中任一者的核苷酸序列编码。
在本发明的优选实施方案中，本发明的抗体包含轻链和重链，其中可变轻链(VL)和可变重链(VH)的组合选自下表3中所示的那些。抗体还包含CDRH和CDRL的组合，其优选选自下表3中所示的那些。应当理解，该表的每一行代表CDRL1，CDRL2，CDRL3，CDRH1，CDRH2和CDRH3的一种特定组合，和可变轻链和可变重链的特定组合。
表3数字表示根据所附序列表中的SEQ ID N.
Figure BDA0002385150140000291
如上所述，本发明的抗体在结合特异性和生物学活性方面，特别是在其识别FGFR4的特定表位并减少细胞生长和细胞迁移的能力方面显示出有利的特性。
特别地，本发明的抗体hu3B6，ch3B6和BMK-3B6-E4-C3具有抗肿瘤活性。
而且，它们与FGFR4特异性结合，并且优选不显示与其他FGF受体FGFR1-3的交叉反应性。
本发明的抗体能够抑制FGF19与FGFR4结合。
可以使用固相受体结合测定法确定抗体对配体与FGFR4结合的作用。可以鉴定出降低配体对FGFR4受体的结合亲和力或阻断配体与FGFR4结合的那些抗体。
本发明特别优选的抗体能够将与另外的FGFR4配体(包括例如FGF1，FGF8，FGF17，FGF18，FGF21，FGF23(Zhang等人，2006))的受体的结合阻断至少60％，优选至少70％，更优选至少80％或87％。
配体与人FGFR4结合的阻断导致FGFR4信号传导的抑制。FGFR4的激活涉及对Cyp7A1的抑制和CTGF基因转录的诱导，以及对受体本身以及下游效应蛋白(如FRS2和Erk1/2)的磷酸化的刺激。为了筛选阻断抗体，可以将细胞与缓冲液(对照)或抗体预孵育，然后用配体或对照缓冲液处理。然后将细胞裂解，并且可以处理细胞裂解液，用于通过使用Cyp7A1和CTGF特异性探针的RT-PCR进行基因表达分析，或者通过用抗磷酸FGFR4、抗磷酸FRS2和/或抗磷酸Erk1/2抗体探测的SDS-PAGE和蛋白质印迹分析。选择相对于对照(未处理的细胞)缓解Cyp7A1抑制，抑制CTGF表达和/或降低FGFR4，FRS2和Erk1/2磷酸化的那些抗体。
为了确定本发明的抗体抑制FGFR4依赖性细胞增殖的能力，可以进行体外实验。可以进行克隆形成测定和软琼脂集落形成测定。接种适当数量的目标单细胞，并用在适当培养基中稀释的抗体处理或不处理。在实验期间(10-15天)每周两次更换抗体，然后对产生的集落计数。为了筛选减少FGFR4介导的细胞迁移的那些抗体，可以进行迁移实验。细胞与抗体一起孵育。可以将适当数量的细胞放置在具有8μm孔的包被的transwell孔板的顶部室中(BD Biosciences,San Jose,CA；U.S.A.)。在刺激的情况下，在底部室中使用单独的培养基或包含趋化剂的培养基。使细胞迁移并随后染色。计数染色细胞；抑制百分数表示为相对于对照抗体的抑制。
发现本发明的抗体具有抗肿瘤活性。
治疗性抗体的抗肿瘤功效可在人类异种移植肿瘤研究中进行评估。在这些研究中，人类肿瘤会在免疫受损的小鼠中以异种移植的形式生长，并且通过抑制肿瘤生长的程度来衡量治疗效果。为了确定本发明的FGFR4抗体是否干扰免疫受损小鼠中人癌细胞的肿瘤生长，将细胞植入小鼠中。肿瘤皮下生长在动物的背部或侧面。可以立即开始治疗，也可以在肿瘤达到一定平均体积时开始治疗。在第一次治疗之前，将小鼠随机分组并进行统计测试，以确保各治疗组之间的起始肿瘤体积(均值，中位数和标准差)一致。以25mg/kg的负荷剂量开始治疗，然后每周两次腹膜内注射25mg/kg。
在某些实施方案中，本文提供的抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体描述于例如美国专利No.4,816,567；和Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984)中。在一个实例中，嵌合抗体包含非人可变区(例如，衍生自小鼠，大鼠，仓鼠，兔或非人灵长类动物，例如猴子的可变区)和人恒定区。在另一个实例中，嵌合抗体是其中类别或亚类已经从亲本抗体的类别或亚类改变的“类别转换”抗体。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在一示例性的实施方案中，嵌合抗体可以通过以下制备：将编码大鼠可变重链区的cDNA与人IgG1恒定区的编码序列在框架内以及编码大鼠可变轻链区的cDNA与人κ链恒定区的编码序列在框架内克隆入相同的表达载体。然后将编码杂合重链和轻链的表达载体共转染到合适的细胞系中，并获得所需的抗体。
在某些实施方案中，抗体是人源化抗体。通常，将非人抗体人源化以减少对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含一或多个可变结构域，其中CDR(或其部分)来源于非人抗体，而FR(或其部分)来源于人抗体序列。人源化抗体任选地还将包含人恒定区的至少一部分。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如，衍生CDR残基的抗体)的相应残基替代，以例如恢复或改善抗体特异性或亲和力。
人源化抗体可以根据已知技术通过将单克隆抗体人源化来制备。通常，将非人抗体人源化以减少对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。人源化抗体及其制备方法在Alamagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)中进行了综述，并且进一步描述于例如Riechmann等人,Nature 332:323-329(1988)；Queen等人,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 86:10029-10033(1989)；美国专利号5,821,337,7,527,791,6,982,321,和7,087,409；Kashmiri等人,Methods 36:25-34(2005)(描述SDR(a-CDR)移植)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述“表面重塑技术”)；Dall'Acqua等人,Methods 36:43-60(2005)(描述“FR重排(FR shuffling)”)；和Osbourn等人,Methods 36:61-68(2005)和Klimka等人,Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述“定向选择”类似于FR重排)中。
可以用于人源化的人框架区域包括但不限于：使用“最佳适应”方法(“best-fit”)选择的框架区域(参见，例如，Sims等人,J.Immunol.151:2296(1993))；从轻链可变区或重链可变区的特定亚组的人抗体的共有序列衍生的框架区(参见，例如，Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；和Presta等人，J.Immunol.,151:2623(1993))；人成熟的(体细胞突变的)构架区或人种系构架区(参见，例如，Almagro和Fransson，Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；以及从筛选FR文库得到的构架区(参见，例如，Baca等人，J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)和Rosok等人，J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。
在本发明的一示例性实施方案中，使用以嵌合表达载体为起始产生的人源化表达载体，并用人源化可变重链编码序列替换原始大鼠可变重链编码序列以及用人源化可变轻链编码序列替换原始大鼠可变轻链编码序列来获得完全人源化抗体。然后将如此获得的表达载体在合适的细胞系中共转染以产生人源化抗体。
可以根据已知技术从基因工程动物(例如包含异种免疫系统的动物)或从抗体展示文库制备人抗体。人抗体通常描述于van Dijk和van de Winkel(Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001))和Lonberg(Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008))。可以通过将免疫原施用于已被修饰以响应抗原攻击而产生完整的人抗体或具有人可变区的完整抗体的转基因动物来制备人抗体。这样的动物通常包含全部人免疫球蛋白基因座或其部分，其替代内源性免疫球蛋白基因座，或存在于染色体外或随机整合到动物的染色体中。在这种转基因小鼠中，内源性免疫球蛋白基因座通常已被灭活。对于从转基因动物获得人抗体的方法的综述，参见例如Lonberg,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。从这类动物产生的完整抗体的人可变区可以被进一步修饰，例如通过与不同的人类恒定区域结合进行修饰。
人抗体也可以通过基于杂交瘤的方法制备。已经描述了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异种骨髓瘤细胞系(参见例如，Kozbor J.Immunol.133:3001(1984)；Brodeur等人,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,pp.51-63)。通过人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体还描述于Li等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA103:3557-3562(2006)中。
人抗体也可以通过噬菌体展示方法产生(参见，例如，US6,248,516,US 5,403,484,US 5,969,108,US 5,885,793,US 6,696,248,US5,849,500)。从抗体文库中筛选人抗体的技术是本领域已知的(例如参见Carmen,S.等人,Briefings in Functional Genomicsand Proteomics(2002),1(2),p.189-203；和Siriwardena,D.等人,Ophthalmology(2002)109(3),p.427-431)。例如，可以使用噬菌体展示方法，其包括使人抗体可变区在噬菌体表面上表达为单链抗体(scFv)，并选择与抗原结合的噬菌体(Nature(1991),352,(6336),p.624-628,Journal of Molecular Biology(1992),227,(2),p 381-388,和NatureBiotechnology(2005),23,(9),p.1105-1116)。同样，也可以使用另一种噬菌体展示方法，其涉及使人抗体Fab(抗原结合片段)在噬菌体表面上表达，并选择与抗原结合的噬菌体(WO97/08320和WO 01/05950)。可以分析基于抗原结合选择的噬菌体的基因，从而确定编码与抗原结合的人抗体可变区的DNA序列。当阐明与抗原结合的scFv或Fab的DNA序列时，从中提取CDR序列，可以制备具有该序列的表达载体并将其引入合适的宿主中，随后进行基因表达以获得人抗体(WO 92/01047,WO 92/20791,WO 93/06213,WO 93/11236,WO 93/19172,WO95/01438,WO 95/15388,Annu.Rev.Immunol(1994)12,p.433-455,和NatureBiotechnology(2005)23(9),p.1105-1116)。人抗体也可以通过分离选自人源噬菌体展示文库的Fv克隆可变结构域序列来产生。然后可以将此类可变结构域序列与所需的人恒定结构域结合。从抗体文库中选择人抗体的技术是本领域已知的。
在本发明的一特定实施方案中，通过将原始杂交瘤大鼠CDR序列移植到选择的人免疫球蛋白可变区中来获得抗体ch3B6的人源化。为了优化人源化变体，鉴定并选择了与原始大鼠抗体3B6最相似的人种系免疫球蛋白可变序列。基于与已知免疫球蛋白晶体结构的同源性，针对重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)生成了所选人种系可变区的3D模型。评估了3D模型中的每个氨基酸位置，以便确定人框架中哪些其他氨基酸残基需要被相应的原始鼠残基替代，尤其要注意可能影响抗原结合或VH/VL定向的氨基酸。设计了稍微不同版本的人源化序列，分别针对VH设计了三个版本和针对VL设计了两个版本，它们的组合产生了六种不同的抗体(hu3B6a，hu3B6b，hu3B6c，hu3B6d，hu3B6e，hu3B6f)。
本发明还包括人抗体的片段，例如包含至少一个抗原结合位点的上述抗体的部分。抗体片段的实例包括Fab片段，Fab'片段，F(ab')2片段，Fv片段，双抗体或单链抗体分子和其他片段，只要它们表现出能与人FGFR4结合的所需能力即可。对于某些抗体片段的综述，请参见Hudson等人，Nat.Met.9:129-134(2003)。
在某些实施方案中，考虑了本文提供的抗体的氨基酸序列变体，只要它们表现出期望的结合人FGFR4的能力即可。例如，可能需要改善抗体的结合亲和力和/或其他生物学特性。可以通过将适当的修饰引入编码抗体的核苷酸序列中，或通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括，例如，抗体氨基酸序列内残基的缺失和/或插入和/或替代。可以进行缺失、插入和替代的任何组合以获得最终的构建体，条件是最终的构建体具有期望的特性，例如，抗原结合。
本发明的抗体可以通过制备方法获得，所述制备方法是本领域公知常识的一部分。
例如，可以参考最新版的“Current protocols in immunology”Colligan等人编辑,John Wiley&Sons,Inc.,NY。
在一实施方案中，根据本发明的单克隆抗体通过基因免疫来制备，如实施例3所示。基因免疫是本领域众所周知的，并且是本领域普通技术人员通常使用的。例如，可以在Tang DC,DeVit M,Johnston SA.Nature.1992,356(6365):152-154中找到该技术的参考。
本发明的抗体可以偶联至异源基团，例如效应子基团。这样的抗体偶联物特别适合于治疗应用。术语“效应子基团”可以指细胞毒性基团，例如放射性同位素或放射性核素，毒素，治疗基团或本领域已知的另一效应子基团。
特别优选其中抗体与治疗基团偶联的偶联物，所谓的抗体-药物偶联物(ADC)。
由于其选择性靶向FGFR4的特性，本发明的抗体在构建抗体-药物偶联物(ADC)中特别有用。在优选的实施方案中，在所述ADC中，要与抗体连接的药物成分是毒素，优选选自：奥利斯他汀(auristatin)，美登木素生物碱类(maytansinoids)，刺孢霉素，微管溶素，倍癌霉素，喜树碱类似物，苯并二氮杂卓，多柔比星，α-鹅膏蕈碱衍生物，蒽环类(anthracyclins)，根瘤菌素，thailanstatin，spliceostatins，隐藻素(cryptophycins)和组蛋白脱乙酰酶抑制剂。对于该主题的综述，可以参考Beck等人，Nat Rev DrugDiscov.16:315-337(2017)。
根据本发明的一实施方案，具有本文公开的单克隆抗体的偶联物(ADC)包含隐藻素，特别是下式的隐藻素：
Figure BDA0002385150140000351
根据本发明的一实施方案，偶联物具有式(I)
Figure BDA0002385150140000353
其中R为-CO-CH2-X-(A)n-B，
其中X选自由NRa组成的组，其中Ra选自由H和C1-C10烷基和O组成的组；
A可以存在或不存在，并且是自降解的接头(linker)，
n为0或1；
B是本发明中公开的抗体；
及其药学上可接受的盐。
在本发明的一实施方案中，在式(I)的偶联物中，接头A是式(II)的部分
Figure BDA0002385150140000361
其中R1选自H，(C1-C10)烷基，R2任选地与R1一起是氨基酸侧链的残基，R3选自H，(C1-C10)烷基，R4任选地与R3一起是氨基酸侧链的残基。
在本发明的一实施方案中，在式(I)的偶联物中，接头A选自由以下组成的组：
Figure BDA0002385150140000362
和
Figure BDA0002385150140000363
在本发明的一实施方案中，上述偶联物具有式(V)
Figure BDA0002385150140000371
其中R1，R2，R3和R4如上定义，X选自NH，N-(C1-C10)-烷基，O；mAb表示如本发明中公开的单克隆抗体。
在本发明的一实施方案中，上述偶联物具有式(VI)，
Figure BDA0002385150140000372
其中该式左端的符号表示如本发明中公开的单克隆抗体。
在本发明的一实施方案中，上述偶联物具有式(VII)
Figure BDA0002385150140000373
其中R1选自H，(C1-C10)烷基，R4任选地与R1一起是氨基酸侧链的残基；X选自NH，N-(C1-C10)，烷基O；mAb表示如本发明中公开的单克隆抗体。
所有上述实施方案还包含各自的药学上可接受的盐。
在一优选的实施方案中，本发明的抗体包含在ADC中，其中药物部分是隐藻素，如WO2016146638中所公开。
在另一优选的实施方案中，本发明的抗体包含在ADC中，其中药物部分是隐藻素，并且接头如WO2016146638中所公开。
在另一优选的实施方案中，本发明的抗体对应于WO2016146638中公开的式(I)化合物中的基团B。
同样，本发明的抗体可以与标记基团偶联。这种抗体偶联物特别适合于诊断应用。如本文所用，术语“标记基团”是指可检测的标记，例如放射性标记的氨基酸或生物素部分，荧光标记，酶或本领域已知的任何其他类型的标记。本发明的抗体或抗体片段与放射性同位素的连接，例如为肿瘤治疗提供了优势。与化学疗法和其他形式的癌症治疗不同，放射免疫疗法或放射性同位素-抗体组合的给药靶向癌细胞，而对周围正常健康组织的损害却最小。
在一些实施方案中，可以对本发明的抗体进行工程改造以改善例如抗原结合特性，效应子功能，药代动力学，药物特性和安全性问题。特别地，可以改造抗体的可变区。工程化抗体，特别是用于获得上述作用的抗体，是免疫学领域的常见活动。例如，可以参考Igawa T,Tsunoda H,Kuramochi T,Sampei Z,Ishii S,Hattori K.MAbs.2011May-Jun；3(3):243-52,“Engineering the variable region of therapeutic IgG antibodies”的综述。特别地，本发明的抗体的糖工程化形式在本发明的范围内，并且它们可以由技术人员根据本领域的公知常识来获得。
本发明还涉及编码如上所述的抗体的核酸分子。
术语“核酸分子”包括DNA，例如单链-或双链-DNA或RNA。该DNA可以是基因组，cDNA或合成来源的，或其组合。本发明的核酸分子可操作连接于表达控制序列，即连接于实现编码核酸序列的表达所必需的序列。这样的表达控制序列可以包括启动子，增强子，核糖体结合位点和/或转录终止序列。合适的表达控制序列的具体实例是本领域已知的。
根据一优选的实施方案，本发明涉及选自以下的分离的核酸分子：
(a)编码如上定义的抗体，其片段或衍生物的核酸序列，
(b)如SEQ ID NO：18-22、92-96和SEQ ID NO：23-26、97-99中任一项或如SEQ ID N.28-31和SEQ ID NO：32-34所示的核酸序列，与(a)或(b)中任一序列互补的核酸序列，和能够在严苛条件下与(a)或(b)杂交的核酸序列。
根据本发明的一特别优选的实施方案，核酸分子包含编码抗体的重链可变区的序列和编码抗体的轻链可变区的序列。
在一替代性实施方案中，提供了两种核酸分子的组合，其中一个核酸分子编码抗体的轻链，另一个核酸分子编码抗体的重链。
编码重链可变区的核酸序列优选选自SEQ ID NO：18-22中任何一个所示的序列。编码抗体轻链可变区的核酸序列优选选自SEQ ID NO：23-26中任一个所示的序列。
本文报道了上述提及的编码重链可变区的具有SEQ ID N.18-22的核酸序列：
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTAGTGCAGCCTGGAAGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCAGGATTCACTTTCAGTAATTATTACATGGCCTGGGTCCGCCAGGCTCCAAAGAAGGGTCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAATCCCAGTGGTACCAGAACTTACTATCCAGACTCCGTGAAAGGCCGATTCACTCTCTCCAGAGATAGTGCAAAGAGCAGCCTATATCTGCAAATGAACAGTCTGAAGTCTGAGGACACGGCCACTTTTTACTGTGCAAGGCTTTATAACAACTACGCTTTTGATTACTGGGGCCAGGGAGTCATGGTCACAGTCTCCTCA
SEQ ID N.18–编码可变重链的核酸
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTAGTGCAGCCTGGAAGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCAGGATTCACTTTCAGTAATTATTACATGGCCTGGGTCCGCCAGGCTCCAAAGAAGGGTCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAATCCCAGTGGTACCAGAACTTACTATCCAGACTCCGTGAAAGGCCGATTCACTCTCTCCAGAGATAGTGCAAAGAGCAGCCTATATCTGCAAATGAACAGTCTGAAGTCTGAGGACACGGCCACTTTTTACTGTGCAAGGCTTTATAACAACTACGCTTTTGATTACTGGGGCCAAGGAGTCATGGTCACTGTCTCCTCA
SEQ ID N.19–编码可变重链的核酸
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAACTATTACATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCACCATAAACCCTAGCGGAACCAGAACCTACTATCCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGACTGTACAACAATTACGCCTTTGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID N.20–编码可变重链的核酸
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAACTATTACATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCAACATAAACCCTAGCGGAACCAGAACCTACTATCCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGACTGTACAACAATTACGCCTTTGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID N.21–编码可变重链的核酸
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAACTATTACATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCACCATAAACCCTAGCGGAACCAGAACCTACTATCCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAGCGCCAAGAGCTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGACTGTACAACAATTACGCCTTTGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID N.22–编码可变重链的核酸
本文报道了上述的编码重链可变区的具有SEQ ID N.92-96的核酸序列：
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAACTATTACATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCACCATAAACCCTAGCGGAACCAGAACCTACTATCCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCCTCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGACTGTACAACAATTACGCCTTTGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID N.92–编码可变重链的核酸
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAACTATTACATGGCCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCACCATAAACCCTAGCGGAACCAGAACCTACTATCCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCCTCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTACCTTCTACTGTGCGAGACTGTACAACAATTACGCCTTTGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID N.93–编码可变重链的核酸
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAACTATTACATGGCCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCACCATAAACCCTAGCGGAACCAGAACCTACTATCCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCCTCTCCAGAGACAGCGCCAAGAGCTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTACCTTCTACTGTGCGAGACTGTACAACAATTACGCCTTTGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID N.94–编码可变重链的核酸
