TW201741330A - Ｔ細胞增生技術 - Google Patents

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Abstract

一種用於產生或增生對一病毒專一的T細胞族群之方法，其係透過包含下列的方法：藉由在呈現該病毒的一胜肽之抗原呈現細胞(APCs)存在下培養來刺激T細胞，其中培養該等細胞之至少10%的培養基為條件培養基，其係得自於包含T細胞及呈現該病毒胜肽之APCs的刺激培養。亦揭示用於加速一病毒專一性T細胞族群增生速率的方法，以及使用該產生或增生的T細胞族群用於治療或預防疾病或障礙的方法。

Description

T細胞增生技術
發明領域
本發明係有關於用於產生及/或增生病毒專一性T細胞族群的方法。
發明背景
病毒專一性T細胞之授受性轉移為用於預防或治療病毒疾病很有前途的策略。
授受性轉移需要使用大量的T細胞。舉例而言，Chia等人，Mol Ther(2014)22(1)：132-139，描述以中位數總數9.6 x 108 EBV-CTLs(範圍由6.3至10.3 x 108 CTLs)之授受性轉移，進行的EBV陽性鼻咽癌(NPC)之治療。
授受性T細胞轉移療法最主要的問題是要產生足夠大量供投與的病毒專一性T細胞所花費的時間期間。Chia等人(在前)報告生產及第一劑CTLs所花費的中位數時間為13週(範圍由8至22週)。此外，據報告此研究中的3個病人由於CTL生產延遲，而偏離預定治療法。
發明概要
用於產生及/或增生病毒專一性T細胞族群的方法典型地包括用呈現感興趣的病毒(亦即，T細胞具專一性的病毒)胜肽之抗原呈現細胞刺激T細胞幾個回合。
本發明係基於發現到，病毒專一性T細胞族群可於從一刺激步驟獲得的條件培養基存在下，藉由執行再刺激而更快速地增生。有利地，與先前技藝方法相比，可藉此於更短的時間期間內獲得大量的病毒專一性T細胞。本發明因而係有用於產生/增生病毒專一性T細胞族群供用於研究及/或治療應用。
於一態樣中，本發明提供一種用於產生或增生對一病毒專一的T細胞族群的方法，其包含藉由在呈現該病毒的一胜肽之抗原呈現細胞(APCs)存在下培養來刺激T細胞，其中培養該等細胞之至少10%的培養基為條件培養基，其係得自於包含T細胞及呈現該病毒胜肽之APCs的刺激培養。
於另一態樣中，本發明提供一種用於加速一病毒專一性T細胞族群增生速率的方法，該方法包含藉由在呈現該病毒的一胜肽之抗原呈現細胞(APCs)存在下培養來刺激T細胞，其中培養該等細胞之至少10%的培養基為條件培養基，其係得自於包含T細胞及呈現該病毒胜肽之APCs的刺激培養。
於另一態樣中，本發明提供一種用於產生或增生對一病毒專一的T細胞族群的方法，其包含： (i)藉由在呈現該病毒的一胜肽之抗原呈現細胞(APCs)存在下培養來刺激T細胞；以及(ii)藉由在呈現該病毒的一胜肽之APCs存在下培養來再刺激該等T細胞，其中培養該等細胞之至少10%的培養基為條件培養基，其係得自於T細胞及呈現該病毒胜肽之APCs的刺激培養。
於另一態樣中，本發明提供一種用於產生或增生對一病毒專一的T細胞族群的方法，其中該方法包含：(i)藉由在呈現該病毒的一胜肽之抗原呈現細胞(APCs)存在下培養來刺激T細胞；(ii)藉由在呈現該病毒的一胜肽之APCs存在下培養來再刺激該等T細胞；以及(iii)藉由在呈現該病毒的一胜肽之APCs存在下培養來再刺激該等T細胞，其中培養該等細胞之至少10%的培養基為條件培養基，其係得自於T細胞及呈現該病毒胜肽之APCs的刺激培養。於該方法的一些具體例中，該條件培養基係得自於步驟(ii)的該刺激培養。
於另一態樣中，本發明提供一種用於產生或增生對一病毒專一的T細胞族群的方法，其包含：(i)藉由在呈現該病毒的一胜肽之抗原呈現細胞(APCs)存在下培養來刺激T細胞；(ii)收集由步驟(ii)獲得的該等細胞，以及；(iii)藉由在呈現該病毒的一胜肽之APCs存在下培養來再刺激該等T細胞，其中培養該等細胞之至少10%的培 養基為條件培養基，其係得自於T細胞及呈現該病毒胜肽之APCs的刺激培養。
於另一態樣中，本發明提供一種用於產生或增生對一病毒專一的T細胞族群的方法，其中該方法包含：(i)藉由在呈現該病毒的一胜肽之抗原呈現細胞(APCs)存在下培養來刺激T細胞；(ii)收集由步驟(i)獲得的該等細胞；(iii)藉由在呈現該病毒的一胜肽之APCs存在下培養來再刺激該等T細胞；(iv)收集由步驟(iii)獲得的該等細胞；以及(v)藉由在呈現該病毒的一胜肽之APCs存在下培養來再刺激該等T細胞，其中培養該等細胞之至少10%的培養基為條件培養基，其係得自於T細胞及呈現該病毒胜肽之APCs的刺激培養。於該方法的一些具體例中，該條件培養基係得自於步驟(iii)的刺激培養。
關於本發明的各種態樣，於一些具體例中，該條件培養基係於得自於1至8天的培養期間後之T細胞及呈現該病毒胜肽之APCs的刺激培養。於一些具體例中，該條件培養基係得自於反應者：刺激者比為1：1至10：1之T細胞及APCs的刺激培養。於一些具體例中，呈現該病毒胜肽之APCs為EBV轉形的類淋巴母細胞株(LCL)細胞。於一些具體例中，至少10%的條件培養基為20至40%的條件培養基。於一些具體例中，至少10%的條件培養基為10至25%，較佳為大約15%的條件培養基。
於另一態樣中，本發明提供一種用於產生或增生艾司坦氏-巴爾氏病毒(Epstein-Barr Virus)(EBV)專一性T細胞族群的方法，其包含藉由以2：1至7：1之反應者對刺激者比、EBV-轉形的LCLs存在下於培養基內培養，來刺激T細胞歷時1至8天的期間，該培養基包含：(a)細胞培養培養基，其包含40-50% RPMI-1640培養基、40-50%克里克培養基(Click’s medium)、5-20% FBS及1-5mM左旋麩醯胺酸，(b)透過一方法獲得之至少10%的條件培養基，該方法包含：藉由以2：1至7：1之反應者對刺激者比、EBV-轉形的LCLs存在下於細胞培養培養基內培養，來刺激T細胞歷時1至8天的期間，該細胞培養培養基包含40-50% RPMI-1640培養基、40-50%克里克培養基、5-20% FBS及1-5mM左旋麩醯胺酸，及最終濃度10-200IU/ml之添加的IL-2，以及(c)最終濃度10-200IU/ml之添加的IL-2。
於另一態樣中，本發明提供一種用於加速艾司坦氏-巴爾氏病毒(Epstein-Barr Virus)(EBV)專一性T細胞族群增生速率的方法，其包含藉由以2：1至7：1之反應者對刺激者比、EBV-轉形的LCLs存在下於培養基內培養，來刺激T細胞歷時1至8天的期間，該培養基包含：(a)細胞培養培養基，其包含40-50% RPMI-1640培養基、40-50%克里克培養基、5-20% FBS及1-5mM左旋麩醯胺酸， (b)透過一方法獲得之至少10%的條件培養基，該方法包含：藉由以2：1至7：1之反應者對刺激者比、EBV-轉形的LCLs存在下於細胞培養培養基內培養，來刺激T細胞歷時1至8天的期間，該細胞培養培養基包含40-50% RPMI-1640培養基、40-50%克里克培養基、5-20% FBS及1-5mM左旋麩醯胺酸，及最終濃度10-200IU/ml之添加的IL-2，以及(c)最終濃度10-200IU/ml之添加的IL-2。
於另一態樣中，本發明提供一種用於產生或增生艾司坦氏-巴爾氏病毒(Epstein-Barr Virus)(EBV)專一性T細胞族群的方法，其包含：(i)藉由以10：1至80：1之反應者對刺激者比、EBV-轉形的LCLs存在下於細胞培養培養基內培養PBMCs，來刺激T細胞歷時7至14天的期間，該細胞培養培養基包含40-50% RPMI-1640培養基、40-50%克里克培養基、5-20% FBS及1-5mM左旋麩醯胺酸；(ii)收集由步驟(i)獲得的該等細胞；(iii)藉由以2：1至7：1之反應者對刺激者比、EBV-轉形的LCLs存在下於細胞培養培養基內培養於步驟(ii)收集的細胞，來再刺激該等T細胞歷時1至8天的期間，該細胞培養培養基包含40-50% RPMI-1640培養基、40-50%克里克培養基、5-20% FBS及1-5mM左旋麩醯胺酸，及最終濃度10-200IU/ml之添加的IL-2；(iv)收集由步驟(iii)獲得的該等細胞，以及； (v)藉由以2：1至7：1之反應者對刺激者比、EBV-轉形的(EBV-transformed)存在下於培養基內培養步驟(iv)收集的細胞，來再刺激該等T細胞歷時1至8天的期間，該培養基包含：(a)細胞培養培養基，其包含40-50% RPMI-1640培養基、40-50%克里克培養基、5-20% FBS及1-5mM左旋麩醯胺酸，(b)於步驟(iii)的終點獲得之至少10%的條件培養基，以及(c)最終濃度10-200(如，40-100)IU/ml之添加的IL-2。在一些具體例中，該方法額外地包含：：(vi)收集由步驟(v)獲得的該等細胞，以及；(vii)藉由以2：1至7：1之反應者對刺激者比、EBV-轉形的LCLs存在下於培養基內培養步驟(vi)收集的細胞，來再刺激該等T細胞歷時1至8天的期間，該培養基包含：(a)細胞培養培養基，其包含40-50% RPMI-1640培養基、40-50%克里克培養基、5-20% FBS及1-5mM左旋麩醯胺酸，(b)於步驟(v)的終點獲得之至少10%的條件培養基，以及(c)最終濃度10-200(如，40-100)IU/ml之添加的IL-2。在一些具體例中，該方法包含下列額外步驟：收集細胞，以及藉由以2：1至7：1之反應者對刺激者比、EBV-轉形的LCLs(譬如，照射的、EBV-轉形的LCLs)存在下於培養基內培養該等收集的細胞，來再刺激該等T細胞歷時1至8天的期間，該培養基包含：(a)細胞培養培養基，其包含40-50% RPMI-1640培養基、40-50%克里克培養基、5-20% FBS及1-5mM左旋麩醯胺酸，(b)於先前刺激步驟 的終點獲得之至少10%的條件培養基，以及(c)最終濃度10-200IU/ml之添加的IL-2。
於另一態樣中，本發明提供一種治療一主體的癌症之方法，該方法包含：(1)從一主體單離T細胞；(2)透過一方法來產生或增生對一病毒專一的T細胞族群，該方法包含：藉由在呈現該病毒的一胜肽之抗原呈現細胞(APCs)存在下培養來刺激T細胞，其中培養該等細胞之10至25%的該培養基為條件培養基，該條件培養基係得自於包含T細胞及呈現該病毒的一胜肽之APCs的刺激培養；以及(3)投與該產生或增生的T細胞族群至一主體。
在一些具體例中，該條件培養基係於得自於以2：1至7：1之反應者：刺激者比、歷時1至8天的期間之刺激培養，該刺激培養包含T細胞及呈現該病毒胜肽之APCs。在一些具體例中，藉由在呈現該病毒的一胜肽之APCs存在下培養來刺激T細胞，包含以2：1至7：1之反應者對刺激者比、EBV-轉形的LCLs存在下於培養基內培養歷時1至8天的期間，該培養基包含：(a)細胞培養培養基，其包含40-50% RPMI-1640培養基、40-50%克里克培養基、5-20% FBS及1-5mM左旋麩醯胺酸，(b)透過一方法獲得之10%至25%的條件培養基，該方法包含：藉由以2：1至7：1之反應者對刺激者比、EBV-轉形的LCLs存在下於細胞培養培養基內培養，來刺激T細胞歷時1至8天的期間，該細 胞培養培養基包含40-50% RPMI-1640培養基、40-50%克里克培養基、5-20% FBS及1-5mM左旋麩醯胺酸，及最終濃度10-200IU/ml之添加的IL-2，以及(c)最終濃度10-200IU/ml之添加的IL-2。於一些具體例中，呈現該病毒胜肽之該APCs為EBV轉形的類淋巴母細胞株(LCL)細胞。於一些具體例中，癌症為一種EBV陽性癌症。於一些具體例中，癌症為一種EBV陽性鼻咽癌(NPC)。於一些具體例中，培養該等細胞之大約15%的該培養基為條件培養基。於一些具體例中，步驟(2)額外地包含：收集該產生或增生的T細胞族群。
於另一態樣中，本發明提供一種治療一主體的癌症之方法，該方法包含：(1)從一主體單離T細胞；(2)透過一方法來產生或增生對一病毒專一的T細胞族群，該方法包含：藉由在呈現該病毒的一胜肽之抗原呈現細胞(APCs)存在下培養來刺激T細胞，其中培養該等細胞之10至25%的該培養基為條件培養基，其中該條件培養基係於得自於以2：1至7：1之反應者：刺激者比、歷時1至8天的期間之刺激培養，該刺激培養包含T細胞及呈現該病毒胜肽之APCs；以及(3)投與該產生或增生的T細胞族群至一主體。
