CN102099055A - B7家族成员zB7H6及相关的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种新鉴定的B7家族成员zB7H6，它发挥NK细胞触发受体NKp30的反受体的功能。本发明还公开了基于zB7H6与NKp30的相互作用调节NKp30介导的NK细胞活性的方法和组合物，以及相关的筛选方法。本发明进一步公开了抗zB7H6抗体以及包含与治疗剂缀合的抗zB7H6抗体的抗体-药物缀合物，包括使用这类抗体和抗体-药物缀合物发挥抗表达zB7H6的细胞的治疗效果的方法。

Description

B7家族成员zB7H6及相关的组合物和方法
背景技术
B7家族
阳性和阴性共刺激信号在调节淋巴细胞活性中起到关键作用，介导这些信号的分子已被证明是免疫调节试剂的有效靶。例如，当与抗原呈递细胞(APC)表面上的B7-1或B7-2相互作用的时候，原型T细胞共刺激分子CD28会释放信号促进响应于T细胞受体(TcR)结合的T细胞增殖和分化，而CD28同系的细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)介导对T细胞增殖和效应物功能的抑制(参见Chambers et al.，Ann.Rev.Immunol.，19：565-594，2001；Egen et al.，Nature Immunol.，3：611-618，2002)。
与B7家族有同源性的数个新分子已被发现(Abbas et al.，Nat.Med.，5：1345-6，1999；Coyle et al.，Nat.Immunol.，2：203-9，2001；Carreno et al.，Annu.Rev.Immunol.，20：29-53，2002；Liang et al.，Curr.Opin.Immunol.，14：384-90，2002)，它们在淋巴细胞活化中的功能正开始被阐明。这些新的共刺激反受体包括B7h2、PD-L1、PD-L2、B7-H3和B7-H4。
已知B7家族成员的表达大多局限于抗原呈递细胞。总之，这些研究已表明，B7家族成员是淋巴样细胞上的反受体，所述反受体与淋巴细胞上的同种受体相互作用，以提供在对细胞介导的免疫反应的调节中起关键作用的阳性或阴性共刺激信号。
因此，现有技术有这样的需求，即鉴定另外的B7家族成员、它们的反受体以及从它们衍生的具有淋巴细胞共刺激活性的分子。该需求主要是基于它们基本的生物学重要性以及能够影响它们活性的试剂的治疗前景。这类能够调节共刺激信号的试剂将在免疫反应的调节中有重要的应用，并且这类试剂也是所高度需要的。
NK细胞和NKp30
自然杀伤(NK)细胞是在免疫系统中有活性的淋巴细胞的一个亚群，并且代表人外周血中平均约15％的单核细胞。NK细胞最初在1971年被进行功能描述，这是通过观察到受到致命辐射的小鼠能够排斥异体移植物或者亲本株骨髓细胞(BMC)同种异体移植物实现的(参见Cudowicz andBennett，J.Exp.Med.134：83-102，1971；Cudowicz and Bennett，J.Exp.Med.135：1513-1528，1971)。Cudowicz和Bennett观察到，受辐照的F1杂种H-2-杂合小鼠(AxB)能够排斥亲本H-2-纯合BMC(A或B)。这种结果与经典的移植理论矛盾，在经典移植理论中移植抗原被认为是共显性遗传，并且后代必须对亲本的主要组织相容性复合体(MHC)决定子耐受(参见Cudowicz and Bennett，J.Exp.Med.134：83-102，1971)。导致该现象的细胞被发现是抗辐照的并且与淋巴细胞完全相同，这些细胞后来在1975年被通过它们的如下能力而表征，即以非MHC限制的方式在体外介导对肿瘤的自然杀伤(参见Herberman and Ortaldo，Science，214：24-30，1981；Ortaldo and Herberman，Annu.Rev.Immunol.2：359-394，1984；Trinchieri，Adv.Immunol.47：187-376，1989；Murphy et al.，J.Natl.Cancer Inst.85：1475-1482，1993)。NK细胞可单独介导骨髓移植排斥的特异性的其他证据出现于1987年，观察到不能形成T细胞和B细胞的患有严重联合免疫缺陷(SCID)的小鼠有正常的NK细胞功能(参见Murphyet al.，J.Exp.Med.165：1212-1217，1987)。