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAACTATTACATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCACCATAAACCCTAGCGGAACCAGAACCTACTATCCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCCTCTCCAGAGACAGCGCCAAGAGCTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGACTGTACAACAATTACGCCTTTGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID N.95–编码可变重链的核酸
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAACTATTACATGGCCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCACCATAAACCCTAGCGGAACCAGAACCTACTATCCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTACCTATTACTGTGCGAGACTGTACAACAATTACGCCTTTGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID N.96–编码可变重链的核酸
本文报道了上述的编码轻链可变区的具有SEQ ID N.23-26的核酸序列：
GATGTCCAGATGACCCAGTCTCCTGCTTTGGCTGTGTCTCCAGGAGAGAGGGTTTCCATCTCCTGTAGGGCCAGTGAAAGTGTCAGTACACTTATGCACTGGTACCAACAGAAACCAGGACAGCAACCCAAACTCCTCATCTACGGTACATCCAACCTAGAGTCTGGAGTCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATAGATCCTGTGGAGGCTGATGACACTGCAACCTATTTCTGTCAGCAGAGTTGGAATGATCCTCCGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAGTGAAA
SEQ ID N.23–编码可变轻链的核酸
GATGTCCAGATGACCCAGTCTCCTGCTTTGGCTGTGTCTCCAGGAGAGAGGGTTTCCATCTCCTGTAGGGCCAGTGAAAGTGTCAGTACACTTATGCACTGGTACCAACAGAAACCAGGACAGCAACCCAAACTCCTCATCTACGGTACATCCAACCTAGAGTCTGGAGTCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATAGATCCTGTGGAGGCTGATGACACTGCAACCTATTTCTGTCAGCAGAGTTGGAATGATCCTCCGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAATTGAAA
SEQ ID N.24–编码可变轻链的核酸
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTGAGAGCATTAGCACCCTGTTACACTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGGCACCTCCAACTTGGAGAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTGGAACGACCCTCCCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA
SEQ ID N.25–编码可变轻链的核酸
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTGAGAGCGTGAGCACCCTGATGCACTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGGCACCTCCAACTTGGAGAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTGGAACGACCCTCCCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAASEQ ID N.26–编码可变轻链的核酸
本文报道了上述提及的编码轻链可变区的具有SEQ ID N.97-99的核酸序列：
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTGAGAGCATTAGCACCCTGTTACACTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAACAGCCTAAGCTCCTGATCTATGGCACCTCCAACTTGGAGAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTTCTGTCAACAGAGTTGGAACGACCCTCCCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA
SEQ ID N.97–编码可变轻链的核酸
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTGAGAGCGTGAGCACCCTGATGCACTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAACAGCCTAAGCTCCTGATCTATGGCACCTCCAACTTGGAGAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTTCTGTCAACAGAGTTGGAACGACCCTCCCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA
SEQ ID N.98–编码可变轻链的核酸
GACGTGCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTGAGAGCATTAGCACCCTGTTACACTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGGCACCTCCAACTTGGAGAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTTCTGTCAACAGAGTTGGAACGACCCTCCCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA
SEQ ID N.99–编码可变轻链的核酸
一种核酸，其包含如SEQ ID NO.18-22、92-96所示的序列中的至少一个和如SEQID NO：23-26、97-99中所示的序列中的至少一个，其在本发明的范围内。
特别优选的是包含如SEQ ID NO：18-22所示的序列的至少一个以及如SEQ ID NO：23-26所示的序列的至少一个的核酸序列的组合。核酸序列可以存在于一个分离的核酸分子内或存在于两个分离的核酸分子的组合中。
在一优选的实施方案(大鼠抗体BMK-3B6-E4-C3)中，所述分离的核酸分子包含作为编码重链可变区的序列的如SEQ ID NO 18所示的序列(编码具有SEQ ID NO 1的氨基酸序列)，以及作为编码轻链可变区的序列的如SEQ ID NO.23所示的序列(编码具有SEQ IDNO 10的氨基酸序列)。
在另一优选的实施方案中(嵌合抗体ch3B6)，所述分离的核酸分子包含作为编码重链可变区的序列的SEQ ID NO 19的序列(编码具有SEQ ID NO 1的氨基酸序列)和作为编码轻链可变区的序列的SEQ ID NO.24的序列(编码具有SEQ ID NO 11的氨基酸序列)。
特别优选的是核酸序列的组合，其中编码重链可变区的核酸序列选自如SEQ IDNO：20-22中任一项所示的序列，并且编码该抗体的轻链可变区的核酸序列选自如SEQ IDNO：25-26中的任一项所示的序列。核酸序列可以存在于一个分离的核酸分子内或存在于两个分离的核酸分子的组合中。
在一优选的实施方案(人抗体Hu3B6a)中，所述分离的核酸分子包含作为编码重链可变区的序列的如SEQ ID NO 20所示的序列(编码具有SEQ ID NO 2的氨基酸序列)，以及作为编码轻链可变区的序列的如SEQ ID NO.25所示的序列(编码具有SEQ ID NO 12的氨基酸序列)。
在一优选的实施方案(人抗体Hu3B6d)中，所述分离的核酸分子包含作为编码重链可变区的序列的如SEQ ID NO 20所示的序列(编码具有SEQ ID NO 2的氨基酸序列)，以及作为编码轻链可变区的序列的如SEQ ID NO.26所示的序列(编码具有SEQ ID NO 13的氨基酸序列)。
在一优选的实施方案中(人抗体Hu3B6b)，所述分离的核酸分子包含作为编码重链可变区的序列的如SEQ ID NO 21所示的序列(编码具有SEQ ID NO 3的氨基酸序列)，以及作为编码轻链可变区的序列的如SEQ ID NO.25所示的序列(编码具有SEQ ID NO 12的氨基酸序列)。
在一优选的实施方案(人抗体Hu3B6e)中，所述分离的核酸分子包含作为编码重链可变区的序列的如SEQ ID NO 21所示的序列(编码具有SEQ ID NO 3的氨基酸序列)，以及作为编码轻链可变区的序列的如SEQ ID NO.26所示的序列(编码具有SEQ ID NO 13的氨基酸序列)。
在一优选的实施方案(人抗体Hu3B6c)中，所述分离的核酸分子包含作为编码重链可变区的序列的如SEQ ID NO 22所示的序列(编码具有SEQ ID NO 4的氨基酸序列)，以及作为编码轻链可变区的序列的如SEQ ID NO.25所示的序列(编码具有SEQ ID NO 12的氨基酸序列)。
在一优选的实施方案(人抗体Hu3B6f)中，所述分离的核酸分子包含作为编码重链可变区的序列的如SEQ ID NO 22所示的序列(编码具有SEQ ID NO 4的氨基酸序列)，以及作为编码轻链可变区的序列的如SEQ ID NO.26所示的序列(编码具有SEQ ID NO 13的氨基酸序列)。
在进一步的实施方案中，所述分离的核酸包含编码重链的序列和编码轻链的序列，均包含可变区和恒定区。
在一实施方案中，所述分离的核酸用于产生嵌合抗体，并且所述编码重链的序列是SEQ ID N.28的序列，而编码轻链的序列是SEQ ID N.32的序列，例如如下所示：
ATGAATCTACTTCTGATCCTTACCTTTGTTGCGGCCGCTGTTGCGGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTAGTGCAGCCTGGAAGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCAGGATTCACTTTCAGTAATTATTACATGGCCTGGGTCCGCCAGGCTCCAAAGAAGGGTCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAATCCCAGTGGTACCAGAACTTACTATCCAGACTCCGTGAAAGGCCGATTCACTCTCTCCAGAGATAGTGCAAAGAGCAGCCTATATCTGCAAATGAACAGTCTGAAGTCTGAGGACACGGCCACTTTTTACTGTGCAAGGCTTTATAACAACTACGCTTTTGATTACTGGGGCCAAGGAGTCATGGTCACTGTCTCCTCAGCGTCGACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGCGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
SEQ ID N.28-编码重链的核酸
ATGAATCTACTTCTGATCCTTACCTTTGTTGCGGCCGCTGTTGCGGATGTCCAGATGACCCAGTCTCCTGCTTTGGCTGTGTCTCCAGGAGAGAGGGTTTCCATCTCCTGTAGGGCCAGTGAAAGTGTCAGTACACTTATGCACTGGTACCAACAGAAACCAGGACAGCAACCCAAACTCCTCATCTACGGTACATCCAACCTAGAGTCTGGAGTCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATAGATCCTGTGGAGGCTGATGACACTGCAACCTATTTCTGTCAGCAGAGTTGGAATGATCCTCCGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAATTGAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGA
SEQ ID N.32-编码轻链的核酸
在另一实施方案中，所述分离的核酸用于产生人源化抗体，并且所述编码重链的序列选自SEQ ID N.29-31的序列，并且编码轻链的序列选自SEQ ID NO.33-34的序列，如下所示：
ATGAATCTACTTCTGATCCTTACCTTTGTTGCGGCCGCTGTTGCGGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAACTATTACATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCACCATAAACCCTAGCGGAACCAGAACCTACTATCCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGACTGTACAACAATTACGCCTTTGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCGTCGACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGCGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
SEQ ID N.29-编码重链的核酸
ATGAATCTACTTCTGATCCTTACCTTTGTTGCGGCCGCTGTTGCGGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAACTATTACATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCAACATAAACCCTAGCGGAACCAGAACCTACTATCCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGACTGTACAACAATTACGCCTTTGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCGTCGACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGCGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
SEQ ID N.30-编码重链的核酸
ATGAATCTACTTCTGATCCTTACCTTTGTTGCGGCCGCTGTTGCGGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAACTATTACATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCACCATAAACCCTAGCGGAACCAGAACCTACTATCCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAGCGCCAAGAGCTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGACTGTACAACAATTACGCCTTTGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCGTCGACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGCGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
SEQ ID N.31-编码重链的核酸
ATGAATCTACTTCTGATCCTTACCTTTGTTGCGGCCGCTGTTGCGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTGAGAGCATTAGCACCCTGTTACACTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGGCACCTCCAACTTGGAGAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTGGAACGACCCTCCCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGA
SEQ ID N.33-编码轻链的核酸
ATGAATCTACTTCTGATCCTTACCTTTGTTGCGGCCGCTGTTGCGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTGAGAGCGTGAGCACCCTGATGCACTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGGCACCTCCAACTTGGAGAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTGGAACGACCCTCCCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGA
SEQ ID N.34-编码轻链的核酸
优选地，所述分离的核酸分子包含作为编码重链的序列的SEQ ID NO 29的序列和作为编码轻链的序列的SEQ ID NO.33的序列。
优选地，所述分离的核酸分子包含作为编码重链的序列的SEQ ID NO 30的序列和作为编码轻链的序列的SEQ ID NO.33的序列。
优选地，所述分离的核酸分子包含作为编码重链的序列的SEQ ID NO 31的序列和作为编码轻链的序列的SEQ ID NO.33的序列。
优选地，所述分离的核酸分子包含作为编码重链的序列的SEQ ID NO 29的序列和作为编码轻链的序列的SEQ ID NO.34的序列。
优选地，所述分离的核酸分子包含作为编码重链的序列的SEQ ID NO 30的序列和作为编码轻链的序列的SEQ ID NO.34的序列。
优选地，所述分离的核酸分子包含作为编码重链的序列的SEQ ID NO 31的序列和作为编码轻链的序列的SEQ ID NO.34的序列。
术语“在严苛条件下杂交”是指两个核酸片段在标准化杂交条件下彼此杂交，例如在Sambrook等人,"Expression of cloned Genes in E.coli"in Molecular Cloning:ALaboratory Manual(1989),Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York,USA中所述的标准化杂交条件。这样的条件是，例如，在约45℃在6.0×SSC(柠檬酸钠盐溶液)中杂交，然后在50℃用2.0×SSC，优选在65℃用2.0×SSC或在50℃用0.2×SSC，优选在65℃下用0.2×SSC进行洗涤步骤。在严苛条件下杂交的另一个例子是在65℃下在0.5M NaHPO4、7％十二烷基硫酸钠(SDS)、1mM EDTA中与滤膜结合的DNA杂交，并在68℃下在0.1xSSC/0.1％SDS中洗涤。(Ausubel FM等人编辑,2003,Current Protocol in Molecular Biology,Vol.I,Green Publishing Associates,Inc.,和John Wiley&sons,Inc.,New York,atp.2.20.3)。
与上述公开的任何序列具有至少80％同一性的核苷酸序列仍在本发明的范围内，条件是编码的抗体保持其结合特异性。
特别地，编码与序列SEQ ID NO：18-22具有至少80％同一性的可变重链的核苷酸序列和编码与SEQ ID NO：23-26序列具有至少80％同一性的可变轻链的核苷酸序列仍在本发明的范围内。至少80％的同一性是指核苷酸同一性百分比被包含在80％至100％之间，优选90％，95％或99％。
本发明的核酸分子可以位于载体上，该载体可以另外包含复制起点和/或选择标志基因。载体的例子是例如质粒，粘粒，噬菌体，病毒等。因此，本发明的另一实施方案是包含本文公开的核酸序列的载体。优选地，载体是表达载体。
所述载体可以是例如噬菌体，质粒，病毒或逆转录病毒载体。
逆转录病毒载体可能具有复制能力或复制缺陷。在后一种情况下，病毒繁殖通常只会在互补的宿主/细胞中发生。
本发明的核酸分子可以与包含用于在宿主中繁殖的选择标志物的载体连接。通常，将质粒载体引入沉淀物中，例如磷酸钙沉淀或氯化铷沉淀中，或具有带电荷脂质的复合物中，或引入基于碳的原子簇(例如富勒烯)中。如果载体是病毒，则可以在应用到宿主细胞之前使用适当的包装细胞系对其进行体外包装。
优选地，本发明的载体是表达载体，其中核酸分子可操作地连接至一或多个控制序列，从而允许在原核和/或真核宿主细胞中转录和任选地表达。所述核酸分子的表达包括核酸分子的转录，优选转录成可翻译的mRNA。确保在真核细胞，优选哺乳动物细胞中表达的调节元件是本领域技术人员众所周知的。它们通常包含确保转录起始的调节序列和确保转录终止和转录稳定的任选的多聚腺苷酸信号。其他调节元件可包括转录增强子和翻译增强子。允许在原核宿主细胞中表达的可能的调控元件包括，例如大肠杆菌中的lac，trp或tac启动子，以及允许在真核宿主细胞中表达的调控元件的例子是酵母中的AOXI或GAL-1启动子或在哺乳动物和其他动物细胞中的CMV(巨细胞病毒)-，SV40(猿猴病毒40)-，RSV-启动子(劳斯肉瘤病毒)，CMV-增强子，SV40-增强子或球蛋白内含子。除了负责转录起始的元件外，此类调节元件还可在多核苷酸下游包含转录终止信号，例如SV40-多聚腺苷酸位点或tk-多聚腺苷酸位点。在这种情况下，合适的表达载体是本领域已知的，例如Okayama-Berg cDNA表达载体pcDV1(Pharmacia)，pCDM8，pRc/CMV，pcDNAI，pcDNA3或pSPORTI(Thermo FisherScientific)。优选地，所述载体是表达载体和/或基因转移或靶向载体。衍生自病毒例如逆转录病毒、牛痘病毒、腺相关病毒、疱疹病毒或牛乳头瘤病毒的表达载体可用于将本发明的多核苷酸或载体递送至靶细胞群。可以使用本领域技术人员众所周知的方法来构建重组病毒载体；参见，例如，描述于Sambrook,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory Press(2001,3<rd>edition),N.Y.和Ausubel,CurrentProtocols in Molecular Biology,Green Publishing Associates and WileyInterscience,N.Y.(1994)中的技术。替代性地，可以将本发明的核酸分子重构入脂质体，以递送至靶细胞。此外，本发明涉及包含如上所述的核酸分子或载体的宿主。可以根据本领域已知的任何方法通过转化，转染或转导将核酸分子或载体引入宿主。
所述宿主可以是原核或真核细胞或非人转基因动物。存在于宿主中的本发明的多核苷酸或载体可以整合到宿主的基因组中，或者可以保持在染色体外。在这方面，还应理解，本发明的核酸分子可用于“基因靶向”和/或“基因替代”，用于恢复突变基因或用于通过同源重组产生突变基因；参见例如，Mouellic,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87(1990),4712-4716；Joyner,Gene Targeting,A Practical Approach,Oxford University Press。
宿主可以是任何原核或真核细胞，例如细菌，昆虫，真菌，植物，动物，哺乳动物或优选人细胞。优选的真菌细胞是，例如，酵母属的那些细胞，特别是酿酒酵母(S.cerevisiae)种的那些细胞。术语“原核的”是指包括可以用多核苷酸转化或转染以表达本发明的变体多肽的所有细菌。原核宿主可以包括革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌，例如大肠杆菌，鼠伤寒沙门氏菌，粘质沙雷氏菌和枯草芽孢杆菌。可以使用本领域普通技术人员通常已知的任何技术，将编码本发明变体多肽的突变形式的多核苷酸用于转化或转染宿主。制备融合的可操作连接的基因并在细菌或动物细胞中表达它们的方法是本领域众所周知的(Sambrook,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press(2001,第3版)))。本文所述的遗传构建体和方法可用于在例如原核宿主中表达本发明的变体抗体、抗体片段或其衍生物。通常，将含有促进启动子序列的表达载体与宿主结合使用，所述启动子序列促进插入的核酸分子的有效转录。表达载体通常包含复制起点，启动子和终止子以及能够提供转化细胞表型选择的特定基因。转化的原核宿主可以在发酵罐中生长并根据本领域已知的技术培养以实现最佳的细胞生长。然后可以从生长培养基，细胞裂解物或细胞膜流分(fraction)中分离出本发明的抗体，抗体片段或其衍生物。本发明的微生物或其他方式表达的抗体、抗体片段或其衍生物的分离和纯化可以通过任何常规手段进行，例如制备色谱分离和免疫学分离，例如涉及使用单克隆或多克隆抗体的那些方法。
根据本发明的一实施方案，宿主是人，细菌，动物，真菌，两栖动物或植物细胞。优选的动物细胞包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，幼仓鼠肾(BHK)细胞，猴肾细胞(COS)，小鼠胚胎成纤维细胞(NIH-3T3)和许多其他细胞系，包括人细胞。
在另一优选的实施方案中，所述动物细胞是昆虫细胞。优选的昆虫细胞包括但不限于来自SF9细胞系的细胞。