在一些具體例中，藉由在呈現該病毒的一胜肽之APCs存在下培養來刺激T細胞，包含以2：1至7：1之反應者對刺激者比、EBV-轉形的LCLs存在下於培養基內培 養歷時1至8天的期間，該培養基包含：(a)細胞培養培養基，其包含40-50% RPMI-1640培養基、40-50%克里克培養基、5-20% FBS及1-5mM左旋麩醯胺酸，(b)透過一方法獲得之10%至25%的條件培養基，該方法包含：藉由以2：1至7：1之反應者對刺激者比、EBV-轉形的LCLs存在下於細胞培養培養基內培養，來刺激T細胞歷時1至8天的期間，該細胞培養培養基包含40-50% RPMI-1640培養基、40-50%克里克培養基、5-20% FBS及1-5mM左旋麩醯胺酸，及最終濃度10-200IU/ml之添加的IL-2，以及(c)最終濃度10-200IU/ml之添加的IL-2。於一些具體例中，癌症為一種EBV陽性癌症。於一些具體例中，癌症為一種EBV陽性鼻咽癌(NPC)。於一些具體例中，培養該等細胞之大約15%的該培養基為條件培養基。於一些具體例中，步驟(2)額外地包含：收集該產生或增生的T細胞族群。
於另一態樣中，本發明提供一種用於產生或增生對一病毒專一的T細胞族群的方法，其包含藉由在呈現該病毒的一胜肽之抗原呈現細胞(APCs)存在下培養來刺激T細胞，其中培養該等細胞之10%至25%的該培養基為條件培養基，該條件培養基係於得自於包含T細胞及呈現該病毒胜肽之APCs之刺激培養。
在一些具體例中，該條件培養基係於得自於以2：1至7：1之反應者：刺激者比、歷時1至8天的期間之刺激培養，該刺激培養包含T細胞及呈現該病毒胜肽之APCs之刺激培養。在一些具體例中，藉由在呈現該病毒的一胜 肽之APCs存在下培養來刺激T細胞，包含以2：1至7：1之反應者對刺激者比、EBV-轉形的LCLs存在下於培養基內培養歷時1至8天的期間，該培養基包含：(a)細胞培養培養基，其包含40-50% RPMI-1640培養基、40-50%克里克培養基、5-20% FBS及1-5mM左旋麩醯胺酸，(b)透過一方法獲得之10%至25%的條件培養基，該方法包含：藉由以2：1至7：1之反應者對刺激者比、EBV-轉形的LCLs存在下於細胞培養培養基內培養，來刺激T細胞歷時1至8天的期間，該細胞培養培養基包含40-50% RPMI-1640培養基、40-50%克里克培養基、5-20% FBS及1-5mM左旋麩醯胺酸，及最終濃度10-200IU/ml之添加的IL-2，以及(c)最終濃度10-200IU/ml之添加的IL-2。於一些具體例中，呈現該病毒胜肽之該APCs為EBV轉形的類淋巴母細胞株(LCL)細胞。於一些具體例中，該10%至25%的條件培養基為大約15%的條件培養基。在一些具體例中，該方法額外地包含：收集該產生或增生的T細胞族群。在一些具體例中，該方法額外地包含：混合該產生或增生的T細胞族群與一種藥學上可接受的載劑、佐劑、賦形劑或稀釋劑。
於另一態樣中，本發明提供一種對一病毒專一的T細胞族群，其中該T細胞族群係透過如本發明的方法獲得、透過如本發明的方法可獲得，或是為如本發明的方法之產物。
於另一態樣中，本發明提供一種藥學組成物，其包含如本發明之T細胞族群，以及一種藥學上可接 受的載劑、佐劑、賦形劑或稀釋劑。
於另一態樣中，本發明提供如本發明之T細胞族群或藥學組成物，供用於治療或預防疾病或障礙。
於另一態樣中，本發明提供一種如本發明之T細胞族群或藥學組成物於製造供用於治療或預防一疾病或障礙的藥物或疫苗之用途。
於另一態樣中，本發明提供一種治療或預防一主體的疾病或障礙之方法，其包含投與治療或預防有效量之如本發明的T細胞族群或藥學組成物至一主體。
在一些具體例中，該疾病或障礙係由該T細胞具專一性的病毒感染所造成或是惡化，或者為該T細胞具專一性的病毒之感染為該疾病或障礙之風險因子。在一些具體例中，該疾病或障礙為癌症。於一些具體例中，癌症為一種EBV陽性癌症。於一些具體例中，癌症為一種EBV陽性鼻咽癌(NPC)。
於另一態樣中，本發明提供一種部件之套組(a kit of parts)，其包含預定量之如本發明的T細胞族群或藥學組成物。
說明 T細胞及抗原呈現細胞
本發明係有關於病毒專一性T細胞族群的產生及/或增生。
當使用於本文中，病毒專一性T細胞為一種對感染或含有病毒胜肽之細胞起反應的T細胞。一種病毒 專一性T細胞包含一種T細胞受體(TCR)，其能與呈現T細胞專一之病毒的胜肽之MHC分子結合。
T細胞受體(TCRs)為異二聚體、抗原結合分子，典型地包含一個α-鏈與一個β-鏈。在本質上，α-鏈與一個β-鏈係與不變的CD3鏈以複合體表現在T細胞的細胞表面(αβ T細胞)。另類包含γ與δ鏈的TCR係表現在T細胞亞群(γδT細胞)上。TCRs辨識(結合)主要組織相容複合體(MHC)分子呈現的抗原胜肽。TCR結構與胜肽-MHC複合體之辨識係舉例而言於Immunobiology，第5版，Edn.Janeway CA Jr,Travers P,Walport M等人，New York：Garland Science(2001)，第3及6章之內詳細地描述，其等係以其等之全體併入於此以作為參考資料。
T細胞可以參考下列之一者或多者之表面表現予以特徵化：一種TCR多肽(例如，α、β、γ或δ鏈)、一種CD3多肽(例如，γ、δ或ε鏈)、CD8，以及CD4。
一假定的多肽之表面表現可以透過本技藝各種各樣眾所周知的方法予以測量，例如透過基於抗體的方法，如免疫組織化學、免疫細胞化學法，以及流動式細胞測量術。
依據本發明的方法增生的T細胞包含一種對一病毒專一的TCR。在一些具體例中，T細胞為CD3+CD8+T細胞。在一些具體例中，T細胞為胞毒型T細胞。在一些具體例中，T細胞為CD3+CD4+T細胞。在一些具體例中，T細胞為輔助型T細胞。在一些具體例中，本發 明的方法係用於產生及/或增生病毒專一性胞毒型T淋巴球(CTLs)及輔助型T淋巴球。
CTLs能夠造成感染病毒的細胞之細胞死亡，其係藉由釋放包括穿孔蛋白、顆粒酶、顆粒溶解素(granulysin)之細胞毒性因子，及/或經由誘導感染細胞的細胞凋亡，其係透過T細胞上表現的FASL與感染細胞上的FAS之連結(舉例而言Chavez-Galan等人，Cellular and Molecular Immunology(2009)6(1)：15-25，之內描述者，以其之全體藉此併入以作為參考資料)。細胞毒性可以舉例而言，使用Zaritskaya等人，Expert Rev Vaccines(2011),9(6)：601-616，中回顧的任一方法來研究，以其之全體藉此併入以作為參考資料。T細胞對靶定細胞之細胞毒性的分析之實例是51Cr釋放分析法，其中靶定細胞係用51Cr來處理，其等內化51Cr。T細胞靶定細胞之溶解作用導致放射性的51Cr釋放至細胞培養懸浮液之內，放射性的51Cr可以被偵測。
APCs所呈現的病毒胜肽可以衍生自病毒粒子，或是可以由病毒的核酸所編碼。當使用於本文中，一種“胜肽”係指由肽鍵連結的二種或更多種胺基酸單體之鏈，其之長度為50個或更少個胺基酸。
病毒胜肽係由MHC第一型或第二型分子予以呈現。MHC第一型分子為一個α-鏈與一個β2-微球蛋白的異二聚體。α-鏈具有三個領域稱為α1、α2及α3。α1及α2領域一起形成溝，與MHC第一型分子呈現的胜肽結合，以 形成胜肽-MHC複合體。MHC第一型α-鏈為多形態的，以及不同的α-鏈能結合及呈現不同的胜肽。相似於MHC第一型分子，MHC第二型分子亦為異二聚體，以及由一個α-鏈與一個β-鏈組成。於人類，MHC第一型α-鏈，及MHC第二型α與β-鏈係由人類白血球抗原(HLA)基因所編碼。
如本揭示之病毒專一性T細胞包含一種TCR，其能與MHC第一型或MHC第二型分子呈現的、T細胞專一之病毒胜肽結合。
T細胞具專一性的病毒可以為一種dsDNA病毒(例如，腺病毒、疱疹病毒、痘病毒)、ssRNA病毒(例如，微小病毒(parvovirus)、dsRNA病毒(例如，里奧病毒(reovirus))、(+)ssRNA病毒(例如，小核糖核酸病毒、披衣病毒(togavirus))、(-)ssRNA病毒(例如，正黏液病毒、棒狀病毒)、ssRNA-RT病毒(例如，反轉錄病毒)或dsDNA-RT病毒(例如，肝去氧核糖核酸病毒(hepadnavirus))。本揭示預期下列科的病毒：腺病毒科(adenoviridae)、疱疹病毒科(herpesviridae)、乳頭瘤病毒科(papillomaviridae)、多瘤病毒科(polyomaviridae)、痘病毒科(poxviridae)、肝去氧核糖核酸病毒科(hepadnaviridae)、微小病毒科(parvoviridae)、星狀病毒科(astroviridae)、杯狀病毒科(caliciviridae)、小核糖核酸病毒科(picornaviridae)、冠狀病毒科(coronaviridae)、黄病毒科(flaviviridae)、披膜病毒科(togaviridae)、肝炎病毒科(hepeviridae)、反轉錄病毒科(retroviridae)、正黏 液病毒科(orthomyxoviridae)、沙粒病毒科(arenaviridae)、本揚病毒科(bunyaviridae)、絲狀病毒科(filoviridae)、副黏液病毒科(paramyxoviridae)、棒狀病毒科(rhabdoviridae)，以及里奧病毒科(reoviridae)。
與疾病或障礙有關連的病毒是特別感興趣的。因此，下列病毒是預期的：腺病毒、單純疱疹第1型病毒、單純疱疹第2型病毒、水痘帶狀疱疹病毒、艾司坦氏-巴爾氏病毒(Epstein-Barr Virus)、人類巨細胞病毒、人類疱疹病毒第8型、人類乳頭瘤病毒、BK病毒、JC病毒、天花、B型肝炎病毒、小病毒B19、人類星狀病毒、諾瓦克病毒(Norwalk virus)、克沙奇病毒(coxsackievirus)、A型肝炎病毒、脊髓灰白質炎病毒(poliovirus)、鼻病毒、嚴重急性呼吸道症候群病毒(severe acute respiratory syndrome virus)、C型肝炎病毒、黃熱病病毒、登革熱病毒、西尼羅河病毒(West Nile virus)、TBE病毒、德國麻疹病毒(Rubella virus)、E型肝炎病毒、人類免疫不全病毒、流行性感冒病毒、賴薩病毒(lassa virus)、克里米亞-剛果出血熱病毒(Crimean-Congo hemorrhagic fever virus)、漢江病毒(Hantaan virus)、伊波拉病毒(ebola virus)、馬堡病毒(Marburg virus)、麻疹病毒、腮腺炎病毒、副流行性感冒病毒、呼吸道融合細胞病毒、狂犬病病毒、D型肝炎病毒、輪狀病毒、環狀病毒(orbivirus)、科拉多壁病毒(coltivirus)，以及班納病毒(banna virus)。
在一些具體例中，病毒為艾司坦氏-巴爾氏病 毒(Epstein-Barr Virus)。因此，在一些具體例中，該方法係用於產生或增生EBV-專一性T細胞族群。
在一些具體例中，EBV為B95-8株、P3HR-1株，或是其衍生物。
於本發明中，病毒胜肽係由抗原呈現細胞(APC)予以呈現。APCs透過分子機器來將多肽加工成胜肽，胜肽繼而與MHC分子聯結，以及在細胞表面呈現為胜肽-MHC複合體。不同的TCRs展現不同的結合能力，以及因而對不同的胜肽-MHC複合體展現不同的反應性。
病毒胜肽/多肽係予以加工且與MHC分子呈現為複合體。抗原加工、裝載及呈現於MHC上係舉例而言於Immunobiology，第5版，Edn.Janeway CA Jr,Travers P,Walport M，等人，New York：Garland Science(2001)，第5章之內詳細地描述，係以全體併入於此以作為參考資料。