NK细胞如今被认为代表一个重要的先天免疫分支，并且在对肿瘤和病毒感染细胞的免疫监视中发挥主要功能。然而，除非被激活，否则NK细胞不会行使它们的正常功能，否则甚至当以足够数目存在的时候也不会行使其正常功能。实际上，NK细胞的活性降低与癌症和感染性疾病有关(参见Yamazaki et al.，Oncology Reports 9：359-363，2002；Rosenberg etal.，Cancer Research 51：5074-5079(suppl.)，1991；Britteenden et al.，Cancer 77：1226-1243，1996；U.S.Patent Nos.5,082,833 and 4,883,662)。相反，如上文指出的，NK细胞活性可介导BMC同种异体移植物的急性排斥。因此，NK细胞活性的水平似乎在免疫相关障碍中起到重要作用。
NK细胞活性通常受I类MHC分子与抑制性及活化受体之间的相互作用调节(参见，例如Barao and Murphy，BB&MT9：727-741，2003)。“自我缺失”假说最初是基于这样的结果，即没有I类MHC分子的肿瘤细胞对于NK细胞的杀伤是敏感的(参见Ljunggren and Karre，Immunol.Today 11：237-244，1990；Ohlen et al.，J.Immunol.145：52-58，1990)。研究人员另外观察到，人NK细胞可裂解I类缺陷爱泼斯坦-巴尔病毒病毒感染的B淋巴样干细胞系(Storkus et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：2361-2364，1989)。同时还发现，将I类基因转染至I类缺陷的靶细胞导致这些细胞部分地或完全地抗NK细胞介导的裂解(参见Storkus et al.，见上文；Shimizu and DeMars，Eur.J.Immunol.，19：447-451，1989)。然而，I类MHC对于抵御NK细胞介导的毒性的保护不总是必需的，并且I类MHC的识别不会总是抑制NK细胞的细胞裂解(Barao and Murphy，见上文)。在最近几年，多种I类MHC特异性激活受体已被鉴定。这些受体与治疗方法例如异体移植物BMT和癌症治疗相关(参见id)。
能够介导NK细胞针对I类MHC缺陷或阴性靶的细胞毒性的非I类MHC特异性激活受体部分地以被称为天然细胞毒性受体(NCR)的NK细胞特异性免疫球蛋白样分子的异源家族作为代表(参见例如，Moretta etal.，Annu.Rev.Immunol.19：197-223，2001；Diefenbach and Raulet，Immunol.Rev.，181：170-184，2001)。在无I类MHC表达(例如在肿瘤细胞或病毒感染的细胞上)的情况下，这些激活受体连接到NK细胞可触发靶细胞杀伤。一种这类激活受体为NKp30，它选择性地并组成性地在成熟的自然杀伤(NK)细胞上表达，并通过与CD3ζ及其他分子偶联进行信号传导(参见Barao and Murphy，见上文)。以前没有鉴定到NKp30结合的靶细胞配体。
这种由NK细胞先天识别的系统代表了在异体移植物骨髓移植(BMT)、癌症治疗或其他NK细胞相关障碍的治疗中临床应用的潜在强大工具(参见例如，Barao and Murphy，见上文)。例如，刺激或抑制NKp30的活化将可用于调节NK细胞活性并治疗与NK细胞活性有关的疾病或障碍。具体而言，通过触发NKp30对NK细胞活性的增强将可用于治疗以NK细胞活性不足为特征的疾病或障碍，例如癌症和感染疾病，而通过阻断NKp30对NK细胞活性的抑制将可用于治疗NK细胞介导的障碍，例如BMC同种异体移植物排斥。本发明提供了用于这些用途和其他用途的组合物和方法，通过本文的教导所述用途对于本领域技术人员将是显而易见的。
发明内容
在一个方面，本发明提供了一种分离的zB7H6多肽，包括多肽融合物，所述多肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列或者它的功能性变体或片段。例如，在一些实施方案中，本发明的zB7H6多肽是一种分离的可溶性多肽，包含与SEQ ID NO：2的第25-266号残基表示的氨基酸序列有至少90％或至少95％序列同一性的多肽片段，其中所述可溶性zB7H6多肽能够特异性结合于人NKp30。在具体的变化方案中，这类可溶性zB7H6多肽包含具有SEQ ID NO：2的第25-266或第1-266号残基表示的氨基酸序列的多肽片段。这类可溶性多肽可以是例如可溶性融合蛋白。合适的可溶性融合蛋白包括这样的多肽，所述多肽还包含免疫球蛋白重链恒定区(如Fc片段)例如IgG(如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)、IgM、IgE、IgA或IgD免疫球蛋白重链恒定区。其他合适的可溶性融合蛋白包括还包含VASP结构域的多肽。
