CN109563483A - T细胞扩增 - Google Patents

T细胞扩增 Download PDF

Info

Publication number
CN109563483A
CN109563483A CN201680086124.3A CN201680086124A CN109563483A CN 109563483 A CN109563483 A CN 109563483A CN 201680086124 A CN201680086124 A CN 201680086124A CN 109563483 A CN109563483 A CN 109563483A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
culture
culture medium
apc
ebv
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201680086124.3A
Other languages
English (en)
Inventor
P·王
C·吴
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tessa Treatment Private Ltd
Original Assignee
Tessa Treatment Private Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tessa Treatment Private Ltd filed Critical Tessa Treatment Private Ltd
Publication of CN109563483A publication Critical patent/CN109563483A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/464838—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C12N5/0638—Cytotoxic T lymphocytes [CTL] or lymphokine activated killer cells [LAK]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K2035/124—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells the cells being hematopoietic, bone marrow derived or blood cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5154—Antigen presenting cells [APCs], e.g. dendritic cells or macrophages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5158—Antigen-pulsed cells, e.g. T-cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2302—Interleukin-2 (IL-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/11—Coculture with; Conditioned medium produced by blood or immune system cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/11—Coculture with; Conditioned medium produced by blood or immune system cells
    • C12N2502/1107—B cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/99—Coculture with; Conditioned medium produced by genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

一种通过以下方法产生或扩增病毒特异性T细胞群的方法，所述方法包括：在有呈递病毒肽的抗原呈递细胞(APC)存在下，通过培养来刺激T细胞，其中至少10％的培养细胞的培养基是从包含T细胞和呈递病毒肽的APC的刺激培养物获得的条件化培养基。还公开了用于加速病毒特异性T细胞群扩增速率的方法，以及使用产生的或扩增的T细胞群治疗或预防疾病或病症的方法。