不同種類的T細胞係通過其等之TCRs、辨識胜肽-MHC複合體而予以活化。CD8+T細胞辨識胜肽-MHC第一型複合體，而CD4+T細胞辨識胜肽-MHC第二型複合體。T細胞活化必須在來自APC正向的共刺激信號的情況下，與T細胞的TCR對其具有高親和性之胜肽-MHC複合體結合。T細胞活化的方法係熟悉此藝者眾所周知的，並且舉例而言於Immunobiology，第5版，Edn.Janeway CA Jr,Travers P,Walport M，等人，New York：Garland Science(2001)，第8章之內詳細地描述，其係以其之全體併入於此以作為參考資料。
如本發明之APCs可以為專業的APCs。專業的APCs係特化用於呈現抗原給T細胞；其等在加工及呈現MHC-胜肽複合體在細胞表面上效率很高，並且表現高位準的共刺激分子。專業的APCs包括樹突細胞(DCs)、巨噬細胞，以及B細胞。非專業的APCs為其他能夠呈現MHC-胜肽複合體給T細胞的細胞，特別是MHC第一型-胜肽複合體給CD8+T細胞的細胞。
關於本發明，APC可以為感染、或是包含或表現病毒胜肽的任何細胞，T細胞含有對該病毒胜肽專一性的TCR。感染、或是包含或表現病毒胜肽的細胞可以將病毒胜肽呈現於細胞表面的MHC分子的環境。
將可以理解的是，於此提到“一胜肽”會包含複數個胜肽。舉例而言，呈現該病毒胜肽之APCs可以呈現數種病毒胜肽。
APCs可以包含一種編碼MHC第一型或第二型分子的HLA對偶基因，MHC第一型或第二型分子能呈現T細胞的TCR專一的病毒胜肽。在一些具體例中，APCs可以為與T細胞之TCR辨識的病毒胜肽匹配的HLA。
在一些具體例中，APCs由於感染一病毒而可以表現或是包含病毒胜肽。在一些具體例中，APCs可能業已經修飾成包含或是表現一病毒胜肽。舉例而言，在一些具體例中，細胞可能業已經修飾成包含編碼一病毒胜肽的核酸，或是可能業已經以一病毒胜肽予以脈衝。
在一些具體例中，病毒胜肽可以以胜肽混合 物庫(library of peptide mixtures)的形式提供給APCs，該等胜肽混合物可以稱為是pepmixes。在一些具體例中，有各種各樣的pepmixes匯集用以暴露至APCs。呈現該病毒胜肽之APCs可以於某些條件下暴露於末梢血液T細胞以導致對某些病毒胜肽專一的T細胞之刺激作用。
在一些具體例中，APCs為B細胞或衍生自B細胞。在特定的具體例中，APCs可以為類淋巴母細胞株(LCL)細胞。
LCLs可以藉由B細胞之病毒轉形來製備。LCLs典型地係藉由以艾司坦氏-巴爾氏病毒進行B細胞轉形來生產。LCLs之產生及特徵係舉例而言於Hui-Yuen等人，J Vis Exp(2011)57：3321，以及Hussain and Mulherkar,Int J Mol Cell Med(2012)1(2)：75-87之內詳細地描述，二者係以整體併入於此以作為參考資料。簡言之，LCLs可以藉由在環孢素A(cyclosporin A)存在下、用生產EBV的細胞，舉例而言B95-8細胞，之濃縮細胞培養懸浮液予以孵育PBMCs而生產。
在一些具體例中，APCs係得自於或是衍生自，產生或增生的T細胞族群之主體相同的主體。那就是說，在一些具體例中，APCs與T細胞是自體來源的。在一些具體例中，APCs係得自於或是衍生自一主體，其與產生或增生的T細胞族群之主體是不同的。那就是說，在一些具體例中，APCs與T細胞是異種來源的。
在依據本發明之一些具體例中，APCs係藉 由用EBV進行的B細胞之轉形來製備的LCLs，其中獲得該B細胞的主體與獲得本發明方法中使用的T細胞之主體是相同的。在一些具體例中，LCLs係藉由B細胞之轉形來製備，獲得該B細胞的主體與獲得T細胞之主體是不同的。
在一些具體例中，製備LCLs使用的B細胞可以得自於末梢血液單核細胞(PBMCs)族群，該PBMCs族群係得自於一個體，該個體與獲得產生及/或增生如本發明之病毒專一性T細胞族群的PBMCs族群之個體是相同的個體。在一些具體例中，製備LCLs使用的B細胞係得自於一PBMCs族群，該PBMCs族群與產生及/或增生如本發明之病毒專一性T細胞族群的PBMCs族群是相同的。
在一些具體例中，在T細胞存在下進行培養以前，APCs(例如，LCLs)係用一物質予以照射或處理(例如，絲裂黴素C)，以預防其等的增殖。依據本方法之LCLs照射典型地係以6000至12000雷德(rads)來進行。
本方法與先前技藝用於產生/增生病毒專一性T細胞的方法相比，可用於在更短的時間期間內生產大量的病毒專一性T細胞。特別是，該方法可用於生產大量的病毒專一性T細胞供用於病毒專一性T細胞之授受性轉移，用於治療或預防該病毒所造成或是惡化的疾病，或是用於該病毒感染為風險因子之疾病。
舉例而言，當該方法係用於產生及/或增生EBV-專一性T細胞族群時，該細胞可透過授受性轉移而用於治療EBV相關的障礙，例如鼻咽癌(nasopharangeal carcinoma)(NPC)，例如於Chia WK等人，Molecular Therapy(2014),22(1)：132-139，之內描述者，以其之全體藉此併入以作為參考資料。
T細胞之授受性轉移一般而言係指一種從一主體得到T細胞的方法，典型地係透過抽取血液樣本。T細胞典型地接著以一些方式予以處理或改變，並且返回同一主體或導入至不同的主體內。處理典型目的在於提供具有所欲特徵的T細胞族群至一主體，或是使該主體內具有此等特徵之T細胞的頻率增加。病毒專一性T細胞之授受性轉移，舉例而言係描述於Cobbold等人，(2005)J.Exp.Med.202：379-386 and Rooney等人，(1998),Blood 92：1549-1555之內，以其之全體藉此併入以作為參考資料。
於此之主體可以為一人類。在一些具體例中，一主體可以為非人類哺乳動物(例如，兔、天竺鼠、大鼠、小鼠或其他齧齒動物(包括囓齒目的任何動物)、貓、犬、豬、綿羊、山羊、牛(包括母牛，例如乳用母牛或牛屬目(order Bos)的任何動物)、馬(包括馬科目(order Equidae)的任何動物)、驢，以及非人類靈長類動物。
刺激T細胞
於本發明中，T細胞族群係予以產生及/或增生。該方法一般而言包含刺激T細胞的步驟，導致其等之細胞分裂且因而增加其等之數目。
可以透過刺激及繼起的細胞分裂而從單一T細胞產生T細胞族群。現存的T細胞族群可以透過T細胞族 群之刺激作用及細胞繼起的細胞分裂而增生。
呈現該病毒胜肽之APCs優先為刺激對病毒專一的T細胞(亦即，具有能夠辨識APC呈現的病毒胜肽之TCR的T細胞)，以及刺激作用因而造成此等細胞之細胞分裂及增殖超過例如，其他不包含/表現對病毒專一的TCR之T細胞。與刺激之前的細胞族群相比，在刺激結束時之細胞族群內對病毒專一的T細胞因而被濃化；那就是說，刺激之後細胞族群內的病毒專一性T細胞存在的頻率增高。通過這種方式，病毒專一性T細胞族群係自具有不同專一性的異質T細胞族群增生/產生。
T細胞係予以刺激，以於活化後經由細胞分裂而增殖。如上文所述，T細胞活化係在來自APC正向的共刺激信號的情況下，通過與MHC-胜肽複合體的結合而發生，T細胞之TCR對該MHC-胜肽複合體具有高親和性。
活化會誘發T細胞生產IL-2，IL-2會促進細胞分裂。T細胞活化亦向上調節IL-2受體的表現，所以活化的T細胞之增殖係以自泌方式而促進。
本發明的方法涉及刺激及再刺激T細胞的步驟，其係使用呈現T細胞專一的病毒胜肽之APCs。刺激性APCs係感染或是包含或表現病毒胜肽，T細胞含有對該病毒胜肽專一性的TCR，以及將病毒胜肽呈現於MHC分子的環境。刺激作用促進細胞分裂(亦即，造成T細胞增殖)，導致病毒專一性T細胞族群之產生及/或增生。
一方法步驟，其包含藉由在呈現該病毒的一 胜肽之APCs存在下培養來「刺激」及/或「再刺激」T細胞，於此可以稱為「刺激步驟」。於依據本發明的刺激步驟的情況中，T細胞及呈現該病毒胜肽之APCs的培養，於此可以稱為是「刺激培養」。如同從本揭示將會明白，一刺激步驟的刺激培養包含培養基內培養的細胞，該培養基含有細胞培養培養基，以及在許多情況下也包含條件培養基。
依據本發明方法之刺激T細胞涉及在APCs存在下培養T細胞；亦即，共培養T細胞及APCs。共培養典型地於活體外或擬體內(ex vivo)執行。
在本方法中，病毒專一性T細胞族群典型地係從PBMCs族群產生，或是從PBMCs族群增生出。因此，在本發明的方法之一些具體例中，在APCs存在下培養予以刺激的T細胞，係存在於具有其他的PBMCs，例如B細胞、NK細胞及/或單核球之培養內。在一些具體例中，T細胞族群可以從白血球族群產生，或是從白血球族群增生出，以及因而可以處於具有T細胞以外的白血球之培養物內，例如B細胞、NK細胞、單核球、嗜中性球、嗜酸性球，及/或嗜鹼性球。
產生或是增生出病毒專一性T細胞族群的細胞族群，於此可以稱為是「反應者」，以及呈現病毒胜肽之APCs於此可以稱為是「刺激者」。在一些具體例中，本方法的刺激步驟提供特定比率的「反應者」及「刺激者」，於此稱為是「反應者對刺激者比」。如同從以上將會明白，在一些具體例中，當使用於本文中，「反應者」係指PBMCs 族群。在一些具體例中，「反應者」係指T細胞或是白血球族群。
於起始刺激步驟方面，「反應者」為細胞族群，其包含要產生及/或增生病毒專一性T細胞族群的T細胞。
一種起始刺激之「反應者」可以為例如，T細胞族群、淋巴球族群、白血球族群，或是PBMCs族群。在特定的具體例中，一種起始刺激之「反應者」為PBMCs族群。
於起始刺激步驟後續的刺激步驟(亦即，再刺激T細胞的步驟)方面，「反應者」為先前的刺激步驟結束時的細胞，舉例而言，在先前的刺激步驟結束時收集的細胞。後續的刺激步驟之「反應者」會包括先前的刺激步驟結束時培養中的活細胞，包括業已經刺激而分裂的細胞。
舉例而言，於包含下列步驟的方法中：(i)藉由在呈現該病毒的一胜肽之APCs存在下培養來刺激T細胞；(ii)收集由步驟(i)獲得的該等細胞，以及；(iii)藉由在呈現該病毒的一胜肽之APCs存在下培養來再刺激該等T細胞，其中培養該等細胞之至少10%的培養基為條件培養基，其係得自於T細胞及呈現該病毒胜肽之APCs的刺激培養；步驟(iii)的刺激作用之「反應者」為步驟(ii)收集的細胞。
將可以理解的是，「反應者對刺激者比」係指一假定的刺激步驟開始之細胞相對數目，亦即，刺激步驟開始時提供培養之細胞比率。
在一些具體例中，再刺激步驟的「反應者」可以包括T細胞以外的細胞；例如，如上所述其他的PBMCs或白血球。舉例而言，於本發明的方法之起始刺激步驟的反應者為PBMCs之具體例中，在起始刺激步驟結束時收集的細胞可以包括T細胞以外的PBMCs或白血球。
包含多重刺激步驟用於增生病毒專一性T細胞的方法係熟悉此藝者眾所周知的。典型的培養條件(亦即，細胞培養培養基、添加物、溫度、氣體氛圍)、反應者對刺激者比、刺激步驟之培養期間等等，可以參照例如，Bollard等人，J Exp Med(2004),200(12)：1623-1633以及Straathof等人，Blood(2005),105(5)：1898-1904，而容易地判定，二者係整體併入於此以作為參考資料。
於如本發明的刺激步驟中，T細胞及APCs之共培養係於細胞培養培養基內執行。細胞培養培養基可以為任何的培養基，其中如本發明的T細胞及APCs能維持於活體外/擬體內培養中。適用於淋巴球培養的培養培養基係熟悉此藝者眾所周知的，並且包括舉例而言，AIM-V培養基、伊思考夫(Iscoves)培養基及RPMI-1640培養基。
當使用於本文中，「細胞培養培養基」與「條件培養基」是有區別的。如同從本完整揭示將會明白，包含依據本發明之T細胞及APCs的培養實質上可以僅使用細胞培養培養基(例如，於起始刺激步驟)來建立，或是可以包含細胞培養培養基及條件培養基二者(例如，於後續的刺激步驟中)。
在一些具體例中，細胞培養培養基可以包含RPMI-1640培養基及/或克里克培養基(亦稱為伊格爾漢姆斯胺基酸(Eagle’s Ham’s amino acids)(EHAA)培養基)。此等培養基之組成係熟悉此藝者眾所周知的。RPMI-1640培養基之配方係描述於例如，Moore等人，JAMA(1967)199：519-524之內，以及克里克培養基之配方係描述於Click等人，Cell Immunol(1972)3：264-276之內。RPMI-1640培養基可得自於例如賽默飛世爾科技(ThermoFisher Scientific)，以及克里克培養基可以得自於例如西格瑪奧瑞奇(Sigma-Aldrich)(目錄編號C5572)。