在另一方面，本发明提供了编码如本文所述的zB7H6多肽的分离多核苷酸。因此，在一些实施方案中，本发明提供了一种包含编码可溶性zB7H6多肽的多核苷酸片段的分离多核苷酸，所述zB7H6多肽包含与SEQ ID NO：2的第25-266号残基表示的氨基酸序列有至少90％的序列同一性的多肽片段，并且其中所述zB7H6多肽能够特异性地结合于人NKp30。在一个具体的变化方案中，所述被编码的可溶性zB7H6多肽包含具有SEQ ID NO：2的第25-266号残基表示的氨基酸序列的多肽片段。所述被编码的可溶性多肽可以是例如可溶性融合蛋白，如包含免疫球蛋白重链恒定区或VASP结构域的可溶性融合蛋白。在一些变化方案中，编码所述zB7H6多肽的多核苷酸片段包含SEQ ID NO：1的第73-798或1-798号核苷酸。
在又一些方面中，本发明提供了包含以上多核苷酸的载体，包括表达载体。例如，在一些实施方案中，本发明提供了包含以下可操作地连接的元件的表达载体：一个转录起始区；一个编码可溶性zB7H6多肽的DNA片段，所述zB7H6多肽包含与SEQ ID NO：2的第25-266号残基表示的氨基酸序列有至少90％的序列同一性的多肽片段，其中所述zB7H6多肽能够特异性地结合于人NKp30；以及一个转录终止区。在另外的相关方面中，本发明提供了包含这类载体的宿主细胞，以及用于产生zB7H6多肽的方法。在一些实施方案中，一种产生可溶性zB7H6多肽的方法包括在所述多肽可表达的条件下培养包含以上表达载体的宿主细胞，并回收所表达的多肽。
本发明还提供了可特异性结合于本文所述zB7H6多肽的分离抗体。例如，在一些实施方案中，本发明提供了一种这样的抗体，所述抗体可特异性结合于具有SEQ ID NO：2的第25-266号残基表示的氨基酸序列的多肽片段。在一些这类变化方案中，所述抗体可抑制zB7H6与人NKp30的相互作用。特别合适的抗体为单克隆抗体，例如人或人源化的单克隆抗体。抗zB7H6抗体还包括单链抗体。
在又一方面中，本发明提供了用于调节人自然杀伤(NK)细胞活性的方法。一些这类的方法包括通过将人NK细胞与表达重组的膜结合zB7H6多肽的细胞相接触而提高NK细胞活性，所述zB7H6多肽包含与SEQ ID NO：2的第25-266号残基表示的氨基酸序列有至少90％的序列同一性的多肽片段，并且其中所述zB7H6多肽能够特异性地结合于人NKp30。在一种具体变化方案中，所述zB7H6多肽片段具有SEQ ID NO：2的第25-266号残基表示的氨基酸序列。
用于调节NK细胞活性的其他方法包括例如降低对表达zB7H6的细胞的NK细胞活性。这类方法一般包括，在存在人NK细胞的情况下，将表达功能性zB7H6的细胞与有效量的一种这样的抗体相接触，所述抗体可特异性结合具有SEQ ID NO：2的第25-266号残基表示的氨基酸序列的多肽片段，其中所述抗体可抑制zB7H6与人NKp30的相互作用。这类用于降低NK细胞活性的方法例如可用在骨髓细胞(BMC)同种异体移植物排斥的治疗中。因此，在一些变化方案中，本发明的方法包括通过以下方式在人受试者中治疗骨髓细胞(BMC)同种异体移植物排斥：以可有效抑制NK细胞活性并从而治疗所述急性BMC同种异体移植物排斥的量给予所述人受试者一种这样的抗体，所述抗体(a)可特异性抑制具有SEQ ID NO：2的第25-266号残基表示的氨基酸序列的多肽片段并且(b)可抑制zB7H6与人NKp30的相互作用。特别合适的抗体包括单克隆抗体(如人或人源化的单克隆抗体)。用于治疗BMC的抗体还可以是单链抗体。
在另一方面，本发明提供了用于诱导针对表达zB7H6的细胞的抗体依赖的细胞毒性(ADCC)的方法。这类方法一般包括将表达zB7H6的细胞与有效量的一种这样的抗体相接触，所述抗体可特异性结合于具有SEQ ID NO：2的第25-266号残基表示的氨基酸序列的多肽片段，其中所述接触在存在表达具有ADCC活性的Fc受体的NK细胞或CD8+T细胞的情况下进行，并且所述抗体包含能够结合Fc抗体的Fc区。合适的抗zB7H6抗体包括单克隆抗体(包括例如人或人源化的单克隆抗体)以及单链抗体。在一些变化方案中，所述Fc区为单链Fc(scFc)。所述表达zB7H6的细胞可以是例如表达zB7H6的癌细胞。可特别易于使用这些方法的靶向杀伤的zB7H6癌细胞包括例如结肠癌细胞、肝癌细胞、宫颈癌细胞、肺癌细胞、胰腺癌细胞、前列腺癌细胞、原血细胞性白血病细胞、B细胞性淋巴瘤细胞、单核细胞性淋巴瘤细胞、红白血病细胞、伯基特淋巴瘤(Burkitt′s lymphoma)细胞和慢性髓细胞性白血病细胞。