优选地，细胞是哺乳动物细胞，例如仓鼠，兔或人细胞。最优选地，细胞是人细胞。所述人细胞包括但不限于人胚胎肾细胞(HEK293、293T，293freestyle)。此外，所述人细胞系包括但不限于HeLa细胞，人肝细胞癌细胞(例如HEPG2，Huh-7)，A549细胞。根据另一实施方案，本发明的宿主是非人转基因动物。本发明提供了包含一种或多种本发明的核酸分子的转基因非人类动物，其可以用于产生本发明的抗体。可以从组织或体液(例如山羊，牛，马，猪，大鼠，小鼠，兔，仓鼠或其他哺乳动物的奶，血液或尿液)或者于其中产生抗体并从中回收抗体。参见例如美国专利No.5,827,690；5,756,687；5,750,172；和5,741,957。如上所述，包含人免疫球蛋白基因座的非人转基因动物可以通过用FGFR4或其一部分进行免疫来产生。本发明的抗体可以通过方法来制备，其中所述抗体从如上所述的宿主获得。因此，本发明的另一实施方案是一种制备抗体的方法，该方法包括在允许合成所述抗体并从所述培养物中回收所述抗体的条件下培养本发明的宿主。
转化的宿主可以在发酵罐中生长并根据本领域已知的技术培养以实现最佳的细胞生长。一旦表达，完整的抗体，其二聚体，单个轻链和重链或本发明的其他免疫球蛋白形式就可以根据本领域的标准程序(包括硫酸铵沉淀，亲和柱，柱层析，凝胶电泳等)进行纯化；参见Scopes,"Protein Purification",Springer-Verlag,N.Y.(1982)。然后可以从生长培养基，细胞裂解物或细胞膜流分中分离出本发明的抗体或其相应的免疫球蛋白链。分离和纯化例如本发明的微生物表达的抗体或免疫球蛋白链可以通过任何常规方式进行，例如制备性色谱分离和免疫学分离，例如涉及使用针对例如本发明抗体的恒定区的单克隆抗体或多克隆抗体的那些分离方法。对于本领域技术人员而言显而易见的是，本发明的抗体可以进一步偶联至其他部分，例如药物靶向和成像应用。这样的偶联可以在抗体或抗原表达到附着侧之后化学地进行，或者偶联产物可以在DNA水平上被工程改造成本发明的抗体或抗原。然后在合适的宿主系统中表达DNA，必要时收集表达的蛋白质并进行复性。
根据一实施方案，如上所述的重组细胞在允许表达编码抗体的核酸分子的条件下培养。可以从培养细胞或培养上清液中收集抗体。优选地，抗体是从哺乳动物，特别是从人细胞制备的。
药物组合物和药物治疗
本发明的另一方面涉及药物组合物，其包含如上所述的抗体，偶联物，融合蛋白，核酸分子，载体或宿主，以及任选地可药用载体。
术语“载体”包括试剂，例如稀释剂，稳定剂，佐剂或其他类型的辅料，它们在所采用的剂量和浓度下对待暴露于其的细胞或哺乳动物是无毒的。药学上可接受的载体的实例是本领域众所周知的，包括磷酸盐缓冲盐溶液，水，乳剂如油/水乳剂，各种类型的润湿剂，无菌溶液等。通常，药学上可接受的载体是pH缓冲水溶液，其可用于药物递送，特别是用于抗体分子的递送。可以通过众所周知的常规方法来配制药物组合物，即通过将活性剂与载体和通常掺入制剂中的任选的其他试剂混合。例如，可以将组合物以冻干制剂，水溶液，分散体或固体制剂的形式配制。合适的组合物的施用可以通过不同的方式来实现，例如通过静脉内，腹膜内，皮下，肌内，局部，皮内，鼻内或支气管内给药。本发明的组合物也可以直接施用于靶部位，例如，通过生物射弹式递送(biolistic delivery)到外部或内部目标部位(例如大脑)。剂量方案将由主治医师和临床因素决定。
本发明还包括将药物组合物给予有需要的受试者，特别是患有与FGFR4表达，过表达和/或过度活跃有关的病症的人类患者。
如医学领域所公知的，任何一位患者的剂量取决于许多因素，包括患者的体型，体表和面积，年龄，待给药的特定化合物，性别，给药时间和途径，总体健康状况和同时服用的其他药物。取决于待治疗的病症的类型和严重性，可以将约1pg/kg至15mg/kg的活性成分施用于需要其的患者，例如通过一次或多次单独给药或通过连续输注。取决于上述因素，典型的日剂量可在约1pg/kg至约100mg/kg的范围内。对于几天或更长时间的重复给药，根据要治疗的病症，持续治疗直到发生所需的疾病或症状抑制。可以通过任何合适的途径来施用组合物，例如通过肠胃外，皮下，鼻内，血管内，静脉内，动脉内或鞘内注射或输注。可以通过定期评估来监控进展。
本发明的组合物可以局部或全身给药。肠胃外给药的制剂包括无菌水溶液或非水溶液，悬浮液和乳剂。非水溶剂的实例是丙烯，乙二醇，聚乙二醇，植物油(例如橄榄油)和可注射的有机酯(例如油酸乙酯)。水性载体包括水，醇/水溶液，乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。亲本载体包括氯化钠溶液，林格氏葡萄糖，葡萄糖和氯化钠，乳酸林格氏油或不挥发性油。静脉内载体包括液体和营养补充剂，电解质补充剂(例如基于林格氏葡萄糖的那些补充剂)等。也可以存在防腐剂和其他添加剂，例如抗微生物剂，抗氧化剂，螯合剂和惰性气体等。
本发明的活性剂可以与其他活性剂一起给药。额外的活性剂可以单独施用或作为本发明药物组合物的一部分施用。
根据本发明的一优选实施方案，本发明的药物组合物可以包含其他试剂，这取决于药物组合物的预期用途。
特别优选的是，药物组合物还包含其他活性剂，例如其他抗赘生物药，小分子抑制剂，抗肿瘤药或化学治疗药。本发明还涉及包含本发明的抗体与至少一种其他抗赘生物剂组合的药物组合物。这种组合在例如抑制异常细胞生长方面是有效的。
目前许多抗赘生物剂是本领域已知的。在一实施方案中，抗赘生物剂选自治疗性蛋白的组，治疗性蛋白包括但不限于抗体或免疫调节蛋白。
在另一实施方案中，抗赘生物剂选自小分子抑制剂或化学治疗剂，其包括有丝分裂抑制剂，激酶抑制剂，烷基化剂，抗代谢物，嵌入性抗生素(intercalating antibodies)，生长因子抑制剂，细胞周期抑制剂，酶，拓扑异构酶抑制剂，组蛋白脱乙酰酶抑制剂，抗存活剂，生物反应调节剂，抗激素(例如抗雄激素)和抗血管生成剂。
当然，上述另外的活性剂不仅可以与本发明的抗体一起在共同药物组合物中一起给药，而且它们也可以分开给药。
一旦配制，本发明的组合物可以直接施用于受试者。待治疗的受试者可以是动物；特别地，可以治疗人类受试者。
本发明的药物可以通过任意数量的途径施用，包括但不限于口服，静脉内，肌内，动脉内，髓内，鞘内，心室内，透皮或经皮施用，皮下，腹膜内，鼻内，肠内，局部，舌下，阴道内或直肠方式。
所有这些方法和制剂都是常规的并且在本领域中是众所周知的，不需要进一步的解释。
在又一实施方案中，本发明涉及一种诊断方法，其包括确定患者组织或患者样品中FGFR4的量和/或定位。在该实施方案中，特别优选使用如上所述的带有标记基团的抗体。将患者组织或患者样品获得的结果与参考数据进行比较，可以诊断与FGFR4表达，过表达和/或过度活跃有关的疾病。本发明的诊断方法可用于检测人FGFR4在不同细胞，组织或其他合适样品中的不希望的表达，过表达或过度活跃。因此，可以评估与FGFR4表达，过表达和/或过度活跃有关的疾病的发作或疾病状态。本发明的诊断方法还可包括基于获得的结果为患者建立治疗方案的步骤。
在另一实施方案中，本发明涉及评估表达FGFR4的细胞的存在的方法，该方法包括使本发明的抗体与怀疑在其表面上携带FGFR4的细胞或组织接触。用于检测样品中FGFR4表达的合适方法可以是酶联免疫吸附测定(ELISA)或免疫组织化学(IHC)。ELISA测定可以以微量滴定板的形式进行，其中例如用抗FGFR4抗体吸附微量滴定板的孔。冲洗孔并用封闭剂(例如乳蛋白或白蛋白)处理，以防止分析物非特异性吸附。随后，用测试样品处理孔。冲洗掉测试样品或标准品后，该孔用(例如通过与生物素结合)标记的第二抗FGFR4抗体处理。洗去多余的二抗后，检测标记，例如使用与抗生物素蛋白结合的辣根过氧化物酶(HRP)和合适的生色底物检测。通过与从标准样品产生的标准曲线比较来确定测试样品中FGFR4抗原的浓度。对于IHC，可以使用石蜡包埋的组织，其中所述组织例如首先在二甲苯中脱蜡，然后脱水(例如用乙醇)，并用蒸馏水冲洗。被福尔马林固定和石蜡包埋掩蔽的抗原表位可通过表位去掩蔽，酶消化或皂苷暴露。为了表位去掩蔽，可将石蜡切片在蒸煮器，水浴或微波炉中、在表位恢复溶液(例如2N HCL溶液(pH 1.0))中加热20-40分钟。在酶消化的情况下，组织切片可以在37℃下于不同的酶溶液(如蛋白酶K，胰蛋白酶，链霉蛋白酶，胃蛋白酶等)中孵育1030分钟。冲洗掉表位恢复溶液或多余的酶后，组织切片用封闭缓冲液处理，以防止非特异性的相互作用。以适当的浓度添加抗FGFR4一抗。冲洗掉多余的一抗并将切片在过氧化物酶封闭溶液中于室温孵育10分钟。在另一个洗涤步骤之后，将组织切片与第二标记的抗体(例如用有可能充当酶锚定物的基团标记的抗体)一起孵育。因此，实例是被链霉亲和素偶联的辣根过氧化物酶识别的生物素标记的第二抗体。抗体/酶复合物的检测是通过与合适的生色底物孵育来实现的。
在另一实施方案中，本发明涉及阻断FGFR4功能的方法，该方法包括在各条件下使本发明的抗体与怀疑在其表面上携带FGFR4的细胞或组织接触，其中所述抗体能够阻断FGFR4功能。接触可以是在体外或体内的。
此外，本发明涉及用于诊断或治疗与FGFR4表达，过度表达和/或过度活跃有关的疾病的试剂盒。本发明的试剂盒包含至少一种如上所述的抗体，核酸分子和/或载体。另外，试剂盒可进一步包含至少一种其他活性剂或其他组分。特别优选的是，试剂盒还包含一种或多种其他可用于癌症联合治疗的治疗剂，例如其他抗赘生物药，小分子抑制剂，抗肿瘤药或化学治疗药。目前许多抗赘生物剂是本领域已知的。在一实施方案中，抗赘生物剂选自治疗性蛋白，该治疗性蛋白包括但不限于抗体或免疫调节蛋白。在另一实施方案中，抗赘生物剂选自小分子抑制剂或化学治疗剂，其包括有丝分裂抑制剂，激酶抑制剂例如酪氨酸激酶抑制剂，烷化剂，抗代谢物，嵌入性抗生素，生长因子抑制剂，细胞周期抑制剂，酶，拓扑异构酶抑制剂，组蛋白脱乙酰基酶抑制剂，抗存活剂，生物反应调节剂，抗激素(例如抗雄激素)和抗血管生成剂。
本发明的诊断试剂盒优选包含如上所述的标记抗体。此外，诊断试剂盒可包含关于在相同类型的组织或样品中FGFR4的量和/或定位的参考数据。参考数据可以从一或多个健康受试者和/或从一或多个患有已知疾病状态的受试者获得。与所述参考数据的比较允许诊断与FGFR4表达，过表达和/或过度活跃有关的疾病。基于获得的结果，可以建立针对患者的治疗方案。
本发明的另一个目的是本发明的抗体，其用于预防和/或治疗与FGFR4表达，过度表达和/或过度活跃有关的疾病的用途。
根据本发明，与FGFR4表达，过度表达和/或过度活跃有关的疾病是例如过度增殖性疾病，例如癌症。可以根据本发明诊断，预防和/或治疗的癌症可以选自肝细胞癌，乳腺癌，胃癌，结肠癌，横纹肌肉瘤，结直肠癌，前列腺癌，乳腺癌，垂体癌，卵巢癌，软组织肉瘤，黑色素瘤，头颈部鳞状癌和肺腺癌以及其他表达或过度表达FGFR4的癌症，以及肿瘤转移的形成。
技术人员可以根据本领域的常识容易地确定疾病是否与FGFR4表达，过表达或过度活跃有关。
例如，可以参考背景介绍部分中提到的参考文献(例如Lin&Desnoyers,2012；Wu&Li,2012；Katoh&Nakagama,2014；Crose等人,2012；Li等人，2014；Sahadevan等人,2007；André&Cortés,2015；Abbass等人,1997；Huang等人,2015；Chen H等人,2015；Zaid等人,2013)。
根据本发明的一特定实施方案，本文公开的抗体用于治疗结肠癌，特别是用于杀死或实质上影响结肠癌干细胞的生长和/或分化。
根据本发明的另一特定实施方案，本文公开的抗体用于治疗肝癌。
在一特定的实施方案中，本发明的抗体用于结肠癌，特别是用于特异性靶向结肠癌干细胞。
在一优选的实施方案中，本发明的抗体用于检测和/或杀死和/或影响和/或抑制结肠癌干细胞的发育和/或分化。
根据另一实施方案，与FGFR4表达，过度表达和/或过度活跃有关的疾病是代谢疾病，特别是代谢综合征或肥胖症。
根据本发明的又一实施方案，与FGFR4表达，过度表达和/或过度活跃有关的疾病是心室肥大，心脏肥大或慢性肾脏疾病。
慢性肾脏疾病(CKD)增加了过早死亡的风险，并且心血管疾病是CKD所有阶段的主要原因(Go等人，N.Engl.J.Med.,351(13):1296-1305,2004)。左心室肥大(LVH)是CKD中心血管疾病的重要机制，可导致舒张功能障碍，充血性心力衰竭，心律不齐和猝死。由于其在LVH中的作用，已知抑制FGFR4有利于预防心血管疾病(参见例如US20160039936和其中引用的参考文献)。
因此，对受试者中的心血管疾病(例如原发性心脏病，继发性心脏病，心脏肥大，心力衰竭，左心室肥大)，CKD，糖尿病，肥胖症的治疗或预防也在本发明范围内，所述治疗或预防包含使用本发明的抗体抑制FGFR4活化，特别是在心脏细胞(例如，心肌细胞，成纤维细胞，内皮细胞，平滑肌细胞)中抑制FGFR4活化。在特定的实施方案中，心血管疾病是高血压，充血性心力衰竭，左心室肥大，尿毒症性心肌病，糖尿病性心肌病或原发性心肌病。
下列实施例进一步说明本发明。
实施例
实施例1
在结肠癌干细胞中选择性表达的膜蛋白编码基因的生物信息学鉴定
为了鉴定新的结肠癌干细胞(CSC)膜抗原，通过挖掘(mining)专有的CSC特有的Affymetrix微阵列并交叉查询可用的公共表达数据库进行了计算分析。
该分析利用了全基因组基因表达数据库(Affymetrix微阵列，Human Gene 1.0ST平台)的可用性，包括从八种从原发性肿瘤样品和转移物中分离出的结肠CSC细胞系获得的数据，这些细胞在补充有EGF和bFGF的限定的无血清培养基中以球体形式繁殖，或在10％血清存在下体外分化的培养基(Ricci-Vitiani等人，2007)。该数据集包含针对26917个不同人类基因的独特探针集。
为了定义潜在靶基因的列表，采用了以下总体工作流程。使用参考结肠CSC数据集，使用Bioconductor RankProd算法(Hong等人，2006和2008)在未分化结肠CSC中相对于其体外分化对应物生成了差异上调的第一基因列表(1325)；仅包括具有统计学显著性的差异表达(p值≤0.1)的基因。然后根据两个不同的来源(http://www.uniprot.org/和
Figure BDA0002385150140000601
Almén等人,2009)，将目标基因列表缩减为250个条目，这些条目被标注为编码潜在跨膜蛋白或糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定蛋白的基因。在该基因列表中，很明显未分化细胞样品中的上调水平通常较低，并且通常<2，该值被认为是在生物竞争中被认为上调的基因的最低限度。因此，作为另一种优先处理策略，将未分化的结肠CSC样品与结肠正常组织样品，结肠肿瘤组织样品和商业肿瘤细胞系样品进行比较，以此作为针对CSC特异性的进一步选择标准。
搜索公共基因表达数据存储库(NCBI GEO和EBI ArrayExpress)以查找包含人类结肠组织样本(正常或肿瘤)的数据集或市售结肠癌细胞系的数据。对发现的数据集的初步检查显示，它们中很少有基于相同的微阵列平台(Human Gene ST 1.0)或密切相关的平台Human Exon ST 1.0。特别是，包含正常或肿瘤结肠样本的大多数数据集均基于Affymetrix平台U133plus 2.0。因此，有必要也包括U133 plus 2.0平台数据作为与结肠CSC比较的基础。对于用于生成可用数据的肿瘤样品(如果可用)的确切解剖位置，未进行任何亚选择。对于肿瘤类别，仅接受癌样品，但不包括所有可识别的腺瘤样品或其他明显不同的样品，例如炎症性肠病患者的样本(表4)。
表4.此分析中包括的公共NCBI GEO数据库中的数据集
Figure BDA0002385150140000621
总体而言，全局数据集总共包括200个正常样品(其中20个是通过激光捕获显微切割(LCM)获得的)，分别来自16个不同数据集的1100个肿瘤样品(其中87个是通过LCM获得的)，和来自8个不同数据集的145个结肠肿瘤细胞系样品(74个独特的细胞系)。此外，还包括含有人正常和肿瘤干细胞样品的6个其他数据集。只有两个数据集具有与参考结肠CSC数据集相同的微阵列架构(HuGene ST 1.0)，所有其他数据集均基于Affymetrix U133 plus2.0平台。可从NCBI网站“Gene Expression Omnibus”(GEO)()下载所有数据集的原始表达数据文件，并使用R Bioconductor程序套件(Gentleman等人,2004；http://www.bioconductor.org/；http://www.r-project.org/)中可获得的方法，通过标准“Robust Multi-array Average”(RMA)程序进行处理。
为了纠正由于使用两种不同的微阵列(microarray)平台而产生的技术影响，应用了以下策略。最初使用ComBat算法(Johnson&Rabinovic,2007)对正常和肿瘤结肠数据集中的数据进行预处理，以纠正明显的批次效应。将相同的程序应用于结肠肿瘤细胞系数据集。然后，将第二个ComBat校正应用于整个组合数据集，然后消除由于两种不同的微阵列架构而引起的偏差。
由于正常结肠和肿瘤结肠数据集中存在大量样本，因此在预处理过程中采用了选择程序，从而减少了总数据量并使正常结肠和肿瘤结肠样本的数量大致相等。根据样本之间的平均中值距离，选择程序成功删除了距离样本簇中心(正常或肿瘤)最远的样本，直到达到所需的剩余样本数。应用该程序，进一步选择(sub-selected)了105个正常样品和176个肿瘤样品。等效程序将数据集GSE18105中的LCM样本数量从77个减少到19个。相反，没有选择应用于数据集GSE20916中的LCM样本。
ComBat算法也应用于结肠肿瘤细胞系数据，以消除批次效应(未显示)。
然后将这些经过批处理校正的子数据集与还添加了其他6个与干细胞相关的数据集的参考结肠CSC数据集(仅未分化的样本)组合。特别是，必须添加数据集GSE33112(结肠CSC培养样品)，因为它提供了使用Affymetrix U133 plus 2.0平台测量的样品，并且与参考CSC样品密切相关。这允许将ComBat应用作为最终的全局扩展步骤，以纠正两个Affymetrix平台(HuGene ST 1.0和U133 plus 2.0)之间特定于架构(architecture-specific)的差异。在应用ComBat校正之前，全局数据集显示了特定于微阵列平台的样本聚类的清晰模式。经过ComBat校正后，结肠CSC样品现在聚集在接近GSE33112的等效样品的位置，从而大大降低了这种效应。
然后，在全局数据集中，将未分化的CSC样本使用RankProd算法与不同子集进行比较：宏观解剖的结肠正常和肿瘤数据集，显微解剖的结肠正常和肿瘤数据集，以及结肠肿瘤细胞系数据集。结肠CSC样本与每个数据集之间的平均倍数变化(FC)差异是通过RankProd在p值截止值为0.05时计算的。没有将FC值分配给高于此p值截止值的探针集/基因。
然后进一步减少潜在靶基因的数量，只接受观察到与正常结肠数据集阳性FC差异的基因。然后详细检查得到的104个基因的列表(膜定位预测和文献数据)，以确认或拒绝其作为跨膜或GPI锚定质膜蛋白的状态，从而将选择限制于57个基因。然后，根据以下标准对这些潜在目标进行了单独分析并确定了优先级：(i)对于结肠肿瘤组织和细胞系(p≤0.05)，FC差异≥2；(ii)通过与从“BioGPS”(http://biogps.org/)和“Body Atlas”数据集GSE14938(位于NCBI GEO存储库中(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi？acc＝GSE14938))中提取的数据相比，在重要器官的正常组织中缺乏表达/表达不足，与预期相应抗体的潜在毒性有关；(iii)对于每种基因产物，均缺失通过可变剪接或脱落产生的可溶性蛋白变体以及短的细胞外结构域；(iv)基于两种在线资源(http://www.uniprot.org/,http://www.genecards.org/,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)和科学出版物的每种基因产物的生物学功能，相关的信号传导途径，蛋白质相互作用网络以及在不同肿瘤类型中的表达和作用。许多其他的免疫学标准导致了反筛选基因(counterscreen genes)，这些基因编码的蛋白质类似于免疫原性差的蛋白质，或者异位表达低，或者与人类旁系同源物和鼠直系同源物太相似，因此产生了21个候选基因的受限列表。
实施例2
确认结肠CSC中所选基因表达的特异性
已经通过qRT-PCR确认并定量了21种选择基因的差异表达。用于生成微阵列数据的八种不同的结肠CSC细胞系在补充有EGF和bFGF的限定的无血清的培养基中以球体形式繁殖。为了进行比较，按照ATCC的推荐规范，培养了11种不同的商业结肠肿瘤细胞系(ATCC)，这些细胞系选自生物信息学分析所用数据集中包含的那些(表5)。
表5.通过qRT-PCR分析的结肠肿瘤细胞系。
Figure BDA0002385150140000651
按照制造商的推荐规范，使用RNAeasy mini试剂盒(Qiagen)制备总RNA。将RNA样品收集在不含RNase的水中，使用Eppendorf BioPhotometer通过测量260nm处的吸光度进行定量，并使用Agilent 2100生物分析仪进行定性控制。通过定量逆转录PCR(qRT-PCR)比较未分化的CSC和结肠肿瘤细胞系中每个选定基因的mRNA水平。此外，已将结肠CSC中21个选定基因的表达与通过qRT-PCR在人类正常结肠组织的RNA样品(FirstChoice HumanColon Total RNA,Life Technologies)中测得的表达进行了比较。
还包括两种结肠CSC特异性标志物OLFM-4和Lgr5(van der Flier等人,2009；Barker等人，2007)作为阳性对照。已将其表达在被分析的细胞系(Affymetrix数据集)中没有显著变化的两个基因包括作为归一化因子(normalizer)，所述两个基因分别编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)和异质性胞核核糖核蛋白K(HNRNPK)。使用基因特异性探针和引物在MicroAmp 96孔板中一式三份进行测定(
Figure BDA0002385150140000652
Gene Expression Assays，Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific)：将40μL反应混合物分配到每个孔中，每孔含25μL 2X Master Mix/0.5μL的100X RT(Qiagen)、2.5μL的每个TaqMan Assay和12μL的H2O。然后添加10μL的浓度为5ng/μL的总RNA，最终反应体积为50μL，并使用Perkin ElmerABI 7900HT实时热循环仪进行qRT-PCR(50℃ 30分钟,95℃ 10分钟,然后进行40个循环:95℃ 15秒,60℃ 1分钟)。使用2^(-△△c-t)方法进行定量计算。
根据其预测的免疫原性，将经qRT-PCR验证的前八个基因(相对于正常结肠CSC选择性≥3倍，和至少3个独立的CSC系中的至少4个不同的肿瘤细胞系)减少至五个(表6)。
表6.选择用于基因免疫的结肠癌干细胞候选抗原。
Figure BDA0002385150140000661
完整的选择过程如图1所示。
为了在蛋白质水平上确认五个选定基因在结肠CSC中的优先表达，已经进行了另外的实验。
已经从表达每个基因的高mRNA水平的结肠CSC系和表达同一基因的低mRNA水平的ATCC结肠肿瘤细胞系制备了总蛋白提取物。另外，从人正常结肠粘膜制备蛋白质提取物。然后通过SDS-PAGE和蛋白质印迹法分析样品(图2)。该分析还在蛋白质水平上证实了在已基于其差异mRNA表达水平选择的五个基因的CSC中的优先表达。
实施例3
抗结肠CSC膜抗原的单克隆抗体的产生
通过使用Aldevron/GENOVAC核心技术平台对大鼠进行基因免疫，已经产生了针对五种选定抗原的单克隆抗体(mAb)，该平台能够使用相应的DNA编码序列直接开发针对蛋白质靶标的抗体(http://www.aldevron.com/services/antibody-development/genetic-immunization,参见例如以下文献:Bioprocessing-Genetic Immunization for AntibodyProduction.Tutorial:Genovac's Technological Shortcut From Gene to Antibody.ByJohn Thompson,Ph.D.,和Stefan Lang,Ph.D.,发表于Genetic Engineering News,Vol.22,No.17,October 1,2002；Custom-made antibodies produced by geneticimmunisation:Applications in drug development,therapy and diagnosis.By StefanLang和John Thompson,发表于Global Outsourcing Review,Vol.5,No.1,Spring 2003；Ashortcut from genomics to drug development.By Jens Lohrmann,Stefan Lang和JohnThompson,发表于Current Drug Discovery,October 2003)。相对于常规免疫技术，基因免疫具有多个优势，特别是因为适当折叠和糖基化抗原或特定抗原结构域的表达增加了产生以高亲和力识别天然表位并且具有更高的功能活性倾向的mAb的可能性。
已将靶cDNA序列克隆到Aldevron(Freiburg,德国)专有的免疫载体(pB8-HA)和检测载体(pB1-myc)中，所述载体经过工程设计以确保相应的蛋白在细胞表面的异位表达，其在框架中分别带有血凝素(HA)标签和myc标签。对于FGFR4，IL17RB和RGMB，构建体包含全长序列，而对于EDAR和OR51E1，则插入了不同的细胞外域。
将HEK293衍生的BOSC23细胞与选定的抗原表达载体(pB8-HA或pB1-myc衍生物)和作为内部阴性对照的相应的(reciprocal)空载体进行瞬时共转染。使用抗HA抗体和抗myc抗体进行的FACS分析证实了所有五个抗原均具有明显且特异性的质膜表达。
通过对吸附在金颗粒上的相应DNA进行4-6次遗传应用，并通过皮内给药直接递送到活体动物的细胞中，用免疫载体pB8-FGFR4，pB8-IL17RB，pB8-RGMB，pB8-EDAR-h-ecdpB8-EDAR-h-ecd+TM或pB8-OR51E1-h-syn对大鼠进行免疫。为了控制该程序是否引发了免疫反应，在免疫后24-60天收集大鼠血清，在PBS/1％BSA中以1：1000稀释，并使用瞬时转染了克隆入pB1-myc检测载体中的相应抗原cDNA的BOSC23细胞通过FACS进行检测。以10μg/mL的山羊抗大鼠IgG R-藻红蛋白偶联物(Southern Biotech)作为二抗使用。作为阴性对照，BOSC23细胞用克隆入相同表达载体中的无关cDNA转染，与每只动物的免疫血清孵育，并进行FACS分析。另外，使用抗-myc一抗和10μg/mL山羊抗小鼠IgG R-藻红蛋白偶联物(Southern Biotech)作为二抗，通过FACS控制检测载体pB1-FGFR4,pB1-IL17RB,pB1-RGMB,pB1-EDAR-h-ecd pB1-EDAR-h-ecd+TM或pB1-OR51E1-h-syn的细胞表面表达。