Description

T细胞扩增
发明领域
本发明涉及产生和/或扩增病毒特异性T细胞群的方法。
发明背景
病毒特异性T细胞的过继性转移是预防和治疗病毒性疾病的有前途策略。
过继性转移需要使用大量T细胞。例如，Chia等在Mol Ther(2014)22(1):132-139中描述了通过过继性转移中值总数为9.6×108EBV-CTL(范围从6.3至10.3x 108CTL)来治疗EBV阳性鼻咽癌(NPC)。
过继性T细胞转移作治疗的主要问题是为给药产生足够大量的病毒特异性T细胞所花的时间。Chia等(同上)报道了，生产和第一剂CTL的中值时间为13周(8至22周)。此外，据报道，在该研究中，由于CTL产生的延迟，有3名患者偏离了预定的治疗。
发明概述
产生和/或扩增病毒特异性T细胞群的方法通常包括几轮的用呈递感兴趣病毒(即，T细胞特异性的病毒)的肽的抗原呈递细胞刺激T细胞。
本发明基于以下发现：在有从刺激步骤获得的条件化培养基的存在下进行再刺激，可以更快速地扩增病毒特异性T细胞群。与现有技术方法相比，由此可以有利地在更短的时间内获得大量的病毒特异性T细胞。因此，本发明可用于产生/扩增病毒特异性T细胞群，以便用于研究和/或治疗应用。
在一方面，本发明提供了产生或扩增病毒特异性T细胞群的方法，包括在有呈递病毒肽的抗原呈递细胞(APC)存在下，通过培养来刺激T细胞，其中至少10％的培养细胞的培养基是从包含T细胞和呈递病毒肽的APC的刺激培养物获得的条件化培养基。
在另一方面，本发明提供一种加速病毒特异性T细胞群扩增速度的方法，该方法包括在有呈递病毒肽的抗原呈递细胞(APC)存在下，通过培养刺激T细胞，其中至少10％的培养细胞的培养基是从包含T细胞和呈递病毒肽的APC的刺激培养物获得的条件化培养基。
在另一方面，本发明提供了一种产生或扩增病毒特异性T细胞群的方法，包括：
(i)在有呈递病毒肽的抗原呈递细胞(APC)存在下通过培养刺激T细胞；和
(ii)在有呈递病毒肽的APC存在下，通过培养再刺激T细胞，其中至少10％的培养细胞的培养基是从T细胞和呈递病毒肽的APC的刺激培养物获得的条件化培养基。
在另一方面，本发明提供了一种产生或扩增病毒特异性T细胞群的方法，其中该方法包括：
(i)在有呈递病毒肽的抗原呈递细胞(APC)存在下，通过培养刺激T细胞；
(ii)在有呈递病毒肽的APC存在下，通过培养再刺激T细胞；和
(iii)在有呈递病毒肽的APC存在下，通过培养再刺激T细胞，其中至少10％的培养细胞的培养基是从T细胞和呈递病毒肽的APC的刺激培养物获得的条件化培养基。在该方法的一些实施方式中，条件化培养基从步骤(ii)的刺激培养物中获得。
在另一方面，本发明提供了一种产生或扩增病毒特异性T细胞群的方法，包括：
(i)在有呈递病毒肽的抗原呈递细胞(APC)存在下，通过培养刺激T细胞；
(ii)收集步骤(i)获得的细胞，和；
(iii)在有呈递病毒肽的APC存在下，通过培养再刺激T细胞，其中至少10％的培养细胞的培养基是从T细胞和呈递病毒肽的APC的刺激培养物获得的条件化培养基。
在另一方面，本发明提供了一种产生或扩增病毒特异性T细胞群的方法，其中所述方法包括：
(i)在有呈递病毒肽的抗原呈递细胞(APC)存在下，通过培养刺激T细胞；
(ii)收集步骤(i)获得的细胞；
(iii)在有呈递病毒肽的APC存在下，通过培养再刺激T细胞；
(iv)收集步骤(iii)获得的细胞，和；
(v)在有呈递病毒肽的APC存在下，通过培养再刺激T细胞，其中至少10％的培养细胞的培养基是从T细胞和呈递病毒肽的APC的刺激培养物获得的条件化培养基。在该方法的一些实施方式中，条件化培养基从步骤(iii)的刺激培养物中获得。
关于本发明的各方面，在一些实施方式中，在1至8天的培养期后，从T细胞和呈递病毒肽的APC的刺激培养物获得条件化培养基。在一些实施方式中，从响应者:刺激物之比为1:1至10:1的T细胞和APC的刺激培养物获得条件化培养基。在一些实施方式中，呈递病毒肽的APC是EBV转化的淋巴母细胞样细胞系(lymphoblastoidcell line,LCL)细胞。在一些实施方式中，所述至少10％的条件化培养基是20至40％的条件化培养基。在一些实施方式中，所述至少10％的条件化培养基是10至25％，优选约15％的条件化培养基。
在另一方面，本发明提供了产生或扩增爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)-特异性T细胞群的方法，包括在有EBV转化的LCL存在下，以响应者:刺激物之比为2:1至7:1，通过在培养基中培养1-8天来刺激T细胞，所述培养基包括：
(a)细胞培养基，包含40-50％RPMI-1640培养基、40-50％克里克培养基(Click’smedium)、5-20％FBS和1-5mM L-谷氨酰胺，
(b)通过以下方法获得的至少10％的条件化培养基：在有EBV转化的LCL存在下，以响应者:刺激物之比为2:1至7:1，通过在细胞培养基中培养1-8天来刺激T细胞，所述细胞培养基包含40-50％RPMI-1640培养基、40-50％克里克培养基、5-20％FBS和1-5mM L-谷氨酰胺，和终浓度为10-200IU/ml的添加的IL-2，和
(c)终浓度为10-200IU/ml的添加的IL-2。
在另一方面，本发明提供加速爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)-特异性T细胞群扩增的方法，包括在有EBV转化的LCL存在下，以响应者:刺激物之比为2:1至7:1，通过在培养基中培养1-8天来刺激T细胞，所述培养基包括：
(a)细胞培养基，包含40-50％RPMI-1640培养基、40-50％克里克培养基、5-20％FBS和1-5mM L-谷氨酰胺，
(b)通过以下方法获得的至少10％的条件化培养基：在有EBV转化的LCL存在下，以响应者:刺激物之比为2:1至7:1，通过在细胞培养基中培养1-8天来刺激T细胞，所述细胞培养基包含40-50％RPMI-1640培养基、40-50％克里克培养基、5-20％FBS和1-5mM L-谷氨酰胺，并终浓度为10-200IU/ml的添加的IL-2，和
(c)终浓度为10-200IU/ml的添加的IL-2。
在另一方面，本发明提供了一种产生或扩增爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)特异性T细胞群的方法，包括：
(i)在有EBV转化的LCL存在下，以响应者:刺激物之比为10:1至80:1，通过在细胞培养基中培养PBMC 7-14天来刺激T细胞，所述细胞培养基包含40-50％RPMI-1640培养基、40-50％克里克培养基、5-20％FBS和1-5mM L-谷氨酰胺；
(ii)收集步骤(i)获得的细胞；
(iii)在有EBV转化的LCL存在下，以响应者:刺激物之比为2:1至7:1，通过在细胞培养基中培养步骤(ii)收集的细胞1-8天来再刺激T细胞，所述细胞培养基包含40-50％RPMI-1640培养基、40-50％克里克培养基、5-20％FBS和1-5mM L-谷氨酰胺，和终浓度为10-200IU/ml的添加的IL-2；
(iv)收集步骤(iii)获得的细胞，和；
(v)在有EBV转化的(LCL)存在下，以响应者:刺激物之比为2:1至7:1，通过在培养基中培养步骤(iv)收集的细胞1-8天来再刺激T细胞，所述培养基包含：(a)细胞培养基，包含40-50％RPMI-1640培养基、40-50％克里克培养基、5-20％FBS和1-5mM L-谷氨酰胺，(b)在步骤(iii)终末点获得的至少10％条件化培养基，和(c)终浓度为10-200(例如40-100)IU/ml的添加的IL-2。在一些实施方式中，所述方法还包括：
(vi)收集步骤(v)获得的细胞，和；
(vii)在有EBV转化的LCL存在下，以响应者:刺激物之比为2:1至7:1，通过在培养基中培养步骤(vi)收集的细胞1-8天来再刺激T细胞，所述培养基包含：(a)细胞培养基，包含40-50％RPMI-1640培养基、40-50％克里克培养基、5-20％FBS和1-5mM L-谷氨酰胺，(b)在步骤(v)终末点获得的至少10％条件化培养基，和(c)终浓度为10-200(例如40-100)IU/ml的添加的IL-2。在一些实施方式中，所述方法包括额外的步骤：收集细胞，和在有EBV转化的LCL(例如辐照的、EBV转化的LCL)存在下，以响应者:刺激物之比为2:1至7:1，通过在培养基中培养收集的细胞1-8天来再刺激T细胞，所述培养基包含：(a)细胞培养基，包含40-50％RPMI-1640培养基、40-50％克里克培养基、5-20％FBS和1-5mM L-谷氨酰胺，(b)在先刺激步骤终末点获得的至少10％条件化培养基，和(c)终浓度为10-200IU/ml的添加的IL-2。
在另一方面，本发明提供治疗对象中癌症的方法，所述方法包括：
(1)从对象分离T细胞；
(2)通过以下方法产生或扩增病毒特异性T细胞群：在有呈递病毒肽的抗原呈递细胞(APC)存在下，通过培养来刺激T细胞，其中10-25％的培养细胞的培养基是从包含T细胞和呈递病毒肽的APC的刺激培养物获得的条件化培养基；和
(3)将产生或扩增的T细胞群给予对象。
在一些实施方式中，从响应者:刺激物之比为1:1至10:1的、包含T细胞和呈递病毒肽的APC的、1-8天刺激培养物获得所述条件化培养基。在一些实施方式中，在有呈递病毒肽的APC存在下，通过培养来刺激T细胞包括在有EBV转化的LCL存在下，以响应者:刺激物之比为2:1至7:1，在培养基中进行1-8的培养，所述培养基包含：(a)细胞培养基，包含40-50％RPMI-1640培养基、40-50％克里克培养基、5-20％FBS和1-5mM L-谷氨酰胺，(b)通过以下方法获得的10％-25％的条件化培养基：在有EBV转化的LCL存在下，以响应者:刺激物之比为2:1至7:1，通过在细胞培养基中培养1-8天来刺激T细胞，所述细胞培养基包含40-50％RPMI-1640培养基、40-50％克里克培养基、5-20％FBS和1-5mM L-谷氨酰胺，和终浓度为10-200IU/ml的添加的IL-2，和(c)终浓度为10-200IU/ml的添加的IL-2。在一些实施方式中，呈递病毒肽的APC是EBV转化的淋巴母细胞样细胞系(lymphoblastoid cell line,LCL)细胞。在一些实施方式中，所述癌症是EBV-阳性癌症。在一些实施方式中，所述癌症是EBV-阳性鼻咽癌(NPC)。在一些实施方式中，约15％的培养细胞的培养基是条件化培养基。在一些实施方式中，步骤(2)还包括：收集产生或扩增的T细胞群。
在另一方面，本发明治疗对象中癌症的方法，所述方法包括：
(1)从对象分离T细胞；
(2)通过以下方法产生或扩增病毒特异性T细胞群：在有呈递病毒肽的抗原呈递细胞(APC)存在下，通过培养来刺激T细胞，其中10-25％的培养细胞的培养基是条件化培养基，所述条件化培养基从响应者:刺激物之比为2:1至7:1的、包含T细胞和呈递病毒肽的APC的、1-8天刺激培养物获得；和
(3)将产生或扩增的T细胞群给予对象。
在一些实施方式中，在有呈递病毒肽的APC存在下，通过培养来刺激T细胞包括在有EBV转化的LCL存在下，以响应者:刺激物之比为2:1至7:1，在培养基中培养1-8天，所述培养基包含：(a)细胞培养基，包含40-50％RPMI-1640培养基、40-50％克里克培养基、5-20％FBS和1-5mM L-谷氨酰胺，(b)通过以下方法获得的10％-25％的条件化培养基：在有EBV转化的LCL存在下，以响应者:刺激物之比为2:1至7:1，通过在细胞培养基中培养1-8天来刺激T细胞，所述细胞培养基包含40-50％RPMI-1640培养基、40-50％克里克培养基、5-20％FBS和1-5mM L-谷氨酰胺，和终浓度为10-200IU/ml的添加的IL-2，和(c)终浓度为10-200IU/ml的添加的IL-2。在一些实施方式中，所述癌症是EBV-阳性癌症。在一些实施方式中，所述癌症是EBV-阳性鼻咽癌(NPC)。在一些实施方式中，约15％的培养细胞的培养基是条件化培养基。在一些实施方式中，步骤(2)还包括：收集产生或扩增的T细胞群。
在另一方面，本发明提供了一种产生或扩增病毒特异性T细胞群的方法，包括在有呈递病毒肽的抗原呈递细胞(APC)存在下，通过培养刺激T细胞，其中10％-25％的培养细胞的培养基是从包含T细胞和呈递病毒肽的APC的刺激培养物获得的条件化培养基。
在一些实施方式中，从响应者:刺激物之比为2:1至7:1的、包含T细胞和呈递病毒肽的APC的、1-8天刺激培养物获得所述条件化培养基。在一些实施方式中，在有呈递病毒肽的APC存在下，通过培养来刺激T细胞包括在有EBV转化的LCL存在下，以响应者:刺激物之比为2:1至7:1，在培养基中进行1-8的培养，所述培养基包含：(a)细胞培养基，包含40-50％RPMI-1640培养基、40-50％克里克培养基、5-20％FBS和1-5mM L-谷氨酰胺，(b)通过以下方法获得的10％-25％的条件化培养基：在有EBV转化的LCL存在下，以响应者:刺激物之比为2:1至7:1，通过在细胞培养基中培养1-8天来刺激T细胞，所述细胞培养基包含40-50％RPMI-1640培养基、40-50％克里克培养基、5-20％FBS和1-5mM L-谷氨酰胺，和终浓度为10-200IU/ml的添加的IL-2，和(c)终浓度为10-200IU/ml的添加的IL-2。在一些实施方式中，呈递病毒肽的APC是EBV转化的淋巴母细胞样细胞系(LCL)细胞。所述10％-25％的条件化培养基是约15％的条件化培养基。在一些实施方式中，所述方法还包括：收集产生或扩增的T细胞群。在一些实施方式中，所述方法还包括：将产生或扩增的T细胞群与药学上可接受的载体、佐剂、赋形剂或稀释剂混合。
在另一方面，本发明提供病毒特异性T细胞群，其中所述T细胞群通过本发明的方法获得，或可通过本发明的方法获得，或是本发明方法的产物。
在另一方面，本发明提供包含本发明的T细胞群和药学上可接受的载体、佐剂、赋形剂或稀释剂的药物组合物。
在另一方面，本发明提供本发明的T细胞群或药物组合物在疾病或病症的治疗或预防中的应用。
在另一方面，本发明提供本发明的T细胞群或药物组合物在制备用于治疗或预防疾病或病症的药物或疫苗中的用途。
在另一方面，本发明提供治疗或预防对象中疾病或病症的方法，包括将治疗或预防有效量的本发明T细胞群或药物组合物给予对象。
在一些实施方式中，所述疾病或病症是T细胞特异性的病毒感染所致或为之恶化，或是T细胞特异性的病毒感染是风险因子的疾病或病症。在一些实施方式中，所述疾病或病症是癌症。在一些实施方式中，所述癌症是EBV-阳性癌症。在一些实施方式中，所述癌症是EBV-阳性鼻咽癌(NPC)。
在另一方面，本发明提供诸部件构成的试剂盒，包括预定量的本发明T细胞群或药物组合物。
