CN102165057B - 用于主动或过继性细胞疗法的类浆细胞树突细胞系 - Google Patents
用于主动或过继性细胞疗法的类浆细胞树突细胞系 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种诱导和扩增特异性效应物的方法，其包括：通过孵化具有至少一种抗原的类浆细胞树突细胞(pDC)系获得脉冲的类浆细胞树突细胞，所述脉冲的pDC随后经过辐射并与外周血单核细胞(PBMC)相接触，并培养或注射到有机体中。所述PBMC和经过脉冲和辐射的pDC共享至少一个主要组织相容性复合物(CMH)等位基因。
Description
说明
本发明涉及在半同种异体的背景下利用类浆细胞树突细胞系(pDC)诱导和扩增细胞毒素效应物的方法。本发明还涉及pDC系在获得用于治疗和/或预防传染病或癌症的药物中的用途。本发明还涉及包含pDC的疫苗以及治疗癌症或传染病的方法。
树突细胞
树突细胞在免疫反应中是关键的参与者：它们负责吸收抗原并处理所述抗原，目的是将其递呈给T淋巴细胞。存在不同类型的树突细胞，可以通过它们的个体发育和它们的功能性能来区分它们：来自表达CD11c、CD13和CD33分子的前体的髓样树突细胞(mDC)，以及类浆细胞树突细胞(pDC)，其特征在于IL3受体(CD123)的表达非常强以及能够在IL3和CD40L的作用下或病毒存在的情况下成熟。
pDC在1997年由G.Grouard等从扁桃体中特定鉴定(Grouard G等，J Exp Med.，1997；185：1101-1111)；它们也在血液中(O’Doherty U.等，Immunology，1994；82：487-493；Robinson SP.等，Eur J Immunol.1999；29：2769-2778)、淋巴结中(Cella M.等，Nat Med.，1999；5：919-923)以及胸腺中(Res PC.等，Blood，1999；94：2647-2657；Bendriss-Vermare N.等，J Clin Invest.，2001；107：835-844)进行描述。这些细胞特征在于其类浆细胞型形态学和其表型。
pDC表达CD4、HLA-DR和CD45RA分子并且缺乏髓样标记CD11c和CD13(Cella M.等，Nat Med.，1999；5：919-923)或缺乏细胞系特异性标记诸如CD3、CD14和CD19，尽管有时观察到CD2、CD5或CD7的表达(Cella M.等，Nat Med.，1999；5：919-923；Res PC.等，Blood.，1999；94：2647-2657)。最近，鉴定由pDC特异性表达的凝集素BDCA2已经成为可能；BDCA4发现于pDC上但是在单核细胞衍生的DC上也存在(Dzionek A.等，J Immunol.，2000；165：6037-6046)。一种支持这些细胞属于淋巴系的想法的理由在于这样的事实，即它们表达编码preTalpha链(Res PC.等，Blood.，1999；94：2647-2657)、类-λ14.1和SpiB(Bendriss-Vermare N.等，J Clin Invest.，2001；107：835-844)的mRNA。这些细胞非常强地表达IL-3受体而表达GM-CSF受体是弱的(Cella M.等，Nat Med.，1999；5：919-923；Rissoan MC.等，Science.，1999；283：1183-1186)，并且这两种细胞因子促进pDC的存活(Grouard G.等，J Exp Med.，1997；185：1101-1111；Kohrgruber N.等，JImmunol.，1999；163：3250-3259；Robinson SP.等，Eur J Immunol.，1999；29：2769-2778)，否则pDC在体外会非常迅速地死亡。共刺激分子CD80和CD86不存在或弱表达(Grouard G.等，J Exp Med.，1997；185：1101-1111)，并且在未成熟阶段，这些细胞不能激活T淋巴细胞(Kohrgruber N.等，JImmunol.，1999；163：3250-3259)。另一方面，在IL-3、CD40L或病毒存在的情况下，pDC成熟，强表达抗原递呈辅助分子(CD40、CD80、CD86和HLA-DR)并且然后变得能够激活同种异体T细胞的增殖(Kohrgruber N.等，J Immunol.，1999；163：3250-3259；Grabbe S.等，Immunol Today.，2000；21：431-433；Kadowaki N.等，J Exp Med.，2000；192：219-226)。取决于负责其成熟的刺激物(IL3或病毒)，pDC将willpolarize the response of the T lymphocytes that they activate，more orless strictly，toward a Th1 or Th2 profile(Rissoan MC.等，Science.，1999；283：1183-1186；Cella M.等，Nat.Immunol.，2000；1：305-310；Kadowaki N.等，J Exp Med.，2000；192：219-226)。pDC也被描述用于诱导调节CD和CD4T反应(Gilliet& Liu，Hum.Immunol.63，2002；Wei等，Cancer Res.65(12)，2005；Gilliet & Liu，J.Exp.Med.，195(6)，2002)。
肿瘤或传染病环境中的树突细胞
在肿瘤情况中，pDC经常表现出未成熟的状态和致耐受性功能(Perrot等，The J.of Imm.，2007；Hartmann等，Cancer Res.，63，2003；Treilleux等，Clinical Cancer Res.，10，2004)。应当注意，通过pDC的乳腺癌浸润与不利的患者存活预测相关，这表示在所述癌症进展中的作用(Treilleux等，2004)，或者在肿瘤微环境中在其功能抑制中的作用。
在病毒感染情况中，由于pDC分泌干扰素-α以及由于其递呈病毒抗原以便激活细胞毒素CD8+T淋巴细胞的能力，pDC在引发抗病毒反应中具有重要作用(Hoefel等，2008，Immunity 27：481-492；DiPucchio，2008，Nature Immunol.adv online publication)。
主动免疫治疗和同种异型免疫治疗