在一些具體例中，細胞培養培養基包含RPMI-1640培養基及克里克培養基。在一些具體例中，細胞培養培養基包含(以體積計)25-65% RPMI-1640培養基，以及25-65%克里克培養基。在一些具體例中，細胞培養培養基包含30-60% RPMI-1640培養基，以及30-60%克里克培養基。在一些具體例中，細胞培養培養基包含35-55% RPMI-1640培養基，以及35-55%克里克培養基。在一些具體例中，細胞培養培養基包含40-50% RPMI-1640培養基，以及40-50%克里克培養基。在一些具體例中，細胞培養培養基包含45% RPMI-1640培養基，以及45%克里克培養基。
在一些具體例中，細胞培養培養基可以包含一或多種細胞培養培養基添加物。細胞培養培養基添加物係熟悉此藝者眾所周知的，以及包括抗生素(例如青黴素、鏈 黴素)、血清(例如，胎牛血清(FBS)、牛血清白蛋白(BSA))、左旋麩醯胺酸、細胞介素(cytokines)/生長因子等等。
在一些具體例中，細胞培養培養基包含(以體積計)5-20% FBS、7.5-15% FBS，或是10% FBS。在一些具體例中，細胞培養培養基包含1-5mM左旋麩醯胺酸、1.5-3mM左旋麩醯胺酸或是2mM麩醯胺酸。
在一些具體例中，一刺激步驟之細胞培養培養基可以包含IL-2。在一些具體例中，IL-2可以為添加的(於此稱為「添加的IL-2」)。在一些具體例中，IL-2可以為外源性，亦即，不是由培養的細胞生產的IL-2。在一些具體例中，IL-2可以為重組型IL-2。
在一些具體例中，如本發明的刺激步驟之細胞培養培養基包含最終濃度10-200IU/ml、15-175IU/ml、20-150IU/ml、30-125IU/ml，或是40-100IU/ml之添加的IL-2。最終濃度是刺激步驟之培養的培養基總體積內的最終濃度(包括細胞培養培養基及任何的條件培養基)。
在一些特定的具體例中，細胞培養培養基包含40-50% RPMI-1640培養基、40-50%克里克培養基、5-20% FBS、1-5mM左旋麩醯胺酸，及最終濃度10-200IU/ml之添加的IL-2。在一些具體例中，細胞培養培養基包含42.5-47.5% RPMI-1640培養基、42.5-47.5%克里克培養基、7.5-15% FBS、1.5-3mM左旋麩醯胺酸，及最終濃度20-150IU/ml之添加的IL-2。在一些具體例中，細胞培養培養基包含45% RPMI-1640培養基、45%克里克培養 基、10% FBS、2mM左旋麩醯胺酸，及最終濃度40-100IU/ml之添加的IL-2。
如本發明的刺激步驟典型地涉及T細胞及APCs之共培養歷時定義的時間期間。時間期間適當地為至少足夠長使得APCs刺激T細胞以進行細胞分裂。在一些具體例中，時間期間係足夠長使得刺激及刺激的T細胞至少單一細胞分裂得以進行。
在一些具體例中，依據本發明的方法之刺激步驟涉及培養T細胞及APCs歷時下列之一的期間：至少1小時，至少6小時，至少12小時，至少24小時，至少48小時，至少36小時，至少72小時，至少4天，至少5天，至少6天，至少8天，至少9天，至少10天，至少11天，至少12天，至少13天，或是至少14天。在一些具體例中，一刺激步驟涉及培養T細胞及APCs歷時下列之一的期間：不超過20天，不超過14天，不超過13天，不超過12天，不超過11天，不超過10天，不超過9天，不超過8天，不超過7天，不超過6天，不超過5天，不超過4天，或是不超過72小時。
在一些具體例中，依據本發明的方法之刺激步驟涉及培養T細胞及APCs歷時下列之一的期間：24小時至20天，48小時至14天，以及3至12天。在一些具體例中，一刺激步驟涉及培養T細胞及APCs歷時下列之一的期間：7至14天，8天至13天，以及9至12天。在一些具體例中，一刺激步驟涉及培養T細胞及APCs歷時下列之一的期間：1至8天，2天至6天，以及3至4天。
一刺激步驟典型地係以分離培養的細胞與培養其等的培養基而結束。在一些具體例中，該方法包含在刺激步驟結束時收集細胞的步驟(亦即，收集在先前的刺激步驟結束時獲得的細胞)。一刺激步驟的結束係由該步驟的培養期間來判定；舉例而言，一方法步驟，其包含藉由在呈現一病毒的胜肽之APCs存在下培養歷時7天的期間來刺激T細胞，係以7天的培養期間結束時收集細胞而結束。
在依據本發明的方法之一些具體例中，一刺激步驟係通過稀釋培養物而結束，例如，透過添加細胞培養培養基。在此等具體例中，不需要收集細胞，以及可以透過添加合適達到再刺激步驟的細胞培養培養基、條件培養基(以及任何添加物)所欲的百分率/濃度的量之細胞培養培養基(以及如本文所述之任何其他的添加物)，來建立如本發明之再刺激步驟。
在刺激步驟的培養期間結束時，可以收集細胞以及與細胞培養懸浮液分離。關於生長於懸浮培養物內的細胞(例如淋巴球)，細胞可以透過離心來收集，以及細胞培養懸浮液可以與細胞小丸分離。細胞小丸繼而可以再懸浮於細胞培養培養基內，例如供用於進一步的刺激步驟。在一些具體例中，細胞於收集之後可以進行清洗步驟。一清洗步驟可以包含使細胞小丸再懸浮於等張的緩衝液內，例如磷酸鹽緩衝生理鹽水(PBS)，透過離心來收集細胞，並且丟棄懸浮液。
依據本發明用於產生及/或增生對一病毒專 一的T細胞族群的方法，典型地涉及超過一單一的刺激步驟。如本發明的方法內可以執行的刺激步驟的數目沒有上限。在一些具體例中，該方法包含超過2、3、4或是5個刺激步驟。在一些具體例中，該方法包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14，或是15個刺激步驟中的一者。
如本發明的方法之刺激步驟可以是彼此不同的。
起始反應者族群(例如，從一主體得到的PBMCs樣本)內要增生的病毒專一性T細胞之頻率可能是非常低的，以及由於先前的刺激，後續的步驟中反應者族群內的病毒專一性T細胞之頻率是比較大的。因此，在一些具體例中，該方法提供起始刺激步驟比後續的(亦即再刺激)步驟，更高的反應者對刺激者比。
在一些具體例中，起始刺激步驟的反應者對刺激者比係落在下列中一者的範圍內：10：1至80：1，15：1至70：1，20：1至65：1，25：1至60：1，30：1至50：1，35：1至45：1，或是40：1。在一些具體例中，再刺激步驟之反應者對刺激者比係落在下列中一者的範圍內：1：1至10：1，1.5：1至8：1，2：1至7：1，2.5：1至6：1，3：1至5：1，3.5：1至4.5：1，或是4：1。
起始刺激步驟(亦即，該方法的第一刺激步驟)典型地涉及，培養T細胞及APCs歷時比後續的刺激步驟之培養期間更長的期間。更長的時間期間允許起始刺激之反應者族群內病毒專一性T細胞從通常很低的頻率，可觀的增加其等之數目。
在一些具體例中，起始刺激步驟涉及培養T細胞及APCs歷時下列之一的期間：7至14天，8天至13天，以及9至12天。在一些具體例中，後續的刺激步驟涉及培養T細胞及APCs歷時下列之一的期間：1至8天，2天至5天，以及3至4天。
在一些具體例中，起始刺激步驟的培養可以不包括添加的IL-2，而後續的刺激步驟之培養可以包括添加的IL-2。
在一些具體例中，該方法包含一起始刺激步驟接著1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13，或是14個後續的刺激步驟。在一些具體例中，各個後續的刺激步驟涉及培養T細胞及APCs歷時相同或相似的時間期間。在一些具體例中，各個後續的刺激步驟涉及以相同或是相似的反應者對刺激者比來培養T細胞及APCs。在一些具體例中，後續的刺激步驟各者之培養包含相同或是相似的最終濃度之添加的IL-2。
合宜地，如本揭示之細胞培養係維持於含5% CO2之加濕的氛圍、37℃下。培養可以於適合培養體積的任何器皿內執行，例如於細胞培養平盤的孔、細胞培養燒瓶、生物反應器等等。依據本發明之細胞培養的細胞可以以任何合適的密度予以建立及/或維持，其可以由熟悉此藝者容易地判定。舉例而言，可以以起始密度~0.5 x 106至~5 x 106細胞/ml的培養(例如，~1 x 106細胞/ml)來建立培養。
細胞可以於任何合適的細胞培養器皿內培 養。在依據本發明的各種態樣之方法之一些具體例中，細胞係於生物反應器內培養。在一些具體例中，細胞係培養於Somerville and Dudley,Oncoimmunology(2012)1(8)：1435-1437，之內描述的生物反應器內，該文章係以其之全體藉此併入於此以作為參考資料。在一些具體例中，細胞係於一種GRex細胞培養器皿，例如一種GRex燒瓶或是一種GRex 100生物反應器內予以培養。
條件培養基
本發明涉及條件培養基內之細胞培養。「條件培養基」係指透過於細胞培養培養基內培養細胞而獲得的培養基。條件培養基含有由培養的細胞分泌/釋放的因子(例如，細胞介素、化學激活素(chemokines)、生長因子等等)。條件培養基係藉由培養細胞於培養培養基內足夠調整(condition)培養基的時間而生產，以及繼而收集條件培養基。
依據本發明的刺激步驟之培養可以包含細胞培養培養基及條件培養基的混合物。那就是說，建立及培養(例如，一刺激步驟的)刺激培養的細胞之培養基，可以包含細胞培養培養基及條件培養基二者。使用條件培養基及新鮮的培養基之混合物可以提供對於培養內的細胞有益、更複雜的營養混合物。
將可以理解的是，條件培養基之組成會取決於細胞、時間期間、培養條件、使用的任何添加物，以及獲取條件培養基之培養物所利用的細胞培養培養基之組成。
於本發明中，該條件培養基係於得自於包含T細胞及APCs之刺激培養。
在一些具體例中，依據本方法之刺激培養的細胞培養培養基及條件培養基可以是相同的，除了條件培養基業已經調整以外。
在依據本發明的方法之一些具體例中，條件培養基可以得自於依據如此所述的任一具體例之刺激步驟的培養。
在一些具體例中，在一刺激結束時收集條件培養基。合宜地，可以在一刺激步驟結束時、在收集細胞的時候，收集條件培養基。舉例而言，如本發明之條件培養基可以如本文所述在刺激步驟結束時，藉由離心收集細胞以得到懸浮液，而從懸浮液獲取條件培養基。
在一些具體例中，如本發明的刺激步驟之培養所含括的條件培養基係得自於如本文所述之刺激步驟的培養。在一些具體例中，條件培養基不是由起始刺激步驟(亦即，如本發明的方法之第一刺激步驟)的培養獲得。
調整培養基適當的培養期間可以由熟悉此藝者、依據已知的方法來判定。典型地，培養基將調整歷時大約1小時及大約8天之間的期間，例如介於大約1天至8天，2天至5天，或是3至4天之間。
在特定的具體例中，如本發明之條件培養基係得自於：(1)一種病毒專一性T細胞的刺激培養，其係處於呈現 該T細胞具專一性的該病毒之胜肽之APCs存在下；(2)一種如(1)之刺激培養，其係在1天至8天，2天至6天，及3至4天之一者的培養期間之後；(3)一種如(1)或(2)之刺激培養，其係處於1：1至10：1，1.5：1至8：1，2：1至7：1，2.5：1至6：1，3：1至5：1，3.5：1至4.5：1，或是4：1中一者的反應者：刺激者比；(4)一種如(1)至(3)中任一者之刺激培養，其中該刺激培養使用的細胞培養培養基包含30-60% RPMI-1640培養基及/或30-60%克里克培養基及/或5-20% FBS及/或1-5mM左旋麩醯胺酸；(5)一種如(1)至(4)中任一者之刺激培養，其包含最終濃度10-200IU/ml、15-175IU/ml、20-150IU/ml、30-125IU/ml，或是40-100IU/ml之添加的IL-2；(6)一種如(1)至(5)中任一者之刺激培養，其額外包含得自於如(1)至(5)中任一者之刺激培養之至少10%的條件培養基；(7)一種如(1)至(6)中任一者之刺激培養，其中APCs為LCLs，例如EBV-轉形的LCLs。
在一些具體例中，一假定的刺激步驟所含括的條件培養基可得自於相同方法之另一個不同的刺激步驟之培養。舉例而言，如本發明的方法之第三刺激步驟的培養所含括的條件培養基可得自於第二刺激步驟之培養。