在又一方面中，本发明提供了用于诱导针对表达zB7H6的细胞的补体依赖性细胞毒性(CDC)的方法。这类方法一般包括将所述表达zB7H6的细胞与有效量的一种这样的抗体相接触，所述抗体可特异性结合于具有SEQ ID NO：2的第25-266号残基表示的氨基酸序列的多肽片段，其中所述接触在存在补体的情况下进行，并且其中所述抗zB7H6抗体包含具有CDC活性的Fc区。合适的抗zB7H6抗体包括单克隆抗体，包括例如人或人源化的单克隆抗体，以及单链抗体。在一些变化方案中，所述Fc区为单链Fc(scFc)。所述表达zB7H6的细胞可以为例如表达zB7H6的癌细胞。可特别适于使用这些方法的靶向杀伤的zB7H6癌细胞包括例如结肠癌细胞、肝癌细胞、宫颈癌细胞、肺癌细胞、胰腺癌细胞、前列腺癌细胞、原血细胞性白血病细胞、B细胞性淋巴瘤细胞、单核细胞性淋巴瘤细胞、红白血病细胞、伯基特淋巴瘤细胞和慢性髓细胞性白血病细胞。
在另一个相关的方面中，本发明提供了用于在受试者中治疗表达zB7H6的癌的方法。这类方法一般包括向所述受试者给予有效量的一种这样的抗体，所述抗体可特异性结合于具有SEQ ID NO：2的第25-266号残基表示的氨基酸序列的多肽片段，其中所述抗体包含具有ADCC和/或CDC活性的Fc区。合适的抗zB7H6抗体包括单克隆抗体(包括例如人或人源化的单克隆抗体)以及单链抗体。在一些变化方案中，所述Fc区为单链Fc(scFc)。可特别适于使用这类方法的靶向杀伤的表达zB7H6的癌包括例如结肠癌、肝癌、宫颈癌、肺癌、胰腺癌和前列腺癌，以及血液的癌症，例如原血细胞性白血病、B细胞性淋巴瘤、单核细胞性淋巴瘤、红白血病、伯基特淋巴瘤和慢性髓细胞性白血病。
在另一方面，本发明提供了一种抗体-药物缀合物，其包含可特异性结合于具有SEQ ID NO：2的第25-266号残基表示的氨基酸序列的多肽片段的抗体，其中所述抗体缀合于一种细胞毒性试剂。在一些实施方案中，所述可结合于SEQ ID NO：2的第25-266号残基的氨基酸序列的抗体是单克隆抗体，例如人或人源化的单克隆抗体。在另一些变化方案中，所述抗体是单链抗体。合适的细胞毒性试剂包括例如抗微管蛋白剂、DNA小沟结合剂、DNA小沟烷基化剂、倍癌霉素(duocarmycin)和嘌呤霉素(puromycin)。特别合适的抗微管蛋白剂包括例如多拉司他汀(dolastatin)、长春碱、鬼臼毒素、紫杉烷(taxane)、浆果赤霉素衍生物、隐藻素(cryptophysin)、美登类化合物(maytansinoid)和考布他汀(combretastatin)。
在如上文概述的抗体-药物缀合物的典型实施方案中，所述抗体经一个连接体缀合于所述细胞毒性试剂。特别合适的连接体为在细胞内条件下可切割的连接体，例如可被细胞内蛋白酶切割(如可被溶酶体蛋白酶或内体蛋白酶切割)的肽连接体。在细胞内条件下可切割的连接体可包括二肽连接体，例如缬氨酸-瓜氨酸连接体或苯丙氨酸-赖氨酸连接体。在另一些变化方案中，所述可切割的连接体在低于5.5的pH下是可水解的(如腙连接体)。在又一些变化方案中，所述可切割的连接体为二硫化物连接体。
本发明还包括包含如上文的抗体-药物缀合物和至少一种可药用载体的药物组合物。
在又一方面中，本发明提供了一种用于在包含所述表达zB7H6的细胞的细胞群中耗尽或抑制表达zB7H6的细胞生长的方法。通常，所述方法包括将所述表达zB7H6的细胞与有效量的如上文所述的抗体-药物缀合物相接触。在一些实施方案中，所述方法通过向受试者给予有效量的所述抗体-药物缀合物，在体内用于治疗所述受试者的表达zB7H6的癌。在具体的变化方案中，所述表达zB7H6的癌为结肠癌、肝癌、宫颈癌、肺癌、胰腺癌或前列腺癌。在又一些变化方案中，所述表达zB7H6的癌为原血细胞性白血病、B细胞性淋巴瘤、单核细胞性淋巴瘤、红白血病、伯基特淋巴瘤或慢性髓细胞性白血病。
本发明还提供了筛选zB7H6与NKp30相互作用的拮抗物或激动剂的方法。例如，在一些实施方案中，筛选zB7H6与NKp30相互作用的拮抗物的方法通常包括(a)在存在NKp30多肽的情况下，将一种试剂与zB7H6多肽相接触；(b)检测所述zB7H6多肽与所述NKp30多肽的相互作用的量度；以及(c)确定步骤(b)中测量的zB7H6/NKp30相互作用水平是否显著低于在无所述试剂的情况下测量的对照zB7H6和NKp30多肽的相互作用水平，这样如果zB7H6/NKp30相互作用水平较低，那么所述试剂被鉴定为zB7H6与NKp30相互作用的拮抗物。在另一些实施方案中，筛选zB7H6与NKp30相互作用的激动剂的方法通常包括(a)在存在NKp30多肽的情况下，将一种试剂与zB7H6多肽相接触；(b)检测所述zB7H6多肽与所述NKp30多肽的相互作用的量度；以及(c)确定步骤(b)中测量的zB7H6/NKp30相互作用水平是否显著高于在无所述试剂的情况下测量的对照zB7H6和NKp30多肽的相互作用水平，这样如果zB7H6/NKp30相互作用水平较高，那么所述试剂被鉴定为zB7H6与NKp30相互作用的激动剂。
附图说明