与用不相关的cDNA转染的细胞相比，可以检测所有接受不同抗原免疫的大鼠队列的免疫血清对在其表面表达相应抗原的细胞的特异性反应性。在平行实验中证实了不同抗原的质膜表达(数据未显示)。
下一步包括从大鼠中分离出对每种抗原具有免疫应答的脾脏B细胞，并将它们与合适的骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤。在选择杂交瘤细胞并进行克隆扩增后，通过以下鉴定出具有适当特异性的生产的抗体：通过流式细胞术评估相应上清液对瞬时转染了pB1-抗原编码构建体的报告细胞系BOSC 23表面上异位表达的它们的抗原的免疫反应性(表7)。
表7.与取自用表达不同抗原的pB8免疫载体免疫的大鼠的淋巴细胞融合的产量。
Figure BDA0002385150140000681
从分离的杂交瘤稳定的亲本克隆中，获得上清液(14-24/靶，表7的最后一栏)，其包含根据FACS分析产生阳性和抗原特异性的抗体。
实施例4
通过流式细胞术评估相应的上清液对结肠CSC内源性抗原的免疫反应性来选择杂交瘤亲本克隆
通过FACS在五种不同细胞系上评估其免疫反应性，分析了针对这五种抗原的阳性上清液结合结肠CSC表面的能力。对应转录本低表达的商业结肠肿瘤细胞系已作为每种抗原的阴性对照包括在内。该测定法在96孔微孔板中进行，每孔3×104细胞，每孔加入50μL细胞培养基和100μL测试上清液。包括在杂交瘤中使用的鼠骨髓瘤细胞的条件培养基(DMEM/10％FBS)作为阴性对照。在4℃下放置1h后，加入抗大鼠荧光二抗(Alexa FluorR 647山羊抗大鼠IgG[H+L]，Thermo Fisher Scientific)，并将细胞用5μg/mL的7-氨基放线菌素D(7-AAD)处理以控制细胞活力。也包括仅与二抗一起孵育的样品作为额外的阴性对照。使用细胞荧光计FACS LSR II(Becton Dickinson)进行了流式细胞仪评估。
在大多数情况下，已在蛋白质水平上证实了结肠CSC与商业结肠肿瘤细胞系之间所选抗原mRNA表达的差异。
对于通过FACS分析的五个结肠CSC系中的每一个(Signore等人，2016)，活细胞的平均荧光强度(MFI)被用作评估参数。对于每个上清液，该值除以阴性对照的MFI，从而获得相对于对照的倍数变化(FC)值。对于每个CSC系，根据其FC值对上清液进行分等级，将最高分分配给具有最高反应性的上清液。通过将分配给每个CSC系上每个上清液的各个等级相加，可以获得最终等级(图3)。
在此基础上，对表现最佳的上清液进行优先排序(5-12/抗原，图3)，在蛋白G-Sepharose上亲和纯化，并在五个结肠CSC系的细胞活力测定中进行分析。
为了进行亲和纯化，将5mL每种上清液在室温(RT)中与0.5mL蛋白质G-Sepharose树脂(GammaBind Plus Protein G Sepharose,GE)在0.1M磷酸钠pH 7.0、1.5M NaCl、0.1MEDTA(1X BB)中一起孵育。结合步骤后，将样品转移至空色谱柱(
Figure BDA0002385150140000691
柱，Bio-Rad)中，使树脂通过重力沉降并用20体积的1X BB洗涤。在两个步骤中，每个用1mL 0.1M甘氨酸HCl(pH 2.3)洗脱结合抗体，收集在含有100μL 1M Tris pH 9的试管中以进行pH中和。然后对纯化的mAb进行定量，并通过SDS-PAGE控制。
对于每种抗体，在用2至4个结肠CSC进行的细胞活力测定中评估纯化的mAb。简而言之，在细胞球体的酶促分解后，将4000个活的单细胞一式三份接种在96孔微孔板的每个孔中的100μL培养基中。在37℃、5％CO2下孵育24小时后，加入10μL每种抗体溶液或10μL在Tris-甘氨酸pH 7中的1：5-1:10稀释液。包括10μL在Tris-甘氨酸pH 7中的30μg/mL的大鼠IgG溶液作为阴性对照。在37℃，5％CO2下与抗体孵育96h后，按照制造商的建议，使用化学发光的CellTiter-GloTM(Promega)试剂测量细胞活力。使用酶标仪Beckman Coulter DTX880Multidetector测量与细胞ATP含量成正比并因此与细胞活力成正比的发光强度。
2至8个抗体/抗原显示出抗增殖/细胞毒性活性，选择了最有效的抗体进行相应杂交瘤的亚克隆(最多4个亚克隆/抗原)。
实施例5
从选定的杂交瘤细胞亚克隆获得的上清液中纯化的抗体的表征
产生了针对每种抗原的最佳特异性抗体的四种亲本杂交瘤已被亚克隆，以维持细胞系的稳定性和单克隆特性。
如实施例3中所述，通过FACS分析其对在BOSC 23报告细胞系表面上异位表达的抗原的免疫反应性，进行由稳定的亚克隆培养物产生的抗体的阳性的评价。
在此基础上，分别为FGFR4，IL17RB，RGMB和EDAR抗原选择了三到四个亚克隆，而对于第五种抗原OR51E1，亚克隆上清液仅对细胞外结构域(用于免疫)显示反应性，而对全抗原无反应性，因此，将其搁置(表8)。
表8.阳性亚克隆
Figure BDA0002385150140000701
使用蛋白G-Sepharose Fast Flow亲和柱(HiTrapTM Protein G HP，GEHealthcare)和快速蛋白液相色谱
Figure BDA0002385150140000702
系统(GE Healthcare)从200mL十三种阳性上清液(在无血清培养基中)中的每一种中纯化相应的单克隆抗体。将在0.1M甘氨酸-HCl pH2.5中洗脱的并用100μL 1M Tris pH 9中和的1mL峰流分(fraction)合并，并通过SDS-PAGE定量和控制纯化的IgG。
纯化的抗体与其特异性表面抗原的结合在五个结肠CSC系上通过FACS在剂量反应测定中进行了分析。使用GraphPad Prism软件通过FACS分析推断出解离常数和最大结合值。通过将实施例4中定义的实验FC值(随mAb浓度的变化而变化)拟合到“一个位点结合”(双曲线)方程：Y＝Bmax*X/(Kd+X)来获得这些值，其中Bmax是最大结合值，Kd(解离常数)是达到最大结合的一半所需的抗体浓度。抗FGFR4和抗EDAR mAb在至少两个细胞系中显示出显著的剂量依赖性反应性，其Kd值在亚纳摩尔/低纳摩尔范围(0.2-1.3nM)内，而抗IL17RBmAb的反应性较低(Kd值介于40到125nM之间)，只有一种抗RGMB mAb为阳性(表9)。
表9.在结肠CSC上抗FGFR4，抗EDAR，抗IL17RB和抗RGMB mAb的解离常数和最大结合值。
Figure BDA0002385150140000711
Figure BDA0002385150140000714
Figure BDA0002385150140000712
Figure BDA0002385150140000713
某些选定抗体的抗原结合特异性已通过用编码短发夹RNA(shRNA)以沉默抗原表达的合适慢病毒载体(GIPZ慢病毒shRNA，Thermo Fisher Scientific)转导的商业结肠肿瘤细胞系进行了证实。分别显示相对较高的FGFR4，IL17RB和RGMB表达水平的三个细胞系HCT116，SW48和SW480用于基于慢病毒的相应转录本敲除。通过qRT-PCR控制的FGFR4-IL17RB和RGMB沉默的细胞的FACS分析表明，抗体对相应抗原具有特异性。
实施例6
评估富含和缺乏FGFR4的结肠CSC的增殖潜能，细胞运动性和致瘤性
已经观察到，当在结肠CSC系CTSC85上测试时，通过FACS分析针对不同靶标的选定抗体显示出双峰分布反应性(Signore等人，2016)。
为了通过实验验证FGFR4作为结肠CSC的潜在治疗靶标，基于与抗FGFR4抗体BFG-5F7-D5的双峰结合模式，使CSC系CTSC85进行流式细胞仪分选以分离两个亚群FGFR4High和FGFR4Low(图4)。
分离后，立即在许多体外测定中评估了这两个细胞群，以突出可能的功能差异。与用作两个分离的亚群的参考的亲本异质细胞群体(模拟分选的细胞)一起并行进行测定。
为了测量细胞增殖，将2000个细胞接种在96孔微孔板的每个孔中的100μL培养基中，一式三份地设置八个实验点。使用细胞活力荧光测定法CellTiter-BlueTM(Promega)，按照制造商的方案，监测细胞增殖速率十四天，每两天测量一次活细胞的数量。用酶标仪Victor 2TM(Wallac，Perkin Elmer)测量与细胞活力成正比的荧光强度。将对应于不同时间点的一式三份荧光强度值的平均值归一化为在细胞接种日(第0天)测得的平均值(图5)。
另外，已经在有限稀释实验和软琼脂中分析了两个FGFR4High和FGFR4Low亚群以及CTSC85细胞的对照群体(模拟分选)的集落形成效率。
对于液体培养中的克隆形成测定，将1、5或25个单细胞接种在96孔微孔板的每个孔中的100μL生长培养基中。14天后，针对每种细胞稀释条件，计算相对于孔总数的含集落的孔数，从而获得集落形成频率。
对于软琼脂中的集落形成测定，使用24孔板。简而言之，将500μL在生长培养基中的0.9％低熔点琼脂糖(低熔点Sea Plaque琼脂糖，Cambrex BioScience)溶液分配到每个孔中，并在4℃下固化至少1h(底层)。对于顶层，将等体积的在生长培养基中1％低熔点琼脂糖溶液和等体积的5.2×104个细胞/mL的细胞悬液混合，并将500μL的混合物转移到每个孔中(1.3×104个细胞/孔)并使其在室温下固化。然后将100μL培养基添加到每个孔中。将每个细胞亚群一式三份铺板并在37℃，5％CO2下孵育，每两天向培养物中添加新鲜培养基。在倒置光学显微镜下监测细胞集落的形成，并在孵育12天后对集落进行计数。对含有30个或更多细胞的集落进行评分(图6)。
总体而言，与FGFR4Low细胞亚群相比，FGFR4High CTSC85细胞亚群显示出更高的增殖速率和克隆形成效率。
还评估了三个CTSC85细胞群体的迁移效率。使用
Figure BDA0002385150140000731
孔微孔板进行跨孔迁移测定，将3000个细胞一式四份接种在每个孔的上腔室(插入)中，并在下腔室中添加200μL完全生长培养基。在37℃，5％CO2下孵育48小时后，将细胞用添加到下腔室的4μM Calcein AM荧光染料(Thermo Fisher Scientific)在室温下染色30分钟。在底部酶标仪Multimode Detector DTX 880(Beckman Coulter)上于485/535nm(Ex/Em)上测量了与通过膜迁移的活细胞相关的荧光。使用具有数字显微镜照相机(Nikon)的倒置荧光显微镜捕获图像，并使用ImageJ软件对染色的细胞计数。
在图7中，显示了三个独立实验的代表性结果，表明与FGFR4Low细胞相比，FGFR4HighCTSC85细胞具有更高的迁移倾向。
根据体外测定获得的实验证据，将两个FGFR4High和FGFR4Low CTSC85细胞亚群注射到免疫缺陷小鼠中，以评估其体内的致癌潜力。
实验是在六只NOD/SCID小鼠(Charles River)上进行的，分别在左右两侧皮下接种了相同数量的两个细胞亚群。在出现肿瘤后的三周内，通过游标卡尺每周两次测量肿瘤大小(长轴和短轴)来评估肿瘤的生长。使用以下公式计算肿瘤体积：TV(mm3)＝d2×D/2，其中d和D分别指最短直径和最长直径。
体内实验的结果(图8)表明，与FGFR4-缺乏的细胞亚群相比，富含FGFR4表达的CSC细胞亚群似乎具有增加的致瘤潜力，与功能性体外数据一致。
实施例7
抗FGFR4单克隆抗体的表征
我们已将FGFR4列为肿瘤学靶标，并进一步表征了针对该抗原产生的新颖单克隆抗体。
三种抗FGFR4纯化抗体BFG-2F7-B9，BFG-5E5-B5和BFG-5F7-D5的细胞荧光分析已扩展至所有五个结肠CSC系(1.1、1.2、18、85，CRO1)并扩展至一组结肠(HCT116，SW48，SW620，HT29，DLD1)和肝脏(Huh7，HepG2)ATCC肿瘤细胞系。每种抗体均以不断增加的浓度进行测试，以评估其与内源性表面受体结合的剂量依赖性。该测定法已在200μL细胞培养基中的105个细胞/孔的96孔微孔板中进行，其中连续稀释测试的抗体。在4℃下孵育1小时后，加入抗大鼠荧光二抗(山羊抗大鼠IgG R-藻红蛋白[R-PE]偶联物，Southern Biotech)，并用1μg/mL的DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐)处理细胞，以控制细胞活力。仅与二抗一起孵育的样品包括作为阴性对照。流式细胞仪评估使用细胞荧光计
Figure BDA0002385150140000741
(Miltenyi Biotec)进行。
基于获得的实验数据，使用每个实验点的平均荧光强度与对照样品的平均荧光强度之比(倍数变化，FC)作为参数来确定每种抗体的结合亲和力。将FC值与以μg/mL表示的mAb浓度的函数关系绘图，并使用如实施例5中所述GraphPad Prism软件计算Bmax和Kd常数。
如表10所总结，抗FGFR4抗体在具有高FGFR4表达水平的CSC和肿瘤细胞系上，特别是在具有在亚/低纳摩尔范围内(0.4-12nM)的Kd值的两个肝细胞癌(HCC)细胞系HepG2和Huh7上均显示出高的剂量依赖性反应性。相反，CTSC18和DLD1细胞系的反应性要差得多，这与它们的FGFR4低表达水平一致。
表10.结肠CSC以及结肠(CRC)和肝脏(HCC)ATCC肿瘤细胞系上抗FGFR4 mAb的解离常数和最大结合值。仅当从Bmax≥2的曲线进行插值时，Kd值才被认为是可靠的。
Figure BDA0002385150140000761
已经在与人IgG Fc融合的重组人FGFR4胞外域的体外结合测定(固相受体结合测定)中测试了抗FGFR4抗体的结合亲和力和特异性。简而言之，将96孔微孔板(
Figure BDA0002385150140000771
ELISA板)在4℃下用50μL 2μg/mL在PBS pH7中稀释的抗人IgG Fc(Bethyl Laboratories)包被过夜。然后将非特异性结合位点用200μL PBS/3％BSA饱和1h，然后在PBS中洗涤5次。接下来，将人嵌合受体FGFR4-Fc(R&D Systems)以1μg/mL的浓度添加到PBS/0.3％BSA中1小时。然后将微孔板在PBS中洗涤五次，并与抗FGFR4抗体或同型对照(Rat IgG2ak，Southern Biotech)在50μL PBS/0.3％BSA中的1：3系列稀释液一起孵育1h。每个实验点一式三份。在PBS中洗涤五次后，使用HRP偶联的抗大鼠IgG二抗(SouthernBiotech)以1：4000稀释并孵育1h，然后加入生色底物TMB(Thermo Fisher Scientific)3-10分钟，检测结合的抗体。加入100μL 2M硫酸终止反应，并使用酶标仪Multimode DetectorDTX 880(Beckman Coulter)测量450nm处的吸光度。
在该测定中，抗FGFR4抗体BFG-2F7-B9和BFG-5F7-D5对嵌合受体均显示出高且相同的结合亲和力(5ng/mL，0.03nM)，而对照免疫球蛋白未检测到结合达到测试的最大浓度。
使用移植有ATCC细胞系HCT116或CSC系CTSC85的免疫缺陷小鼠，在两种不同的结肠癌体内模型中评估了抗体BFG-2F7-B9的潜在治疗性抗肿瘤作用。
对于第一个异种移植模型，在20只5周龄的CD-1裸鼠(Charles River)的每只腹侧皮下接种1.8×106HCT116细胞在50％Matrigel(Corning)中的悬浮液。移植后第9天，将显示可测量肿瘤的小鼠随机分为两组(n＝7)，即抗体组和对照组，两组的平均肿瘤体积为110mm3。用50mg/Kg BFG-2F7-B9抗体的PBS溶液通过腹膜内(IP)注射处理小鼠三周，每周一次。对照组接受相应体积的空白注射液(PBS)。每周两次控制小鼠体重，并每周两次用游标卡尺测量肿瘤大小(长轴和短轴)。使用以下公式计算肿瘤体积：TV(mm3)＝d2×D/2，其中d和D分别指最短直径和最长直径。
相对于对照组，在用抗体治疗的小鼠中观察到肿瘤体积的减少，这种差异从治疗的第14天开始就具有统计学显著性(图9)。相反，未观察到体重减轻或临床不良反应(未显示)。
对于第二个异种移植模型，将1×106CTSC85细胞的悬浮液皮下接种到22只NOD/SCID小鼠(Charles River)的每只小鼠的腹侧。移植大约三周后，将显示可测量肿瘤的小鼠随机分为三组(n＝7)，即抗FGFR4抗体BFG-2F7-B9，无关抗体1H4(同型对照)和载体对照组，每组平均肿瘤体积为70mm3。通过IP注射50mg/Kg在PBS中的BFG-2F7-B9或1H4抗体处理小鼠，每周一次，共五周。对照组接受相应体积的空白注射液(PBS)。每周两次控制小鼠体重，并每周两次用游标卡尺测量肿瘤大小(长轴和短轴)。使用以下公式计算肿瘤体积：TV(mm3)＝d2×D/2，其中d和D分别指最短直径和最长直径。
如图10所示，该实验的结果证实了在其他体外和体内模型中观察到的抗FGFR4抗体BFG-2F7-B9抑制结肠癌细胞生长的能力。将BFG-2F7-B9治疗组的肿瘤生长速率与对照组比较，差异具有统计学显著性。在治疗期间未观察到体重减轻或临床不良反应(未显示)。
实施例8
与鼠FGFR4受体交叉反应并抑制配体-受体相互作用的其他抗FGFR4单克隆抗体的选择和表征
为了鉴定新颖的抗FGFR4抗体能够抑制FGF与受体的结合，因而在阻断相互作用配体-受体方面具有比先前所述更好的生物学作用，遵循了两种不同的策略。
第一种策略：
第一种策略包括重新检查在最初筛选中显示阳性的十四个亲本杂交瘤细胞上清液，其通过鉴定受体细胞外区域上的抗体结合结构域，并通过测试它们在鼠受体上的交叉反应性来实施。事实上，FGFR4 Ig II和Ig III结构域(其是与配体和硫酸乙酰肝素相互作用所必需和充分的(Goetz&Mohammadi，2013))在不同物种中最为保守。另外，在Ig II和III中人和鼠受体之间不同的氨基酸残基位于与FGF结合袋相对的表面上。结果，与鼠受体的交叉反应性以及与结构域Ig II和III的结合可能是抗体的区别特征，可以干扰配体-受体相互作用。
产生了人类FGFR4受体细胞外区域的三个缺失突变体(d1，d2，d3)。在d1中，对应于Ig I结构域的包含氨基酸1-118的区域缺失；在d2中，对应于Ig I和酸性盒两者的包含氨基酸1-151的区域缺失；在d3中，包含对应于Ig I，酸性盒和Ig II的氨基酸1-248的区域缺失(氨基酸编号是指全长(FL)受体，包括信号肽)。已经将编码FGFR4 FL的cDNA和截短形式克隆到pB1-myc表达载体中有myc标签的框架内(实施例3中所描述)。用pB1-FGFR4 FL，d1，d2和d3瞬时转染并用十四个亲本杂交瘤上清液测试的报告细胞BOSC23的FACS分析证实了它们对全长受体的反应性。其中十个保留了对d1突变体的完全反应性，其中BFG-5A5和BFG7H9完全丧失了对d2突变体的阳性。最后，所有八个剩余的上清液，包括先前描述的BFG-2F7，BFG-5E5和BFG-5F7，在d3突变体上均呈阴性，从而显示出对结构域Ig II的结合特异性。
在用相应的pB1-myc构建体转染后，通过异位表达人、猴或鼠FL FGFR4的瞬时转染的BOSC23细胞，通过FACS分析相同的上清液。十三个上清液显示出与猴受体的交叉反应性，而只有三个上清液对鼠受体也呈阳性反应。有趣的是，分离出先前描述的抗体BFG-2F7-B9，BFG-5E5-B5和BFG-5F7-D5的上清液反而对人FGFR4具有特异性。
选择BFG-5B5上清液，其在鼠类受体上具有最强的交叉反应性且在Ig II结构域上呈阳性，可用于亚克隆相应的杂交瘤细胞，从而获得了产生抗体BFG-5B5-G7的细胞亚克隆，并通过如实施例5中所述的蛋白质G-琼脂糖亲和层析进行纯化。
如实施例7所述，在剂量反应实验中通过FACS分析评估了抗体BFG-5B5-G7对五种不同结肠CSC系(1.1、1.2、18、85，CRO1)和对HCC细胞系Huh7的反应性。包括先前描述的BFG-2F7-B9抗FGFR4抗体和无关抗体1H4作为参考。将相对于对照(仅二抗)的倍数变化(FC)值作为mAb浓度(以μg/mL表示)的函数绘图，并且Bmax和Kd常数使用GraphPad Prism软件计算并应用如实施例5中所述的“一个位点结合方程式”。
如表11所示，抗体BFG-5B5-G7在所有表达高FGFR4水平的细胞系上显示出与BFG-2F7-B9相似的高结合活性，而证实FGFR4表达低的CTSC18细胞系对反应迟钝。相反，无关抗体1H4在所有测试的细胞系中均呈阴性。为BFG-5B5-G7计算的Kd值均在亚纳摩尔范围内，与为BFG-2F7-B9计算的Kd值相当或略低。
表11.在五个结肠CSC系和HCC细胞系Huh7上抗FGFR4 mAb BFG-5B5-G7和BFG-2F7-B9的解离常数和最大结合值。
Figure BDA0002385150140000801
然后使用实施例7中所述的固相受体结合测定法和人嵌合受体FGFR1-Fc，FGFR2-Fc，FGFR3-Fc FGFR4-Fc(R&D Systems)在体外测定BFG-5B5-G7对FGFR4的结合亲和力和特异性。已用递增浓度的BFG-5B5-G7或同种型对照(大鼠IgG2a)孵育包被有不同FGFR-Fc的微孔板。在该测定中，抗体BFG-5B5-G7对FGFR4显示出高特异性结合亲和力(Kd＝0.02μg/mL，0.1nM)，而在其他FGF受体或同种型对照中未检测到结合。
然后在实施例7中所述的FGFR4-Fc依赖性固相结合测定中分析了抗体BFG-5B5-G7预防/竞争FGF19-FGFR4复合物的形成的能力，其中已经引入了以下修饰。在将以1：3系列稀释的抗体一式三份孵育1h后，以等摩尔浓度23nM(对应于从先前的剂量反应结合实验推断出的Kd值，未显示)加入重组FGF19(Peprotech)和低分子量肝素(Clexane，平均MW 4.5kDa，Sigma-Aldrich)。孵育2小时后，将微板在PBS中洗涤5次，并与在PBS/0.3％BSA中以1：1000稀释的抗FGF19生物素化抗体(R&D Systems)孵育1小时。在PBS中洗涤5次后，通过在含有3％BSA和0.02％Tween-20的PBS中加入50μL HRP偶联的链霉亲和素(Thermo FisherScientific/Pierce)来检测与固定的受体结合的残留FGF19。孵育30分钟后，通过在PBS/0.02％Tween-20中进行3次洗涤并在PBS中进行2次洗涤，去除多余的链霉亲和素，然后添加生色底物TMB(Thermo Fisher Scientific)12分钟。通过加入100μL 2M硫酸终止反应，并使用酶标仪Multimode Detector DTX 880(Beckman Coulter)测量450nm处的吸光度。
该测定先前已通过测试相对于其他FGFR的FGF19对FGFR4的结合选择性以及FGF1(另一种FGFR4高亲和力配体)抑制FGF19-FGFR4相互作用的能力进行了验证。
随后，在先前所述实验条件下，一式三份测试了BFG-5B5-G7抗体的11种1：2系列稀释液(从0.015μg/mL到15μg/mL)。还以与阴性对照相同的浓度测试了无关抗体1H4。
该结果表明，与先前描述的抗FGFR4 mAb BFG-2F7-B9和无关抗体1H4(未显示)不同，抗体BFG-5B5-G7能够有效抑制FGF19与FGFR4的结合，与其对鼠受体的反应性及其对FGFR域Ig II的结合特异性相一致。
胆固醇7a-羟化酶(CYP7A1)和结缔组织生长因子(CTGF)的表达在正常肝细胞和肿瘤肝细胞中均受FGF19依赖的FGFR4信号传导途径的激活而在转录水平上受到调节(Inagaki等人,2005；Chiang等人,2009；Uriarte等人,2015)。在血清饥饿八小时后在无血清培养基中与抗FGFR4mAb一起预孵育过夜的HepG2细胞上，评估了BFG-5B5-G7和BFG-2F7-B9抗体抑制FGF19介导的基因调节的能力。在细胞裂解前6小时，加入浓度为100ng/mL(4.6nM)的FGF19与等摩尔肝素。包括用PBS处理的阴性对照样品。在细胞裂解前7小时，以0.1μM，0.3μM或1μM的浓度添加FGFR4酪氨酸激酶特异性抑制剂BLU9931作为阳性对照(Hagel等人，2015)。从HepG2细胞中提取总RNA，并如实施例2所述一式三份进行qRT-PCR测定，使用基因特异性探针和引物(Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific
Figure BDA0002385150140000821
Gene Expression Assays)和用作为归一化因子的GAPDH。
与已发表的数据一致，添加FGF19降低了CYP7A1的表达(约5倍)并增加了CTGF的表达(约2.5倍)。用浓度为30μg/mL(0.2μM)的BFG-5B5-G7进行的处理，已部分逆转了(reverted)这些作用，其导致Cyp7A1 mRNA的增加和CTGF mRNA的减少，其水平与用类似浓度的化合物BLU9931所观察到的水平相当。
这些数据表明，不同于BFG-2F7-B9(未显示)，BFG-5B5-G7能够干扰肝细胞癌细胞中FGFR4依赖的信号传导途径，该细胞通过FACS用这种抗体显示出高阳性。
随后，评估了BFG-5B5-G7和BFG-2F7-B9抑制成纤维细胞生长因子受体底物2(FRS2)的FGFR4依赖性磷酸化的能力，这种作用是通过用FGF19处理Huh7和Hep3B肝癌细胞系所诱导的。
血清饥饿8小时后，将细胞在具有浓度为7.5μg/mL、15μg/mL和30μg/mL的BFG-5B5-G7、BFG-2F7-B9或对照抗体1H4的无血清培养基中孵育过夜，而在细胞裂解前10分钟，以等摩尔浓度(4.6nM)加入FGF19和肝素。在细胞裂解之前1h包括浓度为100或300nM的BLU9931作为阳性对照。制备SDS中的总蛋白裂解物，并使用抗磷酸-FRS2抗体(Tyr196，CellSignalling)，抗FRS2抗体(LSBio)和抗GAPDH抗体(Sigma-Aldrich)通过蛋白质印迹法进行分析。
BFG-5B5-G7抗体比BFG-2F7-B9在以剂量依赖性方式和在两种细胞系中抑制FGF19诱导的FRS2磷酸化的效率明显更高，而阴性对照抗体1H4则完全失活。
然后测试了抗体BFG-5B5-G7降低两个FGFR4阳性结肠CSC系(CTSC1.2和CRO1)在软琼脂中集落形成效率的能力。实验程序是在实施例6中详细描述的程序，并具有以下修改。BFG-5B5-G7或无关抗体1H4均以7.5、15或30μg/mL的最终浓度包含在顶层软琼脂层和上层培养基中。作为阳性对照，以100nM的浓度平行测试FGFR4抑制剂BLU9931。将每个实验点一式四份铺板并在37℃，5％CO2下孵育，每两天添加一次含有抗体或化合物的新鲜培养基。
在倒置光学显微镜下监测细胞集落的形成，并且在孵育14天后，测定包含30个或更多细胞的集落数。用BFG-5B5-G7连续处理两个CSC系导致相对于对照的集落数量减少，在CTSC1.2上的所有浓度和在CTSC CRO1上测试的最高浓度下，集落数量减少均达到统计学显著性。
第二种策略：