在一些具體例中，一刺激步驟之培養含括的條件培養基可得自於該方法先前的刺激步驟之培養。舉例 而言，第三刺激步驟的培養所含括的條件培養基可得自於第二刺激步驟的培養，以及第四刺激步驟的培養所含括的條件培養基可得自於第三刺激步驟的培養，等等。
在如本發明的方法之具體例中，不是每個刺激步驟均包含培養基內含括條件培養基的培養。舉例而言，在一些具體例中，如本發明的起始刺激步驟之培養不含括條件培養基。
一種含有條件培養基的刺激步驟之培養可以包含下列一者中數量(以體積計)之條件培養基：至少2%，至少5%，至少7.5%，至少10%，至少15%，至少20%，至少25%，至少30%，至少35%，至少40%，至少45%，至少50%，至少55%，至少60%，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，或是至少95%之刺激步驟的培養之培養基總體積。可以用如本文所述之細胞培養培養基組成剩餘體積，包括該處的任何添加物。在一些具體例中，條件培養基可以包含刺激步驟培養之培養基總體積的至少10%。
雖然條件培養基富含生長因子及細胞介素，但是因為舉例來說培養基內培養的細胞之消耗，條件培養基與尚未經調整之可比較的細胞培養培養基相比，典型地包含較低濃度的例如，胺基酸及葡萄糖。條件培養基亦可以包含用於調整培養基的細胞的廢物。此等因子對細胞生長及分裂可能有負面影響，所以因而如本發明的刺激步驟之刺激培養中之培養基不是100%為條件培養基，可 能是重要的。在一些具體例中，一種含有條件培養基的刺激步驟之培養可以包含下列一者中數量(以體積計)之條件培養基：少於100%，少於95%，少於90%，少於85%，少於80%，少於75%，少於70%，少於65%，少於60%，少於55%，少於50%，少於45%，少於40%，少於35%，少於30%，少於25%，少於20%，或是少於15%之刺激步驟的培養之培養基總體積。
在一些具體例中，可以包含高達30%，高達25%，高達20%或是高達15%之刺激步驟的培養之培養基總體積的條件培養基。
在一些具體例中，可以包含5至70%，7.5至70%，10至70%，10至65%10至60%，12.5至55%，15至50%，15至45%，15至40%，17.5%至45%，20-40%，20-35%，或是20-30%中一者之刺激步驟的培養之培養基總體積的條件培養基。在一些具體例中，可以包含刺激步驟的培養之培養基總體積之20-30%的條件培養基。在一些具體例中，可以包含10至25%，較佳大約15%之刺激步驟的培養之培養基總體積的條件培養基。
在一些具體例中，可以包含5至30%，5至27.5%，5至25%，5至22.5%，5至20%，或是5至17.5%中一者之刺激步驟的培養之培養基總體積的條件培養基。在一些具體例中，可以包含7.5至30%，10至30%或是12.5至30%中一者之刺激步驟的培養之培養基總體積的條件培養基。
在一些具體例中，可以包含5至30%，10至25%，10至20%，12.5至17.5%或是大約15%中一者之刺激步驟的培養之培養基總體積的條件培養基。
在一些具體例中，可以包含大約5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%或是30%中一者之刺激步驟的培養之培養基總體積的條件培養基。
培養培養基可以為1x調配物或一種濃縮的調配物，例如2x至250x濃縮的培養基調配物。於1x調配物方面，培養基內的各成分為細胞培養預期的濃度。於一種濃縮的調配物方面，一或多種成分係存在比細胞培養預期更高的濃度。濃縮的培養培養基係本技藝中眾所周知的。培養培養基可以使用已知的方法予以濃縮，例如鹽沈澱或是選擇性過濾。一種濃縮的培養基可以用水(較佳為去離子及蒸餾的)或是任何合適的溶液予以稀釋供使用，例如食鹽水溶液、水性緩衝液或是培養培養基。
將可以理解的是，所示的百分率係參考1x條件培調配物。熟悉此藝者會理解包含10%的1x條件培養基調配物之培養與包含1%的10x濃縮的條件培養基調配物之培養是相等的。
在一些具體例中，條件培養基可以從一刺激步驟的培養收集並且儲存於，例如-80℃。繼而可以解凍儲存的條件培養基且使用於本發明的方法中。在一些具體 例中，條件培養基可以例如透過過濾，來處理以移除細胞或是碎屑。
本方法的特定例示性具體例
依據本發明，提供本方法的數個特定例示性具體例。下列特定的具體例純粹是作說明用途，以展現上文所述的各種特徵可以如何組合，且無論如何不打算限制本發明。
一種用於產生或增生EBV專一性T細胞(譬如，CTLs)族群的方法，或是一種用於加速EBV專一性T細胞(譬如，CTLs)族群增生速率的方法，其包含藉由以2：1至7：1(如，4：1)之反應者對刺激者比、EBV-轉形的LCLs(譬如，照射的、EBV-轉形的LCLs)存在下於培養基內培養，來刺激(如，於PBMCs族群內的)T細胞歷時1至8(如，3至4)天的期間，該培養基包含：(a)細胞培養培養基，其包含40-50%(譬如45%)RPMI-1640培養基、40-50%(譬如45%)克里克培養基、5-20%(譬如10%)FBS及1-5mM(譬如2mM)左旋麩醯胺酸，(b)至少10%(譬如，10%至70%)的條件培養基，其係透過一方法獲得，該方法包含：藉由以2：1至7：1(如，4：1)之反應者對刺激者比、EBV-轉形的LCLs(譬如，照射的、EBV-轉形的LCLs)存在下於細胞培養培養基內培養，來刺激(如，於PBMCs族群內的)T細胞歷時1至8(如，3至4)天的期間，該細胞培養培養基包含40-50%(譬如45%)RPMI-1640培養基、40-50%(譬如45%)克里克培養 基、5-20%(譬如10%)FBS及1-5mM(譬如2mM)左旋麩醯胺酸，及最終濃度10-200(如，40-100)IU/ml之添加的IL-2，以及(c)最終濃度10-200(如，40-100)IU/ml之添加的IL-2。
一種用於產生或增生EBV專一性T細胞(如CTLs)族群的方法，其包含：(i)藉由以10：1至80：1(如，40：1)之反應者對刺激者比、EBV-轉形的LCLs(譬如，照射的、EBV-轉形的LCLs)存在下於細胞培養培養基內培養，來刺激(如，於PBMCs族群內的)T細胞歷時7至14(如，9至12)天的期間，該細胞培養培養基包含40-50%(譬如45%)RPMI-1640培養基、40-50%(譬如45%)克里克培養基、5-20%(譬如10%)FBS及1-5mM(譬如2mM)左旋麩醯胺酸；(ii)收集由步驟(i)獲得的該等細胞；(iii)藉由以2：1至7：1(如，4：1)之反應者對刺激者比、EBV-轉形的LCLs(譬如，照射的、EBV-轉形的LCLs)存在下，於細胞培養培養基內培養步驟(ii)收集的細胞，來再刺激該等T細胞歷時1至8(如，3至4)天的期間，該細胞培養培養基包含40-50%(譬如45%)RPMI-1640培養基、40-50%(譬如45%)克里克培養基、5-20%(譬如10%)FBS及1-5mM(譬如2mM)左旋麩醯胺酸，以及最終濃度10-200(如，40-100)IU/ml之添加的IL-2；(iv)收集由步驟(iii)獲得的該等細胞，以及； (v)藉由以2：1至7：1(如，4：1)之反應者對刺激者比、EBV-轉形的LCLs(譬如，照射的、EBV-轉形的LCLs)存在下於培養基內培養步驟(iv)收集的細胞，來再刺激該等T細胞歷時1至8(如，3至4)天的期間，該培養基包含：(a)細胞培養培養基，其包含40-50%(譬如45%)RPMI-1640培養基、40-50%(譬如45%)克里克培養基、5-20%(譬如10%)FBS及1-5mM(譬如2mM)左旋麩醯胺酸，(b)於步驟(iii)的終點獲得之至少10%(譬如，10%至70%)的條件培養基，以及(c)最終濃度10-200(如，40-100)IU/ml之添加的IL-2。
在一些具體例中，該方法額外地包含：(vi)收集由步驟(v)獲得的該等細胞，以及；(vii)藉由以2：1至7：1(如，4：1)之反應者對刺激者比、EBV-轉形的LCLs(譬如，照射的、EBV-轉形的LCLs)存在下，於培養基內培養步驟(vi)收集的細胞，來再刺激該等T細胞歷時1至8(如，3至4)天的期間，該培養基包含：(a)細胞培養培養基，其包含40-50%(譬如45%)RPMI-1640培養基、40-50%(譬如45%)克里克培養基、5-20%(譬如10%)FBS及1-5mM(譬如2mM)左旋麩醯胺酸，(b)於步驟(v)的終點獲得之至少10%(譬如，10%至70%)的條件培養基，以及(c)最終濃度10-200(如，40-100)IU/ml之添加的IL-2。
在一些具體例中，該方法包含下列額外步驟：收集細胞，以及藉由以2：1至7：1(如，4：1)之反應者對 刺激者比、EBV-轉形的LCLs(譬如，照射的、EBV-轉形的LCLs)存在下，於培養基內培養該等收集的細胞，來再刺激該等T細胞歷時1至8(如，3至4)天的期間，該培養基包含：(a)細胞培養培養基，其包含40-50%(譬如45%)RPMI-1640培養基、40-50%(譬如45%)克里克培養基、5-20%(譬如10%)FBS及1-5mM(譬如2mM)左旋麩醯胺酸，(b)於先前刺激步驟的終點獲得之至少10%(譬如，10%至70%)的條件培養基，以及(c)最終濃度10-200(如，40-100)IU/ml之添加的IL-2。
增生速率
本方法達成病毒專一性T細胞族群，與先前技藝方法相比之下，增生速率改善的目的。
T細胞族群的增生速率可以用熟悉此藝者眾所周知的方法予以分析。包括測量一個或多個時間點之T細胞數目的方法。舉例而言，可以在執行本發明的方法之後判定T細胞的數目，並且與該方法開始時的T細胞數目作比較；繼而可計算T細胞數目之增生倍數(fold expansion)。
也可以由T細胞於一時間期間內之細胞分裂來分析增生速率。一假定的T細胞族群之細胞分裂可以，舉例而言藉由3H-胸苷參入之活體外分析或是藉由CFSE稀釋分析法予以分析，例如於Fulcher and Wong,Immunol Cell Biol(1999)77(6)：559-564，之內描述者，以其之全體藉此併入以作為參考資料。
依據本發明的方法達成之增生速率的改善， 可以藉由以下方式來判定：執行本發明的方法，以及將該方法之T細胞增生與一種可比較的對照方法作比較，該可比較的對照方法缺乏在條件培養基存在下的刺激培養。
舉例而言，可以比較二種方法之間的增生速率：(i)如本發明的方法，其包含藉由在呈現該病毒的一胜肽之APCs存在下培養來刺激T細胞，其中培養該等細胞之至少10%的培養基為條件培養基，其係得自於一刺激培養，其包含T細胞及呈現該病毒胜肽之APCs；以及(ii)一種可比較的對照方法，該方法除了使用細胞培養培養基替代條件培養基以外，都是相同的。
在一些具體例中，如本發明的方法之T細胞族群的增生速率為下列之一者：一種可比較的對照方法之增生速率的至少1.001倍、1.002倍、1.003倍、1.004倍、1.005倍、1.006倍、1.007倍、1.008倍、1.009倍、1.01倍、1.02倍、1.03倍、1.04倍、1.05倍、1.06倍、1.07倍、1.08倍、1.09倍、1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍，或是2倍，其中該可比較的對照方法中使用細胞培養培養基替代條件培養基。
增生速率可以為病毒專一性T細胞族群的增生速率，或是總T細胞族群的增生速率。
增生細胞之性質
有利地，依據本發明的方法產生/增生的病毒專一性T細胞保留如依據先前技藝的方法所產生/增生的病毒專一性T細胞相同的功能性質。那就是說，加速的增 生速率對增生的T細胞之功能性質不產生負面影響。
舉例而言，於產生/增生病毒專一性CTLs的方法之具體例中，該等CTLs與依據沒有條件培養基存在下的刺激培養方法所增生的、感染或是包含/表現一病毒胜肽的細胞，如病毒專一性CTLs，展現相似的細胞毒性。
增生的CTLs之細胞毒性可以下列方式予以分析：例如，藉由以不同的效應子(亦即，T細胞)對標靶(亦即，APC)比率，培養增生的T細胞族群及呈現T細胞有專一性的病毒胜肽之APCs，以及測量APCs之專一性溶解作用。舉例而言，一種EBV-專一性CTL族群之細胞毒性可以藉由測量用不同的效應子對標靶比率下，EBV-轉形的LCL細胞之專一性溶解作用而予以分析。
治療及預防應用