很多临床试验展示了自体髓样树突细胞(mDC)刺激抗肿瘤免疫反应的能力(Thurner等，1999，J.Exp.Med.190(11)：1669-78；Palucka等，2005，J.Immunother.28(2)：158-68)。在大多数的这些试验中，mDC产生自取自患者的单核细胞，并在细胞因子存在下培养几天，而且这有时包括细胞成熟的另外步骤。这些mDC的生产因此必须针对每位患者个体进行，并且直到此刻利用自体mDC进行的临时试验不提供充足的临床功效以改进总体的患者存活(Banchereau等，2005，Nat.Rev.Immunol.5(4)：296-306)。
在同种异型的环境中细胞疫苗的免疫原性可以被改进；因此在免疫治疗方案中利用半同种异型mDC或利用办同种异型肿瘤系已经得到证明(Hus等，2005，Leukemia 19：1621-1627；Holtl等，2005，CancerImmunol Immunother.54：663-670)。mDC可以从MUTZ3系获得，其是得自白血病的CD34+髓样细胞系。mDC从该细胞系的获取是复杂的(用GM-CSF、IL-4和TNF-α刺激，然后通过添加TNF-α、IL-6、IL-1β和PGE2成熟)。这些MUTZ-3-衍生的mDC被描述为能够体外诱导肿瘤抗原特异性细胞毒T淋巴细胞(Santegoets等，2006 Cancer Immunol.Immunother.55：1480-1490，US 2004/0265998)。然而，反应的诱导水平非常低，仅有0.4％抗原特异性细胞毒T细胞从T淋巴细胞中获得。
此外，利用CD80共刺激因子分子转染的KS乳腺癌系也能够诱导肿瘤抗原特异性T细胞(Guckel，2005，Cancer Immunol.Immunother.，54：129-140)并且已经用在I/II期临床试验中。然而，所诱导的反应就由该系(Her-2/Neu)所表达的抗原被限制，并且未使得诱导针对其他肿瘤或病毒抗原的反应成为可能。
本发明提供对目前免疫治疗策略问题的解决方案，所述问题涉及在执行所述方案以及其工业化方面的困难，涉及缺乏治疗效果，以及涉及所述策略针对高度定向的病理状态被开发并且因此具有非常严格的应用领域这样的事实。
具体而言，本发明的主题是在半同种异型的环境中利用pDC系诱导和扩增特异性效应物的方法，所述系生产药物特别是疫苗的用途，以及本发明的主题还是预防和/或治疗癌症和/或传染病的方法。
本发明的说明
本发明涉及体外诱导和扩增特异性效应物的方法，其包括通过用至少一种抗原孵化pDC系获得脉冲类浆细胞树突细胞(pDC)，所述脉冲pDC随后被辐射并且与外周血单核细胞接触(PBMC)并培养。该脉冲且辐射的pDC和PBMC共享至少一个主要组织相容性复合物(CMH)等位基因。
特异性效应物树木的更大的扩增可以通过至少一个另外的回合获得，即使得自上述培养的细胞与脉冲且辐射的pDC接触，之后进行培养步骤。
本发明也涉及诱导和扩增特异性效应物的方法，其包括通过用至少一种抗原孵化pDC系获得脉冲类浆细胞树突细胞(pDC)，所述脉冲pDC随后被辐射，所述脉冲且辐射的pDC被注射到生物体中。该pDC与其所注射进入的生物体的PBMC共享至少一个CMH等位基因。所述脉冲且辐射的pDC的注射可以被重复。
在本发明的上下文下，术语“生物体”最特定地定义了人或人源化小鼠。
术语“细胞系”适用于体外培养的哺乳动物细胞。初级哺乳动物细胞在培养物中不繁殖，或者在有限次数的分裂之后在培养物中停止繁殖。根据本发明的细胞系能够不确定地繁殖，哺乳动物细胞的原代或继代培养是不能的。根据本发明的人类浆细胞树突细胞(pDC)系的这些性质使得通过这些细胞的体外繁殖或增殖而有利地获得大量的细胞成为可能。
在本发明的一个实施方式中，pDC系得自pDC白血病细胞。欧洲专利EP 1 572 989 B1描述了从这些白血病的细胞获得和培养pDC细胞系的方法。该专利最特定地描述了人pDC系，称为GEN2.2，根据布达佩斯条约第6.1条，其于2002年12月24日以保藏号CNCM I-2938保藏在CNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes[French National Collection of Microorganism Cultures]，Institut Pasteur，25 rue du Docteur Roux，F-75015 Paris)，并且以及描述了人类浆细胞树突细胞系，称为GEN3，根据布达佩斯条约第6.1条，其于2003年10约16日以保藏号CNCM I-3110保藏在CNCM。这些系可以在本发明的完全优选的实施方式中使用。
术语“脉冲”表示pDC细胞(系)用抗原孵化。
在本发明的上下文中，术语“抗原”定义了由免疫系统的细胞识别并且能够触发细胞介导的免疫反应的分子。
根据本发明的抗原可以是天然或或修饰的，肿瘤的或微生物的(特别是细菌或病毒)抗原、蛋白质、糖肽、糖蛋白或磷酸化蛋白质。
抗原可以被引入pDC系培养基中，或者可以通过用允许表达所述抗原的载体转染的pDC系表达。
在本发明的一个优选的实施方式中，抗原是可以从肿瘤或病毒起源的抗原蛋白质获得的肽。
在本发明的一个特定实施方式中，可以从肿瘤抗原获得的肽可以选自包括在下述序列中的肽：抗原CEA、NY-BR1、Her-2/Neu、PSA、RAGE-1、PRAME、TRP-2、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A4、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-C2、MUC-1、p53、hTERT、存活素、黑素-A/MART-1(SEQ ID No.1)、GP100(SEQ ID No.2)、酪氨酸酶(SEQ ID No.3)、MAGE-A3(SEQ ID No.4)或NY-ESO1(SEQ IDNo.5)，其是修饰或未修饰的。
在本发明的另一实施方式中，可以从病毒抗原获得的肽可以选自包括在下述序列中的肽：HIV病毒的抗原env、nef、gp41、gp120、gag序列(SEQ ID No.6)或pol序列(SEQ ID No.7)，HBV病毒的HBc或HBs，HCV病毒的核、NS3或NS5，流感病毒的Flu M1(SEQ IDNo.8)，CMV病毒的CMVpp65(SEQ ID No.9)，EBV病毒的BMLF1(SEQ ID No.10)、LMP2(SEQ ID No.11)、EBNA-2(SEQ ID No.12)或EBNA-3a(SEQ ID No.13)，其是修饰或未修饰的。
在本发明的上下文中，术语“特异性效应物”适用于能够识别特异性抗原或来自该抗原的产物的免疫细胞。
在本发明的一个特定实施方式中，特异性效应物是细胞毒性效应物，并且最特定地，这些细胞毒性效应物是对所使用的抗原特异性的T淋巴细胞，特别是CD8+。
本发明的主题也是pDC系生产用于预防和/或治疗传染病或癌症的药物的应用。因此，本发明的主题也是：包含脉冲且辐射pDC系的药物或非药物组合物，包含细胞培养物的组合物，所述培养物包含脉冲且辐射pDC系以及还包含PBMC，所述pDC和PBMC共享至少一个主要组织相容性复合物(CMH)等位基因，但也是包含特异性效应物的组合物，所述特异性效应物能够通过如上所述的诱导或扩增特异性效应物的方法获得。