描述
T细胞和抗原呈递细胞
本发明涉及病毒特异性T细胞群的产生和/或扩增。
本文所用的病毒特异性T细胞是对被病毒感染或包含病毒肽的细胞具有反应性的T细胞。病毒特异性T细胞包含能够结合MHC分子的T细胞受体(TCR)，所述MHC分子呈递T细胞特异性的病毒肽。
T细胞受体(TCR)是异二聚的抗原结合分子，通常包含α-链和β-链。在自然界中，α-链和β-链在T细胞(αβT细胞)的细胞表面表达为含不变CD3链的复合物。包含γ和δ链的另一TCR在T细胞子集(γδT细胞)上表达。TCR识别(结合)由主要组织相容性复合物(MHC)分子呈递的抗原肽。TCR结构和肽-MHC复合物的识别详细描述于例如《免疫生物学》(Immunobiology),第五版,Janeway CA Jr,Travers P,Walport M等,纽约:GarlandScience(2001),第3和6章，其全部内容通过引用纳入本文。
T细胞可以参考以下一种或多种的表面表达来表征：TCR多肽(例如α、β、γ或δ链)、CD3多肽(例如γ、δ或ε链)、CD8和CD4。给定多肽的表面表达可以通过本领域熟知的各种方法测量，例如基于抗体的方法，如免疫组织化学、免疫细胞化学和流式细胞术。
根据本发明方法扩增的T细胞包含病毒特异性TCR。在一些实施方式中，T细胞是CD3+CD8+T细胞。在一些实施方式中，T细胞是细胞毒性T细胞。在一些实施方式中，T细胞是CD3+CD4+T细胞。在一些实施方式中，T细胞是辅助性T细胞。在一些实施方式中，本发明的方法用于产生和/或扩增病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和辅助性T淋巴细胞群。
通过释放细胞毒性因子，包括穿孔素、颗粒酶、颗粒溶素和/或通过在T细胞上表达的FASL将FAS连接到感染细胞上来诱导被感染细胞的凋亡，CTL能够在感染病毒的细胞中实现细胞死亡(描述于，例如Chavez-Galan等.,Cellular and Molecular Immunology(2009)6(1):15-25，其全部内容通过引用纳入本文)。例如，可以采用Zaritskaya等在Expert RevVaccines(2011),9(6):601-616中综述的任何方法研究细胞毒性，该文献的全部内容通过引用纳入本文。测定T细胞对靶细胞的细胞毒性的一个实例是51Cr释放测定，其中靶细胞用被它们内化的51Cr处理。T细胞对靶细胞的裂解导致放射性51Cr释放到细胞培养上清液中，从而可以被检测到。
APC呈递的病毒肽可以源自病毒颗粒，或者可以由病毒的核酸编码。本文所用的“肽”是指两个或更多个氨基酸单体通过肽键连接的链，其长度为50个氨基酸或更少些。
病毒肽由I类或II类MHC分子呈递。I类MHC分子是α链和β2-微球蛋白的异二聚体。α链具有三个结构域，为α1、α2和α3。α1和α2结构域一起形成与I类MHC分子呈递的肽结合的凹槽，以形成肽-MHC复合物。I类MHCα链是多态的，并且不同的α-链能够结合并呈递不同的肽。类似于I类MHC分子，II类MHC分子也是异二聚体，并且由α链和β链组成。在人中，I类MHCα链和II类MHCα及β链由人白细胞抗原(HLA)基因编码。
本发明的病毒特异性T细胞包含TCR，其能够结合由I类MHC或II类MHC分子呈递的T细胞特异性病毒的肽。
T细胞特异性的病毒可以是dsDNA病毒(例如腺病毒、疱疹病毒、痘病毒)、ssRNA病毒(例如细小病毒)、dsRNA病毒(例如呼肠孤病毒)，(+)ssRNA病毒(例如小RNA病毒、披膜病毒)，(-)ssRNA病毒(例如正粘病毒、弹状病毒)、ssRNA-RT病毒(例如逆转录病毒)或dsDNA-RT病毒(例如嗜肝DNA病毒)。本发明包括腺病毒科、疱疹病毒科、乳头瘤病毒科、多瘤病毒科、痘病毒科、肝DNA病毒科、细小病毒科、星状病毒科、杯状病毒科、微小核糖核酸病毒科、冠状病毒科、黄病毒科、披膜病毒科、肝炎病毒科、逆转录病毒科、正粘病毒科、沙粒病毒科、布尼亚病毒科、丝状病毒科、副粘病毒科、弹状病毒科和呼肠弧病毒科。
疾病或病症相关的病毒是特别令人感兴趣的。因此，考虑了以下病毒：腺病毒、1型单纯疱疹病毒病毒、2型单纯疱疹病毒病毒、水痘-带状疱疹病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、人巨细胞病毒、8型人疱疹病毒、人乳头瘤病毒、BK病毒、JC病毒、天花病毒、乙肝病毒、细小病毒B19、人星状病毒、诺沃克病毒、柯萨奇病毒、甲型肝炎病毒、脊髓灰质炎病毒、鼻病毒、严重急性呼吸综合征病毒、丙型肝炎病毒、黄热病病毒、登革热病毒、西尼罗病毒、TBE病毒、风疹病毒、戊型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒、流感病毒、拉沙病毒、克里米亚-刚果出血热病毒、汉坦病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、狂犬病病毒、丁型肝炎病毒、轮状病毒、环状病毒、科罗拉多蝉热病毒和版纳病毒(bannavirus)。
在一些实施方式中，病毒是爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)。因此，在一些实施方式中，该方法用于产生或扩增EBV特异性T细胞群。
在一些实施方式中，EBV是毒株B95-8、P3HR-1或其衍生物。
在本发明中，病毒肽由抗原呈递细胞(APC)呈递。APC通过分子机制将多肽加工成肽，然后肽与MHC分子结合并作为肽-MHC复合物呈递到细胞表面。不同的TCR显示出不同的结合能力，因此对不同的肽-MHC复合物具有不同的反应性。
病毒肽/多肽经加工并与MHC分子形成复合物呈递。MHC上的抗原加工、加载和呈递详细描述于，例如《免疫生物学》(Immunobiology),第五版,Janeway CA Jr,Travers P,Walport M等,纽约:Garland Science(2001),第5章，其全部内容通过引用纳入本文。
通过识别MHC-肽复合物，不同种类的T细胞经由它们的TCR激活。CD8+T细胞识别肽-MHC I类复合物，而CD4+T细胞识别肽-MHC II类复合物。T细胞活化需要结合MHC-肽复合物，其中在来自APC的阳性共刺激信号的背景下，T细胞的TCR对该复合物具有高亲和力。T细胞活化的过程是本领域技术人员公知的，并且详细描述于，例如《免疫生物学》(Immunobiology),第五版,Janeway CA Jr,Travers P,Walport M等,纽约:GarlandScience(2001),第8章，其全部内容通过引用纳入本文。
本发明的APC可以是专职APC。专职APC专门用于向T细胞呈递抗原；它们有效地加工和在细胞表面呈递MHC-肽复合物，并且表达高水平的共刺激分子。专职APC包括树突细胞(DC)、巨噬细胞和B细胞。非专职APC是能够将MHC-肽复合物呈递给T细胞的其它细胞，特别是将MHC I类肽复合物呈递到CD8+T细胞。
关于本发明，APC可以是被病毒感染的，或包含或表达病毒的肽的任何细胞，其中T细胞对该病毒包含特异性TCR。被病毒感染的或包含或表达病毒肽的细胞可以在细胞表面的MHC分子的环境中下呈递病毒肽。
应理解，本文提及的“肽”包括多种肽。例如，呈递病毒肽的APC可呈递多种病毒肽。
APC可包含编码MHC I类或II类分子的HLA等位基因，这类分子能够呈递T细胞的TCR的特异性病毒肽。在一些实施方式中，对于T细胞的TCR识别的病毒肽，APC可以与HLA匹配。
在一些实施方式中，APC可以由于被病毒感染而表达或包含病毒的肽。在一些实施方式中，APC可能经修饰以包含或表达病毒的肽。例如，在一些实施方式中，细胞可以经修饰为包含编码病毒肽的核酸，或者可以用病毒肽脉冲。
在一些实施方式中，可以向APC提供肽混合物文库中的一种或多种病毒肽，其可以称为肽混(pepmixes)。在一些实施方式中，存在用于暴露于APC的各种肽混的集合。呈递病毒肽的APC可在某些条件下暴露于外周血T细胞，从而导致对某些病毒肽特异性的T细胞的刺激。
在一些实施方式中，APC是B细胞或衍生自B细胞。在具体的实施方式中，APC可以是淋巴母细胞样细胞系(LCL)的细胞。
LCL可以通过B细胞的病毒转化来制备。通常用爱泼斯坦-巴尔病毒转化B细胞来产生LCL。LCL的产生和特征详细描述于，例如，Hui-Yuen等.,J Vis Exp(2011)57:3321和Hussain和Mulherkar,Int J Mol Cell Med(2012)1(2):75-87，二者均通过引用整体并入本文。简言之，可以在有环孢菌素A存在下，将PBMC与产生EBV的细胞的浓缩细胞(例如B95-8细胞)培养上清液孵育来产生LCL。
在一些实施方式中，APC获自或衍生自与产生或扩增T细胞群的对象相同的对象的细胞。即，在一些实施方式中，APC和T细胞是自体来源的。在一些实施方式中，APC获自或来自与产生或扩增T细胞群的对象不同的对象的细胞。即，在一些实施方式中，APC和T细胞是异源来源的。
在本发明的一些实施方式中，APC是用EBV转化B细胞制备的LCL，其中B细胞获自与本发明方法中使用的T细胞相同的对象。在一些实施方式中，通过转化与获得T细胞的对象不同的对象获得的B细胞来制备LCL。
在一些实施方式中，用于制备LCL的B细胞可以从外周血单核细胞(PBMC)群获得，该外周血单核细胞群是从产生和/或扩增本发明的病毒特异性T细胞群PBMC群的相同个体获得。在一些实施方式中，用于制备LCL的B细胞是从产生和/或扩增本发明的病毒特异性T细胞群的相同PBMC群获得。
在一些实施方式中，在有T细胞存在下进行培养之前，用物质(例如丝裂霉素C)照射或处理APC(例如LCL)以防止它们的增殖。根据本方法，LCL照射通常为6000至12000拉德(rad)。
相对于产生/扩增病毒特异性T细胞的现有技术方法，本方法可用于在更短的时间内产生大量病毒特异性T细胞。特别是，该方法可用于产生大量病毒特异性T细胞，以供病毒特异性T细胞的过继性转移，治疗或预防病毒引起或加剧的，或者对病毒感染是风险因子的疾病。
例如，当所述方法用于产生和/或扩增EBV-特异性T细胞群时，所述细胞可用于通过过继性转移来治疗EBV相关病症，例如鼻咽癌(NPC)，例如Chia WK等在MolecularTherapy(2014),22(1):132-139中所述，其全部内容通过引用并入本文。
T细胞的过继性转移通常是指从对象者获得T细胞的过程，一般通过抽取血液样品。然后通常以某种方式处理或改变T细胞，并将其返回到同一对象或引入不同的对象。该治疗通常旨在为对象提供具有某些所需特征的T细胞群，或提高该对象中具有此类特征的T细胞的频率。病毒特异性T细胞的过继性转移描述于，例如Cobbold等.,(2005)J.Exp.Med.202:379-386和Rooney等.,(1998),Blood92:1549-1555，其全部内容通过引用纳入本文。
本文的对象可以是人。在一些实施方式中，对象可以是非人哺乳动物(例如兔、豚鼠、大鼠、小鼠或其它啮齿动物(包括啮齿目中的任何动物)、猫、狗、猪、绵羊、山羊、牛(包括乳牛，例如奶牛，或牛目的任何动物)、马(包括马目的任何动物)、驴和非人灵长类动物。
刺激T细胞
在本发明中，产生和/或扩增T细胞群。该方法通常包括刺激T细胞的步骤，导致它们的细胞分裂并因此增加它们的数量。
可以通过刺激和随后的细胞分裂从单个T细胞产生T细胞群。可以通过刺激T细胞群的细胞和随后的细胞分裂而扩增现有的T细胞群。
呈递病毒肽的APC优先刺激对病毒特异性T细胞(即，具有能够识别由APC呈递的病毒肽的TCR的T细胞)，因此，相比于不包含/表达病毒特异TCR的其它T细胞，刺激导致这些细胞的细胞分裂和增殖。因此，与刺激前细胞群相比，刺激结束时的细胞群富集了病毒特异性T细胞；即，在刺激后，细胞群中病毒特异性T细胞的存在频率增加。以这种方式，从具有不同特异性的异质T细胞群中扩增/产生病毒特异性的T细胞群。
激活后，通过细胞分裂刺激T细胞增殖。如上所述，通过结合MHC-肽复合物而发生T细胞活化，T细胞的TCR在来自APC的阳性共刺激信号的背景下对该复合物具有高亲和力。
激活诱导T细胞产生促进细胞分裂的IL-2。T细胞活化也上调IL-2受体的表达，因此以自分泌方式促进活化T细胞的增殖。
本发明的方法包括使用呈递T细胞特异性的病毒肽的APC刺激和再刺激T细胞的步骤。刺激性APC被病毒感染，或包含或表达该病毒的肽，其中T细胞包含该病毒的特异性TCR，并且刺激性APC在MHC分子的背景下呈递病毒肽。刺激促进细胞分裂(即，使T细胞增殖)，导致病毒特异性T细胞群的产生和/或扩增。
这样的方法步骤在本文中可称为“刺激步骤”，即，包括在有呈递病毒肽的APC存在下，通过培养来“刺激”和/或“再刺激”T细胞。在本发明的刺激步骤的背景下，T细胞和呈递病毒肽的APC的培养物在本文中可称为“刺激培养物”。从本公开内容将清楚，刺激步骤的刺激培养物包括在包含细胞培养基的培养基中培养的细胞，并且在许多情况下还包含条件化培养基。
根据本发明的方法刺激T细胞包括在有APC存在下培养T细胞；即，共培养T细胞和APC。共培养通常在体外或离体进行。
在本方法中，病毒特异性T细胞群通常由PBMC群产生或扩增。因此，在本发明方法的一些实施方式中，在有APC存在下，通过培养刺激的T细胞与其它PBMC，如B细胞、NK细胞和/或单核细胞一起存在于培养物中。在一些实施方式中，可以从白细胞群产生或扩增T细胞群，因此可以与除T细胞之外的白细胞，例如B细胞、NK细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和/或嗜碱性粒细胞一起培养。
从中产生或扩增病毒特异性T细胞群的细胞群在本文中可称为“响应者”，呈递病毒肽的APC在本文中可称为“刺激物”。在一些实施方式中，本发明方法的刺激步骤提供特定比例的“响应者”和“刺激物”，在本文中称为“响应者与刺激物之比”。从上文可以明白，在一些实施方式中，本文所用的“响应者”是指PBMC群。在一些实施方式中，“响应者”是指T细胞群或白细胞群。
在初始刺激步骤中，“响应者”是包含T细胞的细胞群，从该T细胞产生和/或扩增病毒特异性T细胞群。初始刺激的“响应者”可以是，例如T细胞群、淋巴细胞群、白细胞群或PBMC群。在具体的实施方式中，初始刺激的“响应者”是PBMC群。
在初始刺激步骤之后的刺激步骤(即，再刺激T细胞的步骤)中，“响应者”是在前一刺激步骤结束时的细胞，例如在前一刺激步骤结束时收集的细胞。后续刺激步骤的“响应者”将包括在前一刺激步骤结束时培养物中的活细胞，包括已被刺激而分裂的细胞。
例如，在一方法中包括以下步骤：
(i)在有呈递病毒肽的APC存在下，通过培养刺激T细胞；
(ii)收集步骤(i)获得的细胞，和；
(iii)在有呈递病毒肽的APC存在下，通过培养再刺激T细胞，其中至少10％的培养细胞的培养基是从T细胞和呈递病毒肽的APC的刺激培养物获得的条件化培养基；