为了鉴定具有比BFG-2F7-B9潜在更高的抗肿瘤活性的新颖抗FGFR4抗体，从冷冻保存的淋巴细胞中产生了新的杂交瘤细胞系，该淋巴细胞是从最初用如实施例3所述的pB8-HA-FGFR4表达载体免疫的大鼠中分离得到的。对于第二次筛选，引入了两个新的选择标准，包括(i)与鼠受体的交叉反应性的早期评估和(ii)相应的上清液干扰FGF19-FGFR4相互作用的能力。
如实施例3中一样，已经产生了新的杂交瘤细胞系，并且在杂交瘤选择和扩增步骤之后，通过用任一种表达载体转染的BOSC23细胞的FACS分析来评估相应的上清液对人和鼠受体两者的反应性。
在此基础上，选择了70种产生对人FGFR4呈阳性结果的抗体的杂交瘤细胞系(BMK融合)，其中50种对鼠受体也有反应，另外20种对人FGFR4具有特异性。
对于第一次筛选(实施例4)，已经通过FACS分析了70种选择的上清液与结肠CSC表面结合的效率。在对先前鉴定出的抗FGFR4抗体(CTSC1.1，CTSC1.2，CTSC85和CTSC CRO1)具有高反应性的四个结肠CSC系上以及在对相同抗体具有低反应性的CSC系CTSC18上进行了实验。通过在96孔微孔板中接种105个细胞/孔，并向其中加入200μL的每种上清液进行测定。将用于杂交瘤融合的鼠骨髓瘤细胞的条件培养基(DMEM/10％FBS)添加到每个平板中作为阴性对照，而浓度为3ug/mL的抗FGFR4 BFG-2F7-B9抗体被包括作为阳性对照。在4℃下孵育1小时后，加入抗大鼠荧光二抗(山羊抗大鼠IgG R-藻红蛋白[R-PE]偶联物，SouthernBiotech)，并用0.25μg/mL(1μM)的DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐)处理细胞，以控制细胞活力。流式细胞仪评估已使用细胞荧光计
Figure BDA0002385150140000841
(MiltenyiBiotec)进行。
如实施例4中所述，除了两个上清液外，所有上清液均在CTSC18细胞系上呈阴性，并根据它们的FC值、根据在其他CSC系上它们的阳性率进行分等级。通过添加分配给在四个具有高FGFR4表达的CSC系中的每个上的每个上清液的各个等级，获得最终等级(表12)，其中最低的数字对应于最高的反应性。
表12.用在5个不同的CSC系上的70种上清液获得的FACS分析数据汇总。倍数变化(FC)是用每种上清液测得的平均荧光强度(MFI)与阴性对照(骨髓瘤细胞条件培养基)之比。根据每个FGFR4阳性CSC系的FC值分配分数，并通过添加各个分数来计算最终等级(总等级)。下划线标出与鼠受体没有交叉反应的上清液。
Figure BDA0002385150140000851
平行地，已经在前述固相受体结合测定中测量了70种上清液的反应性。将包被有FGFR4-Fc的微孔板的孔用从0.08μL到10μL的递增体积的每种上清液孵育，用骨髓瘤细胞条件培养基使最终体积达到50μL。将针对不同靶标产生的抗体(BGC-6H7)作为阴性对照添加到每个平板中，同时将浓度为6μg/mL的抗FGFR4 BFG-2F7-B9抗体包括作为阳性对照。通过减去条件培养基的背景值获得450nm处的吸光度值。如表13中总结的，除了BMK-7E4，BMK-8H9和BMK-8H10之外，所有上清液均显示出剂量依赖性受体结合活性，尽管程度不同。在使用较低的体积范围的第二次测试中(其中所有上清液均显示出剂量反应活性)评估了14个上清液，即使在最小测试体积下也未观察到450nm处的吸光度降低。同样在这种情况下，根据表13汇总的2μL和0.08μL上清液体积获得的数据，对每个上清液分配最终等级。
表13.在固相FGFR4依赖性测定(n＝3)中用70个上清液获得的结合数据汇总。最小的数字对应于最高的反应性。最佳的18个上清液标有(+)号。
Figure BDA0002385150140000871
评估总体数据以选择待进一步表征多个上清液。对从结肠CSC的FACS分析获得的最佳17种上清液进行了优先排序，其中13种对鼠类受体也有反应性，而其他4种对人FGFR4具有特异性。在重组受体上在两种结合测定中的至少一种中，即在FGFR4依赖性固相测定中和在其表面异位表达该受体的BOSC23细胞上，这些上清液是最佳的上清液之一。
在剂量反应实验中评估了17种上清液在前述固相测定中抑制FGF19与固定的受体结合的能力。在添加FGF19和肝素之前，将固定化的FGFR4-Fc与递增体积(从0.185μL到16.6μL)的每种上清液进行预孵育，用骨髓瘤细胞条件培养基使最终体积达到50μL。将在所有三种结合测定中均导致无反应的上清液作为阴性对照，而FGF1用作阳性对照，浓度为5nM。
如图11所示，在十七种分析的上清液中，有七种对FGF19-FGFR4的结合产生明显的剂量依赖性抑制作用。其中，有五种与鼠受体交叉反应(BMK-1E7、3B6、5H9、6C9、10G11)，而只有两种对人FGFR4具有特异性(BMK-8D4和BMK-8E3)。有趣的是，这七种上清液是结合内源性和重组受体的最有效的上清液之一。
实施例9
抗FGFR4单克隆抗体的表征
将产生7种选择的上清液的亲本杂交瘤细胞系亚克隆，他们每个都获得了稳定的亚克隆，可产生对异位表达FGFR4的BOSC23细胞反应的抗体(在实施例3中详细描述)。已经通过如实施例5中所述的蛋白G-琼脂糖亲和层析纯化了相应的单克隆抗体。
在如实施例7所述的剂量反应实验中通过FACS分析评估了这七种抗体对三种不同结肠CSC系(CTSC1.2，CTSC85和CTSC CRO1)和对HCC细胞系Huh7的反应性。作为参考，还测试了先前描述的BFG-5B5-G7抗体。将相对于对照(仅二抗)的倍数变化(FC)值作为mAb浓度(以μg/mL表示)的函数绘图，并且Bmax和Kd常数使用GraphPad Prism软件计算并应用如实施例5中所述的“一个位点结合方程式”。
如表14中总结的，BFG-5B5-G7证实了先前实验中显示的高结合效率。在新颖单克隆抗体中，BMK-3B6-E4和BMK-6C9-C11在所有细胞系上均显示出与BFG-5B5-G7相似的高结合效率。相反，抗体BMK-1E7-C4，BMK-5H9-D1，BMK-8D4-E2，BMK-8E3-E4和BMK-10G11-F3产生的反应性显著降低，对于BMK-8E3-E4而言，曲线确实在某些分析的细胞系上未达到饱和，因此暗示有一定程度的非特异性脱靶结合。
表14.在三个结肠CSC系和HCC细胞系Huh7上的七个抗FGFR4mAb和BFG-5B5-G7的解离常数和最大结合值。
Figure BDA0002385150140000891
在如实施例8中描述的受体依赖性固相测定中，新颖mAb还证实了阻止/竞争FGF19-FGFR4复合物形成的能力。抗体BFG-5B5-G7作为参考，其他mAb显示出低纳摩尔抑制常数(表15)。
表15.基于在不断增加的抗体浓度(以1：3连续稀释，从0.014到30μg/mL；n＝3)下在450nm处的残留吸光度(PBS对照的％)，使用KaleidaGraph软件对实验数据进行4Plogistic拟合获得IC50值。
mAb IC50(ug/mL) IC50(nM)
5B5-G7 0.2 1.7
1E7-C4 0.1 0.7
3B6-E4 0.17 1.1
5H9-D1 0.17 1.1
6C9-C11 0.25 1.65
8D4-E2 0.26 1.7
8E3-E4 0.8 5.5
10G11-F3 0.13 0.9
然后用来自HCC细胞系HepG2的总RNA进行qRT-PCR分析，以评估抗体调节Cyp7A1和CTGF基因的FGF19/FGFR4依赖性表达的能力。在实施例8中描述的包括抗体BFG-5B5-G7作为参考的实验条件下，在加入FGF19(100μg/mL)之前，用60μg/mL的每种抗体或PBS处理细胞。RNA提取和qRT-PCR方案与先前描述的相同。
用2^(-△△c-t)计算方法获得的该分析的结果如图12所示。与先前的实验一样，添加FGF19降低了CYP7A1表达(约5倍)并增加了CTGF表达(约2.5倍)。BFG-5B5-G7和新抗体BMK-1E7-C4，BMK-3B6-E4和BMK-6C9-C11能够部分逆转这些作用，从而分别导致Cyp7A1mRNA水平升高和CTGF mRNA水平降低。
随后，评估抗体抑制由HCC细胞系Hep3B的FGF19处理诱导的FRS2的FGFR4依赖性磷酸化的能力。在实施例8中描述的包括抗体BFG-5B5-G7作为参考的实验条件下，在加入FGF19/肝素之前，用60μg/mL的每种抗体或PBS处理细胞。
该分析的结果显示在图13中。抗体BMK-1E7-C4，BMK-3B6-E4，BMK-6C9-C11和BMK-10G11-F3以及阳性对照BFG-5B5-G7可以抑制FGF19诱导的FRS2磷酸化，尽管程度不同。
最后，在液体中的克隆形成测定中评估了抗体对HCC细胞系Huh7的抗增殖活性。包括抗体BFG-5B5-G7和FGFR4抑制剂BLU9931作为参考。
代表性的结果显示在图14中。用所有抗体以及BFG-5B5-G7连续处理Huh7细胞，与对照相比集落数量有所减少，尽管程度不同。浓度为50-100μg/mL(0.3-0.6μM)的BMK-3B6-E4，BMK-5H9-D1，BMK-6C9-C11，BMK-8D4-E2和BMK-8E3-E4以及参考抗体BFG-5B5-G7显示出的抗增殖作用，与使用相似浓度的FGFR4抑制剂BLU9931所观察到的结果相当或更高。
总之，根据其免疫学和功能特性，选择了三种抗FGFR4单克隆抗体进行进一步表征，即满足以下三个条件的BMK-3B6-E4，BFG-5B5-G7和BMK-6C9-C11：i.结合在结肠CSC和HCC细胞表面表达的受体，其解离常数在低纳摩尔范围内；ii.表达高受体水平的细胞中的FGFR4信号传导途径抑制；iii.在与标准治疗剂量的抗体药物相容的浓度下，对FGFR4阳性细胞具有抗增殖活性。
实施例10
抗FGFR4人-大鼠嵌合抗体的生产与表征
使用标准RT-PCR实验方法，用一组Aldevron's(Freiburg,德国)专有引物从杂交瘤细胞产生的cDNA，扩增大鼠杂交瘤BFG-5B5-G7,BMK-1E7-C4,BMK-3B6-E4,BMK-5H9-D1,BMK-6C9-C11,BMK-8D4-E2,BMK-8E3-E4,和BMK-10G11-F3表达的免疫球蛋白基因的VH和VL区。使用标准的染料-终止子毛细管测序方法进行测序后，将编码VH区的cDNA与人IgG1恒定区的编码序列在框架内克隆入gWIZ表达载体(Aldevron)中，而将编码VL区的cDNA与人κ链恒定区的编码序列在框架内克隆入相同的表达载体中(图15)。
编码三种嵌合抗体BFG-5B5-G7，BMK-3B6-E4和BMK-6C9-C11中的每一个的重链和轻链的表达载体(为简单起见定义为ch3B6，ch6C9和ch5B5)被瞬时共转染到细胞系293F中，且在PBS pH 7.2中通过蛋白-A琼脂糖亲和层析从≥2L的细胞上清液中纯化抗体，最终浓度为2-3mg/mL。取决于抗体和制备物，上清液的产量为20和30mg/L。质量控制证实了重组抗体的纯度和单体状态(monomeric state)(图16)。
嵌合抗体通过FACS控制其结合在HepG2和Huh7肝细胞癌细胞表面表达的FGFR4的能力。ch3B6也已在乳腺癌细胞系MDA-MB453上进行了测试，据报道它可表达高水平的FGFR4Y367C突变体(Roidl等人，2010)。如实施例7中所述进行测定，但是在这种情况下使用抗人荧光二抗(山羊抗人IgG R-藻红蛋白[R-PE]偶联物，Southern Biotech)。
代表性数据报告于图17。
已确认嵌合抗体在低nM范围内以相似的解离常数保留了相应大鼠mAb的结合活性。另外，显示出ch3B6也有效结合于在MDA-MB453细胞中过表达的FGFR4 Y367C突变体。该突变体受体被描述为显性，非配体依赖性，组成型活化变体，对已知的拮抗抗体的抑制不敏感(Roidl等人，2010)。
然后使用固相受体结合测定和人类嵌合受体FGFR1-Fc,FGFR2-Fc,FGFR3-Fc和FGFR4-Fc(R&D systems)在体外测量FGFR4嵌合抗体相对于FGF受体家族其他成员的结合亲和力和特异性。对于FGFR1和FGFR2，都测试了α和β剪接变体。另外，对于两个FGFR2变体中的每一个，测试了在Ig III结构域上不同的两个替代性剪接变体IIIb和IIIc。基本上如实施例7中所述进行以下所述的该固相结合测定和其他固相结合测定，并进行以下修改。用浓度为2μg/mL的在PBS中的人嵌合受体FGFR-Fc直接包被96孔微孔板，在4℃过夜。在递增的抗体浓度下孵育后，以1：2500稀释的HRP偶联的山羊抗人IgG，Fab特异性二抗(Sigma Aldrich)用于检测。
代表性的剂量反应结合曲线如图18所示。
在该测定中，嵌合抗体证实了对FGFR4的亚纳摩尔亲和力，而在其他FGF受体上未检测到显著结合。
接下来，以递增的抗体浓度孵育后，通过添加23nM的等摩尔浓度的FGF19/肝素，在如实施例8中进行的固相测定分析中，我们证实了嵌合抗体在阻止/竞争FGF19与FGFR4-Fc结合方面的有效性。
代表性的剂量反应抑制曲线如图19所示。
然后在液体中在克隆形成试验中评估嵌合抗体对HCC细胞系Huh7的抗增殖活性。FGFR4抑制剂BLU9931作为参考，浓度从0.2μM增加到5μM。
代表性的结果如图20所示。
用三种抗体连续处理Huh7细胞，与对照相比导致集落数量减少，尽管有不同程度的影响。在30和100μg/mL的浓度(分别为0.2μM和0.6μM)下的抗体ch3B6显示的抗增殖作用与在相同浓度下用化合物BLU9931观察到的抗增殖作用相当。其他两种抗体显示出不太明显的抑制作用。
为了证实观察到的抗增殖作用的特异性，评估了三种抗FGFR4嵌合抗体干扰敏感HCC细胞系Huh7中FGFR4信号传导途径激活的能力。为了这个目的，通过蛋白质印迹分析了对通过用FGF19的细胞处理诱导的对FGFR4和衔接子蛋白FRS2的磷酸化的抑制作用(图21)。
所有这三种抗体以及阳性对照BLU9931均可抑制Huh7细胞中FGF19诱导的FGFR4和FRS2磷酸化。
基于体外实验证据，使用移植了HCC细胞系Huh7的免疫缺陷小鼠在体内模型中评估了三种嵌合抗体的潜在治疗性抗肿瘤作用。在5-6周龄的35只无胸腺裸鼠(Envigo)的每只腹侧皮下接种5×106Huh7细胞在50％基质胶(Corning)中的悬浮液。移植后第12天，将显示可测量肿瘤的小鼠随机分为四组，分别为BMK-3B6-E4，BMK-6C9-C11，BFG-5B5-G7(n＝8)和对照组(n＝7)，所有组的平均肿瘤体积为107mm3。通过IP注射用25mg/Kg的每种抗体的PBS溶液处理小鼠，每周两次，连续三周。对照组接受相应体积的空白注射液(PBS)。每周两次控制小鼠体重，并每周两次用游标卡尺测量肿瘤大小(长轴和短轴)。使用以下公式计算肿瘤体积：TV(mm3)＝d2×D/2，其中d和D分别指最短直径和最长直径。
相对于对照组，在用每种抗体处理的小鼠中观察到肿瘤体积的减少，这种差异从处理的第16天开始就具有统计学显著性(图22)。相反，未观察到体重减轻或临床不良反应(未显示)。
在研究结束时，处死存活的小鼠并收集残留的肿瘤块，并分成三个片段，用于分别通过qRT-PCR，蛋白质印迹法和免疫组织化学评估特异性生物标志物。
首先，我们评估了抗体在处理的小鼠肿瘤中调节两种FGFR4-和肝脏特异性生物标志物CYP7A1和CTGF转录的能力，这些标志物在正常肝细胞和肿瘤肝细胞中在mRNA水平上受FGFR4信号传导途径的FGF19依赖性激活的调控，如在实施例8中详细描述的。我们先前已经表明，用相应的大鼠抗FGFR4抗体处理肝癌细胞培养物部分地逆转了这两个基因的表达的FGF19依赖性调节(实施例8和9)。
在该离体研究中，使用实施例8中详细描述的实验步骤，从用三种抗FGFR4嵌合抗体的每一种或用PBS处理的小鼠收集的肿瘤样本中提取的总RNA进行qRT-PCR分析。
分析结果如图23所示。
嵌合抗FGFR4抗体的治疗性给药引起肿瘤中分析的生物标志物的调节，与在该肝异种移植模型中对FGFR4信号转导途径激活的拮抗作用一致。
为了进一步证实观察到的抗肿瘤活性的特异性，评估了在处理的肿瘤中抗体对FGFR4和MAP激酶ERK1/2(细胞外调节激酶1和2)磷酸化的抑制作用。通过蛋白质印迹法分析从处理的和对照小鼠收集的肿瘤样品制备的蛋白质提取物(图24)。
已显示在处理小鼠的肿瘤中，抗体ch3B6显著降低了在对照肿瘤中测得的FGFR4和ERK1/2磷酸化水平。
总体而言，离体实验证据表明，抗FGFR4嵌合抗体的治疗性处理调节了Huh7肿瘤中FGFR4信号传导的不同成分，并在其上显示出生长抑制作用。
然后在Huh7中评估抗体的受体介导的细胞内的内在化。用三种抗FGFR4嵌合抗体中的每一种或无关抗体1H4在4℃下将细胞处理1小时，以促进与细胞表面受体的结合。在孵育结束时(时间0)收集样品，然后在37℃下转移细胞以促进抗体-受体复合物的内在化，并在不同的时间收集以进行如前所述的FACS分析。结果总结在表16中。
表16.Huh7细胞中三种嵌合抗体的FGFR4依赖性内在化。在4℃(时间0)用抗FGFR4抗体或无关抗体1H4处理细胞1h，然后在37℃孵育。在指定的时间点收集样品并进行FACS分析。数据表示为在时间0测量的几何平均荧光值的百分比。
Figure BDA0002385150140000941
分析显示，在用抗FGFR4抗体而非阴性对照抗体处理的样品中，膜信号随时间依赖性的下降，这表明特异性的受体介导的细胞内在化。
接下来，我们进行了FGFR4细胞外区域内三种抗体的抗原结合位点的鉴定。为了该目的，异位表达FL FGFR4或在实施例8中详细描述的三种FGFR4缺失突变体(d1，d2，d3)的BOSC23报告细胞用每种抗体处理并如前所述通过FACS进行分析。结果示意性地报告在图25中。
所有这三种抗体都证实了它们在全长受体上的反应性，并且在d1突变体上也呈阳性，因此表明不与Ig I结构域相互作用。抗体ch3B6在d2突变体上完全丧失了阳性，因此显示了对酸性盒的结合特异性。保留了对d2突变体的反应性的其他两种抗体在d3上显示阴性，因此显示了对Ig II结构域的结合特异性，在ch5B5的情况下，证实了使用相应大鼠抗体获得的结合数据。
使用表位作图ELISA技术，基于用目标抗体扫描覆盖完整靶蛋白氨基酸序列的重叠合成肽文库，确定了抗原结合位点。
为此，基于FGFR4结构域Ig I(aa 22-118)和Ig II(aa 157-241)的序列，分别合成了具有11个氨基酸的序列重叠的23个和22个具有15个氨基酸的肽。基于FGFR4酸性盒结构域(aa 119-156)(JPT Peptide Technologies)的序列，合成了26个其他的15个氨基酸肽，其序列具有13个氨基酸的重叠。通过化学间隔子将所有肽在N末端缀合到生物素上，以使其与链霉亲和素包被的微孔板结合。在对应于Ig I，Ig II和酸性盒结构域的三个肽库上，通过ELISA评估了三种嵌合抗体的结合特异性，包括嵌合抗myc抗体(Absolute Antibody)和相应的合成生物素化肽表位(JPT Peptide Technologies)作为阳性对照。用200μL封闭缓冲液(含0.1％BSA和0.5％Tween-20的PBS)将链霉亲和素包被的高结合能力的96孔白色微孔板(Pierce/Thermo Fisher Scientific)的每个孔洗涤3次。然后用100μL的每种肽包被孔，在浓度为50μM的封闭缓冲液中悬浮，在室温下摇动2h。用200μL封闭缓冲液洗涤3次后，加入100μL浓度为150μg/mL的在封闭缓冲液中稀释的每种抗体，并在室温振荡孵育1.5h。用200μL封闭缓冲液洗涤3次后，添加100μL的在封闭缓冲液中以1：10000稀释的HRP偶联的山羊抗人IgG、Fab特异性二抗(Sigma Aldrich)，并在室温下摇动孵育1h。用200μL封闭缓冲液洗涤四次后，添加100μL化学发光HRP底物(SuperSignal ELISA Pico化学发光底物，Pierce/Thermo Fisher Scientific)，并在1分钟后，使用酶标仪Multimode Detector DTX880(Beckman Coulter)测量发光。
如从FGFR4缺失分析所预期的那样，没有一种嵌合抗体对对应于Ig I结构域的肽表现出特异性反应(未显示)，抗体ch6C9和ch5B5在对应于酸性盒的肽上也呈阴性。ch6C9显示低反应性，分布在对应于Ig II结构域的肽上的多个峰中，表明其识别该区域中的不连续/构象性表位。相反，ch5B5对结构域Ig II中的三个重叠肽表现出高特异性反应，因此定义了23个氨基酸的线性表位(图26A)。
与其他抗体不同，ch3B6在对应于酸性盒的特定肽上显示出明显的阳性，从而证实了FGFR4缺失数据。尽管在这种情况下也将反应性分布在不连续的多个峰中，但是可以为该抗体定义酸性盒中包含127至154之间氨基酸的不连续结合位点(图26B)。图26C中所示的人FGFR4蛋白序列与小鼠直系同源序列的比对显示，有助于在实验鉴定出的ch3B6表位内结合的残基在相应的小鼠序列中是保守的，从而支持了所观察到的抗体对鼠受体的交叉反应性。
实施例11
抗FGFR4抗体ch3B6的人源化
然后，我们通过将原始杂交瘤大鼠CDR序列移植到选定的人免疫球蛋白可变区中，来进行抗体ch3B6的人源化。为了优化人源化变体，鉴定并选择了与原始大鼠抗体3B6最相似的人种系免疫球蛋白可变序列。基于与已知免疫球蛋白晶体结构的同源性，针对重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)生成了所选人种系可变区的3D模型。已评估3D模型中每个氨基酸的位置，以便确定人类框架中哪些额外氨基酸残基需要被相应的原始鼠残基替代，尤其要注意可能影响抗原结合或VH/VL定向的氨基酸。对于少数位置，人或大鼠氨基酸之间的理论上最佳选择并不容易，因此必须进行实验测试。因此，设计了稍微不同版本的人源化序列，其中三个分别用于VH和两个用于VL，它们的组合产生六种不同的抗体。此过程如图27所示。
此外，我们选择了一种已知的人源化抗FGFR4抗体(hLD1.v22Genentech，US9266955B2)作为基准纳入我们的实验，并将无关的抗体Bezlotoxumab(Merck&Co)用作同型对照。表17列出了3B6人源化VH和VL变体的氨基酸序列。
表17.显示了人源化可变序列，3个变体用于VH，2个变体用于VL。相对于原始大鼠3B6序列的氨基酸变化以黑体表示，而相对于选择用于移植的人种系序列的变化则用下划线标出。表17按出现顺序分别公开了SEQ ID NO：2-4和12-13。
Figure BDA0002385150140000971
基于选择用于移植和在必要时引入用于大鼠氨基酸的密码子的人种系免疫球蛋白可变区的核苷酸序列确定编码为抗体3B6提议的五个氨基酸变体的DNA序列。对于对照抗体，可通过在线提供的密码子优化方法(http://eu.idtdna.com/CodonOpt)确定DNA序列。
产生了五个3B6变体和对照抗体的合成DNA片段，在末端带有独特的限制性酶识别位点，该位点适于将这些片段中的每一个克隆到ch3B6重链和轻链表达载体中(实施例10)。通过在表达载体gWiz-3B6-E4-G1中用三个人源化3B6 VH编码序列中的每一个替换原始大鼠VH编码序列，并在表达载体gWiz-3B6-E4-k中用两个人源化3B6 VL编码序列中的每一个替换原始大鼠VL编码序列，从而生成完全人源化的表达载体(图28)。使用相同的克隆策略来产生编码对照抗体的重链和轻链的表达载体。通过测序控制所有DNA构建体。
编码6种3B6人源化变体(表18)中每一个的重链和轻链以及阳性和阴性对照抗体的重链和轻链的表达载体，以及表达ch3B6重链和轻链的载体，均被瞬时共转染到细胞系293F中。
表18.列出了产生六个人源化抗体变体的VH和VL序列组合以及相应的CDRH和CDRL序列组合。数字对应于SEQ ID号码。
Figure BDA0002385150140000972
Figure BDA0002385150140000981
细胞上清液的蛋白质印迹分析表明，所有不同的3B6人源化变体均以高于嵌合3B6抗体的水平表达(图29)。
实施例12
六个3B6人源化变体的表征
在剂量响应实验中评估了表18中所列的6个3B6人源化变体在先前描述的如实施例8中进行的固相化验中抑制FGF19与固定的受体的结合的能力。
在添加FGF19和肝素之前，将固定化的FGFR4-Fc与递增浓度的每种抗体进行预孵育。纳入在实施例11中描述的嵌合ch3B6抗体和hLD1.v22抗体作为阳性对照，而无关抗体贝索洛单抗(Bezlotoxumab)用作同种型对照。
如图30所示，除同种型对照外，所有测试的抗体均对FGF19-FGFR4结合产生明显的剂量依赖性抑制，IC50值在亚/低nM范围内，与针对ch3B6和阳性对照抗体计算的非常相似。
实施例13
ch3B6与商业抗体ab41948的比较分析
根据在线可得的数据表，针对人FGFR4残基100-200内衍生的未公开序列的合成肽，产生了兔多克隆抗体ab41948，由Abcam市售。该抗体被描述为与人类受体发生特异性反应，适用于WB，ICC/IF和IHC应用。根据可用数据，与ch3B6不同，ab41948不会与鼠受体发生交叉反应。
为了评估ab41948是否与ch3B6共有任何生物学特性，我们对这两种抗体进行了比较分析。
首先，在我们的固相受体结合测定中商业抗体ab41948可以与hFGFR4-Fc重组蛋白结合。该测定基本上如实施例10中所述进行。在递增的浓度的抗体孵育后，使用以1：2000稀释的山羊抗兔IgG(HL)-HRP偶联物二抗(Pierce)进行检测。
如图31a中代表性的剂量反应结合曲线所示，ab41948可以有效地以亚纳摩尔亲和力结合受体。
接下来，我们在如实施例8中进行的固相测定中，通过在用递增的抗体浓度孵育后，加入23nM的等摩尔浓度的FGF19/肝素，评估了ab41948阻止/竞争FGF19与FGFR4-Fc结合的能力。ch3B6作为阳性对照重新平行测试。
代表性的剂量反应抑制曲线如图31b所示。尽管ch3B6确认可以有效抑制FGF19与受体的结合，IC50值为0.2μg/mL(1.3nM)，但ab41948导致完全失活。
最后，评估了ab41948抗体与ch3B6一起干扰敏感HCC细胞系Huh7中FGFR4信号传导途径激活的能力。为了这个目的，通过蛋白质印迹分析了对通过用FGF19的细胞处理诱导的下游效应蛋白FRS2的磷酸化的抑制作用(图31c)。
与ch3B6相反，ab41948导致无法抑制Huh7细胞中FGF19诱导的FRS2磷酸化。
总之，基于关键功能分析中ab41948抗体显示的生物活性缺乏，可以得出结论，这两种抗体在FGFR4酸性盒区域内不结合相同表位。
实施例14
ch3B6在结肠CSC衍生的异种移植模型中的抗肿瘤活性
我们测定了抗体ch3B6对免疫缺陷小鼠中结肠CSC注射产生的皮下肿瘤的影响。
将CTSC85细胞重悬于冷PBS中，并将悬浮液与等体积的冷基质胶(BectonDickinson)混合，最终细胞浓度为5×106细胞/mL。向26只NOD/SCID小鼠(Charles River)皮下注射0.2mL细胞/基质胶悬浮液。移植后三周，将表现出可测量肿瘤的小鼠随机分为两个治疗组(n＝9)，即抗FGFR4抗体ch3B6和载体对照组，每组平均肿瘤体积为65mm3。