所述系可以以试剂盒的形式提供，其也包含PBMC，所述pDC和PBMC共享至少一个CMH等位基因。在一个特定的形式中，试剂盒还可以包含至少一种抗原。
本发明的主题也是疫苗，其特征在于其包含脉冲且辐射的pDC系作为激活免疫系统的制剂，对于所述疫苗而言在疫苗接种方法的上下文中被施用是可能的。
根据另一方面，本发明的主题是预防和/或治疗癌症和/或传染病的方法，其特征在于辐射且脉冲的pDC系被注射入生物体中，所述生物体的PBMC和pDC共享至少一个主要组织相容性复合物(CMH)等位基因。
根据又一方面，本发明的主题还是预防和/或治疗癌症和/或传染病的方法，其特征在于通过用至少一种抗原孵化pDC系而获得的特异性效应物——脉冲pDC随后被辐射并与PBMC接触并孵化，被注射，所述pDC和PBMC共享至少一个主要组织相容性复合物(CMH)等位基因。
在传染病中，可以提到媒介是微生物诸如细菌、真菌、酵母或可选地病毒的疾病，并且更特定地是由于流感病毒(例如flu)、HIV病毒(例如AIDS)、CMV(细胞巨化病毒)、EBV(EB病毒，例如单核细胞增多症)、HBV和HCV(例如肝炎)的感染，以及由于突然出现的病毒引起的疾病。
在可以预防性或治疗性治疗的癌症中，可以提到黑素瘤、乳腺癌、肺癌或另外前列腺癌以及病毒诱导的癌症。
本发明也根据其一些方面在下面的实施例中详细描述。
附图说明
图1：特异性初级和记忆CD8T反应的体外诱导
在第(D)0天和第7天得自健康供体的PBMC培养的特异性CD8+T细胞百分比的流式细胞计量术分析，其中pDC系GEN2.2用肽(分别地，病毒肽CMV pp65和肿瘤肽MelA)利用四聚体脉冲。所指示的百分比对应于CD8+T细胞中四聚体+细胞的百分比。
图2：反复刺激对扩增特异性CD8T细胞的功效
2a)在第0天和第40天，得自健康供体的PBMC培养的CD8+T细胞流式细胞计量术分析，其pDC系GEN2.2在IL-2的存在下每周刺激后，用CMVpp65或MelA肽脉冲。所指示的百分比对应于CD8+T细胞中四聚体+细胞的百分比。
2b)四聚体+CD8+T细胞的百分比的改变，以及
2c)每周刺激带有用MelA在IL-2(FluM1四聚物作为对照)存在的情况下脉冲的pDC的PBMC后，MelA-特异性CD8T细胞的绝对数的扩增(×106)。箭号指示执行的重复刺激(restim)。
图3：多特异性CD8T反应的同时诱导
在第七天(3a)或第21天，得自健康供体的PBMC培养CD8+T特异性细胞流式细胞计量术分析，其pDC系GEN2.2用得自病毒抗原(得自EBV病毒：BMLF1和LMP2，图3a)或肿瘤抗原(黑素瘤：MelA、GP100、TYR、MAGE-3，图3b)的不同肽的混合物脉冲。所指示的百分比对应于CD8+T细胞中四聚体+细胞的百分比。
图4：生成特异性CD8T细胞在体外以HLA-和抗原-限制方式起作用
4a)通过用脉冲和辐射的GEN2.2pDC系培养PBMC(HLA-A2供体)生成的MelA-特异性CD8T细胞的细胞毒素活性的抗原-限制和HLA-A2-限制，关于黑素瘤系：Me275和A375系是HLA-A2，theMe275和COLO系表达MelA抗原。
4b)IFNγ的分泌物和CD107的表面表达，其通过脉冲和辐射的GEN2.2pDC系在重复刺激(左面板和中间面板)或无重复刺激(右面板；-)后在用FluM1肽或控制肽(LMP2)冲击的T2细胞上生成FluM1-特异性CD8T细胞；效应物/靶(E/T)比率＝10/1。
图5：将根据本发明的脉冲和辐射pDC系与外源或内源骨髓DCs相比较，关于诱导高亲和性且高活性的特异性CD8T细胞
5a)在第20天，得自健康供体的PBMC培养的特异性CD8+T细胞百分比的流式细胞计量术分析，所述PBMC分别地具有pDC系GEN2.2(GEN)或用MelA肽脉冲的同种异型或自体髓样树突状细胞，在细胞因子存在的情况下每周刺激后。所指示的百分比对应于CD8+T细胞中四聚体+细胞的百分比。
5b)在PBMC培养的第20天，MelA-特异性CD8+T细胞绝对数的扩增。其中所述分别地具有pDC系GEN2.2(GEN)、或用MelA肽脉冲的同种异型或自体髓样树突状细胞，在(-)或IL-2或IL-15细胞因子存在的情况下每周刺激后。
5c)分别具有pDC系(GEN2.2)、或同种异型(mDC allo)或自体髓样树突状细胞(mDC auto)生成的特效CD8T细胞的亲和性的对照，由标贴后四聚物分解的时间函数来测量。
5d)分别具有pDC系GEN2.2)、或同种异型(mDC allo)或自体髓样树突状细胞(mDC auto)生成的特效CD8T细胞的活性的对照，由其用肽的渐减浓缩物冲击的T2细胞细胞毒素活性测量。C和d的结果作为获得的大信号百分比表达(分别为四聚物最大标记的和最大细胞毒性)。
图6：根据本发明的由脉冲pDC系生成的特异性CD8T细胞在体内起作用
6a)在使用源自HLA-A2+供体的PBMC通过冲击且辐射GEN2.2pDC系扩增的CMVpp65-特异性或FluM1-特异性CD8T细胞的内部过继转移后，NOD-SCID b2m-/-小鼠中人系肿瘤HLA-A2+和CMVpp65+的生长的进行。图中展示代表性试验。箭头指示特异性T细胞的注射。
6b)肿瘤移植20天后的肿瘤尺寸对照。每个点代表一只人化小鼠。
6c)在所述T细胞过继移植之后，根据本发明由脉冲且辐射pDC系生成的特异性CD8T细胞的抗原限制和HLA限制的治疗功效。在使用源自HLA-A2+供体的PBMC通过冲击且辐射GEN2.2pDC系扩增的CMVpp65-特异性或FluM1-特异性CD8T细胞的内部过继转移后，移植在NOD-SCID b2m-/-免疫缺陷小鼠中的表达或不表达CMVpp65+抗原的HLA-A2+或HLA-A2-人系肿瘤生长的进展。
图7：在人源化小鼠模型中接种根据本发明的脉冲和辐射pDC系的反应
7a)用人HLA-A2 PBMC腹膜内再造NOD-SCID b2m-/-免疫缺陷鼠并且用根据本发明的脉冲和辐射pDC以同样的腹膜内的方式接种一周。图表显示四聚物+CD8+T细胞在接种位点(免疫位点)，在循环中，分别在第一次接种后的第9天(D9)和第30天(D30)在动物的淋巴器官(脾脏)用经CMVpp65或MelA肽脉冲的pDC系接种。所示百分比对应于CD8+T细胞中的四聚物+细胞的百分比。
7b)在第0天之前的特异性CD8+T细胞，接种后，用经CMVpp65或MelA肽脉冲的和辐射的pDC系接种(1个疫苗和3个加强剂量)在人源化小鼠的各个器官中。每个点表示一个人源化小鼠。
图8：在人源化小鼠模型中接种根据本发明的脉冲和辐射pDC系后产生的应CD8T细胞的治疗效果