步骤(iii)的刺激的“”是在步骤(ii)收集的细胞。
应当理解，“响应者与刺激物之比”是指在给定刺激步骤开始时细胞的相对数量，即，在刺激步骤开始时提供给培养物的细胞的比例。
在一些实施方式中，再刺激步骤的“响应者”可包括除T细胞以外的细胞；例如上述的其它PBMC或白细胞。例如，在其中本发明方法的初始刺激步骤的响应者是PBMC的实施方式中，在所述初始刺激步骤结束时收集的细胞可以包括除T细胞之外的PBMC或白细胞。
包括多个刺激步骤的用于扩增病毒特异性T细胞的方法是本领域技术人员公知的。典型的培养条件(即，细胞培养基、添加剂、温度、气体气氛)、响应者与刺激物之比、刺激步骤的培养时间等通过参考，例如Bollard等.,J Exp Med(2004),200(12):1623-1633和Straathof等.,Blood(2005),105(5):1898-1904不难决定，两者均通过引用全文纳入本文。
在细胞培养基中进行本发明刺激步骤中的T细胞和APC共培养。细胞培养基可以是其中本发明的T细胞和APC可以在体外/离体培养中维持的任何培养基。适用于淋巴细胞培养的培养基是本领域技术人员公知的，包括例如AIM-V培养基、Iscoves培养基和RPMI-1640培养基。
本文所用的“细胞培养基”不同于“条件化培养基”。从本公开的完整内容将清楚，可以基本上仅利用细胞培养基(例如在初始刺激步骤中)建立本发明的包含T细胞和APC的培养物，或者可以包含细胞培养基和条件化培养基(例如在后续刺激步骤中)。
在一些实施方式中，细胞培养基可包含RPMI-1640培养基和/或克里克培养基(也称为伊汉氨基酸(Eagle’s Ham’s amino acids(EHAA)培养基)。这些培养基的组成是技术人员熟知的。RPMI-1640培养基的配方描述于例如Moore等.,JAMA(1967)199:519-524，克里克培养基的配方描述于Click等.,Cell Immunol(1972)3:264-276。RPMI-1640培养基可以从，例如赛默飞世尔科技公司获得，克里克培养基可以从，例如西格玛奥德里奇(目录号C5572)获得。
在一些实施方式中，细胞培养基包括RPMI-1640培养基和克里克培养基。在一些实施方式中，细胞培养基包含(按体积计)25-65％的RPMI-1640培养基和25-65％的克里克培养基。在一些实施方式中，细胞培养基包含30-60％的RPMI-1640培养基和30-60％的克里克培养基。在一些实施方式中，细胞培养基包含35-55％的RPMI-1640培养基和35-55％的克里克培养基。在一些实施方式中，细胞培养基包含40-50％的RPMI-1640培养基和40-50％的克里克培养基。在一些实施方式中，细胞培养基包含45％的RPMI-1640培养基和45％的克里克培养基。
在一些实施方式中，细胞培养基可包含一种或多种细胞培养基添加剂。细胞培养基添加剂是本领域技术人员公知的，包括抗生素(例如青霉素、链霉素)、血清(例如胎牛血清(FBS)、牛血清白蛋白(BSA))、L-谷氨酰胺、细胞因子/生长因子等。
在一些实施方式中，细胞培养基包含(按体积计)5-20％的FBS、7.5-15％的FBS或10％的FBS。在一些实施方式中，细胞培养基包含1-5mM L-谷氨酰胺、1.5-3mML-谷氨酰胺或2mM谷氨酰胺。
在一些实施方式中，用于刺激步骤的细胞培养基可包含IL-2。在一些实施方式中，可以添加IL-2(在本文中称为“添加的IL-2”)。在一些实施方式中，IL-2可以是外源的，即，IL-2不是由所培养的细胞产生的。在一些实施方式中，IL-2可以是重组IL-2。
在一些实施方式中，本发明的刺激步骤的细胞培养基包含终浓度为10-200IU/ml、15-175IU/ml、20-150IU/ml、30-125IU/ml或40-100IU/ml的添加的IL-2。该终浓度是在刺激步骤的培养物中培养基(包括细胞培养基和任何条件化培养基)总体积中的浓度。
在一些具体的实施方式中，细胞培养基包含40-50％的RPMI-1640培养基、40-50％的克里克培养基、5-20％的FBS、1-5mM L-谷氨酰胺，和终浓度为10-200IU/ml的添加的IL-2。在一些实施方式中，细胞培养基包含42.5-47.5％的RPMI-1640培养基、42.5-47.5％的克里克培养基、7.5-15％的FBS、1.5-3mM L-谷氨酰胺和终浓度为20-150IU/ml的添加的IL-2。在一些实施方式中，细胞培养基包含45％的RPMI-1640培养基、45％的克里克培养基、10％的FBS、2mM L-谷氨酰胺和终浓度为40-100IU/ml的添加的IL-2。
本发明的刺激步骤通常包括将T细胞和APC共培养一段确定的时间。该时间段宜至少足以使APC刺激T细胞进行细胞分裂。在一些实施方式中，所述时间段对于刺激足够长并且至少刺激的T细胞的单次细胞分裂。
在一些实施方式中，本发明方法的刺激步骤包括培养T细胞和APC至少1小时、至少6小时、至少12小时、至少24小时、至少48小时、至少36小时、至少72小时、至少4天、至少5天、至少6天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、在至少12天、至少13天或至少14天。在一些实施方式中、刺激步骤包括培养T细胞和APC的时间为以下之一：不超过20天、不超过14天、不超过13天、不超过12天、不超过11天、不超过10天、不超过9天、不超过8天、不超过7天、不超过6天、不超过5天、不超过4天或不超过72小时。
在一些实施方式中，本发明方法的刺激步骤包括将T细胞和APC培养以下之一的时间段：24小时至20天、48小时至14天和3至12天。在一些实施方式中，刺激步骤包括将T细胞和APC培养以下之一的时间段：7至14天、8天至13天和9至12天。在一些实施方式中，刺激步骤包括将T细胞和APC培养以下之一的时间段：1至8天、2至6天和3至4天。
通常将培养中的细胞与培养它们的培养基分离来终止刺激步骤。在一些实施方式中，所述方法包括在刺激步骤结束时收集细胞的步骤(即，收集在前一刺激步骤结束时获得的细胞)。刺激步骤的结束由该步骤的培养期决定；例如，通过在7天培养期结束时收集细胞来终止在有呈递病毒肽的APC存在下，培养7天来刺激T细胞的方法步骤。
在本发明方法的一些实施方式中，通过稀释培养物，例如通过加入细胞培养基来终止刺激步骤。通过添加细胞培养基。在此类实施方式中，不需要收集细胞，并且可以通过以下方式建立本发明的再刺激步骤：添加适当量的细胞培养基(和本文所述的任何其它添加剂)以达到细胞培养基、条件培养基(和任何添加剂)的所需百分比/浓度以供再刺激步骤。
在刺激步骤的培养期结束时，可以收集细胞并从细胞培养上清液中分离。对于悬浮培养中生长的细胞(例如淋巴细胞)，可以通过离心收集细胞，并且可以将细胞培养上清液与细胞沉淀分离。然后可以将细胞沉淀重悬在细胞培养基中，例如作进一步的刺激步骤。在一些实施方式中，细胞可在收集后经历洗涤步骤。洗涤步骤可包括将细胞沉淀重悬于等渗缓冲液，如磷酸缓冲盐水(PBS)中，通过离心收集细胞，并弃去上清液。
本发明的产生和/或扩增病毒特异性T细胞群的方法通常涉及不止一个刺激步骤。在本发明的方法中可以进行的刺激步骤的数量没有上限。在一些实施方式中，所述方法包括超过2、3、4或5个刺激步骤。在一些实施方式中，所述方法包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个刺激步骤之一。
本发明方法中的刺激步骤可以彼此不同。
待扩增的病毒特异性T细胞的频率在初始响应者群体(例如，从对象获得的PBMC样品)中可能非常低，在后续步骤中，响应者群体中病毒特异性T细胞的频率因先前的一次或多次刺激而变大。因此，在一些实施方式中，相比于后续(即再刺激)步骤，该方法为初始刺激步骤提供更高的响应者与刺激物之比。
在一些实施方式中，对于初始刺激步骤，响应者与刺激物之比在以下之一的范围内：10:1至80:1、15:1至70:1、20:1至65:1、25:1至60:1、30:1至50:1、35:1至45:1或40:1。在一些实施方式中，对于再刺激步骤，响应者与刺激物之比率在在以下之一的范围内：1:1至10:1、1.5:1至8:1、2:1至7:1、2.5:1至6:1、3:1至5:1、3.5:1至4.5:1，或4:1。
初始刺激步骤(即，该方法的第一刺激步骤)通常涉及培养T细胞和APC一段时间，该时间段比后续刺激步骤的培养期更长。较长的时间段允许病毒特异性T细胞的数量从初始刺激的响应者群体中通常低的频率显著增加。
在一些实施方式中，初始刺激步骤包括将T细胞和APC培养以下之一的时期：7至14天、8天至13天和9至12天。在一些实施方式中，后续刺激步骤包括将T细胞和APC培养以下之一的时期：1至8天、2天至5天和3至4天。
在一些实施方式中，初始刺激步骤的培养物可以不包括添加的IL-2，而后续刺激步骤的培养物可以包括添加的IL-2。
在一些实施方式中，所述方法包括初始刺激步骤，然后是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个后续刺激步骤。在一些实施方式中，每个后续刺激步骤包括培养T细胞和APC相同或相似的时间段。在一些实施方式中，每个后续刺激步骤涉及以相同或相似的响应者与刺激物之比来培养T细胞和APC。在一些实施方式中，每个后续刺激步骤的培养物包括相同或相似终浓度的添加的IL-2。
方便地，将本发明的细胞培养物维持在37℃下，含5％CO2的潮湿气氛中。可以在适合培养物体积的任何容器中进行培养，例如在细胞培养板的孔中、细胞培养瓶、生物反应器等。可以以任何合适的密度建立和/或维持本发明的细胞培养物的细胞，技术人员不难确定。例如，可以建立约0.5×106至约5×106个细胞/ml培养物的初始密度(例如约1×106个细胞/ml)的培养物。
细胞可以在任何合适的细胞培养容器中培养。在本发明各方面的方法的一些实施方式中，细胞在生物反应器中培养。在一些实施方式中，细胞在Somerville和Dudley,Oncoimmunology(2012)1(8):1435-1437中描述的生物反应器中培养，其通过引用全文纳入本文。在一些实施方式中，细胞在GRex细胞培养容器，例如GRex烧瓶或GRex 100生物反应器中培养。
条件化培养基
本发明涉及在条件化培养基中培养细胞。“条件化培养基”是指通过在细胞培养基中培养细胞获得的培养基。条件化培养基含有从培养的细胞分泌/释放的因子(例如细胞因子、趋化因子、生长因子等)。通过在培养基中培养细胞足以条件化培养基的时间，然后收集该条件化培养基来产生条件化培养基。
本发明的刺激步骤的培养物可包含细胞培养基和条件化培养基的混合物。即，在其中建立和培养刺激培养物的细胞(例如刺激步骤的)的培养基可以包含细胞培养基和条件化培养基。使用条件化培养基和新鲜培养基的混合物可以提供更复杂的营养混合物，其有益于培养中的细胞。
应理解，条件化培养基的组成将取决于细胞、时间、培养条件、任何添加剂的使用和用于从中获得条件化培养基的培养物的细胞培养基的组成。
在本发明中，条件化培养基从包含T细胞和APC的刺激培养物中获得。
在一些实施方式中，除了已经条件化的条件化培养基，本发明方法的刺激培养物的细胞培养基和条件化培养基可以是相同的。
在本发明方法的一些实施方式中，条件化培养基可以从本文所述的任何实施方式的刺激步骤的培养物中获得。
在一些实施方式中，在刺激步骤的终末点收集条件化培养基。可以在收集细胞时在刺激步骤的终末点方便地收集条件化培养基。例如，本发明的条件化培养基可以从离心获得的上清液中获得，从而在本文所述的刺激步骤结束时收集细胞。
在一些实施方式中，包含在本发明的刺激步骤的培养物(即刺激培养物)中的条件化培养基获自本文所述刺激步骤的培养物。在一些实施方式中，条件化培养基不是从初始刺激步骤(即，本发明方法的第一刺激步骤)的培养物中获得。
用于条件化培养基的适当培养期可以由技术人员基于已知方法确定。通常，将培养基条件化约1小时至约8天，例如约1天至8天、2天至5天或3至4天。
在具体的实施方式中，本发明的条件化培养基获自：
(1)有APC存在下的病毒特异性T细胞的刺激培养物，所述APC呈递该T细胞的特异性病毒肽；
(2)在培养以下时间之一：1至8天、2天至6天、3至4天之后，(1)的刺激培养物；
(3)(1)或(2)的刺激培养物，响应者:刺激物之比为以下之一：1:1至10:1、1.5:1至8:1、2:1至7:1、2.5:1至6:1、3:1至5:1、3.5:1至4.5:1、或4:1；
(4)(1)-(3)中任一项的刺激培养物，其中用于刺激培养的细胞培养基包含30-60％的RPMI-1640培养基和/或30-60％的克里克培养基和/或5-20％的FBS和/或1-5mM L-谷氨酰胺；
(5)(1)-(4)中任一项的刺激培养物，其包含添加的IL-2，终浓度为10-200IU/ml、15-175IU/ml、20-150IU/ml、30-125IU/ml或40-100IU/ml；
(6)(1)-(5)中任一项所述的刺激培养物，还包含从(1)-(5)中任一项所述的刺激培养物得到的至少10％的条件化培养基；
(7)(1)-(6)中任一项所述的刺激培养物，其中APC是LCL，例如EBV转化的LCL。
在一些实施方式中，包含在给定刺激步骤的培养物中的条件化培养基可以从相同方法的另一个不同刺激步骤的培养物中获得。例如，可以从第二刺激步骤的培养物中获得包含在本发明方法的第三刺激步骤的培养物中的条件化培养基。
在一些实施方式中，刺激步骤的培养物中包含的条件化培养基可以从该方法的先前刺激步骤的培养物中获得。例如，包括在第三刺激步骤的培养物中的条件化培养基可以从第二刺激步骤的培养物获得，并且包括在第四刺激步骤的培养物中的条件化培养基可以从第三刺激步骤的培养物获得，等等。
在本发明方法的实施方式中，不是每个刺激步骤都包括在包含条件化培养基的培养基中的培养物。例如，在一些实施方式中，所述方法的初始刺激步骤的培养物不包括条件化培养基。
包含条件化培养基的刺激步骤的培养物可以含有的条件化培养基的量(以体积计)是以下之一：刺激步骤培养物中培养基总体积的至少2％、至少5％、至少7.5％、至少10％、至少15％、至少15％至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。剩余的体积可以通过如本文所述的细胞培养基补充，包括其中的任何添加剂。在一些实施方式中，条件化培养基可以占刺激步骤培养物中培养基总体积的至少10％。
尽管条件化培养基富含生长因子和细胞因子，但与未条件化的相当细胞培养基相比，它因培养基中培养的细胞消耗而通常包含较低浓度的，例如氨基酸和葡萄糖。条件化培养基还可包含用于条件化培养基的细胞的废物。此类因素可能对细胞生长和分裂有负面影响，因此重要的是本发明刺激步骤的刺激培养物中不是100％的培养基是条件化培养基。在一些实施方式中，包含条件化培养基的刺激步骤的培养物可以含有的条件化培养基的量(以体积计)是以下之一：小于100％、小于95％、小于90％、小于85％、小于80％、小于75％、小于70％、小于65％、小于60％、小于55％、小于50％、小于45％、小于40％、小于35％、小于30％、小于25％、小于20％或小于15％的刺激步骤培养物中培养基总体积。