本方法找到於醫學治療方法之應用。可以提供治療給具有疾病或是病況的主體。
特別地，提供用於治療或預防疾病或障礙(譬如，癌症)的方法，其包含一種用於產生或增生對一病毒專一的T細胞族群的方法，或是一種用於加速一病毒專一性T細胞族群增生速率的方法，如本文中所述。
如本發明之治療或預防一疾病或障礙的方法可包含T細胞之授受性轉移。
於一態樣中，本發明提供一種治療或預防一主體的疾病或障礙之方法，其包含：(1)從一主體單離T細胞； (2)如本文中所述來產生或增生對一病毒專一的T細胞族群，以及；(3)投與該產生或增生的T細胞族群至一主體。
在一些具體例中，該方法的步驟(1)獲得T細胞的主體，與該方法的步驟(3)投與如本文所述的方法產生或增生的T細胞族群之主體，是相同的(亦即，自體的T細胞之授受性轉移)。在一些具體例中，該方法的步驟(1)獲得T細胞的主體，與該方法的步驟(3)投與如本文所述的方法產生或增生的T細胞族群之主體，是不同的(亦即，同種異體的T細胞之授受性轉移)。
將可以理解的是，從依據以上的步驟(1)之主體單離的T細胞可以在PBMCs族群之內。
在一些具體例中，該方法可以包含下列步驟之一者或多者：從一主體取得一血液樣本；從該血液樣本單離PBMCs；從該PBMCs單離T細胞；依據本文中所述的方法產生或增生對一病毒專一的T細胞族群；修飾該等T細胞，舉例來說，以表現一種嵌合抗原受體(CAR)或是T細胞受體(TCR)；收集該產生/增生的病毒專一性T細胞族群；混合該產生/增生的病毒專一性T細胞族群與一種佐劑、稀釋劑或載劑；投與該產生/增生的病毒專一性的T細胞族群至一主體。
該方法可以以某些方式修飾或處理T細胞。舉例而言，T細胞可以於活體外或擬體內修飾以表現或包含有一種嵌合抗原受體(CAR)或是T細胞受體(TCR)。T細 胞可以依據熟悉此藝者眾所周知的方法予以修飾。修飾可以包含核酸轉移以永久性或暫時性的表現轉移的核酸。此等修飾可以使用任何合適的遺傳工程平台。適合的方法包括使用例如下列的遺傳工程平台：γ反轉錄病毒載體、慢病毒(lentiviral)載體、腺病毒載體、DNA轉染、轉位子為基的基因遞送以及RNA轉染，舉例而言如Maus等人，Annu Rev Immunol(2014)32：189-225內描述者，以其之全體藉此併入以作為參考資料。
處理的目的可以是預防一種疾病/障礙，以及因此依據本發明的方法產生/增生的病毒專一性T細胞可以用來預防性地對抗疾病狀態的發展。此可以在疾病狀態的症狀開始之前發生，及/或可以提供給認為有較大的疾病或障礙風險之主體。
通過投與一種如本發明之T細胞族群，或是投與一種如本發明包含T細胞族群之藥學組成物，來治療或預防疾病或障礙。
依據本發明的方法產生/增生的T細胞具有專一性的病毒之感染，可以造成一疾病或病況或是使疾病或病況惡化。在一些具體例中，該疾病或病況可以是本文中所述的一病毒感染所造成或是惡化者。
特別是，該疾病或病況可以是下列之一者所造成或是惡化者：艾司坦氏-巴爾氏病毒(EBV)、流行性感冒病毒、麻疹病毒、B型肝炎病毒(HBV)、C型肝炎病毒(HCV)、人類免疫不全病毒(HIV)、淋巴細胞性脈絡叢腦 膜炎病毒(LCMV)、單純疱疹病毒(HSV)或是人類乳頭瘤病毒(HPV)。
依據本發明的方法產生/增生的病毒專一性T細胞係有用於治療或預防癌症的方法。因此，在一些具體例中，一疾病或障礙的治療或預防方法係用於治療或預防癌症。
醫學治療方法可以涉及癌症治療，其係透過一種改良、治療或預防一人類主體內的惡性腫瘤，其中該方法的步驟協助或是推動免疫系統根除癌細胞。此等方法可以包括投與依據本發明的方法產生/增生的病毒專一性T細胞，其引動主動(或是達成被動)免疫反應以摧毀癌細胞。治療方法可以選擇性地包括共投與生物佐劑(例如，間白素、細胞介素、卡介苗(Bacillus Comette-Guerin)、單磷醯脂質A(monophosphoryl lipid A)等等)，與治療癌症傳統療法組合，例如化學療法、放射療法，或是外科手術。治療方法可以涉及投與依據本發明的方法產生/增生的病毒專一性T細胞作為疫苗，疫苗係透過活化免疫系統來預防或是摧毀癌細胞生長來運作。醫學治療方法可以涉及活體內、擬體內，以及授受性免疫療法，包括使用自體及/或異種的細胞或是永生化細胞株的該等。
一種癌症可以為任何不需要的細胞增殖(或其自身表現出不需要的細胞增殖之任何疾病)、贅生物或是腫瘤，或是不需要的細胞增殖、贅生物或是腫瘤的風險增高或是體質。癌症可以是良性或惡性的，以及可以為原發 性或是繼發性(轉移的)。贅生物或是腫瘤可以為任何異常的細胞生長或增殖，以及可以位於任何的組織內。組織之實例包括腎上腺、腎上腺髓質、肛門、闌尾、膀胱、血液、骨骼、骨髓、腦、胸、盲腸、中樞神經系統(包括或是排除腦)小腦、子宮頸、結腸、十二指腸、子宮內膜、上皮細胞(例如，腎臟上皮)、膽囊、食道、神經膠細胞、心臟、迴腸、空腸、腎臟、淚腺(lacrimal glad)、喉、肝臟、肺臟、淋巴、淋巴結、淋巴母細胞、上頜骨、縱膈、腸繫膜、子宮肌層、鼻咽、網膜、口胺、卵巢、胰臟、腮腺、周邊神經系統、腹膜、胸膜、前列腺、唾腺、乙狀結腸、皮膚、小腸、軟組織、脾臟、胃、睪丸、胸腺、甲狀腺、舌、扁桃腺、氣管、子宮、女陰、白血球細胞。
要治療的腫瘤可以為神經或非神經系統腫瘤。神經系統腫瘤可以發源自中樞或周邊神經系統，例如神經膠質瘤、神經管胚細胞瘤、腦脊髓膜瘤、神經纖維瘤、室管膜瘤、神經鞘瘤、神經纖維肉瘤、星細胞瘤及寡樹突神經膠細胞瘤。非神經系統癌症/腫瘤可以發源自任何其他非神經組織，實例包括黑色素瘤、間皮瘤、淋巴瘤、骨髓瘤、白血病、非何杰金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma)(NHL)、何杰金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性骨髓白血病(AML)、骨髓發育不良症候群(myelodysplastic syndrome)(MDS)、皮膚T細胞淋巴瘤(CTCL)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、肝癌、表皮樣癌、前列腺癌、乳癌、 肺癌、結腸癌、卵巢癌、胰臟癌、胸腺癌、NSCLC、血液學癌症及肉瘤。
特別是，頭頸部癌、鼻咽癌(NPC)、口咽癌(OPC)、子宮頸癌(CC)、胃(gastric)/胃(stomach)癌或肺癌之治療是預期的。
在一些具體例中，癌症為一種EBV-或HPV-陽性癌症。於一些具體例中，癌症為EBV-陽性NPC。在一些具體例中，癌症為HPV-陽性OPC或HPV-陽性CC。
依據本發明的方法產生/增生的病毒專一性T細胞之投與較佳為「治療或預防有效量」，此量足以對個體顯示益處。投與的實際量，以及投與的速率及時間過程會取決於要治療的疾病本質及嚴重性。治療的處方，例如決定劑量等等，係在普通科醫生及其他的醫生的責任範圍內，並且典型地考慮要治療的疾病、個別病人的狀況、遞送的位置、投與的方法以及開業醫生已知的其他因素。以上提及的技術與程序述之實例可以於Remington’s Pharmaceutical Sciences,20th版，2000,pub.Lippincott,Williams & Wilkins，中找到。
本發明提供如本文所述的方法產生或增生的T細胞族群。因此，提供對一病毒專一的T細胞族群，其中該T細胞族群係透過如本發明的方法獲得、透過如本發明的方法可獲得，或是為如本發明的方法之產物。
亦提供T細胞族群於治療或預防如本文所述之疾病或障礙的方法之用途。
那就是說，本發明提供對一病毒專一的T細胞族群於治療或預防一疾病或障礙的方法，其中該T細胞族群係透過如本發明的方法獲得、透過如本發明的方法可獲得，或是為如本發明的方法之產物。
亦提供一種治療或預防一主體的疾病或障礙之方法，其包含投與對一病毒專一的T細胞族群至一主體，其中該T細胞族群係透過如本發明的方法獲得、透過如本發明的方法可獲得，或是為如本發明的方法之產物。
亦提供如本發明之T細胞族群或藥學組成物於製造供用於治療或預防一疾病或障礙的藥物或疫苗之用途，其中該T細胞族群係透過如本發明的方法獲得、透過如本發明的方法可獲得，或是為如本發明的方法之產物。藥學上有用的組成物及藥物。
依據本發明的方法產生/增生的病毒專一性T細胞可以予以調配供臨床使用，以及可以包含一種藥學上可接受的載劑、稀釋劑、賦形劑或佐劑
依據本發明，亦提供用於生產藥學上有用的組成物之方法，其包含依據本發明的方法產生/增生的病毒專一性T細胞，此等生產方法可以包含選自於下列的一或多個步驟：依據本發明的方法來產生/增生病毒專一性T細胞族群；及/或混合依據本發明的方法產生/增生的病毒專一性T細胞與一種藥學上可接受的載劑、佐劑、賦形劑或稀釋劑。
於一態樣中，本發明提供一種製備藥學組成 物、藥物或是疫苗的方法，該方法包含依據本發明的方法產生或增生對一病毒專一的T細胞族群，以及混合獲得的細胞與一種藥學上可接受的載劑、佐劑、賦形劑或稀釋劑。
本發明亦提供藥學組成物，其包含如本發明之T細胞族群，以及一種藥學上可接受的載劑、佐劑、賦形劑或稀釋劑。該T細胞族群能透過如本發明的方法獲得、透過如本發明的方法可獲得，或是為如本發明的方法之產物。
本發明提供如本發明之藥學組成物，供治療或預防疾病或障礙的方法使用。
亦提供一種治療或預防一主體的疾病或障礙之方法，其包含投與如本發明之藥學組成物至一主體。
亦提供如本發明之藥學組成物，於製造供用於治療或預防一疾病或障礙的藥物或疫苗之用途。
主體
待治療的主體可以為任何動物或人類。主體較佳為哺乳動物，更佳為人類。主體可以為非人類哺乳動物，但更佳為人類。主體可以為男性或女性。主體可以為一病人。
一主體可以業已診斷為帶有需要治療的疾病或病況，可以為懷疑具有此一疾病或病況，或是可以為處於發展此一疾病或病況中的風險。
套組
於本發明的一態樣中，提供一種部件之套組 (kit of parts)。該部件之套組包含如本發明之T細胞族群，或如本發明之藥學組成物。
在一些具體例中，該套組可包括使用T細胞族群或藥學組成物以治療或預防如本文所述之疾病或障礙的使用說明。
在一些具體例中，一套組可包含一容器，其含有調配用於投與一定量由本發明的方法獲得的T細胞至一主體(譬如，透過與一種合適的載劑、賦形劑、稀釋劑或佐劑混合)，較佳透過灌注(infusion)，更佳為透過自體的授受性細胞免疫療法方法予以灌注投與。該套組可以維持於預定的溫度下，例如低於大約4℃，低於大約-2℃或是低於大約-50℃。該套組可進一步包含儲存及/或運送套組及/或T細胞投與之使用說明。
***
本發明包括所述之態樣與較佳特徵之組合，但是排除明確不允許或明確避免的這樣的組合。
本文中使用之節標題係僅僅為了編制的目的以及不被解釋為限制所說明的主題。
現在將參照附圖來闡釋本發明之態樣與具體例，以作為例證。進一步的態樣與具體例對於本技藝中具有技術者會是明顯的。本文中提及的全部文件係併入本文中以作為參考資料。
貫穿本說明包括隨後的申請專利範圍，除非上下文需要，否則用字「包含(comprise)」及變體，例如 「包含(comprises)」及「包含(comprising)」，會瞭解到是暗示含括所述的事物或步驟或是事物或步驟組，但是不排除任何其他的事物或步驟或是事物或步驟組。
必須指出的是，當使用於本說明書及附隨的申請專利範圍中，除非上下文明確表指示，否則單數形式「一(a)」、「一(an)」，以及「該」包括複數的指示對象。於本文中範圍可以表達為由「大約」一特定的數值及/或至「大約」另一特定的數值。當表達此一範圍時，另一具體例會含括由該一特定的數值及/或至另一特定的數值。同樣地，當用先行詞「大約」、以近似值表達數值時，會瞭解到該特定的數值構成另一具體例。
現在將參照附圖來討論闡釋本發明原理之具體例與實驗，其中：圖1A及圖1B.顯示條件培養基對於得自於(1A)供給者1及(1B)供給者2與3的細胞之EBV-專一性T細胞增生功效的圖。將漸增百分率的條件培養基添加至培養培養基。在與LCL共培養一週之後，增生的T細胞數目係與原始播種的(seeded)T細胞數目作比較。
圖2.顯示於一種Grex-100生物反應器內，條件培養基對於得自於3位供給者的細胞之EBV-專一性T細胞增生功效的圖。將漸增百分率的條件培養基添加至培養培養基。在與LCL共培養一週之後，增生的T細胞數目係與原始播種的T細胞數目作比較。