通过IP注射用25mg/Kg ch3B6抗体的PBS溶液处理小鼠，每周两次，共两周。对照组接受相应体积的空白注射液(PBS)。每周两次控制小鼠体重，并每周两次用游标卡尺测量肿瘤大小(长轴和短轴)。使用以下公式计算肿瘤体积：TV(mm3)＝d2×D/2，其中d和D分别指最短直径和最长直径。
与载体处理的对照相比，ch3B6显著降低了肿瘤的生长速度(图32)。在治疗期间未观察到体重减轻或临床不良反应。
实施例15
ch3B6和ch6C9对结肠CSC衍生的肝转移模型的抗肿瘤活性
我们测定了抗体ch3B6和ch6C9对免疫缺陷小鼠肝脏中结肠CSC注射产生的肝转移的影响。
为了这个目的，使用了报告子CTSC85 LUC-GFP细胞系。使用pRRLsin-cPPT-hCMV-hPGK-GFP-Wpre载体通过慢病毒感染产生CTSC85LUC-GFP细胞(Ricci-Vitiani等人，2004)。将荧光素酶cDNA克隆到GFP慢病毒载体中(Ricci-Vitiani等人，2004)。如先前所述，在包装的人胚胎肾细胞系293T中通过磷酸钙转染方案产生了慢病毒颗粒(Ricci-Vitiani等人，2004)。转染后48h收集病毒上清液，通过0.45μm孔径的过滤器过滤，并在存在8μg/ml聚凝胺的情况下添加到细胞中。将细胞以1800rpm离心30分钟。感染后，通过FACSCanto(BectonDickinson)评价转导细胞的荧光。
将CTSC85 LUC-GFP细胞重悬于冷PBS中，并将悬浮液与等体积的冷基质胶(BectonDickinson)混合，最终细胞浓度为1.25×107细胞/mL。将20μL的细胞/基质胶悬浮液(250000个细胞)注射到三十只NOD/SCID小鼠(Charles River)的每一只的肝实质中。使用IVIS Spectrum成像仪(PerkinElmer)通过荧光素酶标记的癌细胞的生物发光成像监测肿瘤的生长。移植后十天，将小鼠随机分为ch3B6，ch6C9和对照组三组(n＝7)，所有组的平均光子/秒均值相似。通过IP注射25mg/Kg的在PBS中的每种抗体对小鼠进行处理，每周两次，连续四周。对照组接受相应体积的空白注射液(PBS)。每周一次测量小鼠体重和肿瘤生长。除测量肿瘤信号和体重外，将处理的小鼠维持长达2周而不进行任何进一步治疗，然后通过颈脱位法处死。
与载体处理的对照相比，ch3B6和ch6C9均能够降低肿瘤的生长速率(图33)。特别地，ch3B6显示的抗肿瘤作用达到统计学显著性。
在治疗期间未观察到体重减轻或临床不良反应。
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<400> 5
Asn Tyr Tyr Met Ala
1 5
<210> 6
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多肽"
<400> 6
Asn Tyr Tyr Met Ser
1 5
<210> 7
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多肽"
<400> 7
Thr Ile Asn Pro Ser Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 8
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多肽"
<400> 8
Asn Ile Asn Pro Ser Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多肽"
<400> 9
Leu Tyr Asn Asn Tyr Ala Phe Asp Tyr
1 5
<210> 10
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多肽"
<400> 10
Asp Val Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Leu Ala Val Ser Pro Gly Glu
1 5 10 15
Arg Val Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Thr Leu Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
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Gly Thr Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile Asp Pro Val Glu Ala Asp
65 70 75 80
Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Trp Asn Asp Pro Pro Thr
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Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys
100 105
<210> 11
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多肽"
<400> 11
Asp Val Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Leu Ala Val Ser Pro Gly Glu
1 5 10 15
Arg Val Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Thr Leu Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Gly Thr Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile Asp Pro Val Glu Ala Asp
65 70 75 80
Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Trp Asn Asp Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 12
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多肽"
<400> 12
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Ile Ser Thr Leu
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Thr Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Trp Asn Asp Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 13
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多肽"
<400> 13
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Thr Leu
20 25 30
Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Thr Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Trp Asn Asp Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 14
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多肽"
<400> 14
Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Thr Leu Met His
1 5 10
<210> 15
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多肽"
<400> 15
Arg Ala Ser Glu Ser Ile Ser Thr Leu Leu His
1 5 10
<210> 16
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多肽"
<400> 16
Gly Thr Ser Asn Leu Glu Ser
1 5
<210> 17
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多肽"
<400> 17
Gln Gln Ser Trp Asn Asp Pro Pro Thr
1 5
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<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
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gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ctagtgcagc ctggaaggtc cctgaaactc 60
tcctgtgcag cctcaggatt cactttcagt aattattaca tggcctgggt ccgccaggct 120
ccaaagaagg gtctggagtg ggtcgcaacc attaatccca gtggtaccag aacttactat 180
ccagactccg tgaaaggccg attcactctc tccagagata gtgcaaagag cagcctatat 240
ctgcaaatga acagtctgaa gtctgaggac acggccactt tttactgtgc aaggctttat 300
aacaactacg cttttgatta ctggggccag ggagtcatgg tcacagtctc ctca 354
<210> 19
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多核苷酸"
<400> 19
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ctagtgcagc ctggaaggtc cctgaaactc 60
tcctgtgcag cctcaggatt cactttcagt aattattaca tggcctgggt ccgccaggct 120
ccaaagaagg gtctggagtg ggtcgcaacc attaatccca gtggtaccag aacttactat 180
ccagactccg tgaaaggccg attcactctc tccagagata gtgcaaagag cagcctatat 240
ctgcaaatga acagtctgaa gtctgaggac acggccactt tttactgtgc aaggctttat 300
aacaactacg cttttgatta ctggggccaa ggagtcatgg tcactgtctc ctca 354
<210> 20
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多核苷酸"
<400> 20
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt aactattaca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtggccacc ataaacccta gcggaaccag aacctactat 180
ccagactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagactgtac 300
aacaattacg cctttgacta ctggggccaa ggaaccctgg tcaccgtctc ctca 354
<210> 21
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多核苷酸"
<400> 21
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt aactattaca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtggccaac ataaacccta gcggaaccag aacctactat 180
ccagactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagactgtac 300
aacaattacg cctttgacta ctggggccaa ggaaccctgg tcaccgtctc ctca 354
<210> 22
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多核苷酸"
<400> 22
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt aactattaca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtggccacc ataaacccta gcggaaccag aacctactat 180
ccagactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca gcgccaagag ctcactgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagactgtac 300
aacaattacg cctttgacta ctggggccaa ggaaccctgg tcaccgtctc ctca 354
<210> 23
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多核苷酸"
<400> 23
gatgtccaga tgacccagtc tcctgctttg gctgtgtctc caggagagag ggtttccatc 60
tcctgtaggg ccagtgaaag tgtcagtaca cttatgcact ggtaccaaca gaaaccagga 120
cagcaaccca aactcctcat ctacggtaca tccaacctag agtctggagt ccctgccagg 180
ttcagtggca gtgggtctgg gacagacttc accctcaaca tagatcctgt ggaggctgat 240
gacactgcaa cctatttctg tcagcagagt tggaatgatc ctccgacgtt cggtggaggc 300
accaagctgg aagtgaaa 318
<210> 24
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多核苷酸"
<400> 24
gatgtccaga tgacccagtc tcctgctttg gctgtgtctc caggagagag ggtttccatc 60
tcctgtaggg ccagtgaaag tgtcagtaca cttatgcact ggtaccaaca gaaaccagga 120
cagcaaccca aactcctcat ctacggtaca tccaacctag agtctggagt ccctgccagg 180
ttcagtggca gtgggtctgg gacagacttc accctcaaca tagatcctgt ggaggctgat 240
gacactgcaa cctatttctg tcagcagagt tggaatgatc ctccgacgtt cggtggaggc 300
accaagctgg aattgaaa 318
<210> 25
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多核苷酸"
<400> 25
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtga gagcattagc accctgttac actggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatggc acctccaact tggagagtgg ggtcccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240
gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttggaacg accctcccac tttcggcgga 300
gggaccaagg tggagatcaa a 321
<210> 26
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多核苷酸"
<400> 26
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtga gagcgtgagc accctgatgc actggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatggc acctccaact tggagagtgg ggtcccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240
gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttggaacg accctcccac tttcggcgga 300
gggaccaagg tggagatcaa a 321
<210> 27
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多肽"
<400> 27
Asp Glu Asp Pro Lys Ser His Arg Asp Pro Ser Asn Arg His Ser Tyr
1 5 10 15
Pro Gln Gln Ala Pro Tyr Trp Thr His Pro Gln Arg
20 25
<210> 28
<211> 1392
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多核苷酸"
<400> 28
atgaatctac ttctgatcct tacctttgtt gcggccgctg ttgcggaggt gcagctggtg 60
gagtctgggg gaggcctagt gcagcctgga aggtccctga aactctcctg tgcagcctca 120
ggattcactt tcagtaatta ttacatggcc tgggtccgcc aggctccaaa gaagggtctg 180
gagtgggtcg caaccattaa tcccagtggt accagaactt actatccaga ctccgtgaaa 240
ggccgattca ctctctccag agatagtgca aagagcagcc tatatctgca aatgaacagt 300
ctgaagtctg aggacacggc cactttttac tgtgcaaggc tttataacaa ctacgctttt 360
gattactggg gccaaggagt catggtcact gtctcctcag cgtcgaccaa gggcccatcg 420
gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc 480
ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc 540
agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta cagtcctcag gactctactc cctcagcagc 600
gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac 660
aagcccagca acaccaaggt ggacaagaaa gttgagccca aatcttgtga caaaactcac 720
acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc 780
ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 840
gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 900
cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc 960
gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 1020
aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga 1080
gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgcgaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc 1140
ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 1200
gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 1260
ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1320
tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1380
ccgggtaaat ga 1392
<210> 29
<211> 1392
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多核苷酸"
<400> 29
atgaatctac ttctgatcct tacctttgtt gcggccgctg ttgcggaggt gcagctggtg 60
gagtctgggg gaggcttggt ccagcctggg gggtccctga gactctcctg tgcagcctct 120
ggattcacct ttagtaacta ttacatgagc tgggtccgcc aggctccagg gaaggggctg 180
gagtgggtgg ccaccataaa ccctagcgga accagaacct actatccaga ctctgtgaag 240
ggccgattca ccatctccag agacaacgcc aagaactcac tgtatctgca aatgaacagc 300
ctgagagccg aggacacggc tgtgtattac tgtgcgagac tgtacaacaa ttacgccttt 360
gactactggg gccaaggaac cctggtcacc gtctcctcag cgtcgaccaa gggcccatcg 420
gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc 480
ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc 540
agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta cagtcctcag gactctactc cctcagcagc 600
gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac 660
aagcccagca acaccaaggt ggacaagaaa gttgagccca aatcttgtga caaaactcac 720
acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc 780
ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 840
gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 900
cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc 960
gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 1020
aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga 1080
gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgcgaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc 1140
ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 1200
gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 1260
ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1320
tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1380
ccgggtaaat ga 1392
<210> 30
<211> 1392
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多核苷酸"
<400> 30
atgaatctac ttctgatcct tacctttgtt gcggccgctg ttgcggaggt gcagctggtg 60
gagtctgggg gaggcttggt ccagcctggg gggtccctga gactctcctg tgcagcctct 120
ggattcacct ttagtaacta ttacatgagc tgggtccgcc aggctccagg gaaggggctg 180
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ggccgattca ccatctccag agacaacgcc aagaactcac tgtatctgca aatgaacagc 300