图1A和1B显示以可溶性NKp30融合蛋白对NK-92抗K562靶的细胞裂解活性的抑制。具体而言，可溶性NKp30/VASP A1683F抑制了NK-92细胞对K562靶的细胞裂解活性(参见图1A)。在一项独立细胞裂解测定实验中，所述实验使用不同浓度的可溶性NKp30/VASP(0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0和16.0μg/ml)加入含有效应物∶靶比例为9∶1的NK-92效应物和K562靶的孔中，可溶性NKp30以剂量依赖的方式抑制了NK-92细胞造成的裂解(参见图1B)。
图2显示可溶性NKp30融合蛋白对K562细胞的结合。将K562细胞在存在NKp30/mFc2融合蛋白的情况下孵育，然后以PE mIgG抗体进行二次标记并通过FACS进行PE染色分析。NKp30/mFc2结合于K562细胞(“非竞争性”)。该结合可被第二可溶性NKp30融合蛋白NKp30/VASP竞争，但不被对照VASP蛋白(“hzB7R1/Vasp”和“B7-DC/Vasp”)竞争。
图3显示可溶性NKp30融合蛋白与K562细胞结合，但不与BaF3细胞结合。以缀合于生物素的NKp30/mFc2探测K562细胞和BaF3细胞，然后以PE缀合的链亲和素进行二次标记。
图4和5A-5B显示K562细胞和生物素化NKp30/mFc2的交联。分析了四个样品——目的样品和3个阴性对照样品。所述目的样品是与生物素化NKp30/mFc2孵育的K562细胞。所述3个阴性对照样品是有NKp30的K562细胞和有或无NKp30的BaF3细胞。每个样品均与一种化学交联剂反应，以共价地连接任何蛋白-蛋白相互作用，并且将生物素化组分分离并通过链亲和素琼脂糖沉淀进行收集。将样品分开，进行同样的4-12％Nu-Page凝胶电泳。一个凝胶用于以链亲和素-HRP探测的蛋白质印迹(参见图4和5B)。对第二个凝胶进行考马斯染色(参见图5A)。图5A和5B示出了考马斯染色的凝胶和相应的平行蛋白质印迹。
图6显示蛋白DKFZP686I21167(后文称作zB7H6)的氨基酸序列，经LC-MS/MS鉴定的肽以黑体下划线给出。
图7显示蛋白DKFZP686I21167(后文称作zB7H6)的基因结构图。所述基因结构图为信号序列-2-IgV-2-IgC-2-TMD-0-LgEx，其中整数“2”和“0”表示外显子1至5之间的定相(phasing)，这些外显子分别编码前导序列(“S”)、IgV结构域、IgC结构域、跨膜结构域(“TMD”)和与Gag多蛋白有同源性的细胞内结构域。“SxYxxL”、“YxxQ”和“PxxPxxP”表示zB7H6的细胞内结构域中可能的信号传导基序(分别是ITIM基序、SH2结合基序和SH3结合基序)。
图8显示可溶性NKp30对表达全长zB7H6的BaF3细胞的结合。可溶性NKp30/VASP-A647结合于以人zB7H6表达载体电穿孔的细胞(参见图8A和8B-实线、虚线)，但未结合于包含空载体对照的细胞(参见图8A和8B-实线)。NKp30/VASP-A647染色未出现在存在100倍过量的未标记NKp30/VASP的情况下(参见图8A-虚线)，但出现在了存在100倍过量的未标记无关VASP蛋白的情况下(参见图8B-虚线)。
图9显示NK-92对P815细胞的裂解。在27∶1下至1∶1的效应物∶靶比例下，将NK-92细胞与P815细胞以3倍稀释一块培养。NK-92细胞未溶解野生型P815细胞或转染有两种非触发对照蛋白(hIgSF1和hB7H1)的P815细胞，而加入激活NKp30单克隆抗体触发了再定向的裂解。hCD86或zB7H6的转染触发了P815细胞的直接杀伤。
图10显示以可溶性NKp30和抗zB7H6抗体抑制NK-92对表达zB7H6的细胞的细胞裂解活性。在9∶1的效应物∶靶比例下，将NK-92细胞与K562细胞或P815细胞一块培养。将可溶形式的NKp30(NKp30/VASP)、对照VASP蛋白(B7H3/VASP)、zB7H6多克隆抗体和不相关的对照抗体加入至一些孔中。可溶性NKp30/VASP和抗zB7H6的多克隆抗体抑制了NK-92细胞对K562和P815zB7H6靶的细胞溶解活性，而VASP和抗体对照物无效应。
图11A-11C显示可溶性NKp30对K562、P815zB7H6和293F细胞的特异性结合。在不存在或存在100倍质量过量的NKp30/VASP、zB7H6/VASP或对照VASP蛋白(B7H3/VASP)的情况下，将K562、P815zB7H6和293F细胞通过FACS以生物素化NKp30/mFc2进行探测。在将细胞与生物素化NKp30/mFc2进行孵育以后，将细胞洗涤并以链亲和素-PE染色。然后，将细胞洗涤并在FACSCalibur上对PE染色进行分析。NKp30/mFc2-生物素结合于K562(11A)、293F(11B)和P815zB7H6(11C)细胞(“非竞争性”)。该结合可被NKp30/VASP和zB7H6/VASP竞争，但不被对照VASP蛋白(“B7H3/VASP”)竞争。