圖3.顯示透過EBV-專一性T細胞進行之EBV-轉形的LCL細胞之專一性致死的圖。於0%及30%條件培養基內培養所增生的T細胞係以不同的效應子/靶定細胞比率、與LCLs共培養，並且在4小時之後測量LCL細胞之專一性溶解作用。
圖4.顯示存在不同百分率的條件培養基，對於Grex-100生物反應器培養器皿內培養之EBV-專一性CTLs之增生倍數功效的圖。
實施例
於下列實施例中，本發明人說明EBV-專一性T細胞之增生技術，其包括在條件培養基存在下培養。本發明人說明判定培養內含括的條件培養基之最適百分率的實驗，以及確認增生的CTLs之細胞毒性活性的實驗。
實施例1：條件培養基的最適百分率
為了判定T細胞增生之條件培養基的最適百分率，於24孔平盤內執行之T細胞增生方面，包含45% RPMI 1640、45%克里克培養基、10% FBS、2mM左旋麩醯胺酸之細胞培養培養基，係與得自於T細胞及LCL細胞共培養之10%、20%、30%、40%、50%，以及60%的條件培養基混合。
在與LCL細胞共培養一週後，計數T細胞的數目且與播種的細胞之細胞數目作比較，以判定增生倍數。
圖1A中顯示預期的增生結果。以含括存在條 件培養基下予以培養之方法，T細胞增生的速率較快。如B的方法步驟內最大的增生倍數，條件培養基的最適百分率預期為20-30%的條件培養基。
得自於二位另外的、不同的供給者(供給者2及3)的細胞執行同樣的實驗。預期結果會與供給者1相似，且於20-30%的條件培養基觀察到最大的T細胞增生(見圖1B)。
因為大規模的T細胞增生係於生物反應器，例如，舉例而言Grex-100培養器皿內執行，所以進一步調查生物反應器培養內最佳化百分率的條件培養基。為了說明的目的：細胞係以1 x 106細胞/ml的細胞密度，於具有不同百分率的條件培養基之200ml培養基之內培養：
圖2中顯示T細胞增生預期的結果。預期到條件培養基之最適百分率將為20-30%，跨越不同的供給者是一致的。
實施例2：EBV-轉形的LCLs之產生及EBV-專一性CTLs之增生
得自於EBV-陽性NPC的病人之末梢血液(40-60mL)係使用來產生EBV-轉形的類淋巴母細胞B-細胞株(LCLs)及EBV-專一性T細胞二者。
EBV-轉形的LCLs之產生
簡言之，在LCL產生方面，15 x 106末梢血液單核細胞(PBMCs)係在1μg/mL環孢素A(Sandoz，Vienna，Austria)存在下、以濃縮的B95-8培養懸浮液予以孵育，以建立LCL。
LCLs在用於刺激(在刺激那天)之前，以60Gy來照射。
EBV-專一性T細胞之增生
比較二種不同的方法增生之EBV-專一性T細胞。
於二種方法中，第一次刺激執行如下：
■使60 x 106 PBMCs再懸浮於包含45% RPMI 1640、45%克里克培養基、10% FBS、2mM左旋麩醯胺酸之細胞培養培養基之內，以及執行活細胞計數。
■PBMCs係以2 x 106細胞/孔播種至24孔平盤的孔內。
■PBMCs係以40：1之反應者對刺激者比、經照射、無環鳥糞核苷(Acyclovir)處理的自體LCLs予以刺激。
■細胞係於5% CO2的氛圍、37℃下培養歷時9-12天。
於二種方法中，第二次刺激繼而執行如下：
■在第一次刺激結束時收集細胞，執行活細胞計數，以及使細胞以1 x 106細胞/ml再懸浮於細胞培養培養基之 內，該細胞培養培養基包含45% RPMI 1640、45%克里克培養基、10% FBS、2mM左旋麩醯胺酸。
■將1ml的細胞添加至24孔平盤的孔內，或是細胞懸浮液以15 x 106細胞/GRex10的濃度添加至生物反應器內，於包含45% RPMI 1640、45%克里克培養基、10% FBS、2mM左旋麩醯胺酸之細胞培養培養基之內，以及細胞係以4：1之反應者對刺激者比、自體照射的LCLs予以再刺激。
■細胞予以培養歷時3-4天，然後使細胞再懸浮於新鮮的細胞培養培養基之內，其包含45% RPMI 1640、45%克里克培養基、10% FBS、2mM左旋麩醯胺酸。添加最終濃度40-100IU/ml之重組型人類IL-2(rhIL-2，Proleukin；Chiron Emeryville，CA))至細胞培養。
後續的刺激
於第二次刺激之後，收集細胞，執行活細胞計數。保留培養培養基(亦即，條件培養基)供以下的方法B使用。繼而細胞以1 x 106細胞/ml(於24孔平盤)或是0.5 x 106細胞/ml(於GRex10)再懸浮於細胞培養培養基之內，該細胞培養培養基包含45% RPMI 1640、45%克里克培養基、10% FBS、2mM左旋麩醯胺酸，以及以反應者對刺激者比4：1之自體照射的LCLs予以再刺激。一旦達到200 x 106細胞，細胞繼而依據方法步驟A或方法步驟B予以再刺激：
在依據方法步驟A或方法步驟B之刺激步驟結束時收集細胞，且依據相同的方法步驟A或B再刺激。
關於依據方法步驟B之再刺激方面，所使用的條件培養基係來自於依據B之先前刺激。
實施例3：效能測試
以包括條件培養基存在下培養的方法所增生的CTLs之細胞毒性活性，與沒有條件培養基存在下培養增生的CTLs之細胞毒性活性作比較。
以不同的效應子/靶定細胞比率(E/T比)將 0%及30%的條件培養基增生的T細胞添加至LCL細胞，並且在4小時之後，測量LCL細胞之專一性溶解作用。預期在0%及30%的條件培養基內培養增生的細胞之專一性溶解作用差異非常小或是沒有差異(圖3)。
預期以增高速率增生的CTLs會保留專一性殺死EBV-轉形的LCL細胞的能力。
實施例4：使用條件培養基進行之艾司坦氏-巴爾氏病毒專一性T細胞(EB-VSTs)生長之最佳化
下列實施例說明最大的CTL增生之再刺激作用所含括的最適百分率條件培養基之調查研究。
第1週：
‧解凍類淋巴母細胞株(LCL)樣本且予以培養歷時1週
‧最低限度需要10 x 106 LCLs以起始實驗
第2週：
‧使源自不同的病人之冷凍的EB-VST03細胞解凍、再懸浮於細胞培養培養基之內，該細胞培養培養基包含45% RPMI 1640、45%克里克培養基、10% FBS、2mM左旋麩醯胺酸，以及執行活細胞計數
o依據實施例2透過PMBCs培養來獲得EB-VST03細胞，其中PBMCs進行第一次及第二次刺激，然後依據方法步驟A(亦即，缺乏條件培養基)進行第三次刺激，在此之後收穫細胞且予以冷凍
‧EB-VST03細胞係以1 x 106細胞/孔予以播種於24-孔平盤
‧將細胞懸浮液添加至生物反應器(15 x 106細胞/G-Rex 10)，其內有含有45% RPMI 1640、45%克里克培養基、10% FBS、2mM左旋麩醯胺酸之細胞培養培養基，以及以反應者：刺激者比4：1之自體照射的LCLs予以再刺激。
‧細胞培養3-4天，然後再懸浮於細胞培養培養基之內，該細胞培養培養基包含45% RPMI 1640、45%克里克培養基、10% FBS及2mM左旋麩醯胺酸。
‧繼而添加最終濃度40-100IU/ml之IL-2至細胞培養。
第3週起：
‧收穫細胞、匯集、計數並且如上之第2週所述予以刺激直到有120 x 106細胞為止。
‧繼而將100 x 106細胞播種至G-Rex 100燒瓶內，其內有包含45% RPMI 1640、45%克里克培養基、10% FBS、2mM左旋麩醯胺酸之細胞培養培養基，以及不同百分率的條件培養基(得自於先前的刺激培養結束時之培養)，如下：
‧細胞繼而於5% CO2的氛圍、37℃下培養歷時3-4天。
‧繼而添加最終濃度40-100IU/ml之IL-2至細胞培養。
‧在一週之後，收穫細胞以及執行活細胞計數。
觀察到所有的成活力(viabilities)均大於70%。結果顯示於圖4中。
發現到，於包含45% RPMI 1640、45%克里克培養基、10% FBS、2mM左旋麩醯胺酸之細胞培養培養基及高達15%的條件培養基之內的培養，提供最高的EB-VSTs產率，其與使用包含45% RPMI 1640、45%克里克培養基、10% FBS、2mM左旋麩醯胺酸之100%細胞培養培養基相比，EB-VST的比率高~20%。
當使用較高百分率(亦即，30%、45%)的條件培養基時，EB-VSTs之增生倍數降低。
觀察到樣本3-EB-VST的增生倍數並不如樣本1 &樣本2顯著。此可能是因為樣本3 EBV-VST進行額外的刺激週期，其結果是細胞生長的壓力過大。
得到的結論是15%的條件培養基與85%新鮮的培養培養基(完全的克里克培養基)之組合生產出最高的EB-VST產率，亦即與使用100%新鮮的培養培養基相比，較高的EB-VST增生速率。
雖然條件培養基對於EB-VST生長的功效於不同的個體間各不相同，但是觀察到在任何情況下，使用15%的條件培養基會提供最佳的增生速率。

Claims (46)

  1. 一種用於產生或增生對一病毒專一的T細胞族群的方法，該方法包含藉由在呈現該病毒的一胜肽之抗原呈現細胞(APCs)存在下培養來刺激T細胞，其中至少10%的培養該等細胞之培養基為條件培養基，其係得自於包含T細胞及呈現該病毒的一胜肽之APCs的刺激培養物。
  2. 一種用於加速一病毒專一性T細胞族群增生速率的方法，該方法包含：藉由在呈現該病毒的一胜肽之抗原呈現細胞(APCs)存在下培養來刺激T細胞，其中至少10%的培養該等細胞之培養基為條件培養基，其係得自於包含T細胞及呈現該病毒的一胜肽之APCs的刺激培養物。
  3. 一種用於產生或增生對一病毒專一的T細胞族群的方法，該方法包含：(i)刺激T細胞，其係藉由在呈現該病毒的一胜肽之抗原呈現細胞(APCs)存在下來培養；以及(ii)再刺激該等T細胞，其係藉由在呈現該病毒的一胜肽之APCs存在下來培養，其中至少10%的培養該等細胞之培養基為條件培養基，其係得自於具T細胞及呈現該病毒的一胜肽之APCs的刺激培養物。
  4. 一種用於產生或增生對一病毒專一的T細胞族群的方法，該方法包含：(i)刺激T細胞，其係藉由在呈現該病毒的一胜肽之抗原呈現細胞(APCs)存在下來培養； (ii)收集由步驟(i)獲得的該等細胞，以及；(iii)再刺激該等T細胞，其係藉由在呈現該病毒的一胜肽之APCs存在下來培養，其中至少10%的培養該等細胞之培養基為條件培養基，其係得自於具T細胞及呈現該病毒的一胜肽之APCs的刺激培養物。
  5. 一種用於產生或增生對一病毒專一的T細胞族群的方法，其中該方法包含：(i)刺激T細胞，其係藉由在呈現該病毒的一胜肽之抗原呈現細胞(APCs)存在下來培養；(ii)收集由步驟(i)獲得的該等細胞；(iii)再刺激該等T細胞，其係藉由在呈現該病毒的一胜肽之APCs存在下來培養；(iv)收集由步驟(iii)獲得的該等細胞；以及(v)再刺激該等T細胞，其係藉由在呈現該病毒的一胜肽之APCs存在下來培養，其中至少10%的培養該等細胞之培養基為條件培養基，其係得自於具T細胞及呈現該病毒的一胜肽之APCs的刺激培養物。
  6. 如請求項5之方法，其中該條件培養基係得自於步驟(iii)的刺激培養物。
  7. 如請求項1至6中任一項之方法，其中該條件培養基係得自於1至8天的培養期間後之具T細胞及呈現該病毒的一胜肽之APCs的刺激培養物。
  8. 如請求項1至7中任一項之方法，其中該條件培養基係得自於反應者：刺激者比為1：1至10：1之具T細 胞及APCs的刺激培養物。
  9. 如請求項1至8中任一項之方法，其中呈現該病毒的一胜肽之該APCs為經艾司坦氏-巴爾氏病毒(Epstein-Barr Virus)(EBV)轉形的類淋巴母細胞株(lymphoblastoid cell line)(LCL)細胞。
  10. 如請求項1至9中任一項之方法，其中該至少10%的條件培養基為20至40%的條件培養基。
  11. 一種用於產生或增生艾司坦氏-巴爾氏病毒(Epstein-Barr Virus)(EBV)專一性T細胞族群的方法，該方法包含刺激T細胞，其係藉由在經EBV-轉形的LCLs存在下，以2：1至7：1之反應者對刺激者比，於培養基內培養歷時1至8天的期間，該培養基包含：(a)細胞培養培養基，其包含40-50% RPMI-1640培養基、40-50%克里克培養基(Click’s medium)、5-20%胎牛血清(FBS)及1-5毫莫耳(mM)左旋麩醯胺酸(L-glutamine)，(b)透過一方法獲得之至少10%的條件培養基，該方法包含：刺激T細胞，其係藉由在經EBV-轉形的LCLs存在下，以2：1至7：1之反應者對刺激者比，於細胞培養培養基內培養歷時1至8天的期間，該細胞培養培養基包含40-50% RPMI-1640培養基、40-50%克里克培養基、5-20% FBS及1-5mM左旋麩醯胺酸，及最終濃度為10-200國際單位/毫升(IU/ml)之添加的IL-2，以及(c)最終濃度為10-200IU/ml之添加的IL-2。