在一些实施方式中，条件化培养基可以占刺激步骤培养物中培养基总体积的至多30％、至多25％、至多20％或至多15％。
在一些实施方式中，条件化培养基可以占刺激步骤培养物中培养基总体积的以下之一：5至70％、7.5至70％、10至70％、10至65％、10至60％、12.5至55％、15至50％、15至45％、15至40％、17.5％至45％、20至40％、20至35％或20至30％。在一些实施方式中，条件化培养基可占刺激步骤培养物中培养基总体积的20-30％。在一些实施方式中，条件化培养基可以占刺激步骤培养物中培养基总体积的10至25％，优选约15％。
在一些实施方式中，条件化培养基可以占刺激步骤培养物中培养基总体积的以下一种：5至30％、5至27.5％、5至25％、5至22.5％、5至20％或5至17.5％。在一些实施方式中，条件培养基可以占刺激步骤培养物中培养基总体积的以下一种：7.5至30％、10至30％或12.5至30％。
在一些实施方式中，条件化培养基可以占刺激步骤培养物中培养基总体积的以下一种：5至30％、10至25％，10至20％，12.5至17.5％或约15％。
在一些实施方式中，条件化培养基可以占刺激步骤培养物中培养基总体积的以下一种：5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％或30％。
培养基可以是1x制剂或浓缩制剂，例如2x至250x浓缩培养基制剂。在1x制剂中，培养基中的各成分是打算用于细胞培养的浓度。在浓缩制剂中，一种或多种成分存在的浓度高于打算用于细胞培养的。浓缩的培养基是本领域熟知的。可以使用已知方法浓缩培养基，例如盐沉淀或选择性过滤。浓缩的培养基可以用水(优选去离子水和蒸馏水)或任何适当的溶液，例如盐水溶液、水性缓冲液或培养基稀释。
应理解，所示的百分比是参考1x条件培养基制剂。技术人员理解，包含10％1x条件化培养基制剂的培养基等同于包含1％的10x浓缩的条件化培养基制剂的培养基。
在一些实施方式中，可以从刺激步骤的培养物中收集条件化培养基并储存在，例如-80℃。然后可以将储存的条件化培养基解冻并用于本发明的方法。在一些实施方式中，可以处理条件化培养基以除去细胞或碎片，例如通过过滤。
所述方法的具体示范性实施方式
根据本发明，提供了这些方法的几个具体的示范性实施方式。以下具体的实施方式仅用于说明目的，以示出如何组合上文描述的各种特征，并且不旨在以任何方式限制本发明。
用于产生或扩增EBV特异性T细胞(例如CTL)群的方法，或加快EBV特异性T细胞(例如CTL)群的扩增速率的方法，包括在EBV-转化的LCL(例如，经辐照的EBV转化的LCL)存在下，以响应者与刺激物之比为2:1至7:1(例如4:1)，通过在培养基中培养1至8天(例如3至4天)来刺激T细胞(例如在PBMC群体内)，所述培养基包含：
(a)细胞培养基，包含40-50％(例如45％)RPMI-1640培养基、40-50％(例如45％)克里克培养基、5-20％(例如10％)FBS和1-5mM(例如2mM)L-谷氨酰胺，
(b)通过以下方法获得的至少10％(例如，10％至70％)的条件化培养基：在有EBV转化的LCL(例如，经辐照的EBV转化的LCL)存在下，以响应者:刺激物之比为2:1至7:1(例如4:1)，通过在细胞培养基中培养1-8天(例如3至4天)来刺激T细胞(例如在PBMC群体内)，所述细胞培养基包含40-50％(例如45％)RPMI-1640培养基、40-50％(例如45％)克里克培养基、5-20％(例如10％)FBS和1-5mM(例如2mM)L-谷氨酰胺，和终浓度为10-200(例如40-100)IU/ml的添加的IL-2，和
(c)终浓度为10-200(例如40-100)IU/ml的添加的IL-2。
一种产生或扩增EBV-特异性T细胞群(例如CTL)的方法，包括：
(i)在有EBV转化的LCL(例如，经辐照的EBV转化的LCL)存在下，以响应者:刺激物之比为10:1至80:1(例如40:1)，通过在细胞培养基中培养7-14天(例如9至12天)来刺激T细胞(例如在PBMC群体内)，所述细胞培养基包含40-50％(例如45％)RPMI-1640培养基、40-50％(例如45％)克里克培养基、5-20％(例如10％)FBS和1-5mM(例如2mM)L-谷氨酰胺；
(ii)收集步骤(i)获得的细胞；
(iii)在有EBV转化的LCL(例如，经辐照的EBV转化的LCL)存在下，以响应者:刺激物之比为2:1至7:1(例如4:1)，通过在细胞培养基中培养步骤(ii)收集的细胞1-8天(例如3-4天)来再刺激T细胞，所述细胞培养基包含40-50％(例如45％)RPMI-1640培养基、40-50％(例如45％)克里克培养基、5-20％(例如10％)FBS和1-5mM(例如2mM)L-谷氨酰胺，和终浓度为10-200(例如40-100)IU/ml的添加的IL-2；
(iv)收集步骤(iii)获得的细胞，和；
(v)在有EBV转化的LCL(例如，经辐照的EBV转化的LCL)存在下，以响应者:刺激物之比为2:1至7:1(例如4:1)，通过在培养基中培养步骤(iv)收集的细胞1-8天(例如3-4天)来再刺激T细胞，所述培养基包含：(a)细胞培养基，包含40-50％(例如45％)RPMI-1640培养基、40-50％(例如45％)克里克培养基、5-20％(例如10％)FBS和1-5mM(例如2mM)L-谷氨酰胺，(b)在步骤(iii)终末点获得的至少10％(例如10％-70％)条件化培养基，和(c)终浓度为10-200(例如40-100)IU/ml的添加的IL-2。
在一些实施方式中，所述方法还包括：
(vi)收集步骤(v)获得的细胞，和；
(vii)在有EBV转化的LCL(例如，经辐照的EBV转化的LCL)存在下，以响应者:刺激物之比为2:1至7:1(例如4:1)，通过在培养基中培养步骤(vi)收集的细胞1-8天(例如3-4天)来再刺激T细胞，所述培养基包含：(a)细胞培养基，包含40-50％(例如45％)RPMI-1640培养基、40-50％(例如45％)克里克培养基、5-20％(例如10％)FBS和1-5mM(例如2mM)L-谷氨酰胺，(b)在步骤(v)终末点获得的至少10％(例如10％-70％)条件化培养基，和(c)终浓度为10-200(例如40-100)IU/ml的添加的IL-2。
在一些实施方式中，所述方法包括额外的步骤：收集细胞，和在有EBV转化的LCL(例如辐照的、EBV转化的LCL)存在下，以响应者:刺激物之比为2:1至7:1(例如4:1)，通过在培养基中培养收集的细胞1-8天(例如3-4天)来再刺激T细胞，所述培养基包含：(a)细胞培养基，包含40-50％(例如45％)RPMI-1640培养基、40-50％(例如45％)克里克培养基、5-20％(例如10％)FBS和1-5mM(例如2mM)L-谷氨酰胺，(b)在前一刺激步骤终末点获得的至少10％(例如10％-70％)条件化培养基，和(c)终浓度为10-200(例如40-100)IU/ml的添加的IL-2。
扩增速率
与现有技术方法相比，本方法实现了病毒特异性T细胞群扩增速率的改善。
可以通过技术人员熟知的方法分析T细胞群的扩增速率。方法包括在一个或多个时间点测量T细胞的数量。例如，可以在实施本发明方法之后确定T细胞的数量，并且与该方法开始时的T细胞数量进行比较；然后可以计算T细胞数量的倍数扩增。
也可以通过分析一段时间内T细胞的细胞分裂来确定扩增速率。可以分析给定T细胞群的细胞分裂，例如，通过体外分析3H-胸苷掺入或通过CFSE稀释测定，例如Fulcher和Wong,Immunol Cell Biol(1999)77(6):559-564中所述，该文献通过引用全文纳入本文。
通过实施本发明方法，并且将该方法中的T细胞扩增情况与缺乏条件化培养基存在下的刺激培养的相当对照方法进行比较可以确定本发明方法实现的扩增速率改善。
例如，可以在两种方法之间比较扩增速率：(i)本发明的方法，包括在有呈递病毒肽的APC存在下通过培养来刺激T细胞，其中至少10％的培养细胞的培养基是从包含T细胞和呈递病毒肽的APC的刺激培养物中获得的条件化培养基；(ii)相当的对照方法，除了使用细胞培养基代替条件化培养基外，其余是相同的。
在一些实施方式中，本发明方法中T细胞群的扩增速率是使用细胞培养基代替条件化培养基的相当对照方法中的扩增速率是至少1.001倍、1.002倍、1.003倍、1.004倍、1.005倍、1.006倍、1.007倍、1.008倍、1.009倍、1.01倍、1.02倍、1.03倍、1.04倍、1.05倍、1.06倍、1.07倍、1.08倍、1.09倍、1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍或2倍。
扩增速率可以是病毒特异性T细胞群或总T细胞群的扩增速率。
扩增细胞的特性
本发明方法产生/扩增的病毒特异性T细胞宜保留与现有技术方法产生/扩增的病毒特异性T细胞相同的功能特性。即，加速的扩增速率不会对扩增的T细胞的功能性质产生负面影响。
例如，在所述方法产生/扩增病毒特异性CTL群的实施方式中，CTL对感染病毒或包含/表达病毒肽的细胞显示出与根据缺乏条件化培养基存在下的刺激培养的方法扩增的病毒特异性CTL相似的细胞毒性。
可以分析扩增的CTL的细胞毒性，例如通过在不同的效应物(即T细胞)与靶标(即APC)之比下培养扩增的T细胞群与呈递T细胞特异性的病毒肽的APC，并测量APC的特异性裂解。例如，可以通过测量在不同效应物与靶标之比下EBV转化的LCL细胞的特异性裂解来分析EBV特异性CTL群的细胞毒性。
治疗性和预防性应用
本方法可用于医学治疗方法。可以向患有需要治疗的疾病或病症的对象提供治疗。
具体地说，提供了用于治疗或预防疾病或病症(例如癌症)的方法，包括产生或扩增病毒特异性T细胞群的方法，或加速病毒特异性T细胞群扩增速率的方法，如本文所述。
本发明的治疗或预防疾病或病症的方法可包括T细胞的过继性转移。
在一方面，本发明提供治疗或预防对象中疾病或病症的方法，所述方法包括：
(1)从对象分离T细胞；
(2)产生或扩增病毒特异性T细胞群；和
(3)将产生或扩增的T细胞群给予对象。
在一些实施方式中，在该方法的步骤(1)获得T细胞的对象与在该方法的步骤(3)中给予本文所述方法产生或扩增的T细胞群的对象是相同的对象(即，过继转移的是自体T细胞)。在一些实施方式中，在该方法的步骤(1)获得T细胞的对象与在该方法的步骤(3)中给予本文所述方法产生或扩增的T细胞群的对象是不同的对象(即，过继转移的是同种异体T细胞)。
应当理解，根据上述步骤(1)从对象分离的T细胞可以在PBMC群内。
在一些实施方式中，该方法可包括以下步骤中的一个或多个：从对象中取血液样本；从血液样本中分离PBMC；从血液样本中分离T细胞；根据本文所述的方法产生或扩增病毒特异性T细胞群；修饰T细胞，例如表达嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)；收集产生/扩增的病毒特异性T细胞群；将产生/扩增的病毒特异性T细胞群与佐剂、稀释剂或载体混合；将产生/扩增的病毒特异性T细胞群给予对象。
该方法可以包括以某种方式修饰或处理T细胞。例如，可以在体外或离体修饰T细胞以表达或包含嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)。可以根据技术人员熟知的方法修饰T细胞。修饰可以包括核酸转移，以便永久或瞬时表达转移的核酸。任何合适的基因工程平台都可用于这种修饰。合适的方法包括使用基因工程平台，例如γ逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、DNA转染、基于转座子的基因递送和RNA转染，例如Maus等.,Annu RevImmunol(2014)32:189-225中所述，该文献通过引用全文纳入本文。
治疗可以旨在预防疾病/病症，因此，本发明方法产生/扩增的病毒特异性T细胞可以预防性地用于疾病状态的产生。这可以在疾病状态症状发作之前实施，和/或可以给予被认为具有更大疾病或病症风险的对象。
通过给予本发明的T细胞群，或给予包含本发明的T细胞群的药物组合物来治疗或预防疾病或病症。
所述疾病或病症可以是由病毒感染引起或加剧的疾病或病症，所述病毒是本发明方法产生/扩增的T细胞特异性的。在一些实施方式中，所述疾病或病症可以是由本文所述的病毒感染引起或加剧的疾病或病症。
具体地说，所述疾病或病症是由以下病毒引起或加剧的疾病或病症：爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)、流感病毒、麻疹病毒、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)、单纯疱疹病毒(HSV)或人乳头瘤病毒(HPV)。
本发明方法产生/扩增的病毒特异性T细胞可用于治疗或预防癌症的方法中。因此，在一些实施方式中，治疗或预防疾病或病症的方法是用于治疗或预防癌症。
医学治疗方法可以包括通过改善、治疗或预防人对象中恶性肿瘤的方法来治疗癌症，其中该方法的步骤有助于或增强免疫系统以根除癌细胞。此类方法可包括给予本发明方法产生/扩增的病毒特异性T细胞，其引发活性(或实现被动)免疫应答以破坏癌细胞。治疗方法可任选地包括共同给予生物佐剂(例如白介素、细胞因子、卡介苗(BacillusComette-Guerin)、单磷酰脂质A等)与用于治疗癌症的常规疗法的组合，例如化疗、放疗或手术。治疗方法可包括给予本发明方法产生/扩增的病毒特异性T细胞作为通过激活免疫系统以预防或破坏癌细胞生长而起作用的疫苗。医学治疗方法可涉及体内、离体和过继性免疫疗法，包括使用自体和/或异体细胞或永生化细胞系的那些。
癌症可以是任何不良的细胞增殖(或本身表现为不良细胞增殖的任何疾病)、赘生物或肿瘤，或不良细胞增殖、赘生物或肿瘤的倾向性或风险增加。癌症可以是良性或恶性的，可以是原发性或继发性(转移性)。赘生物或肿瘤可以是细胞的任何异常生长或增殖，并且可以位于任何组织中。组织的实例包括肾上腺、肾上腺髓质、肛门、阑尾、膀胱、血液、骨、骨髓、脑、乳腺、盲肠、中枢神经系统(包括或排除大脑)、小脑、子宫颈、结肠、十二指肠、子宫内膜、上皮细胞(例如肾上皮细胞)、胆囊、食道、神经胶质细胞、心脏、回肠、空肠、肾、泪腺、喉、肝、肺、淋巴、淋巴结、淋巴母细胞、上颌骨、纵隔、肠系膜、子宫肌层、鼻咽、网膜、口腔、卵巢、胰腺、腮腺、周围神经系统、腹膜、胸膜、前列腺、唾液腺、乙状结肠、皮肤、小肠、软组织、脾、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、舌、扁桃体、气管、子宫、外阴、白细胞。