ctgagagccg aggacacggc tgtgtattac tgtgcgagac tgtacaacaa ttacgccttt 360
gactactggg gccaaggaac cctggtcacc gtctcctcag cgtcgaccaa gggcccatcg 420
gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc 480
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agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta cagtcctcag gactctactc cctcagcagc 600
gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac 660
aagcccagca acaccaaggt ggacaagaaa gttgagccca aatcttgtga caaaactcac 720
acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc 780
ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 840
gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 900
cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc 960
gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 1020
aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga 1080
gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgcgaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc 1140
ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 1200
gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 1260
ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1320
tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1380
ccgggtaaat ga 1392
<210> 31
<211> 1392
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多核苷酸"
<400> 31
atgaatctac ttctgatcct tacctttgtt gcggccgctg ttgcggaggt gcagctggtg 60
gagtctgggg gaggcttggt ccagcctggg gggtccctga gactctcctg tgcagcctct 120
ggattcacct ttagtaacta ttacatgagc tgggtccgcc aggctccagg gaaggggctg 180
gagtgggtgg ccaccataaa ccctagcgga accagaacct actatccaga ctctgtgaag 240
ggccgattca ccatctccag agacagcgcc aagagctcac tgtatctgca aatgaacagc 300
ctgagagccg aggacacggc tgtgtattac tgtgcgagac tgtacaacaa ttacgccttt 360
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gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc 480
ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc 540
agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta cagtcctcag gactctactc cctcagcagc 600
gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac 660
aagcccagca acaccaaggt ggacaagaaa gttgagccca aatcttgtga caaaactcac 720
acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc 780
ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 840
gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 900
cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc 960
gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 1020
aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga 1080
gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgcgaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc 1140
ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 1200
gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 1260
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tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1380
ccgggtaaat ga 1392
<210> 32
<211> 687
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多核苷酸"
<400> 32
atgaatctac ttctgatcct tacctttgtt gcggccgctg ttgcggatgt ccagatgacc 60
cagtctcctg ctttggctgt gtctccagga gagagggttt ccatctcctg tagggccagt 120
gaaagtgtca gtacacttat gcactggtac caacagaaac caggacagca acccaaactc 180
ctcatctacg gtacatccaa cctagagtct ggagtccctg ccaggttcag tggcagtggg 240
tctgggacag acttcaccct caacatagat cctgtggagg ctgatgacac tgcaacctat 300
ttctgtcagc agagttggaa tgatcctccg acgttcggtg gaggcaccaa gctggaattg 360
aaacgtacgg tggctgcacc atctgtcttc atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa 420
tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg aataacttct atcccagaga ggccaaagta 480
cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag 540
gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc agcaccctga cgctgagcaa agcagactac 600
gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca 660
aagagcttca acaggggaga gtgttga 687
<210> 33
<211> 690
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多核苷酸"
<400> 33
atgaatctac ttctgatcct tacctttgtt gcggccgctg ttgcggacat ccagatgacc 60
cagtctccat cctccctgtc tgcatctgta ggagacagag tcaccatcac ttgccgggca 120
agtgagagca ttagcaccct gttacactgg tatcagcaga aaccagggaa agcccctaag 180
ctcctgatct atggcacctc caacttggag agtggggtcc catcaaggtt cagtggcagt 240
ggatctggga cagatttcac tctcaccatc agcagtctgc aacctgaaga ttttgcaact 300
tactactgtc aacagagttg gaacgaccct cccactttcg gcggagggac caaggtggag 360
atcaaacgta cggtggctgc accatctgtc ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg 420
aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg ctgaataact tctatcccag agaggccaaa 480
gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag 540
caggacagca aggacagcac ctacagcctc agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac 600
tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc 660
acaaagagct tcaacagggg agagtgttga 690
<210> 34
<211> 690
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多核苷酸"
<400> 34
atgaatctac ttctgatcct tacctttgtt gcggccgctg ttgcggacat ccagatgacc 60
cagtctccat cctccctgtc tgcatctgta ggagacagag tcaccatcac ttgccgggca 120
agtgagagcg tgagcaccct gatgcactgg tatcagcaga aaccagggaa agcccctaag 180
ctcctgatct atggcacctc caacttggag agtggggtcc catcaaggtt cagtggcagt 240
ggatctggga cagatttcac tctcaccatc agcagtctgc aacctgaaga ttttgcaact 300
tactactgtc aacagagttg gaacgaccct cccactttcg gcggagggac caaggtggag 360
atcaaacgta cggtggctgc accatctgtc ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg 420
aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg ctgaataact tctatcccag agaggccaaa 480
gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag 540
caggacagca aggacagcac ctacagcctc agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac 600
tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc 660
acaaagagct tcaacagggg agagtgttga 690
<210> 35
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多肽"
<400> 35
Ala Pro Tyr Trp Thr His Pro Gln Arg Met Glu Lys Lys Leu His
1 5 10 15
<210> 36
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多肽"
<400> 36
Thr His Pro Gln Arg Met Glu Lys Lys Leu His Ala Val Pro Ala
1 5 10 15
<210> 37
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多肽"
<400> 37
Arg Met Glu Lys Lys Leu His Ala Val Pro Ala Gly Asn Thr Val
1 5 10 15
<210> 38
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多肽"
<400> 38
Lys Leu His Ala Val Pro Ala Gly Asn Thr Val Lys Phe Arg Cys
1 5 10 15
<210> 39
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多肽"
<400> 39
Val Pro Ala Gly Asn Thr Val Lys Phe Arg Cys Pro Ala Ala Gly
1 5 10 15
<210> 40
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多肽"
<400> 40
Asn Thr Val Lys Phe Arg Cys Pro Ala Ala Gly Asn Pro Thr Pro
1 5 10 15
<210> 41
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多肽"
<400> 41
Phe Arg Cys Pro Ala Ala Gly Asn Pro Thr Pro Thr Ile Arg Trp
1 5 10 15
<210> 42
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多肽"
<400> 42
Ala Ala Gly Asn Pro Thr Pro Thr Ile Arg Trp Leu Lys Asp Gly
1 5 10 15
<210> 43
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多肽"
<400> 43
Pro Thr Pro Thr Ile Arg Trp Leu Lys Asp Gly Gln Ala Phe His
1 5 10 15
<210> 44
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多肽"
<400> 44
Ile Arg Trp Leu Lys Asp Gly Gln Ala Phe His Gly Glu Asn Arg
1 5 10 15
<210> 45
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多肽"
<400> 45
Lys Asp Gly Gln Ala Phe His Gly Glu Asn Arg Ile Gly Gly Ile
1 5 10 15
<210> 46
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多肽"
<400> 46
Ala Phe His Gly Glu Asn Arg Ile Gly Gly Ile Arg Leu Arg His
1 5 10 15
<210> 47
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多肽"
<400> 47
Glu Asn Arg Ile Gly Gly Ile Arg Leu Arg His Gln His Trp Ser
1 5 10 15
<210> 48
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多肽"
<400> 48
Gly Gly Ile Arg Leu Arg His Gln His Trp Ser Leu Val Met Glu
1 5 10 15
<210> 49
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多肽"
<400> 49
Leu Arg His Gln His Trp Ser Leu Val Met Glu Ser Val Val Pro
1 5 10 15
<210> 50
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多肽"
<400> 50
His Trp Ser Leu Val Met Glu Ser Val Val Pro Ser Asp Arg Gly
1 5 10 15
<210> 51
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多肽"
<400> 51
Val Met Glu Ser Val Val Pro Ser Asp Arg Gly Thr Tyr Thr Cys
1 5 10 15
<210> 52
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多肽"
<400> 52
Val Val Pro Ser Asp Arg Gly Thr Tyr Thr Cys Leu Val Glu Asn
1 5 10 15
<210> 53
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多肽"
<400> 53
Asp Arg Gly Thr Tyr Thr Cys Leu Val Glu Asn Ala Val Gly Ser
1 5 10 15
<210> 54
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多肽"
<400> 54
Tyr Thr Cys Leu Val Glu Asn Ala Val Gly Ser Ile Arg Tyr Asn
1 5 10 15
<210> 55
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多肽"
<400> 55
Val Glu Asn Ala Val Gly Ser Ile Arg Tyr Asn Tyr Leu Leu Asp
1 5 10 15
<210> 56
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多肽"
<400> 56
Glu Asn Ala Val Gly Ser Ile Arg Tyr Asn Tyr Leu Leu Asp Val
1 5 10 15
<210> 57
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多肽"
<400> 57
Phe Arg Cys Pro Ala Ala Gly Asn Pro Thr Pro Thr Ile Arg Trp Leu
1 5 10 15
Lys Asp Gly Gln Ala Phe His
20
<210> 58
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多肽"
<400> 58
Ile Thr Gly Asp Ser Leu Thr Ser Ser Asn Asp Asp Glu Asp Pro
1 5 10 15
<210> 59
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多肽"
<400> 59
Thr Gly Asp Ser Leu Thr Ser Ser Asn Asp Asp Glu Asp Pro Lys
1 5 10 15
<210> 60
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多肽"
<400> 60
Gly Asp Ser Leu Thr Ser Ser Asn Asp Asp Glu Asp Pro Lys Ser
1 5 10 15
<210> 61
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多肽"
<400> 61
Asp Ser Leu Thr Ser Ser Asn Asp Asp Glu Asp Pro Lys Ser His
1 5 10 15
<210> 62
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多肽"
<400> 62
Ser Leu Thr Ser Ser Asn Asp Asp Glu Asp Pro Lys Ser His Arg
1 5 10 15
<210> 63
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多肽"
<400> 63
Leu Thr Ser Ser Asn Asp Asp Glu Asp Pro Lys Ser His Arg Asp
1 5 10 15
<210> 64
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多肽"
<400> 64
Thr Ser Ser Asn Asp Asp Glu Asp Pro Lys Ser His Arg Asp Pro
1 5 10 15
<210> 65
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多肽"
<400> 65
Ser Ser Asn Asp Asp Glu Asp Pro Lys Ser His Arg Asp Pro Ser
1 5 10 15
<210> 66
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多肽"
<400> 66
Ser Asn Asp Asp Glu Asp Pro Lys Ser His Arg Asp Pro Ser Asn
1 5 10 15
<210> 67
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多肽"
<400> 67
Asn Asp Asp Glu Asp Pro Lys Ser His Arg Asp Pro Ser Asn Arg
1 5 10 15
<210> 68
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多肽"
<400> 68
Asp Asp Glu Asp Pro Lys Ser His Arg Ser Pro Ser Asn Arg His
1 5 10 15
<210> 69
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多肽"
<400> 69
Asp Glu Asp Pro Lys Ser His Arg Asp Pro Ser Asn Arg His Ser
1 5 10 15
<210> 70
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多肽"
<400> 70
Glu Asp Pro Lys Ser His Arg Asp Pro Ser Asn Arg His Ser Tyr
1 5 10 15
<210> 71
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多肽"
<400> 71
Asp Pro Lys Ser His Arg Asp Pro Ser Asn Arg His Ser Tyr Pro
1 5 10 15
<210> 72
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多肽"
<400> 72
Pro Lys Ser His Arg Asp Pro Ser Asn Arg His Ser Tyr Pro Gln
1 5 10 15
<210> 73
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多肽"
<400> 73
Lys Ser His Arg Asp Pro Ser Asn Arg His Ser Tyr Pro Gln Gln
1 5 10 15
<210> 74
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多肽"
<400> 74
Ser His Arg Asp Pro Ser Asn Arg His Ser Tyr Pro Gln Gln Ala
1 5 10 15
<210> 75
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多肽"
<400> 75
His Arg Asp Pro Ser Asn Arg His Ser Tyr Pro Gln Gln Ala Pro
1 5 10 15
<210> 76
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多肽"
<400> 76
Arg Asp Pro Ser Asn Arg His Ser Tyr Pro Gln Gln Ala Pro Tyr
1 5 10 15
<210> 77
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多肽"
<400> 77