  12. 一種用於加速艾司坦氏-巴爾氏病毒(EBV)專一性T細胞族群增生速率的方法，該方法包含刺激T細胞，其係藉由在經EBV-轉形的LCLs存在下，以2：1至7：1之反應者對刺激者比，於培養基內培養歷時1至8天的期間，該培養基包含：(a)細胞培養培養基，其包含40-50% RPMI-1640培養基、40-50%克里克培養基、5-20% FBS及1-5mM左旋麩醯胺酸，(b)透過一方法獲得之至少10%的條件培養基，該方法包含：刺激T細胞，其係藉由在經EBV-轉形的LCLs存在下，以2：1至7：1之反應者對刺激者比，於細胞培養培養基內培養歷時1至8天的期間，該細胞培養培養基包含40-50% RPMI-1640培養基、40-50%克里克培養基、5-20% FBS及1-5mM左旋麩醯胺酸，及最終濃度為10-200IU/ml之添加的IL-2，以及(c)最終濃度為10-200IU/ml之添加的IL-2。
  13. 一種用於產生或增生艾司坦氏-巴爾氏病毒(EBV)專一性T細胞族群的方法，該方法包含：(i)刺激T細胞，其係藉由在經EBV-轉形的LCLs存在下，以10：1至80：1之反應者對刺激者比，於細胞培養培養基內培養PBMCs歷時7至14天的期間，該細胞培養培養基包含40-50% RPMI-1640培養基、40-50%克里克培養基、5-20% FBS及1-5mM左旋麩醯胺酸；(ii)收集由步驟(i)獲得的該等細胞； (iii)再刺激該等T細胞，其係藉由在經EBV-轉形的LCLs存在下，以2：1至7：1之反應者對刺激者比，於細胞培養培養基內培養於步驟(ii)收集的細胞歷時1至8天的期間，該細胞培養培養基包含40-50% RPMI-1640培養基、40-50%克里克培養基、5-20% FBS及1-5mM左旋麩醯胺酸，及最終濃度為10-200IU/ml之添加的IL-2；(iv)收集由步驟(iii)獲得的該等細胞，以及；(v)再刺激該等T細胞，其係藉由在經EBV-轉形的(EBV-transformed)存在下，以2：1至7：1之反應者對刺激者比，於培養基內培養步驟(iv)收集的細胞歷時1至8天的期間，該培養基包含：(a)細胞培養培養基，其包含40-50% RPMI-1640培養基、40-50%克里克培養基、5-20% FBS及1-5mM左旋麩醯胺酸，(b)於步驟(iii)的終點獲得之至少10%的條件培養基，以及(c)最終濃度為10-200(如，40-100)IU/ml之添加的IL-2。
  14. 如請求項13之方法，其中該方法額外包含：(vi)收集由步驟(v)獲得的該等細胞，以及；(vii)再刺激該等T細胞，其係藉由在經EBV-轉形的LCLs存在下，以2：1至7：1之反應者對刺激者比，於培養基內培養於步驟(vi)收集的細胞歷時1至8天的期間，該培養基包含：(a)細胞培養培養基，其包含40-50% RPMI-1640培養基、40-50%克里克培養基、5-20% FBS及1-5mM左旋麩醯胺酸，(b)於步驟(v)的終點獲得之至少10%的條件 培養基，以及(c)最終濃度為10-200(如，40-100)IU/ml之添加的IL-2。
  15. 如請求項13或14之方法，其中該方法包含下列額外步驟：收集細胞，以及再刺激該等T細胞，其係藉由在經EBV-轉形的LCLs(如，經照射之經EBV-轉形的LCLs)存在下，以2：1至7：1之反應者對刺激者比，於培養基內培養該等收集的細胞歷時1至8天的期間，該培養基包含：(a)細胞培養培養基，其包含40-50% RPMI-1640培養基、40-50%克里克培養基、5-20% FBS及1-5mM左旋麩醯胺酸，(b)於先前刺激步驟的終點獲得之至少10%的條件培養基，以及(c)最終濃度為10-200IU/ml之添加的IL-2。
  16. 一種治療一個體的癌症之方法，該方法包含：(1)從一個體單離T細胞；(2)透過一方法來產生或增生對一病毒專一的T細胞族群，該方法包含：藉由在呈現該病毒的一胜肽之抗原呈現細胞(APCs)存在下培養來刺激T細胞，其中10至25%的培養該等細胞之培養基為條件培養基，該條件培養基係得自於包含T細胞及呈現該病毒的一胜肽之APCs的刺激培養物；以及(3)投與該產生或增生的T細胞族群至一個體。
  17. 如請求項16之方法，其中該條件培養基係得自於一刺激培養物，該刺激培養物包含T細胞及呈現該病毒的一胜肽之APCs，其以2：1至7：1之反應者：刺激者比 歷時1至8天的期間。
  18. 如請求項16或請求項17之方法，其中藉由在呈現該病毒的一胜肽之APCs存在下培養來刺激T細胞包含在經EBV-轉形的LCLs存在下，以2：1至7：1之反應者對刺激者比，於培養基內培養歷時1至8天的期間，該培養基包含：(a)細胞培養培養基，其包含40-50% RPMI-1640培養基、40-50%克里克培養基、5-20% FBS及1-5mM左旋麩醯胺酸，(b)10%至25%的條件培養基，其係透過一方法獲得，該方法包含：刺激T細胞，其係藉由在經EBV-轉形的LCLs存在下，以2：1至7：1之反應者對刺激者比，於細胞培養培養基內培養歷時1至8天的期間，該細胞培養培養基包含40-50% RPMI-1640培養基、40-50%克里克培養基、5-20% FBS及1-5mM左旋麩醯胺酸，及最終濃度為10-200IU/ml之添加的IL-2，以及(c)最終濃度為10-200IU/ml之添加的IL-2。
  19. 如請求項16或請求項17之方法，其中呈現該病毒的一胜肽之該APCs為經EBV轉形的類淋巴母細胞株(LCL)細胞。
  20. 如請求項16至19中任一項之方法，其中該癌症為一EBV陽性癌症。
  21. 如請求項16至20中任一項之方法，其中該癌症為EBV陽性鼻咽癌(NPC)。
  22. 如請求項16至21中任一項之方法，其中大約15%的培養該等細胞之培養基為條件培養基。
  23. 如請求項16至22中任一項之方法，其中步驟(2)額外地包含：收集該產生或增生的T細胞族群。
  24. 一種治療一個體的癌症之方法，該方法包含：(1)從一個體單離T細胞；(2)透過一方法來產生或增生對一病毒專一的T細胞族群，該方法包含：藉由在呈現該病毒的一胜肽之抗原呈現細胞(APCs)存在下培養來刺激T細胞，其中10至25%的培養該等細胞之培養基為條件培養基，其中該條件培養基係於得自於一刺激培養物，該刺激培養物包含T細胞及呈現該病毒的一胜肽之APCs，其以2：1至7：1之反應者：刺激者比歷時1至8天的期間；以及(3)投與該產生或增生的T細胞族群至一個體。
  25. 如請求項24之方法，其中藉由在呈現該病毒的一胜肽之APCs存在下培養來刺激T細胞包含在經EBV-轉形的LCLs存在下，以2：1至7：1之反應者對刺激者比，於培養基內培養歷時1至8天的期間，該培養基包含：(a)細胞培養培養基，其包含40-50% RPMI-1640培養基、40-50%克里克培養基、5-20% FBS及1-5mM左旋麩醯胺酸，(b)10%至25%的條件培養基，其係透過一方法獲得， 該方法包含：刺激T細胞，其係藉由在經EBV-轉形的LCLs存在下，以2：1至7：1之反應者對刺激者比，於細胞培養培養基內培養歷時1至8天的期間，該細胞培養培養基包含40-50% RPMI-1640培養基、40-50%克里克培養基、5-20% FBS及1-5mM左旋麩醯胺酸，及最終濃度為10-200IU/ml之添加的IL-2，以及(c)最終濃度為10-200IU/ml之添加的IL-2。
  26. 如請求項24或請求項25之方法，其中該癌症為一EBV陽性癌症。
  27. 如請求項24至26中任一項之方法，其中該癌症為EBV陽性鼻咽癌(NPC)。
  28. 如請求項24至27中任一項之方法，其中該10%至25%的條件培養基為大約15%的條件培養基。
  29. 如請求項24至28中任一項之方法，其中步驟(2)額外地包含：收集該產生或增生的T細胞族群。
  30. 一種用於產生或增生對一病毒專一的T細胞族群的方法，該方法包含藉由在呈現該病毒的一胜肽之抗原呈現細胞(APCs)存在下培養來刺激T細胞，其中10%至25%的培養該等細胞之培養基為條件培養基，該條件培養基係於得自於包含T細胞及呈現該病毒的一胜肽之APCs之刺激培養物。
  31. 如請求項30之方法，其中該條件培養基係得自於一刺激培養物，該刺激培養物包含T細胞及呈現該 病毒的一胜肽之APCs，其以2：1至7：1之反應者：刺激者比歷時1至8天的期間。
  32. 如請求項30或請求項31之方法，其中藉由在呈現該病毒的一胜肽之APCs存在下培養來刺激T細胞包含在經EBV-轉形的LCLs存在下，以2：1至7：1之反應者對刺激者比，於培養基內培養歷時1至8天的期間，該培養基包含：(a)細胞培養培養基，其包含40-50% RPMI-1640培養基、40-50%克里克培養基、5-20% FBS及1-5mM左旋麩醯胺酸，(b)10%至25%的條件培養基，其係透過一方法獲得，該方法包含：刺激T細胞，其係藉由在經EBV-轉形的LCLs存在下，以2：1至7：1之反應者對刺激者比，於細胞培養培養基內培養歷時1至8天的期間，該細胞培養培養基包含40-50% RPMI-1640培養基、40-50%克里克培養基、5-20% FBS及1-5mM左旋麩醯胺酸，及最終濃度為10-200IU/ml之添加的IL-2，以及(c)最終濃度為10-200IU/ml之添加的IL-2。
  33. 如請求項30至或請求項31之方法，其中呈現該病毒的一胜肽之該APCs為經EBV轉形的類淋巴母細胞株(LCL)細胞。
  34. 如請求項30至33中任一項之方法，其中該10至25%的條件培養基為大約15%的條件培養基。
  35. 如請求項30至34中任一項之方法，其中該 方法額外地包含：收集該產生或增生的T細胞族群。
  36. 如請求項30至34中任一項之方法，其中該方法額外地包含：混合該產生或增生的T細胞族群與一藥學上可接受的載劑、佐劑、賦形劑或稀釋劑。
  37. 一種對一病毒專一的T細胞族群，其中該T細胞族群係透過如請求項1至15或30至36中任一項之方法獲得、透過如請求項1至15或30至36中任一項之方法可獲得，或是為如請求項1至15或30至36中任一項之方法的產物。
  38. 一種藥學組成物，其包含如請求項37之T細胞族群，以及一藥學上可接受的載劑、佐劑、賦形劑或稀釋劑。
  39. 如請求項37之T細胞族群或是如請求項38之藥學組成物，其供使用於治療或預防一疾病或障礙。
  40. 一種如請求項37之T細胞族群或是如請求項38之藥學組成物於製造供用於治療或預防一疾病或障礙的藥物或疫苗之用途。
  41. 一種治療或預防一個體的疾病或障礙之方法，其包含投與治療或預防有效量之如請求項37之T細胞族群或是如請求項38之藥學組成物至一個體。
  42. 如請求項39之供使用的T細胞族群或是藥學組成物、如請求項40之用途，或是如請求項41之方法， 其中該疾病或障礙係由於該T細胞具專一性的該病毒之感染所造成或是惡化，或者該T細胞具專一性的該病毒之感染為該疾病或障礙之風險因子。
  43. 如請求項39至42中任一項之供使用的T細胞族群或藥學組成物、用途或是方法，其中該疾病或障礙為癌症。
  44. 如請求項43之供使用的T細胞族群或是藥學組成物、用途或是方法，其中該癌症為一EBV陽性癌症。
  45. 如請求項43或請求項44之供使用的T細胞族群或是藥學組成物、用途或是方法，其中該癌症為一EBV陽性鼻咽癌(NPC)。
  46. 一種部件之套組(kit of parts)，其包含預定量之如請求項37之T細胞族群或是如請求項38之藥學組成物。
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