8a)人源化小鼠用GEN2.2系接种，用CMVpp65肽(GEN-pp65)脉冲后辐照，从该人源化小鼠的腹腔灌洗(左板)和从脾脏(右板)纯化的CD8T细胞的体内细胞毒性活性，相对于用CMVpp65肽(GEN-pp65)或无关的肽(上板)脉冲的T2细胞，和相对于表达或不表达CMVpp65抗原的HLA-A2+或HLA-A2-系(下板)。GRE是HLA-A2+，COL是HLA-A2-。
8b)植入人源化NOD-SCID b2m-/-免疫缺陷小鼠的HLA-A2+MelA+黑素瘤系的肿瘤生长进程，该免疫缺陷小鼠用以MelA或FluM1肽脉冲和辐照的pDC系GEN2.2(GEN)免疫接种。
8c)在接种的人源化小鼠的肿瘤位点水平显示出存在Mel A-特异性CD8T细胞的存在的肿瘤悬浮液的细胞流量计数分析。
图9：根据本发明的脉冲和辐照的pDC系能够诱导和扩增CD8T细胞，其是特异性的并对黑素瘤患者有作用
9a)PMBC培养物(来自黑素瘤的HLA-A2+患者)在D0和在D15-20的CD8+T细胞的细胞流量计数分析，以来自MelA、GP100、MAGE3和酪氨酸酶(TYR)抗原脉冲并辐照的pDC系。显示的百分比对应于CD8+T细胞中的四聚物+细胞的百分比。
9b)通过根据本发明脉冲的pDC系所产生的MelA-特异性CD8+T细胞的细胞毒性活性，使用来自黑素瘤HLA-A2+患者的PBMC，相对于用MelA肽或对照肽脉冲的T2细胞。
图10：特异性的初始和记忆CD8T细胞的诱导的体外反应
来自健康供体的PBMC培养物在第0天的不同时间的特异性CD8+T细胞的百分比，用肽(分别是病毒性肽Flu M1和肿瘤肽MelA)脉冲的pdc系GEN2.2，使用四聚物进行细胞流量计数分析。所示百分比对应于CD8+T细胞中的四聚物+细胞的百分比。每个点表示的结果获得自一个供体(对于Flu n＝20，对于MelA n＝18)。平均数用水平杠表示，所示百分比是达到的最大值。
图11：辐射对于pDC系的激活效果和所述激活的pDC系诱导特异性T细胞反应的效果
11a)HLA-A2分子的表达水平以及已被辐照或未辐照的刺激分子在Pdc系的表面的细胞流量计数分析，随后培养24小时，与在相同条件下处理的骨髓样DCs相比较。
11b)在存在TLR7(灭活流感病毒：Flu)或TLR9(CpGA)配体的条件下，HLA-A2和CD40分子在Pdc系表面的表达水平的细胞流量计数分析，所述细胞系已被辐照或未被辐照，并随后培养24小时。
11c)在PBMC培养物(源自健康供体)7天后，特异性的CD8+T细胞的百分比的比较性细胞流量计数分析，用已被辐照或未被辐照的pDC系GEN2.2，随后用Flu肽脉冲。所示百分比对应于CD8+T细胞中的四聚物+细胞的百分比。
图12：使用来自I-IV期黑素瘤患者的PBMC和TIL的pdc系在体外扩增特异性抗癌抗菌素CD8+T细胞的效果
源自黑素瘤(I至IV期)患者的PBMC(n＝12)和TIL(n＝6)用Pdc系培养，所述Pdc系用肿瘤肽(a-b)或四种肿瘤肽(MelA、GP100、TYR和/或MAGE-3)(c-d)的混合物进行脉冲，随后辐照。在存在IL2的条件下，每周再刺激所述培养物。
a-d)用脉冲的和辐照的pDC系的PBMC(a，b)或TIL(c，d)的培养期间(20天)的四聚物+CD+T细胞的百分比的细胞流量计数分析。用PBMC(a)或TIL(c)进行的代表性试验被示出(D20分析)，用四聚物+CD8+百分比的初始测量(D0)，和第7、14和20天后的培养的测量。每个点表示一个患者，水平横杠代表平均值，所示百分比是达到的最大值。
e-h)使用PBMC和TIL的用脉冲的和辐照的Pdc系诱导的抗癌抗菌素T淋巴细胞的特异性和功能性的分析。e)由T淋巴细胞分泌的IFNγ分泌物的测量，该分泌物产自以MelA或GP100脉冲的pDC系而得的PBMC，由流式细胞计数法，在用无关的肽或对照肽脉冲后的T2细胞再激发(用PBMC(n＝6)和TIL(n＝2)进行8的代表性试验)。所示百分比对应于四聚物+CD8+T细胞产生的IFNγ的百分比。
f-h)测量产生的T淋巴细胞的细胞毒性(51Cr释放)。由PBMC或TIL培养物在15至20天后纯化的T淋巴细胞被用作对比脉冲的T2细胞系、同种异体和自体的黑素瘤细胞及自体CD45+的非肿瘤细胞的细胞毒性试验的效应物。f)用肽MelA脉冲的pDC系激活PBMC(患者#9)，用四种肽类MelA、GP100、TYR和MAGE-3的混合物脉冲的pDC系激活TIL(患者#11)。这些实验是代表性的12个用PBMC进行，6组用TIL进行。g)自体肿瘤细胞的溶菌百分比与自体CD45+非肿瘤细胞相比较，比较在最初和刺激之后进行。这两组实验所分析的六个TIL样本的代表。h)在用四种肿瘤肽混合物脉冲的pDC细胞系刺激之前和刺激之后，通过TIL的所示靶的溶菌效率的比较。所示出的溶菌百分比的平均+/-标准误差测量为60∶1的比率(n＝6)。
实施例
实施例1-pDC系GEN2.2使得利用来自健康个体的细胞体外诱导对目的抗原特异性的初级和记忆CD8T反应成为可能
借助来自HLA-A2+健康志愿受试者的外周血单核细胞(PBMC)在半同种异型的环境中GEN2.2细胞诱导抗原特异性CD8T反应的能力通过培养GEN2.2系的细胞(下文：GEN2.2细胞)进行测试，用目的肽脉冲并辐射。
为了用目的肽脉冲GEN2.2细胞，所述细胞在无FCS的完全RPMI培养基(补充有1mM丙酮酸钠、20μg/ml庆大霉素、10μM非必需氨基酸的RPMI 1640 Glutamax公司)被洗涤三次，并以1×106/ml再悬浮。细胞被补充100ng/ml的β2-微球蛋白并在37℃孵化10分钟(孵化器)。然后以10μM的比例加入目的肽。然后将细胞悬液在规则搅拌下在37℃孵化3小时(孵化器)。然后洗涤细胞，在30Gy下辐射，并在补充有10％胎牛血清的完全RPMI培养基中以2×105/ml再悬浮。通过菲可利用来自健康供体的血袋纯化PBMC。将它们以2×106/ml再悬浮于补充有10％胎牛血清的完全RPMI培养基中。脉冲且辐射的GEN2.2细胞与HLA-A2+半同种异型PBMC在24-孔板(2×105GEN2.2+2×106PBMC/2ml)中在37℃共培养7天。在实验开始(D0)以及培养7天之后(D7)测定CD8 T细胞的表型。通过用四聚体标记分析CD8 T细胞的特异性(图1)。
PBMC与用得自病毒或肿瘤抗原的肽脉冲且辐射的pDC系GEN2.2的共培养使得在仅7天的培养物中高效地诱导和扩增对目的肽特异性的CD8 T细胞成为可能。利用该策略，我们展示了针对肿瘤抗原MelA、GP100、MAGE-3、酪氨酸酶和NY-ESO1定向的初级应答的诱导，以及针对病毒抗原FluM1、CMVpp65、EBV BMLF1和EBV LMP2定向的记忆应答的诱导。
实施例2-被脉冲和辐射的pDC系使用于感兴趣的抗原的CD8 T细胞的大量扩增成为可能。