待治疗的肿瘤可以是神经系统或非神经系统肿瘤。神经系统肿瘤可能源自中枢神经系统或外周神经系统，例如胶质瘤、成神经管细胞瘤、脑膜瘤、神经纤维瘤、室管膜瘤、神经鞘瘤、神经纤维肉瘤、星形细胞瘤和少突神经胶质瘤。非神经系统癌症/肿瘤可能源自任何其它非神经组织，例子包括黑色素瘤、间皮瘤、淋巴瘤、骨髓瘤、白血病、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、霍奇金淋巴瘤、慢性粒细胞白血病(CML)、急性髓性白血病(AML)、骨髓增生异常综合征(MDS)、皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、肝癌、表皮样癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌、卵巢癌、胰腺癌、胸腺癌、NSCLC、血液癌和肉瘤。
具体地说，包括治疗头颈癌、鼻咽癌(NPC)、口咽癌(OPC)、宫颈癌(CC)、胃癌或肺癌。
在一些实施方式中，癌症是EBV-或HPV-阳性癌症。在一些实施方式中，癌症是EBV-阳性NPC。在一些实施方式中，癌症是HPV-阳性OPC或HPV-阳性CC。
本发明方法产生/扩增的病毒特异性T细胞的给药优选为“治疗或预防有效量”，该量足以显示对个体的益处。给予的实际量、给药的速率和时间过程将取决于所治疗疾病的性质和严重程度。治疗处方，例如剂量等的决定由全科医生和其他医生作出，并且通常考虑待治疗的病症、个体患者的状况、递送的部位、给药方法和从业者已知的其它因素。上述技术和方案的实例可见于《雷明顿药物科学》(Remington’s Pharmaceutical Sciences),第20版,2000出版.LWW出版社(Lippincott,Williams&Wilkins)。
本发明提供了根据本文所述方法产生或扩增的T细胞群。因此，提供了病毒特异性T细胞群，其中T细胞群通过本发明方法获得，或可通过本发明方法获得，或者是本发明方法的产物。
还提供了所述T细胞群在治疗或预防本文所述疾病或病症的方法中的用途。
即，本发明提供了病毒特异性的T细胞群，以供治疗或预防疾病或病症的方法，其中所述T细胞群通过本发明方法获得，或可通过本发明方法获得，或者是本发明方法的产物。
还提供了治疗或预防对象的疾病或病症的方法，包括给予对象病毒特异性T细胞群，其中所述T细胞群通过本发明方法获得，或可通过本发明方法获得，或者是本发明方法的产物。
还提供了本发明的T细胞群或药物组合物在制备用于治疗或预防疾病或病症的药物或疫苗中的用途，其中所述T细胞群通过本发明方法获得，或可通过本发明方法获得，或者是本发明方法的产物。
药学上有用的组合物和药物
可以将本发明方法产生/扩增的病毒特异性T细胞配制以便用于临床，并且可以包含药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或佐剂。
本发明还提供了用于生产药学上有用的组合物的方法，所述组合物包含本发明方法产生/扩增的病毒特异性T细胞，此类生产方法可包括选自以下的一个或多个步骤：根据本发明的方法产生/扩增病毒特异性T细胞群；和/或将根据本发明方法产生/扩增的病毒特异性T细胞与药学上可接受的载体、佐剂、赋形剂或稀释剂混合。
在一方面，本发明提供了制备药物组合物、药物或疫苗的方法，该方法包括根据本发明的方法产生或扩增病毒特异性T细胞群，并将获得的细胞与药学上可接受的载体、佐剂、稀释剂或赋形剂混合。
本发明还提供了药物组合物，其包含本发明的T细胞群和药学上可接受的载体、佐剂、赋形剂或稀释剂。T细胞群通过本发明方法获得，或可通过本发明方法获得，或者是本发明方法的产物。
本发明提供用于治疗或预防疾病或病症的方法中的本发明药物组合物。
还提供了治疗或预防对象的疾病或病症的方法，包括给予对象本发明的药物组合物。
还提供了本发明的药物组合物在制备用于治疗或预防疾病或病症的药物或疫苗中的用途。
对象
待治疗的对象可以是任何动物或人。所述对象优选哺乳动物，更优选人。所述对象可以是非人哺乳动物，但更优选人。所述对象可以是雄性或雌性。所述对象可以是患者。
对象可能已经被诊断患有需要治疗的疾病或病症，可能怀疑患有这种疾病或病症，或者可能具有产生这种疾病或病症的风险。
试剂盒
在本发明的一方面，提供了诸部件构成的试剂盒。所述诸部件构成的试剂盒包括本发明的T细胞群或本发明的药物组合物。
在一些实施方式中，所述试剂盒可包括使用所述T细胞群或药物组合物治疗或预防本文所述疾病或病症的说明书。
在一些实施方式中，试剂盒可装有容器，所述容器装有本发明方法获得的一定量的T细胞，所述T细胞经配制用于向对象(例如通过与合适的载体、赋形剂、稀释剂或佐剂混合)给药，优选通过输注，更优选在自体过继细胞免疫疗法的方法中通过输注给药。该试剂盒可以保持在预定的温度，例如低于约4℃、低于约-2℃或低于约-50℃。试剂盒可以进一步包括用于储存和/或运输该试剂盒和/或用于给予T细胞的说明书。
***
本发明包括所述诸方面和优选特征的组合，除非此类组合是明显不允许或明确要避免的。
本文使用的章节标题仅用于组织目的，不应解释为限制所描述的主题。
现将参考附图，通过示例说明本发明的各方面和实施方式。其它方面和实施方式对于本领域技术人员是显而易见的。本文中提到的所有文献都通过引用纳入本文。
在整个说明书，包括随后的权利要求中，除非上下文另有要求，否则词语“包括”和诸如“包含”和“包含着”等变体将被理解为暗示包括所述整数或步骤或整数或步骤的组，但不排除任何其它整数或步骤或整数或步骤的组。
必须注意的是，除非上下文另有明确说明，说明书和所附权利要求中所使用的单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指示物。范围在本文中可以表示为从“约”一个特定值，和/或到“约”另一个特定值。当表达此类范围时，另一实施方式包括从一个特定值和/或到另一个特定值。类似地，当使用先行词“约”将值表示为近似值时，将理解该特定值形成另一个实施方式。
附图简述
现在将参考附图讨论说明本发明原理的实施方式和实验，其中：
图1A和图1B.图表显示条件化培养基对获自(1A)供体1和(1B)供体2和3的细胞的EBV特异性T细胞扩增的影响。将百分比增加的条件化培养基加入培养基中。与LCL共培养一周后，将扩增的T细胞数量与接种T细胞的原始数量作比较。
图2.图表显示条件化培养基对Grex-100生物反应器中从三个供体获得的细胞的EBV特异性T细胞扩增的影响。将百分比增加的条件化培养基添加到培养基中。与LCL共培养一周后，将扩增的T细胞数量与接种T细胞的原始数量作比较。
图3.图表显示EBV特异性T细胞对EBV转化的LCL细胞的特异性杀伤。通过在0％和30％条件化培养基中培养来扩增的T细胞与LCL以不同的效应细胞/靶细胞之比共培养，4小时后测量LCL细胞的特异性裂解。
图4.图表显示不同百分比的条件化培养基的存在情况对Grex-100生物反应器培养容器中培养的EBV特异性CTL倍数扩增的影响。
实施例
在以下实施例中，发明人描述了EBV特异性T细胞的扩增，包括在有条件化培养基存在下的培养。发明人描述了用于确定包含在培养物中的条件化培养基的最佳百分比以及用于确认扩增CTL的细胞毒性活性的实验。
实施例1：条件化培养基的最佳百分比
为了确定用于T细胞扩增的条件化培养基的最佳百分比，在24孔板中进行的T细胞扩增，将包含45％RPMI 1640、45％克里克培养基、10％FBS、2mM L-谷氨酰胺的细胞培养基与从T细胞与LCL细胞的共培养物获得的10％、20％、30％、40％、50％和60％的条件化培养基混合。
与LCL细胞共培养一周后，计数T细胞的数量并与接种细胞的数量作比较，以确定倍数扩增。
预期的扩增结果如图1A所示。通过在方法中包括在有条件化培养基存在下进行培养，T细胞以更快的速率扩增。根据B，在方法步骤中用于最大倍数扩增的条件化培养基的最佳百分比预期为20-30％条件化培养基。
对从另外两个不同供体(供体2和3)获得的细胞进行相同的实验。预计结果将与供体1相似，在20-30％条件化培养基中观察到最大T细胞扩增(参见图1B)。
因为在生物反应器，例如Grex-100培养容器中进行T细胞的大规模扩增，在生物反应器培养中进一步研究条件化培养基的优化百分比。
为说明目的：将细胞以1×106个细胞/ml的细胞密度在200ml培养基中培养，其中不同百分比是条件化培养基的
T细胞扩增的预期结果显示在图2中。预计条件化培养基的最佳百分比将为20-30％，在不同供体之间是一致的。
实施例2：EBV-转化的LCL的产生和EBV-特异性CTL的扩增
从EBV阳性NPC患者获得的外周血(40-60mL)用于产生EBV转化的淋巴母细胞样B细胞系(LCL)和EBV特异性T细胞。
EBV-转化的LCL的产生
简言之，为产生LCL，在有1μg/mL环孢菌素A(山德士公司-Sandoz，维也纳，奥地利)的存在下，将15x106个外周血单核细胞(PBMC)与B95-8培养物的浓缩上清液一起温育，以建立LCL。
先以60Gy照射LCL，再用于刺激(在刺激当天)。
EBV-特异性CTL的扩增
比较了两种不同方法扩增EBV特异性T细胞。
在两种方法中，第一次刺激如下进行：
■将60×106个PBMC重悬于细胞培养基中，所述细胞培养基包含45％RPMI1640、45％克里克培养基、10％FBS、2mM L-谷氨酰胺，并作活细胞计数。
■将PBMC以2×106个细胞/孔接种到24孔板的孔中。
■用受辐射的阿昔洛韦处理的自体LCL刺激PBMC，响应者与刺激物之比为40:1。
■将细胞在37℃，5％CO2气氛中培养9-12天。
在两种方法中，然后进行第二次刺激，如下所述：
■在第一次刺激结束时收集细胞，并作活细胞计数，将细胞以1×106个细胞/ml重悬于细胞培养基中，所述细胞培养基包含45％RPMI 1640、45％克里克培养基、10％FBS、2mML-谷氨酰胺。
■将细胞培养基中的1ml细胞加入24孔板的孔中，或将细胞悬液加入生物反应器，浓度为15×106个细胞/GRex10，所述细胞培养基包含45％RPMI 1640、45％克里克培养基、10％FBS、2mM L-谷氨酰胺，并且用自体经辐射的LCL以响应者与刺激物之比为4:1再刺激细胞。
■将细胞培养3-4天，然后将细胞重悬于含有45％RPMI 1640、45％克里克培养基、10％FBS、2mM L-谷氨酰胺的新鲜细胞培养基中。将重组人IL-2(rhIL-2，阿地白介素；希龙公司，艾默里维尔，加利福尼亚州)以40-100IU/ml的终浓度加入细胞培养物。
后续刺激
在第二次刺激后，收集细胞并作活细胞计数。保留培养基(即，条件化培养基)用于下面的方法B。然后将细胞以1×106个细胞/ml(24孔板中)或0.5×106个细胞/ml(GRex10中)重悬于包含45％RPMI 1640、45％克里克培养基、10％FBS、2mM L-谷氨酰胺的细胞培养基中，并且用自体经辐射的LCL以响应者与刺激物之比为4:1再刺激细胞。
一旦达到200×106个细胞，然后根据方法步骤A或方法步骤B刺激细胞：
在根据方法步骤A或方法步骤B的刺激结束时，收集细胞并根据相同的方法步骤A或B作再刺激。
对于根据方法步骤B的再刺激，使用的条件化培养基来自根据B的先前刺激。
实施例3：效力测试
将包括在有条件化培养基存在下进行培养的方法扩增的CTL的细胞毒性活性与未在有条件化培养基存在下进行培养时扩增的CTL的细胞毒活性进行比较。
将从0％和30％条件化培养基扩增的T细胞以不同的效应细胞/靶细胞比(E/T比)加入LCL细胞，4小时后，测量LCL细胞的特异性裂解。预期在0％和30％条件化培养基中通过培养扩增的细胞的特异性裂解之间几乎没有或没有差异(图3)。
预计以增加的速率扩增的CTL保留特异性杀伤EBV转化LCL细胞的能力。
实施例4：优化利用条件化培养基的爱泼斯坦-巴尔病毒特异性T细胞(EB-VST)生 长
以下实施例描述了对于最大CTL扩增，有待包括在再刺激中的条件化培养基的最佳百分比的研究。
第1周：
●将淋巴母细胞样细胞系(LCL)样品解冻并培养1周。
●需要最低10x 106LCL以启动实验。
第2周：
●将来自不同患者的冷冻EB-VST03细胞解冻，重悬于包含45％RPMI 1640、45％克里克培养基、10％FBS、2mM L-谷氨酰胺的细胞培养基中，并作活细胞计数。
○通过根据实施例2的PMBC培养获得EB-VST03细胞，其中PBMC经历第一次和第二次刺激，然后根据方法步骤A作第三次刺激(即，在没有条件化培养基的存在下)，随后收获并冷冻细胞。
●将EB-VST03细胞以1×106个细胞/孔接种于24孔板中。
●将细胞悬液加入生物反应器(15×106细胞/G-Rex 10)中包含45％RPMI1640、45％克里克培养基、10％FBS、2mM L-谷氨酰胺的细胞培养基中，并用自体经辐射的LCL以响应者与刺激物之比为4:1再刺激细胞。
●将细胞培养3-4天，然后重悬于包含45％RPMI 1640、45％克里克培养基、10％FBS和2mM L-谷氨酰胺的细胞培养基中。
●然后将IL-2加入细胞培养物中，终浓度为40-100IU/ml。
第3周起：
●如第2周所述收获、合并、计数和刺激细胞，直至有120×106个细胞。
●然后将100×106个细胞接种到G-Rex 100烧瓶中包含45％RPMI 1640、45％克里克培养基、10％FBS、2mM L-谷氨酰胺的细胞培养基和不同百分比的条件化培养基(在前次刺激培养结束时从培养物获得)中，如下所示：
●然后将细胞在37℃、5％CO2气氛中培养3-4天。
●然后将IL-2加入细胞培养物中，终浓度为40-100IU/ml。
●一周后，收获细胞并作活细胞计数。
观察到所有活力均大于70％。结果如图4所示。
发现与使用100％的包含45％RPMI 1640、45％克里克培养基、10％FBS、2mML-谷氨酰胺的细胞培养基相比，在包含45％RPMI 1640、45％克里克培养基、10％FBS、2mM L-谷氨酰胺的细胞培养基和最高15％的条件化培养基中培养得到最高收率的EB-VST，EB-VST的速率约高20％。
当使用更高百分比(即，30％、45％)的条件化培养基时，EB-VST的倍数扩增降低。
样品3-EB-VST观察到的倍数扩增不如样品1和样品2所观察到的那样明显。这可能是因为样品3EBV-VST经历了额外的刺激循环，结果细胞生长过度加重。
结论是，与使用100％新鲜培养基相比，15％条件化培养基与85％新鲜培养基(完全克里克培养基)的组合产生最高的EB-VST产率，即，更高的EB-VST扩增速率。
虽然条件化培养基对EB-VST生长的影响在不同个体之间有所不同，但观察到在每种情况下，使用15％的条件化培养基得出最佳扩增率。