Asp Pro Ser Asn Arg His Ser Tyr Pro Gln Gln Ala Pro Tyr Trp
1 5 10 15
<210> 78
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多肽"
<400> 78
Pro Ser Asn Arg His Ser Tyr Pro Gln Gln Ala Pro Tyr Trp Thr
1 5 10 15
<210> 79
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多肽"
<400> 79
Ser Asn Arg His Ser Tyr Pro Gln Gln Ala Pro Tyr Trp Thr His
1 5 10 15
<210> 80
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多肽"
<400> 80
Asn Arg His Ser Tyr Pro Gln Gln Ala Pro Tyr Trp Thr His Pro
1 5 10 15
<210> 81
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多肽"
<400> 81
Arg His Ser Tyr Pro Gln Gln Ala Pro Tyr Trp Thr His Pro Gln
1 5 10 15
<210> 82
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多肽"
<400> 82
His Ser Tyr Pro Gln Gln Ala Pro Tyr Trp Thr His Pro Gln Arg
1 5 10 15
<210> 83
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多肽"
<400> 83
Ser Tyr Pro Gln Gln Ala Pro Tyr Trp Thr His Pro Gln Arg Met
1 5 10 15
<210> 84
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多肽"
<400> 84
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Asn Pro Ser Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Tyr Asn Asn Tyr Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 85
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多肽"
<400> 85
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Asn Pro Ser Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Phe Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Tyr Asn Asn Tyr Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 86
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多肽"
<400> 86
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Asn Pro Ser Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Arg Asp Ser Ala Lys Ser Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Phe Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Tyr Asn Asn Tyr Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 87
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多肽"
<400> 87
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Asn Pro Ser Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Arg Asp Ser Ala Lys Ser Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Tyr Asn Asn Tyr Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 88
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多肽"
<400> 88
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Asn Pro Ser Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Tyr Asn Asn Tyr Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 89
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多肽"
<400> 89
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Ile Ser Thr Leu
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Gln Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Thr Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Trp Asn Asp Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 90
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多肽"
<400> 90
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Thr Leu
20 25 30
Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Gln Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Thr Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Trp Asn Asp Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 91
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多肽"
<400> 91
Asp Val Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Ile Ser Thr Leu
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Thr Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Trp Asn Asp Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 92
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多核苷酸"
<400> 92
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt aactattaca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtggccacc ataaacccta gcggaaccag aacctactat 180
ccagactctg tgaagggccg attcaccctc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagactgtac 300
aacaattacg cctttgacta ctggggccaa ggaaccctgg tcaccgtctc ctca 354
<210> 93
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多核苷酸"
<400> 93
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt aactattaca tggcctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtggccacc ataaacccta gcggaaccag aacctactat 180
ccagactctg tgaagggccg attcaccctc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctacct tctactgtgc gagactgtac 300
aacaattacg cctttgacta ctggggccaa ggaaccctgg tcaccgtctc ctca 354
<210> 94
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多核苷酸"
<400> 94
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt aactattaca tggcctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtggccacc ataaacccta gcggaaccag aacctactat 180
ccagactctg tgaagggccg attcaccctc tccagagaca gcgccaagag ctcactgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctacct tctactgtgc gagactgtac 300
aacaattacg cctttgacta ctggggccaa ggaaccctgg tcaccgtctc ctca 354
<210> 95
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
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<400> 95
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt aactattaca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtggccacc ataaacccta gcggaaccag aacctactat 180
ccagactctg tgaagggccg attcaccctc tccagagaca gcgccaagag ctcactgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagactgtac 300
aacaattacg cctttgacta ctggggccaa ggaaccctgg tcaccgtctc ctca 354
<210> 96
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
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<400> 96
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt aactattaca tggcctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtggccacc ataaacccta gcggaaccag aacctactat 180
ccagactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctacct attactgtgc gagactgtac 300
aacaattacg cctttgacta ctggggccaa ggaaccctgg tcaccgtctc ctca 354
<210> 97
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多核苷酸"
<400> 97
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtga gagcattagc accctgttac actggtatca gcagaaacca 120
gggaaacagc ctaagctcct gatctatggc acctccaact tggagagtgg ggtcccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240
gaagattttg caacttactt ctgtcaacag agttggaacg accctcccac tttcggcgga 300
gggaccaagg tggagatcaa a 321
<210> 98
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多核苷酸"
<400> 98
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtga gagcgtgagc accctgatgc actggtatca gcagaaacca 120
gggaaacagc ctaagctcct gatctatggc acctccaact tggagagtgg ggtcccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240
gaagattttg caacttactt ctgtcaacag agttggaacg accctcccac tttcggcgga 300
gggaccaagg tggagatcaa a 321
<210> 99
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多核苷酸"
<400> 99
gacgtgcaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtga gagcattagc accctgttac actggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatggc acctccaact tggagagtgg ggtcccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240
gaagattttg caacttactt ctgtcaacag agttggaacg accctcccac tttcggcgga 300
gggaccaagg tggagatcaa a 321
<210> 100
<211> 89
<212> PRT
<213> 智人
<400> 100
Ala Arg Gly Ser Met Ile Val Leu Gln Asn Leu Thr Leu Ile Thr Gly
1 5 10 15
Asp Ser Leu Thr Ser Ser Asn Asp Asp Glu Asp Pro Lys Ser His Arg
20 25 30
Asp Pro Ser Asn Arg His Ser Tyr Pro Gln Gln Ala Pro Tyr Trp Thr
35 40 45
His Pro Gln Arg Met Glu Lys Lys Leu His Ala Val Pro Ala Gly Asn
50 55 60
Thr Val Lys Phe Arg Cys Pro Ala Ala Gly Asn Pro Thr Pro Thr Ile
65 70 75 80
Arg Trp Leu Lys Asp Gly Gln Ala Phe
85
<210> 101
<211> 89
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 101
Ala Arg Gly Ser Met Thr Val Val His Asn Leu Thr Leu Leu Met Asp
1 5 10 15
Asp Ser Leu Thr Ser Ile Ser Asn Asp Glu Asp Pro Lys Thr Leu Ser
20 25 30
Ser Ser Ser Ser Gly His Val Tyr Pro Gln Gln Ala Pro Tyr Trp Thr
35 40 45
His Pro Gln Arg Met Glu Lys Lys Leu His Ala Val Pro Ala Gly Asn
50 55 60
Thr Val Lys Phe Arg Cys Pro Ala Ala Gly Asn Pro Met Pro Thr Ile
65 70 75 80
His Trp Leu Lys Asp Gly Gln Ala Phe
85
<210> 102
<211> 28
<212> PRT
<213> 智人
<400> 102
Asp Glu Asp Pro Lys Ser His Arg Asp Pro Ser Asn Arg His Ser Tyr
1 5 10 15
Pro Gln Gln Ala Pro Tyr Trp Thr His Pro Gln Arg
20 25

Claims (28)

1.一种单克隆抗体，其识别在FGFR4的酸性盒结构域内的被包含在人FGFR4的氨基酸119至156之间的表位，并抑制FGF19与FGFR4的结合。
2.根据权利要求1所述的抗体，其识别被包含在人FGFR4的氨基酸127至154之间的表位。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的抗体，其将具有SEQ ID N.27的氨基酸序列识别为表位。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其与FGFR4的酸性盒或其一部分结合，并包含：
(i)重链CDR1，其包含如SEQ ID NO：5或6的氨基酸序列，和/或
(ii)重链CDR2，其包含如SEQ ID NO：7或8的氨基酸序列，和/或
(iii)重链CDR3，其包含如SEQ ID NO：9的氨基酸序列，和/或
(iv)轻链CDR1，其包含如SEQ ID NO：14或15的氨基酸序列，和/或
(v)轻链CDR2，其包含如SEQ ID NO：16的氨基酸序列，和/或
(vi)轻链CDR3，其包含如SEQ ID NO：17的氨基酸序列，
其中所述CDR中的任何一个与上述序列中的至少一个相比可以有一个或两个氨基酸不同，条件是所述抗体保持其结合特异性。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其与FGFR4的酸性盒或其一部分结合，其中其重链可变区由与SEQ ID NO：18-22或SEQ ID NO：92-96的任一序列具有至少80％的同一性的核苷酸序列编码，并且其轻链可变区由与SEQ ID NO：23-26或SEQ IDNO：97-99的任一序列具有至少80％的同一性的核苷酸序列编码，条件是所述抗体保持其结合特异性。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO：1-4或SEQ ID N.84-88中任一项的氨基酸序列或与所述序列的任一个具有至少85％的同一性的序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO：10-13或SEQ ID N.89-91中任一项的氨基酸序列的或与所述序列的任一个具有至少85％的同一性的序列。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的抗体，其是包含重链和轻链的人抗体，所述重链包含如SEQ ID NO：6所示的CDRH1、如SEQ ID NO：7所示的CDRH2和如SEQ ID NO：9所示的CDRH3，所述轻链包含如SEQ ID NO：14所示的CDRL1、如SEQ ID NO：16所示的CDRL2和如SEQID NO：17所示的CDRL3，其中所述CDR的一或多个与上述序列有1或2个氨基酸不同。
8.根据权利要求1-6中任一项所述的抗体，其是包含重链和轻链的人抗体，所述重链包含如SEQ ID NO：6所示的CDRH1、如SEQ ID NO：7所示的CDRH2和如SEQ ID NO：9所示的CDRH3，所述轻链包含如SEQ ID NO：15所示的CDRL1、如SEQ ID NO：16所示的CDRL2和如SEQID NO：17所示的CDRL3，其中所述CDR的一或多个与上述序列有1或2个氨基酸不同。
9.根据权利要求1-6中任一项所述的抗体，其是包含重链和轻链的人抗体，所述重链包含如SEQ ID NO：6所示的CDRH1、如SEQ ID NO：8所示的CDRH2和如SEQ ID NO：9所示的CDRH3，所述轻链包含如SEQ ID NO：14所示的CDRL1、如SEQ ID NO：16所示的CDRL2和如SEQID NO：17所示的CDRL3，其中所述CDR的一或多个与上述序列有1或2个氨基酸不同。
10.根据权利要求1-6中任一项所述的抗体，其是包含重链和轻链的人抗体，所述重链包含如SEQ ID NO：6所示的CDRH1、如SEQ ID NO：8所示的CDRH2和如SEQ ID NO：9所示的CDRH3，所述轻链包含如SEQ ID NO：15所示的CDRL1、如SEQ ID NO：16所示的CDRL2和如SEQID NO：17所示的CDRL3，其中所述CDR的一或多个与上述序列有1或2个氨基酸不同。
11.根据权利要求1-6中任一项所述的抗体，其是包含重链和轻链的大鼠或嵌合单克隆抗体，所述重链包含如SEQ ID NO：5所示的CDRH1、如SEQ ID NO：7所示的CDRH2和如SEQ IDNO：9所示的CDRH3，所述轻链包含如SEQ ID NO：14所示的CDRL1、如SEQ ID NO：16所示的CDRL2和如SEQ ID NO：17所示的CDRL3，其中所述CDR的一或多个与上述序列有1或2个氨基酸不同。
12.一种抗体，其识别被根据权利要求1-11中任一项所述的抗体识别的抗原或表位。
13.一种抗体或其抗原结合片段，其包含对于特异性结合根据权利要求1-11中任一项所述的抗体所结合的表位是必需的根据权利要求1-11中任一项所述的抗体的高变区的氨基酸。
14.一种分离的核酸分子，其选自由以下组成的组：
(a)编码根据权利要求1-11中任一项所述的抗体、其片段或衍生物的核酸序列，
(b)如SEQ ID NO：18-26、SEQ ID NO：28-34和SEQ ID NO：92-99中任一项所示的核酸序列，
与(a)或(b)中任一序列互补的核酸序列，和
能够在严苛条件下与(a)或(b)杂交的核酸序列。
15.根据权利要求14所述的核酸分子，其包含如SEQ ID NO：18-22或SEQ ID NO：92-96所示的序列中的至少一个以及如SEQ ID NO：23-26或SEQ ID NO：97-99所示的序列中的至少一个。
16.一种载体，其包含根据权利要求14或15所述的核酸序列，其优选为表达载体，其中所述核酸序列可操作地连接于控制序列。
17.宿主，特别是重组细胞，其包含根据权利要求14-15中任一项所述的核酸序列或根据权利要求16所述的载体。
18.根据权利要求1-13中任一项所述的抗体，其用于体内诊断，预防和/或治疗与FGFR4表达、过表达和/或过度活跃有关的疾病的用途。
19.根据权利要求1-13中任一项所述的抗体用于体外诊断与FGFR4表达、过表达和/或过度活跃有关的疾病的用途。
20.根据权利要求18或19的用于所述用途的所述抗体，其中所述疾病是癌症疾病，优选选自结肠癌，肝细胞癌(HCC)，乳腺癌，胃癌，结肠癌，横纹肌肉瘤，结直肠癌，前列腺癌，乳腺癌，垂体癌，卵巢癌，软组织肉瘤，黑色素瘤，头颈部鳞状上皮癌，肺腺癌，或者是肿瘤转移的形成。
21.根据权利要求18或19的用于所述用途的所述抗体，其中所述疾病是代谢疾病，心血管疾病或慢性肾脏疾病。
22.根据权利要求21的用于所述用途的所述抗体，其中，所述疾病是选自代谢综合症，糖尿病和肥胖症的代谢性疾病；或者其是选自心室肥大，心脏肥大，高血压，充血性心力衰竭，左心室肥大，尿毒症性心肌病，糖尿病性心肌病和原发性心肌病的心血管疾病。
23.抗FGFR4的抗体，特别是根据权利要求1-13中任一项所述的抗体，其用于体内检测和/或杀死和/或影响和/或抑制结肠癌干细胞的发育和/或分化的用途。
24.抗FGFR4的抗体，特别是根据权利要求1-13中任一项所述的抗体用于体外检测和/或杀死和/或影响和/或抑制结肠癌干细胞的发育和/或分化的用途。
25.药物组合物，其包含根据权利要求1-13中任一项所述的单克隆抗体抗FGFR4和至少一种药学上可接受的载体和/或辅料，任选地包含一种或多种其他活性成分，例如额外的抗赘生物剂、小分子抑制剂、抗肿瘤剂或化学治疗剂。
26.一种抗体-药物偶联物(ADC)，其包含根据权利要求1-13中任一项所述的单克隆抗体。
27.根据权利要求26所述的抗体-药物偶联物(ADC)，其中待与所述抗体连接的药物组分是选自由以下组成的组的毒素：奥利斯他汀，美登木素生物碱类，刺孢霉素，微管溶素，倍癌霉素，喜树碱类似物，苯并二氮杂卓，多柔比星，α-鹅膏蕈碱衍生物，蒽环类，根瘤菌素，thailanstatin，spliceostatin，隐藻素和组蛋白脱乙酰基酶抑制剂。
28.根据权利要求27所述的抗体-药物偶联物(ADC)，其中所述偶联物具有下式(I)
Figure FDA0002385150130000041
其中R为-CO-CH2-X-(A)n-B，
其中X选自由NRa组成的组，其中Ra选自由H和C1-C10烷基和O组成的组；
A可以存在或不存在，并且是自降解的接头，
n是0或1；
B是根据权利要求1-13中任一项所述的单克隆抗体；
及其药学上可接受的盐。
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