为了优化特异性T细胞的诱导，在IL2存在的情况下，将该细胞用脉冲且辐射的GEN2.2细胞有规律地刺激。在此，如上述方法培养所述特异性T细胞。培养7天之后，将细胞恢复、冲洗、计数和以2×106/ml悬浮于补充有10％胎牛血清的完全RPMI培养基中。将它们用加入200U/ml的IL2的以2×105/ml比例的脉冲且辐射的GEN2.2细胞放回到24-孔板中培养。该过程每七天重复。在每次重复刺激之前评估特定使用肽的CD8 T细胞的百分比和绝对数。
如图2所示，在细胞因子存在的情况下，用脉冲且辐射的GEN2.2系重复刺激，使特定使用肽的，具有非常高效力的CD8 T细胞的大量扩增成为可能。这可以导致特定感兴趣的肽(获得多于97％的四聚物CD8 T细胞)的CD8 T细胞的独有扩增及其伴随扩增(以20000000因子绝对数的特效CD8 T细胞增加)，二者均用于病毒抗原和肿瘤抗原。
实施例3-pDC系GEN2.2使得对多特异性的初级和记忆CD8 T反应的同时诱导成为可能
为了评估诱导多目的T反应的可能性，同时用源自病毒抗原(BMLF1，LMP2)或源自肿瘤抗原(黑素A、GP100、酪氨酸酶、MAGE-3)的几个肽脉冲GEN2.2系细胞，然后辐射。它们随后用HLA-A2+半同种异体PBMC培养，根据上面描述的条款。在这些PBMC中，最初的在CD8+T淋巴细胞中的四聚物细胞(BMLF1、LMP2、MelA、GP100、TYR或MAGE-3)的百分比严格地少于0.05％。在七天(对EBV、BMLF和LMP2肽，图3a)或在21天用两次重复刺激的培养(对MelA、GP100、TYR和MAGE-3，图3b)，通过四聚物标志分析具体到使用的每种肽的CD8 T细胞的扩增。
用各种肽的混合物脉冲的pDC系的使用，使得在病毒模式和肿瘤模式中，同时诱导具体到使用的每种肽的CD8 T细胞成为可能。
实施例4-由pDC系GEN2.2生成的特定T细胞在生物体外展示了非常优良的功能性
使用三种方法评估由pDC系GEN2.2生成的CD8 T细胞：细胞毒试验、干扰素γ分泌物和具体的重复刺激后CD107的薄膜表达。
由GEN2.2系生成特异性T细胞的细胞因子的活性通过51Cr释放试验评估。在此，在带有已经用MelA肽脉冲和辐射的GEN2.2细胞的半同种异体PBMC的刺激后，将该细胞恢复并将CD8+T淋巴细胞纯化(EasySep CD8 T负选择法)和用51Cr-标记的靶细胞以不同的比率(E∶T比率范围60∶1到7.5∶1)放在一起4个小时。随后分析伏在表面的51Cr。抗-MelA T细胞，例如，能够有效地溶解HLA-A2+肿瘤细胞，其表达黑素-A(Me275)但在不表达MelA(A375)或不是HLA-A2(COLO829)(图4a)的肿瘤细胞上不具有细胞毒素活性。
特异性T细胞的效应物能力也根据特异性再刺激之后其分泌IFNγ和表达表面CD107的能力来评估。基于此，在含有已经用fluM1肽脉冲和辐射的GEN2.2细胞的半同种异型PBMC激发后，回收和计数细胞并进行标上四聚体标记(在环境温度下30分钟)。洗涤后，将细胞以1×106/200μl悬浮于含有10％FCS的RPMI培养基中。任选地添加已经用目的肽(fluM1)或对照肽(LMP2)脉冲的T2细胞(效应物细胞∶再刺激细胞比＝10∶1)。对于IFNγ分泌，将细胞在37℃再刺激5小时30分钟，在布雷菲地菌素A(GolgiPlug，1μl/ml)存在，进行最后的3小时。在表面抗原(CD3、CD8)标记之后，然后进行IFNγ的胞内标记(图4b)。为了测量CD107表达，在再刺激的整个持续期间添加抗-CD107a和抗-CD107b抗体(20ml/106个细胞)，并且将细胞在37℃孵化5h，在莫能菌素(GolgiSTOP，0.67μl/ml)存在下进行最后4小时。然后进行表面抗原(CD3、CD8)的标记(图4b)。在四聚体CD8+T细胞上分析IFNγ和CD107标记。因此，由GEN系产生的抗-FluM1 CD8+T细胞在用FluM1-脉冲T细胞再刺激之后能够分泌IFNγ并表达CD107，而在用利用另一种肽(T2 LMP2)脉冲的T2细胞再刺激之后或者再刺激不存在的情况下则不能(图4b)。
由pDC系GEN2.2产生的抗原-特异性CD8 T细胞因此能够以HLA-限制性方式杀死表达这种抗原的靶细胞。在正确的HLA情况下，在用呈递它们具有特异性的肽的细胞再刺激之后，它们特异性地分泌IFNγ并表达CD107。
实施例5-相比髓样树突状细胞(mDC)，pDC系GEN2.2使得以更大功效诱导和扩增对目的抗原具有特异性的CD8 T细胞成为可能并且在所述T细胞上赋予更大的功能能力
我们比较了pDC系GEN2.2与同种异型或自体髓样树突状细胞(mDC)诱导特异性CD8 T细胞的能力并评价了它们的功能性质。
为了产生mDC，通过负排序(使用试剂盒，按照生产商的建议)从PBMC纯化单核细胞，并以0.5×106个细胞/ml在含有10％FCS的RPMI培养基中在GM-CSF(500U/ml)和IL4(10ng/ml)存在下培养6天。然后如实施例1所述用目的肽脉冲mDC和GEN2.2细胞，辐射，并用为半-同种异型或自体(对于mDC而言)的HLA-A2+PBMC培养。在IL2(200U/ml)或IL15(5ng/ml)存在下每7天进行再刺激。在用利用MelA脉冲的GEN2.2细胞、同种异型mDC或自体mDC刺激PBMC之后，在培养的第7天和第20天，分别评价四聚体CD8 T细胞的百分比(图5a)和绝对数(图5b)。在基本条件下或者存在细胞因子的情况下，与同种异型或自体mDC相比，GEN2.2系使得能够以大得多的效力诱导抗-MelA T细胞。在各种条件下所产生的CD8 T细胞的亲和性通过四聚体在37℃的解离进行测量。基于此，进行特异性CD8 T细胞的四聚体标记(4℃，30分钟)。洗涤之后，在37℃孵化细胞。在各种孵化时间之后(从0到16h)，回收并固定细胞进行流式细胞计量术分子。将四聚体的解离评价为初始四聚体标记百分比(图5c)。根据CD8 T细胞在用减小的肽浓度(从1到0.0001μM)脉冲的T2细胞上的细胞毒性活性测量CD8 T细胞的亲和力。细胞毒性表达为所观察到的最大细胞毒性百分比(图5d)。与由同种异型或自体mDC产生的抗-MelA T细胞相比，由GEN2.2系产生的抗-MelA T细胞表现出更高的亲和性和更高的亲和力。
pDC系GEN2.2对诱导特异性T细胞比mDC有效得多(在相同的条件下获得的四聚体+细胞百分比更高)，并且特别是对扩增特异性T细胞比mDC有效得多(利用pDC的扩增相比mDC大十倍)。另外，GEN2.2系在特异性T细胞上赋予更大的功能能力，因为与利用mDC产生的细胞相比它们获得更大的亲和性和更大的亲和力。
实施例6-由pDC系产生的特异性T细胞通过过继转移在体内展示出非常优良的抗肿瘤活性
根据由pDC系GEN2.2体外产生的特异性T细胞在抑制移植在免疫缺陷小鼠中的人肿瘤发展的能力，体内评价它们的功能功效。