图12A-12D显示抗B7H6抗体对K562、P815zB7H6和293F细胞的特异性结合。将K562、P815、P815zB7H6和293F细胞以A647缀合形式的抗小鼠zB7H6多克隆抗体(E10607)进行探测。将细胞与人整个IgG一块孵育以阻断Fc受体，并在不存在或存在100倍质量过量的VASP蛋白(zB7H6/VASP或对照VASP蛋白B7H3/VASP)的情况下，将A647缀合的抗zB7H6(“抗zB7H6-A647”)抗体加入至细胞。在将细胞与抗体进行孵育以后，将细胞洗涤并在FACSCalibur上对APC染色进行分析。抗zB7H6抗体结合于K562(12B)、P815zB7H6(12C)和293F(12D)细胞，但不结合未转染的P815细胞(12A)(“非竞争性”)。该结合可被zB7H6/VASP竞争，但不被对照VASP蛋白(“B7H3/VASP”)竞争。
图13A-13C显示一些免疫球蛋白Fc多肽的氨基酸序列。氨基酸序列数目基于EU索引(Kabat et al.，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，US Department of Health and Human Services，NIH，Bethesda，1991)。所显示序列包括野生型人序列(“wt”；SEQ ID NO：29)以及5个变体序列，称为Fc-488(SEQ ID NO：30)、Fc4(SEQ ID NO：31)、Fc5(SEQ ID NO：32)、Fc6(SEQ ID NO：33)和Fc7(SEQ ID NO：34)。在正常情况下参与轻链恒定区(LC)和重链恒定区(HC)的二硫键形成的Cys残基被标出。“.”表示在该位置与野生型相同。＊＊＊表示终止密码子；C末端Lys残基已从Fc6上去除。铰链CH2和CH3结构域的边界被显示。
具体实施方式
Ⅰ.综述
本发明涉及对B7家族细胞受体的新成员zB7H6进行鉴定和表征，以及发现其结合于NKp30的能力。本发明的新型受体被命名为“zB7H6”，不同于以前已知的B7家族成员，例如B7-1、B7-2、B7h2、PD-L1、PD-L2、B7-H3和B7-H4。还提供了用于调节zB7H6介导的信号传导例如调节zB7H6和NKp30的天然相互作用的方法和组合物，具有用于免疫治疗的多种治疗应用，包括例如用于癌症和感染性疾病的免疫治疗。
编码人zB7H6的一个示例性核苷酸序列由SEQ ID NO：1提供；所编码的多肽显示于SEQ ID NO：2中。SEQ ID NO：2的zB7H6多肽包含大约242个氨基酸残基的细胞外结构域(SEQ ID NO：2的第25-266号残基)、大约18个氨基酸残基的跨膜结构域(SEQ ID NO：2的第267-284号残基)和大约158个氨基酸残基的细胞内结构域(SEQ ID NO：2的第285-454号残基)。zB7H6还具有大约117氨基酸残基的IgV结构域(SEQ ID NO：2的第25-141号残基)和大约97氨基酸残基的IgC结构域(SEQ ID NO：2的第142-238号残基)。在zB7H6的细胞内结构域中还有几个可能的信号传导基序，包括ITIM基序(SaYtpL，SEQ ID NO：2的第293-298号氨基酸残基)；SH2结合基序(YqlQ，SEQ ID NO：2的第229-332号氨基酸残基)；和SH3结合基序(PdaPilPvsP，SEQ ID NO：2的第418-427号氨基酸残基)。
基于B7家族基因作谱，将zB7H6鉴定为B7家族细胞受体的成员。所述基因结构图为信号序列-2-IgV-2-IgC-2-TMD-0-LgEx(参见图7)。该图的细胞外区域与B7基因结构模型相匹配，包含特征性的外显子模式，其中第一外显子编码前导序列，第二外显子编码IgV结构域，第三密码子编码IgC结构域。B7家族基因结构的另一个特征是外显子的定相：在细胞外结构域相应的区域中，B7家族成员在外显子1-4之间显示的保守定相为2(参见id.)。