Claims (46)

1.一种产生或扩增病毒特异性T细胞群的方法，包括在有呈递病毒肽的抗原呈递细胞(APC)存在下，通过培养来刺激T细胞，其中至少10％的培养细胞的培养基中是从包含T细胞和呈递病毒肽的APC的刺激培养物获得的条件化培养基。
2.一种加速病毒特异性T细胞群的扩增速率的方法，包括在有呈递病毒肽的抗原呈递细胞(APC)存在下，通过培养来刺激T细胞，其中至少10％的培养细胞的培养基中是从包含T细胞和呈递病毒肽的APC的刺激培养物获得的条件化培养基。
3.一种产生或扩增病毒特异性T细胞群的方法，包括：
(i)在有呈递病毒肽的抗原呈递细胞(APC)存在下通过培养来刺激T细胞；和
(ii)在有呈递病毒肽的APC存在下，通过培养来再刺激T细胞，其中至少10％的培养细胞的培养基是从T细胞和呈递病毒肽的APC的刺激培养物获得的条件化培养基。
4.一种产生或扩增病毒特异性T细胞群的方法，包括：
(i)在有呈递病毒肽的抗原呈递细胞(APC)存在下，通过培养来刺激T细胞；
(ii)收集步骤(i)获得的细胞；和
(iii)在有呈递病毒肽的APC存在下，通过培养来再刺激T细胞，其中至少10％的培养细胞的培养基是从T细胞和呈递病毒肽的APC的刺激培养物获得的条件化培养基。
5.一种产生或扩增病毒特异性T细胞群的方法，其中所述方法包括：
(i)在有呈递病毒肽的抗原呈递细胞(APC)存在下，通过培养来刺激T细胞；
(ii)收集步骤(i)获得的细胞；
(iii)在有呈递病毒肽的APC存在下，通过培养来再刺激T细胞；
(iv)收集步骤(iii)获得的细胞，和；
(v)在有呈递病毒肽的APC存在下，通过培养来再刺激T细胞，其中至少10％的培养细胞的培养基是从T细胞和呈递病毒肽的APC的刺激培养物获得的条件化培养基。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述条件化培养基从步骤(iii)的刺激培养物中获得。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于，在1至8天的培养期后，从T细胞和呈递病毒肽的APC的刺激培养物获得所述条件化培养基。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，从响应者:刺激物之比为1:1至10:1的T细胞和APC的刺激培养物获得所述条件化培养基。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于，呈递病毒肽的APC是EBV转化的淋巴母细胞样细胞系(LCL)细胞。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其特征在于，所述至少10％的条件化培养基是20至40％的条件化培养基。
11.一种产生或扩增爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)-特异性T细胞群的方法，包括在有EBV转化的LCL存在下，以响应者：刺激物之比为2:1至7:1，通过在培养基中培养1-8天来刺激T细胞，所述培养基包括：
(a)细胞培养基，包含40-50％RPMI-1640培养基、40-50％克里克培养基、5-20％FBS和1-5mM L-谷氨酰胺，
(b)通过以下方法获得的至少10％的条件化培养基：在有EBV转化的LCL存在下，以响应者：刺激物之比为2:1至7:1，通过在细胞培养基中培养1-8天来刺激T细胞，所述细胞培养基包含40-50％RPMI-1640培养基、40-50％克里克培养基、5-20％FBS和1-5mM L-谷氨酰胺，和终浓度为10-200IU/ml的添加的IL-2，和
(c)终浓度为10-200IU/ml的添加的IL-2。
12.一种加速爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)-特异性T细胞群扩增的方法，包括在有EBV转化的LCL存在下，以响应者：刺激物之比为2:1至7:1，通过在培养基中培养1-8天来刺激T细胞，所述培养基包括：
(a)细胞培养基，包含40-50％RPMI-1640培养基、40-50％克里克培养基、5-20％FBS和1-5mM L-谷氨酰胺，
(b)通过以下方法获得的至少10％的条件化培养基：在有EBV转化的LCL存在下，以响应者：刺激物之比为2:1至7:1，通过在细胞培养基中培养1-8天来刺激T细胞，所述细胞培养基包含40-50％RPMI-1640培养基、40-50％克里克培养基、5-20％FBS和1-5mM L-谷氨酰胺，和终浓度为10-200IU/ml的添加的IL-2，和
(c)终浓度为10-200IU/ml的添加的IL-2。
13.一种产生或扩增爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)特异性T细胞群的方法，包括：
(i)在有EBV转化的LCL存在下，以响应者：刺激物之比为10:1至80:1，通过在细胞培养基中培养PBMC 7-14天来刺激T细胞，所述细胞培养基包含40-50％RPMI-1640培养基、40-50％克里克培养基、5-20％FBS和1-5mM L-谷氨酰胺；
(ii)收集步骤(i)获得的细胞；
(iii)在有EBV转化的LCL存在下，以响应者：刺激物之比为2:1至7:1，通过在细胞培养基中培养步骤(ii)收集的细胞1-8天来再刺激T细胞，所述细胞培养基包含40-50％RPMI-1640培养基、40-50％克里克培养基、5-20％FBS和1-5mM L-谷氨酰胺，和终浓度为10-200IU/ml的添加的IL-2；
(iv)收集步骤(iii)获得的细胞，和；
(v)在有EBV转化的(LCL)存在下，以响应者：刺激物之比为2:1至7:1，通过在培养基中培养步骤(iv)收集的细胞1-8天来再刺激T细胞，所述培养基包含：(a)细胞培养基，包含40-50％RPMI-1640培养基、40-50％克里克培养基、5-20％FBS和1-5mM L-谷氨酰胺，(b)在步骤(iii)终末点获得的至少10％条件化培养基，和(c)终浓度为10-200(例如40-100)IU/ml的添加的IL-2。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：
(vi)收集步骤(v)获得的细胞，和；
(vii)在有EBV转化的LCL存在下，以响应者：刺激物之比为2:1至7:1，通过在培养基中培养步骤(vi)收集的细胞1-8天来再刺激T细胞，所述培养基包含：(a)细胞培养基，包含40-50％RPMI-1640培养基、40-50％克里克培养基、5-20％FBS和1-5mM L-谷氨酰胺，(b)在步骤(v)终末点获得的至少10％条件化培养基，和(c)终浓度为10-200(例如40-100)IU/ml的添加的IL-2。
15.如权利要求13或14所述的方法，其特征在于，所述方法包括额外的步骤：收集细胞，和在有EBV转化的LCL(例如辐照的、EBV转化的LCL)存在下，以响应者：刺激物之比为2:1至7:1，通过在培养基中培养收集的细胞1-8天来再刺激T细胞，所述培养基包含：(a)细胞培养基，包含40-50％RPMI-1640培养基、40-50％克里克培养基、5-20％FBS和1-5mM L-谷氨酰胺，(b)在先刺激步骤终末点获得的至少10％条件化培养基，和(c)终浓度为10-200IU/ml的添加的IL-2。
16.一种治疗对象中癌症的方法，所述方法包括：
(1)从对象分离T细胞；
(2)通过以下方法产生或扩增病毒特异性T细胞群：在有呈递病毒肽的抗原呈递细胞(APC)存在下，通过培养来刺激T细胞，其中10-25％的培养细胞的培养基是从包含T细胞和呈递病毒肽的APC的刺激培养物获得的条件化培养基；和
(3)将产生或扩增的T细胞群给予对象。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，从响应者：刺激物之比为2:1至7:1的、包含T细胞和呈递病毒肽的APC的、1-8天刺激培养物获得所述条件化培养基。
18.如权利要求16或17所述的方法，其特征在于，在有呈递病毒肽的APC存在下，通过培养来刺激T细胞包括在有EBV转化的LCL存在下，以响应者：刺激物之比为2:1至7:1，在培养基中进行1-8天的培养，所述培养基包含：
(a)细胞培养基，包含40-50％RPMI-1640培养基、40-50％克里克培养基、5-20％FBS和1-5mM L-谷氨酰胺，
(b)通过以下方法获得的10％-25％的条件化培养基：在有EBV转化的LCL存在下，以响应者:刺激物之比为2:1至7:1，通过在细胞培养基中培养1-8天来刺激T细胞，所述细胞培养基包含40-50％RPMI-1640培养基、40-50％克里克培养基、5-20％FBS和1-5mM L-谷氨酰胺，和终浓度为10-200IU/ml的添加的IL-2，和
(c)终浓度为10-200IU/ml的添加的IL-2。
19.如权利要求16或17所述的方法，其特征在于，所述呈递病毒肽的APC是EBV转化的淋巴母细胞样细胞系(LCL)细胞。
20.如权利要求16-19中任一项所述的方法，其特征在于，所述癌症是EBV-阳性癌症。
21.如权利要求16-20中任一项所述的方法，其特征在于，所述癌症是EBV-阳性鼻咽癌(NPC)。
22.如权利要求16-21中任一项所述的方法，其特征在于，约15％的培养细胞的培养基是条件化培养基。
23.如权利要求16-22中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)还包括：收集产生或扩增的T细胞群。
24.一种治疗对象中癌症的方法，所述方法包括：
(1)从对象分离T细胞；
(2)通过以下方法产生或扩增病毒特异性T细胞群：在有呈递病毒肽的抗原呈递细胞(APC)存在下，通过培养来刺激T细胞，其中10-25％的培养细胞的培养基是条件化培养基，所述条件化培养基从响应者：刺激物之比为2:1至7:1的、包含T细胞和呈递病毒肽的APC的、1-8天刺激培养物获得；和
(3)将产生或扩增的T细胞群给予对象。
25.如权利要求24所述的方法，其特征在于，在有呈递病毒肽的APC存在下，通过培养来刺激T细胞包括在有EBV转化的LCL存在下，以响应者：刺激物之比为2:1至7:1，在培养基中培养1-8天，所述培养基包含：
(a)细胞培养基，包含40-50％RPMI-1640培养基、40-50％克里克培养基、5-20％FBS和1-5mM L-谷氨酰胺，
(b)通过以下方法获得的10％-25％的条件化培养基：在有EBV转化的LCL存在下，以响应者:刺激物之比为2:1至7:1，通过在细胞培养基中培养1-8天来刺激T细胞，所述细胞培养基包含40-50％RPMI-1640培养基、40-50％克里克培养基、5-20％FBS和1-5mM L-谷氨酰胺，和终浓度为10-200IU/ml的添加的IL-2，和
(c)终浓度为10-200IU/ml的添加的IL-2。
26.如权利要求24或25所述的方法，其特征在于，所述癌症是EBV-阳性癌症。
27.如权利要求24-26中任一项所述的方法，其特征在于，所述癌症是EBV-阳性鼻咽癌(NPC)。
28.如权利要求24-27中任一项所述的方法，其特征在于，所述10％-25％的条件化培养基是约15％的条件化培养基。
29.如权利要求24-28中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)还包括：收集产生或扩增的T细胞群。
30.一种产生或扩增病毒特异性T细胞群的方法，包括在有呈递病毒肽的抗原呈递细胞(APC)存在下，通过培养刺激T细胞，其中10％-25％的培养细胞的培养基是从包含T细胞和呈递病毒肽的APC的刺激培养物获得的条件化培养基。
31.如权利要求30所述的方法，其特征在于，从响应者：刺激物之比为2:1至7:1的、包含T细胞和呈递病毒肽的APC的、1-8天刺激培养物获得所述条件化培养基。
32.如权利要求30或31所述的方法，其特征在于，在有呈递病毒肽的APC存在下，通过培养来刺激T细胞包括在有EBV转化的LCL存在下，以响应者：刺激物之比为2:1至7:1，在培养基中进行1-8的培养，所述培养基包含：
(a)细胞培养基，包含40-50％RPMI-1640培养基、40-50％克里克培养基、5-20％FBS和1-5mM L-谷氨酰胺，
(b)通过以下方法获得的10％-25％的条件化培养基：在有EBV转化的LCL存在下，以响应者:刺激物之比为2:1至7:1，通过在细胞培养基中培养1-8天来刺激T细胞，所述细胞培养基包含40-50％RPMI-1640培养基、40-50％克里克培养基、5-20％FBS和1-5mM L-谷氨酰胺，和终浓度为10-200IU/ml的添加的IL-2，和
(c)终浓度为10-200IU/ml的添加的IL-2。
33.如权利要求30或31所述的方法，其特征在于，呈递病毒肽的APC是EBV转化的淋巴母细胞样细胞系(LCL)细胞。
34.如权利要求30-33中任一项所述的方法，其特征在于，所述10％-25％的条件化培养基是约15％的条件化培养基。
35.如权利要求30-34中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：收集产生或扩增的T细胞群。
36.如权利要求30-34中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：将产生或扩增的T细胞群与药学上可接受的载体、佐剂、赋形剂或稀释剂混合。
37.一种病毒特异性T细胞群，其中所述T细胞群通过权利要求1-15或30-36中任一项所述方法获得，或可通过权利要求1-15或30-36中任一项所述方法获得，或是权利要求1-15或30-36中任一项所述方法的产物。
38.一种包含权利要求37所述的T细胞群和药学上可接受的载体、佐剂、赋形剂或稀释剂的药物组合物。
39.权利要求37所述的T细胞群或权利要求38所述的药物组合物，用于疾病或病症的治疗或预防。
40.权利要求37所述的T细胞群或权利要求38所述的药物组合物在制备用于治疗或预防疾病或病症的药物或疫苗中的用途。
41.一种治疗或预防对象中疾病或病症的方法，包括将治疗或预防有效量的权利要求37所述的T细胞群或权利要求38所述的药物组合物给予对象。
42.如权利要求39所述应用的T细胞群或药物组合物，如权利要求40所述的用途，或如权利要求41所述的方法，其特征在于，所述疾病或病症是T细胞特异性的病毒感染所致或为之恶化，或者所述疾病或病症是T细胞特异性的病毒感染是风险因子的疾病或病症。
43.如权利要求39-42中任一项所述应用的T细胞群或药物组合物、用途或方法，其特征在于，所述疾病或病症是癌症。
44.如权利要求43所述应用的T细胞群或药物组合物、用途或方法，其特征在于，所述癌症是EBV-阳性癌症。
45.如权利要求43或44所述应用的T细胞群或药物组合物、用途或方法，其特征在于，所述癌症是EBV-阳性鼻咽癌(NPC)。
46.一种诸部件构成的试剂盒，包括预定量的权利要求37所述的T细胞群或权利要求38所述的药物组合物。
CN201680086124.3A 2016-05-24 2016-10-25 T细胞扩增 Pending CN109563483A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662340605P 2016-05-24 2016-05-24
US62/340,605 2016-05-24
US15/290,230 US10052372B2 (en) 2016-05-24 2016-10-11 T cell expansion
US15/290,230 2016-10-11
PCT/EP2016/075644 WO2017202478A1 (en) 2016-05-24 2016-10-25 T cell expansion