通过将1至2.5×106个肿瘤细胞皮下注射入侧腹中在NOD-SCIDb2m-/-小鼠中建立肿瘤。平行地，如上所述，利用GEN2.2系体外产生对目的抗原具有特异性的CD8 T细胞。在通过负排序(按照生产商的建议使用试剂盒)选择CD8+T细胞之后，然后将1至5×106个CD8+T细胞通过4-5天间隔的4个注射进行肿瘤内转移。然后测量肿瘤生长的进展。图6a显示在抗-CMVpp65或抗-FluM1 CD8+T系细胞过继转移之后GRE pp65肿瘤(HLA-A2+CMVpp65+)生长的进展。图6b显示在用抗-CMVpp65或抗-FluM1CD8+T细胞处理之后，在其移植之后20天肿瘤大小的比较(每个点代表一只小鼠)。
通过GEN系体外产生的抗-CMVpp65 T细胞因此使得抑制HLA-A2+CMVpp65+肿瘤的发展成为可能。所观察到的注射细胞的治疗功效是HLA-限制和抗原限制的，原因在于这种治疗没有使得抑制非HLA-A2的肿瘤的发展成为可能(COL pp65)，或者没有使得抑制不表达其所定向的抗原的肿瘤的发展成为可能(GRE IE)(图6c)。
实施例7-pDC系能过通过接种体内诱导特异性的初级或记忆性的T细胞反应
为了评估pDC系GEN2.2诱导特异性的T细胞体内反应的能力，建立人源化小鼠的模型(用人的免疫系统重建的免疫缺陷小鼠)。
对于此，50×106 PBMC腹膜内被注射入NOD-SCID b2m-/-小鼠。第二天，用感兴趣的肽脉冲并辐照的5×106 GEN2.2细胞进行腹膜内注射。可选地，接种每星期重复一次。在接种后的不同时间(CMV疫苗的9天，MelA疫苗的30天以后)，在免疫位点(灌洗)评估特异性CD8+T细胞的诱导，在循环系统中和辅助淋巴腺器官(脾脏，淋巴结)中。对于此，血样从被牺牲的小鼠采样。用15ml的RPMI培养基腹膜内灌洗使得能够从免疫位点恢复细胞。然后去除淋巴腺器官，并且用2.5mg/ml胶原酶的消化以后制备细胞悬浮液。特异性CD8 T细胞的四聚物标记被执行。图7a显示的实施例得自每个案子的一只小鼠，图7b显示在PBMC中的四聚物+CD8 T细胞的初始水平，和所得到的对CMV或MelA接种的所有反应。因此，用根据本发明脉冲的pDC系的接种能够非常有效地诱导特异性CD8 T体内反应，所述反应在免疫位点也在循环系统和辅助淋巴器官中。我们展示了对用病毒抗原FluM1、EBV BMLF1、EBV LMP2和CMVpp65接种的体内反应和用肿瘤抗原MelA、GP100、MAGE 3和酪氨酸酶接种的反应。
产品的注射(脉冲的，被辐照的pDC系GEN2.2)在体内使得能够在接受者中直接诱导特异性T反应，即是病毒抗原也是肿瘤抗原。与已知的参考水平相比，得到的反应水平是高的。这展示使用产品作为细胞疫苗的可行性。这种效力为这个产品作为细胞疫苗的治疗有效性的临床概念提供证明。
实施例8-在用pDC系接种体内产生的特异性T细胞显示了非常好的功能性
我们评估了在接种以后诱导的体内反应的治疗效力，首先，通过特异性CD8 T细胞的前体内细胞毒素活性来评估，第二，通过对肿瘤体内扩增的作用来评估
用50×106PBMC腹膜内注射重建NON-SCID b2m-/-小鼠，之后用CMV衍生肽(CMVpp65)脉冲并辐照的5×106GEN2.2细胞进行接种。在接种以后的九天，从取自免疫位点和取自器官的样品纯化CD8+T细胞从从免疫站点拿取的样品被纯化，并且从淋巴腺器官(EasySep试剂盒进行负排序，根据制造者的推荐规范使用)，并且对比用CMVpp65肽或对照肽(flu M1)脉冲T2细胞，评估其细胞毒素的活性(图8a)，和在HLA-A2+肿瘤细胞(GRE pp65)或HLA A2肿瘤细胞(COL pp65)上，表达对应的抗原或不表达对应的抗原(GRE IE)(图8a)。如图8a所显示，在接种后体内产生的特异性CD8 T细胞显示T2细胞在表达特异性抗原的HLA-A2+肿瘤细胞上的细胞毒性活性。
为了评估用根据本发明的脉冲pDC系在发展的肿瘤上接种的治疗效果，用50×106PBMC细胞腹膜内注射重建NOD-SCID b2m-/-小鼠，所述小鼠之后用从MelA或(Flu M1)获得的肽脉冲的GEN2.2系的5×106细胞进行接种，每周一次。在第一接种后的五到十天，在肋腹皮下植入10×106HLA-A2+MelA+肿瘤细胞(Me275)。观察肿瘤细胞的生长进程(图8b)。在将所述肿瘤细胞植入后的1个月，通过流式细胞计数法分析肿瘤悬浮液在肿瘤位点研究MelA-特异性CD8 T细胞的存在(图8c)。因此，以根据本发明的脉冲pDC系的接种能够抑制HLA-A2+肿瘤的发展，所述HLA-A2+肿瘤表达用于脉冲GEN细胞的相关抗原。CD8 T细胞对通过接种产生的相关肽是特异性的，该CD8 T细胞能够迁移到抗原的表达位点和肿瘤细胞溶解位点。
该实施例显示出通过接种体内诱导的特异性CD8 T细胞由接种显示出HLA受限和抗原受限的体外细胞毒素功效，并且所述特异性CD8T细胞能够迁移到特异性抗原的表达位点，并能够抑制肿瘤发展。
实施例9-pDC系GEN2.2使得诱导和扩增CD8T细胞成为可能，所述CD8T细胞对于相关抗原是特异性和功能性的，使用来自癌症患者的细胞
为了分析根据发明的脉冲pDC系是否能够扩增癌症患者的特异性T细胞反应，我们培养从IV期黑素瘤的HLA-A2患者获得的PBMC，所述培养使用以来自MelA、GP100、MAGE 3或酪氨酸酶的肽，与实施例2中使用相同的方法。在用脉冲的GEN细胞刺激前和3次刺激之后通过流式细胞计数法分析特异性CD8+T细胞(图9a)。所产生的CD8 T细胞的功能性随后通过测量T2细胞上的细胞毒性来评估，所述T2细胞用相关肽或对照肽(FluM1)根据实施例4中相同方法进行脉冲(图9b)。
因此，使用来自癌症患者的细胞，pDC系GEN2.2能够诱导对各种肿瘤抗原特异性的CD8 T细胞的大量扩增。产生的T细胞的细胞毒素的活性证实他们的抗癌抗菌素的功能性。
实施例10-pDC系GEN2.2能够在所有的测试供体上诱导针对相关抗原特异性的最初和记忆的CD8 T反应
在半同种异体条件下，测试GEN2.2细胞诱导抗原特异性CD8+T反应能力，在存在来自HLA-A*0201+健康志愿者供体的PBMC的条件下，该测试通过培养脉冲且辐照的pDC系进行。使用黑素A肽，记忆反应的诱导被评估；使用流行性感冒模板的flu M1肽来评估记忆反应的诱导。