zB7H6被鉴定为NKp30的反受体，受体NKp30在自然杀伤(NK)细胞上被选择性地表达，并作为激活性受体参与人自然细胞毒性。一般可通过I类MHC分子和抑制性受体之间的相互作用来阻止NK细胞对正常组织的攻击。然而，在无I类MHC表达(例如在肿瘤细胞或病毒感染的细胞上)的情况下，激活受体连接于NK细胞上可触发靶细胞杀伤。这样触发的NK细胞受体包括NKp30、NKp44、NKp46、NKG2D和DNAM1。NKp30可结合的激活靶细胞配体尚没有被鉴定，将zB7H6鉴定为NKp30的反受体使得多种治疗剂能够模拟或干扰zB7H6和NKp30的相互作用，以为了治疗癌症、感染性疾病、NK细胞介导的同种异体移植物排斥及其他病症而调节NK淋巴细胞活性。例如，可模拟zB7H6-NKp30相互作用的试剂(包括包含细胞外结构域的可溶形式的zB7H6)可用于通过激活NKp30刺激性信号而促进NK细胞对肿瘤或病毒感染细胞的反应。相反，可阻断zB7H6-NKp30相互作用的试剂(例如与NKp30竞争结合的抗zB7H6抗体)可用于抑制NK细胞介导的反应，例如在急性骨髓细胞(BMC)同种异体移植物排斥中。
因此，在一方面中本发明提供了zB7H6多肽，所述zB7H6多肽可用于调节NK细胞活性以及用于治疗诸如癌症、感染性疾病或NK细胞介导的同种异体移植物排斥的障碍。通常，这类zB7H6多肽包含zB7H6细胞外结构域(SEQ ID NO：2的第25-266号残基)；与SEQ ID NO：2的第25-266号残基具有至少80％(例如至少90％或至少95％)同一性并且能够结合于NKp30的zB7H6细胞外结构域的一个功能性变体；或者上述zB7H6细胞外结构域或结构域变体的一个功能性片段，该片段能够结合于NKp30。在一些变化方案中，所述zB7H6多肽具有SEQ ID NO：2的第25-454号残基的氨基酸序列(如SEQ ID NO：2的多肽)或者与SEQ IDNO：2的第25-454号残基具有至少80％(例如至少90％或至少95％)同一性的zB7H6的一个功能性变体。在一些实施方案中，所述zB7H6多肽是缺少功能性跨膜结构域的可溶性zB7H6多肽。特别合适的可溶性zB7H6多肽包括这样的融合蛋白，即该融合蛋白包含zB7H6细胞外结构域或其功能性变体或片段以及一种异源性多肽，或者由zB7H6细胞外结构域或其功能性变体或片段以及一种异源性多肽组成。在一些这类变化方案中，所述异源性多肽是免疫球蛋白部分；特别合适的免疫球蛋白部分是免疫球蛋白重链恒定区，例如人Fc片段。在另一些变化方案中，所述异源性多肽是血管舒张素刺激的磷蛋白(VASP)结构域，它特别适合用于制备多聚体(例如四聚体)形式的可溶性zB7H6。在一些实施方案中，所述可溶性融合蛋白还包括多肽连接体。
本发明还提供了编码本发明的可溶性zB7H6多肽的多核苷酸，包括载体，以及包含这类多核苷酸的宿主细胞。在本发明的一些方面中，这类多核苷酸、载体和宿主细胞可用在制备可溶性zB7H6蛋白的方法中。这类方法通常包括在蛋白可表达的条件下培养以编码可溶性zB7H6蛋白的表达载体转化或转染的宿主细胞，并从所述宿主细胞回收所述可溶性zB7H6蛋白。
本发明还提供了可特异性结合于zB7H6的细胞外结构域的抗体。在多个实施方案中，这类抗体可结合于单体和/或多聚体形式的zB7H6，包括例如单体或多聚体形式的可溶性zB7H6。这类抗体包括激动剂抗体、中和抗体、多克隆抗体、鼠类单克隆抗体、来源于鼠类单克隆抗体的人源化抗体、人单克隆抗体及其抗原结合片段。示例性的抗体片段包括F(ab’)2、F(ab)2、Fab’、Fab、Fv、scFv和最小识别单位。中和抗体可结合zB7H6，使得它与NKp30的相互作用被抑制或者被阻断。
本发明还包括包含可药用载体和如本文描述的可溶性zB7H6多肽或抗zB7H6抗体的药物组合物。这类组合物可用在根据本发明的治疗方法中。
在另一些方面中，本发明提供了使用模拟或阻断zB7H6活性的试剂调节NK细胞活性的方法。可模拟zB7H6活性的合适试剂包括可溶形式的包含细胞外zB7H6结构域的zB7H6，或者其能够结合于NKp30并刺激NKp30活性的功能性变体或片段。另外的激动剂包括能够在细胞内重组地产生功能性zB7H6分子的基因治疗载体、zB7H6表达和/或zB7H6介导的信号传导的小分子增强物等。合适的zB7H6阻断剂包括能够结合于至少一部分的zB7H6细胞外结构域并干扰zB7H6与NKp30的相互作用的抗zB7H6抗体；zB7H6与NKp30相互作用的小分子抑制剂等。另外的zB7H6拮抗物还包括靶向zB7H6核酸序列的反义寡核苷酸、抑制性RNA序列、B7H6表达和/或细胞内信号传递的小分子抑制剂等。
例如，在一些实施方案中，本发明提供了一种用于治疗以自然杀伤(NK)细胞活性不足为特征的疾病或障碍(如癌症或感染性疾病)的方法，所述方法是通过向受试者给予有效量的可溶性zB7H6多肽。在另一些方面中，本发明提供了用于降低人自然杀伤(NK)细胞对表达zB7H6的细胞的活性的方法，所述方法是通过在存在人NK细胞的情况下，将表达zB7H6的细胞与有效量的一种这样的抗体相接触，所述抗体可特异性结合于zB7H6的细胞外结构域并可抑制zB7H6与人NKp30的相互作用；这类方法可用于例如在体内治疗NK细胞介导的同种异体移植物排斥，特别是急性BMC同种异体移植物排斥。