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109563483A true CN109563483A (zh) 2019-04-02

Family

ID=57886334

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201680086124.3A Pending CN109563483A (zh) 2016-05-24 2016-10-25 T细胞扩增

Country Status (12)

Country Link
US (2) US10052372B2 (zh)
EP (1) EP3265555B1 (zh)
JP (1) JP2019520061A (zh)
KR (1) KR20190013831A (zh)
CN (1) CN109563483A (zh)
DK (1) DK3265555T3 (zh)
ES (1) ES2742215T3 (zh)
HK (1) HK1250378B (zh)
PT (1) PT3265555T (zh)
SG (1) SG11201810471YA (zh)
TW (1) TWI660970B (zh)
WO (1) WO2017202478A1 (zh)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RS65177B1 (sr) * 2012-03-20 2024-03-29 Eagle Pharmaceuticals Inc Formulacije bendamustina
SG11201809805WA (en) 2016-05-05 2018-12-28 Southwest Res Inst Three-dimensional bioreactor for cell expansion and related applications
US10052372B2 (en) * 2016-05-24 2018-08-21 Tessa Therapeutics Pte Ltd T cell expansion
JP7028895B2 (ja) * 2017-05-06 2022-03-02 エルジー エレクトロニクス インコーポレイティド 無線通信システムにおける端末のＤ２Ｄ（ｄｅｖｉｃｅ ｔｏ ｄｅｖｉｃｅ）動作方法及び前記方法を利用する端末
US11149244B2 (en) 2018-04-04 2021-10-19 Southwest Research Institute Three-dimensional bioreactor for T-cell activation and expansion for immunotherapy
US11447731B2 (en) 2018-09-24 2022-09-20 Southwest Research Institute Three-dimensional bioreactors
WO2021221927A1 (en) 2020-04-27 2021-11-04 Parsons Corporation Narrowband iq signal obfuscation
WO2022197933A1 (en) 2021-03-18 2022-09-22 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for characterizing lymphoma and related conditions
CA3218235A1 (en) 2021-04-27 2022-11-03 Baylor College Of Medicine Virus-specific immune cells expressing chimeric antigen receptors
WO2023198744A1 (en) 2022-04-13 2023-10-19 Tessa Therapeutics Ltd. Therapeutic t cell product

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999025812A1 (en) * 1997-11-14 1999-05-27 Hemosol Inc. Method for the production and use of dendritic cells
CN1981031A (zh) * 2004-03-05 2007-06-13 宾久法尼亚大学理事会 调节性t细胞及它们在免疫治疗和抑制自身免疫反应中的应用

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5962318A (en) * 1996-11-15 1999-10-05 St. Jude Children's Research Hospital Cytotoxic T lymphocyte-mediated immunotherapy
WO2003012085A1 (en) * 2001-07-30 2003-02-13 Sigma-Tau Industrie Farmaceutiche Riunite S.P.A. Antigen presenting cells, method for their preparation and their use for cancer vaccines
SG181559A1 (en) * 2009-12-08 2012-07-30 Wolf Wilson Mfg Corp Improved methods of cell culture for adoptive cell therapy
AU2012351347B2 (en) * 2011-12-12 2016-05-19 Baylor College Of Medicine Process of expanding T cells
US10052372B2 (en) * 2016-05-24 2018-08-21 Tessa Therapeutics Pte Ltd T cell expansion

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999025812A1 (en) * 1997-11-14 1999-05-27 Hemosol Inc. Method for the production and use of dendritic cells
CN1981031A (zh) * 2004-03-05 2007-06-13 宾久法尼亚大学理事会 调节性t细胞及它们在免疫治疗和抑制自身免疫反应中的应用

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AJIT LALVANI等: "Optimization of a peptide-based protocol employing IL-7 for in vitro restimulation of human cytotoxic T lymphocyte precursors", 《JOURNAL OF IMMUNOLOGICAL METHODS》 *
CHRYSTAL U LOUIS等: "Adoptive transfer of EBV-specific T cells results in sustained clinical responses in patients with locoregional nasopharyngeal carcinoma", 《J IMMUNOTHER》 *
DAVID H. MUNN等: "Inhibition of T Cell Proliferation by Macrophage Tryptophan Catabolism", 《J. EXP. MED.》 *
I. V. REDCHENKO等: "Accessing Epstein-Barr Virus-Specific T-Cell Memory with Peptide-Loaded Dendritic Cells", 《JOURNAL OF VIROLOGY》 *
KARIN C. M. STRAATHOF等: "Treatment of nasopharyngeal carcinoma with Epstein-Barr virus–specific T lymphocytes", 《BLOOD》 *
LESZEK K. BORYSIEWICZ等: "Human cytomegalovirus-specific cytotoxic T cells: their precursor frequency and stage specificity", 《EUR. J. IMMUNOL.》 *
WHAY-KUANG CHIA等: "Adoptive T-cell Transfer and Chemotherapy in the First-line Treatment of Metastatic and/or Locally Recurrent Nasopharyngeal Carcinoma", 《MOLECULAR THERAPY》 *
李文杰: "EBV特异性CTL的制备及其对EBV阳性肿瘤细胞杀伤效应的研究", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库（硕士）医药卫生科技辑》 *

Also Published As

Publication number Publication date
TW201741330A (zh) 2017-12-01
HK1250378B (zh) 2020-05-08
TWI660970B (zh) 2019-06-01
PT3265555T (pt) 2019-09-04
JP2019520061A (ja) 2019-07-18
US10052372B2 (en) 2018-08-21
KR20190013831A (ko) 2019-02-11
US20190269768A1 (en) 2019-09-05
US20170028042A1 (en) 2017-02-02
EP3265555B1 (en) 2019-05-22
DK3265555T3 (da) 2019-08-12
WO2017202478A1 (en) 2017-11-30
EP3265555A1 (en) 2018-01-10
SG11201810471YA (en) 2018-12-28
ES2742215T3 (es) 2020-02-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109563483A (zh) T细胞扩增
US20220016172A1 (en) Activation of marrow infiltrating lymphocytes in hypoxic alternating with normoxic conditions
JP6010136B2 (ja) ナチュラルキラー細胞の製造方法、その方法により製造されたナチュラルキラー細胞、並びにそれを含む腫瘍及び感染性疾患治療用組成物
US20180223257A1 (en) Method for the induction and expansion of natural killer cells derived from peripheral blood mononuclear cells
CN107922925A (zh) 用于自然杀伤细胞扩增的方法
CN105848484A (zh) 用于免疫治疗的多克隆γδ T细胞
CA2941519C (en) Pooled nk cells from ombilical cord blood and their uses for the treatment of cancer and chronic infectious disease
CN102137925A (zh) 同时诱导CTL和γδT细胞的方法
CN1541113A (zh) 利用激活的t细胞使抗原提呈细胞成熟
CN107002039A (zh) 使用t细胞用于培养自然杀伤细胞的方法
US20210147803A1 (en) Method for producing natural killer cells
CN107502591B (zh) 一种浓度梯度rhIL-2依赖的iNKT细胞扩增方法及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information
CB02 Change of applicant information

Address after: Singapore City

Applicant after: Tech Co.

Address before: Singapore City

Applicant before: TESSA THERAPEUTICS Pte. Ltd.

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20190402