为了用感兴趣的肽脉冲GEN2.2细胞，在不带有FCS的完全RPMI培养基(RPMI 1640 Glutamax公司，用1mM丙酮酸钠，20μg/ml庆大霉素、100μM非必须氨基酸补充)中洗涤所述细胞3次，并且以1×106/ml重悬。细胞用100ng/ml的β2-微球蛋白补充，并在37℃(孵化器)中孵化10分钟。感兴趣的肽随后以10μM(flu M1)或1μM(MelA)的比例增加。细胞悬浮液随后在37℃(孵化器)下孵化3小时，伴随规则搅拌。随后洗涤细胞，30Gy辐照，以2×105/ml在补充有10％的胎牛血清的完全RPMI培养基中再悬。使用聚蔗糖纯化来自健康供体的血液袋的PBMC。在以10％的胎牛血清补充的完全RPMI培养基中以2×106/ml浓度将它们重悬。在37℃下，在24孔板中用HLAA2+半同种异体的PBMC中培养脉冲和辐照的GEN2.2细胞(2×105GEN2.2+2×106 PBMC/2ml)达7到20天。在与Mel A模型中进行培养物的每周再刺激，添加IL 2(200U/ml)。在实验开始时(D0)和在培养7天后(D7)对CD8 T细胞的表型评估用于测量抗FluM1的反应，及在7、14和20天后评估用于测量抗MelA反应。CD8 T细胞的特异性通过四聚物标记被分析(图10)。
培养7天后，流感病毒抗原特异性的四聚物+T淋巴细胞的百分比平均是11％(0.1％到49％)(由不同供体PBMC制备的20培养物)。培养20天后，直接针对MelA的抗癌抗菌素T淋巴细胞的百分比平均是22％(2％到60％)(由不同供体PBMC制备的18培养物)。抗-Flu和抗MelA四聚物+T淋巴细胞的各自最初的百分比是平均0.23％和0.02％。
在本例中，我们证实使用这个方案，在初始和记忆反应中，100％供体(HLA A*0201)放大抗原特异性T淋巴细胞是可能的。
实施例11-pDC系的辐照诱导成熟
pDC系的脉冲和辐照细胞诱导HLA-A*0201特异性T淋巴细胞的扩增。与髓样树突细胞比较，我们评估了辐照对pDC成熟的影响。
由单核细胞准备的髓样树突细胞(MoDCs)通过负排序(使用EasySep试剂盒，根据制造者的推荐规范)从PBMC纯化，在存在GM-CSF(500U/ml)和IL4(10ng/ml)的条件下，在包含10％FCS的RPMI培养基中以，0.5×106cells/ml培养6天。
GEN2.2系的细胞和髓样树突细胞(二个不同供体)在包含10％FCS的RPMI培养基被辐照(30格雷)24小时，然后进行表型。CD40、CD80、CD86和HLA-A2分子的表示水平由流式细胞计数法检测(图11a)。辐照诱导了这四种分子特异性地在pDC中增加，而没有在MoDC中增加。
pDC的辐照效果与强pDC成熟诱导物效果的比较，所述诱导物即流感病毒(Flu，TLR7配体)和CpG 2336(TLR9配体)。GEN2.2线的细胞被辐射(30格雷)或未被辐射，并且在存在或缺乏灭活流感病毒或CpG 2336的条件下培养24小时。细胞然后表型，HLA-A2表达和CD40表达由流式细胞计数法测量。辐射诱导GEN2.2系统的细胞的成熟，所述最大程度的成熟在存在TLR7或TLR9配体时被观察到(图11b)。
为了评估辐射GEN2.2细胞导致的成熟对T反应诱导的影响，GEN2.2系的细胞用Flu肽脉冲，可选地随后进行辐射。根据以上所述的方案，用HLA-A2+半同种异体PBMC培养所述细胞。对Flu肽特异性的CD8 T细胞的扩增，通过在第7天进行四聚物标记来进行分析(图11c)。未经辐射的pDC不能诱导特异性T淋巴细胞的增殖。因此辐射是所述方法的基本元素。
实施例12：脉动和辐射的pDC系能够实现肿瘤抗原-特异性CD8T细胞的大量扩增，该抗原-特异性CD8 T细胞来自黑色素瘤患者的PBMC和TIL
在半同种异体条件下，GEN2.2细胞诱导来自黑素瘤患者的T淋巴细胞的肿瘤抗原特异性CD8 T反应的能力通过培养GEN2.2(下文称为GEN2.2细胞)系细胞进行测试，所述GEN2.2细胞已经用感兴趣的肽或感兴趣的肽的四种混合物脉冲，并辐射，使用来自黑素瘤HLA-A2+患者的外周血单核细胞(PBMC)或肿瘤过滤T淋巴细胞(TIL)。
使用聚蔗糖净化来自黑素瘤个体的血管(n＝12)的PBMC。对黑素A、GP100、酪氨酸酶和MAGE3抗原特异性的四聚物+CD8+T细胞的百分比进行最初的测量，所述百分比平均在0.02％和0.03％之间。
从以机械方式撕裂的肿瘤活组织切片纯化肿瘤细胞和TIL，然后将其用酶法(胶原酶+脱氧核糖核酸酶)消化。这些细胞悬浮液中包含的肿瘤细胞利用它们与塑料附着的特性而将它们与TIL分离。这些肿瘤细胞在包含10％FCS的RPMI培养基中进行培养，并在冻结之前扩增，用在某些实验中作为自体同源的肿瘤细胞源。对黑素A、GP100、酪氨酸酶和MAGE3抗原特异性的四聚物+CD8+T细胞的百分比最初在TIL中测量，所述百分比的平均值分别为0.17％、0.2％、0.05％和0.3％。
GEN2.2系的细胞使来自患者的PBMC和TIL的肿瘤抗原特异性T淋巴细胞扩增的能力被评价。
如上所述，用感兴趣的肽(每种肽浓度10μM)或所研究的四种肿瘤抗原衍生的肽混合物(每种肽浓度2.5μM)对GEN2.2细胞进行脉冲。简而言之，细胞悬浮液与所述一种或若干种肽在37℃下孵化3小时，随后洗涤细胞，在30格雷条件下辐射，并在补充10％胎牛血清的完全RPMI培养基中以2×105/ml进行重悬。
PBMC或TIL在补充10％胎牛血清的完全RPMI培养基中以2×106/ml进行重悬。在37℃下，在24孔板中将HLA-A2+半同种异体淋巴细胞与脉冲和辐照的GEN2.2细胞一同培养(2×105GEN2.2+2×106PBMC或TIL/2ml)7天。添加IL 2(200U/ml)，相同条件下，每隔七天进行培养物再刺激。在培养7、14和20天(D7、D14，D21)后对CD8 T细胞的表型进行评估。通过四聚物标记，对使用PBMC(图12a和b)和使用TIL的CD8 T细胞的特异性进行分析。
PBMC与pDC细胞系GEN2.2的共培养能够在仅有7天的培养物中以非常好的效果诱导和扩增针对感兴趣肽特异性的CD8 T细胞，所述pDC细胞系GEN2.2细胞已经被源自肿瘤抗原的肽脉冲和辐射。我们证明：直接针对MelA、GP100、MAGE 3或酪氨酸酶的肿瘤抗原的反应是能够使用这样的方法的，所述反应来自黑素瘤患者的样本，不考虑该患者的疾病阶段。来自患者的PBMC针对至少两种所研究的四种抗原之外的抗原发生应答，TIL针对这些抗原中的至少三种应发生答。
二种方法被用于评价由脉冲的pDC细胞系GEN2.2细胞产生的CD8 T细胞的功能性：细胞毒性试验和特异性再刺激之后的IFNγ分泌物。
为了评估再刺激之后的IFNγ分泌物，回收培养后扩增的细胞并计数，并进行四聚物标记(室温下30分钟)。洗涤后，细胞以1×106/200μl悬浮在包含10％FCS的RPMI培养基中。添加用感兴趣肽(MelA或GP100)或对照肽(流感Flu)脉冲的T2细胞(效应物细胞∶再刺激细胞比率＝10∶1)。37℃下细胞被再刺激5小时，后的3个小时在存在布雷菲德菌素A(GolgiPlug，浓度1μl/ml)的条件下进行。在标记表面抗原(CD3、CD8)后，进行细胞内标记IFNγ(图12e)。在四聚物+CD8+T细胞上进行对IFNγ标记的分析。因此，通过GEN细胞系产生的抗MelA CD8+T细胞能够在用经MelA脉冲的T2细胞再刺激之后特异性地分泌IFNγ，而不能在用经其它肽(T2Flu)脉冲的T2细胞再刺激之后特异性地分泌IFNγ，而GP100特异性T细胞能够在经GP100脉冲的T2细胞表面上分泌IFNγ，而不能在经过Flu脉冲的T2细胞表面上分泌IFNγ(图12b)。
通过51Cr释放试验评估GEN2.2系产生的特异性T细胞的细胞毒性的活性。为此，用经MelA肽脉冲和辐射的GEN2.2细胞对来自黑素瘤患者的半同种异体PBMC刺激之后，细胞被回收，且CD8+T淋巴细胞被纯化(通过负极选择的EasySep CD8 T排序)，并与51Cr标记的靶细胞放置在一起4小时(E∶T比例范围是60∶1到7.5∶1)。随后检验上清液层中的51Cr。例如，抗MelA T细胞能够有效溶解表达黑素-A的HLA-A2+肿瘤细胞(Me275和Mel89)，但对于不表达MelA(A375)或不是HLA A2(COLO829)的肿瘤细胞没有细胞毒性的活性(图12f)。用CD8+T细胞进行相似实验，所述CD8+T细胞来自用经所研究的四种肿瘤肽的混合物脉冲的GEN2.2系刺激的TIL培养物。图12f的实施例(TIL患者#11)表示，在HLA-A2环境下，所产生的含有对MelA、P100和MAGE3特异性的四聚物+细胞(图12c)的淋巴细胞使表达这些抗原中的至少一种抗原的靶细胞溶解。
由经所研究的四种肿瘤肽的混合物脉冲的GEN2.2系产生的特异性T细胞的细胞毒性还针对患者的自体同源的肿瘤细胞和自体同源的非肿瘤细胞(纯化CD45+白细胞)进行测定。图12g示出针对两个患者的两个实施例，TIL最初的细胞毒性不是针对自体同源的肿瘤细胞，TIL在用经四种肽混合物脉冲后的GEN细胞刺激之后得到了摧毁自体同源肿瘤细胞的能力。自体同源的非肿瘤细胞部分未被溶解。使用来自五个患者的样本能够再现这些结果(图12h)。
因此，通过来自患者PBMC和TIL的pDC细胞系GEN2.2产生的肿瘤抗原特异性CD8 T细胞能够以HLA受限方式杀死表达该抗原的靶细胞和自体同源的肿瘤细胞，但不会杀死自体同源的非肿瘤细胞。在正确的HLA环境下，以细胞表达特异性的肽的方式刺激之后，所述肿瘤抗原特异性CD8 T细胞特异性地分泌IFNγ。
Claims (18)
1.一种体外诱导和扩增抗原特异性效应物的方法，其包含如下步骤：
a)通过孵化具有至少一种抗原的类浆细胞树突细胞系获得脉冲的类浆细胞树突细胞；
b)辐射步骤a)中所获细胞；
c)将步骤b)中所获的经过脉冲和辐射的类浆细胞树突细胞与外周血单核细胞相接触，培养所述外周血单核细胞和经过脉冲和辐射的类浆细胞树突细胞，此二者共享至少一个主要组织相容性复合物等位基因,
其中所述抗原特异性效应物是对至少一种所用抗原特异性的T淋巴细胞CD8+，
其中抗原选自具有病毒或肿瘤源的肽。
2.如权利要求1所述的诱导和扩增抗原特异性效应物的方法，其包含至少一个再刺激步骤，该步骤包括：
d)将步骤c)中获得的细胞与步骤b)中获得的经脉冲和辐射的类浆细胞树突细胞系再次接触，并培养。
3.如权利要求1所述的诱导和扩增抗原特异性效应物的方法，其特征在于，所述选自具有肿瘤源的肽的抗原，选自包括在以下抗原序列中的肽：CEA、NY-BR1、Her-2/Neu、PSA、RAGE-1、PRAME、TRP-2、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A4、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-C2、MUC-1、p53、hTERT、存活素、黑素-A/MART-1、GP100、酪氨酸酶、MAGE-A3或NY-ESO1。
4.如权利要求1所述的诱导和扩增抗原特异性效应物的方法，其特征在于，所述选自具有病毒源的肽的抗原，选自包括在以下抗原序列中的肽：流感病毒的Flu M1、巨细胞病毒的pp65、BMLF1、LMP2。
5.如权利要求1或2任一项所述的诱导和扩增抗原特异性效应物的方法，其特征在于所述类浆细胞树突细胞系由类浆细胞树突细胞的白血病细胞获得。
6.如权利要求5所述的诱导和扩增抗原特异性效应物的方法，其特征在于，所述类浆细胞树突细胞系是GEN2.2系或GEN3系。
7.经脉冲和辐射的类浆细胞树突细胞系在制造用于预防和/或治疗传染病的药物中的用途，
其中所述类浆细胞树突细胞系经抗原脉冲，所述抗原选自具有病毒源的肽。
8.经脉冲和辐射的类浆细胞树突细胞系在制造用于预防和/或治疗癌症的药物中的用途，
其中所述类浆细胞树突细胞系经抗原脉冲，所述抗原选自具有癌症源的肽。
9.一种包含类浆细胞树突细胞系的药物组合物，所述类浆细胞树突细胞系经过肿瘤抗原或病毒抗原的孵化脉冲并经过辐射，所述病毒抗原选自包括在下述抗原序列中的肽：HIV病毒的抗原env、nef、gp41、gp120、gag序列或pol序列，HBV病毒的HBc或HBs，HCV病毒的核、NS3或NS5，流感病毒的Flu M1，CMV病毒的pp65，EBV病毒的BMLF1、LMP2、EBNA-2或EBNA-3a。
10.如权利要求9所述的药物组合物，其中所述病毒抗原选自包括在下述抗原序列中的肽：流感病毒的Flu M1，CMV病毒的pp65，EBV病毒的BMLF1、LMP2。
11.一种包含细胞培养物的组合物，所述培养物包含外周血单核细胞和经过脉冲和辐射的类浆细胞树突细胞系，所述外周血单核细胞和经过脉冲和辐射的类浆细胞树突细胞系共享至少一个主要组织相容性复合物等位基因。
12.一种组合物，其包含能够通过权利要求1所述方法获得的抗原特异性效应物。
13.一种试剂盒，其包含类浆细胞树突细胞系和外周血单核细胞，所述类浆细胞树突细胞系和外周血单核细胞共享至少一个主要组织相容性复合物等位基因，
其中所述类浆细胞树突细胞系经过选自具有病毒或肿瘤源的肽的抗原脉冲。
14.如权利要求13所述的试剂盒，其还包含至少一种抗原。
15.类浆细胞树突细胞系在制备用于预防或治疗癌症和/或传染病的药物中的用途，其特征在于，所述药物包含外周血单核细胞和经过脉冲和辐射的类浆细胞树突细胞系，所述外周血单核细胞和经过脉冲和辐射的类浆细胞树突细胞系共享至少一个主要组织相容性复合物等位基因。
16.权利要求1所述方法获得的所述抗原特异性效应物在制备用于预防或治疗癌症和/或传染病的药物中的用途。
17.如权利要求3所述的诱导和扩增抗原特异性效应物的方法，其中所述选自具有肿瘤源的肽的抗原，选自包括在下述抗原序列中的肽：黑素-A/MART-1、GP100、酪氨酸酶或MAGE-A3。
18.如权利要求9所述的药物组合物，其中所述肿瘤源选自包括在下述抗原序列中的肽：黑素-A/MART-1、GP100、酪氨酸酶或MAGE-A3。
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