参考下文的具体描述可以更清楚地认识到本发明的这些方面和其他方面。此外，下文引用了多篇参考文献，它们都以援引的方式全文纳入本文。
Ⅱ.定义
除非另外定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语与所述方法和组合物所属技术领域的普通技术人员通常理解的含义相同。除非另外指出，否则本文使用的如下术语和短语具有为它们定义的含义。
本文所使用的“核酸”或”核酸分子”指多核苷酸，例如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)、寡核苷酸、通过聚合酶链式反应(PCR)生成的片段，和通过任何连接反应、裂解反应、内切酶作用和外切酶作用生成的片段。核酸分子可由天然存在的核苷酸单体构成(例如DNA和RNA)，或者可由天然存在的核苷酸的类似物构成(例如天然存在的核苷酸的α对映体形式)，或由它们的组合构成。经修饰的核苷酸可以在其糖部分和/或嘧啶碱基或嘌呤碱基部分被修饰。糖修饰包括例如用卤素、烷基、胺基和叠氮基取代一个或多个羟基，或者将糖官能化为醚或酯。此外，整个糖部分都可以被其立体上或电子上相似的结构所取代，例如氮杂糖和碳环糖类似物。碱基部分的修饰的实例包括烷基化的嘌呤和嘧啶、酰基化的嘌呤和嘧啶或其他公知的杂环取代。核酸单体可以通过磷酸二酯键相连接或者通过这类键的类似物相连接。磷酸二酯键的类似物包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸硒酰酯(phosphoroselenoate)、磷酸二硒酰酯(phosphorodiselenoate)、硫代苯胺磷酸酯(phosphoroanilothioate)、酰苯胺磷酸酯(phosphoranilidate)、氨基磷酸酯等等。术语“核酸分子”还包括所谓的“肽核酸”，所述肽核酸包括与聚酰胺主链相连的天然存在的或经修饰的核酸碱基。核酸可为单链核酸或双链核酸。
术语“核酸分子的互补物”指的是具有与参照核苷酸序列反向互补的核苷酸序列的核酸分子。
术语“简并核苷酸序列”指的是与编码一种多肽的参照核酸分子相比具有一个或多个简并密码子的核苷酸序列。简并密码子具有不同的核苷酸三联体，但是却编码相同的氨基酸残基(即GAU和GAC三联体均编码Asp)。
术语“结构基因”指的是这样一种核酸分子，它会被转录为信使RNA(mRNA)，该信使RNA随后被翻译为特定多肽的特征性氨基酸序列。
“分离的核酸分子”为未整合在生物体基因组DNA中的核酸分子。例如，从细胞的基因组DNA中分离出来的编码生长因子的DNA分子就是一种分离的DNA分子。分离的核酸分子的另一个实例为未整合在生物体基因组中的化学合成的核酸分子。从特定物种中分离的核酸分子要小于该物种染色体的完整DNA分子。
“核酸分子构建体”为一种单链或双链的核酸分子，它经过人干预而被修饰，从而含有以自然界中不存在的方式排列并组合的核酸区段。
“线性DNA”是指具有自由的5’和3’末端的非环状DNA分子。线性DNA可以通过酶消化或物理破坏闭合环状DNA分子(例如质粒)来制备。
“互补DNA(cDNA)”为从mRNA模板通过反转录酶制备生成的单链DNA分子。通常，使用与mRNA的一部分互补的引物来启动反转录。本领域技术人员还使用术语“cDNA”来指由这类单链DNA分子及其互补DNA链组成的双链DNA分子。术语“cDNA”还指从RNA模板合成的cDNA分子的克隆。
“启动子”为指导结构基因的转录的核苷酸序列。通常，启动子位于基因的5’非编码区，接近结构基因的转录起始位点。具有启动转录功能的启动子中的序列元件通常以共有核苷酸序列为特征。这些启动子元件包括：RNA聚合酶结合位点、TATA序列、CAAT序列、分化特异性元件(DSE；McGehee et al.，Mol.Endocrinol.7：551(1993))、环AMP应答元件(CRE)、血清应答元件(SRE；Treisman，Seminars in Cancer Biol.1：47(1990))、糖皮质激素应答元件(GRE)，以及其他转录因子的结合位点，例如CRE/ATF(O′Reilly et al.，J.Biol.Chem.267：19938(1992))、AP2(Ye et al.，J.Biol.Chem.269：25728(1994))、SP1、cAMP应答元件结合蛋白(CREB；Loeken，Gene Expr.3：253(1993))和八聚体因子(一般参见Watson et al.，编著，Molecular Biology of the Gene，4th ed.(The Benjamin/Cummings Publishing Company，Inc.1987)和Lemaigre和Rousseau，Biochem.J.303：1(1994))。如果启动子为一种可诱导的启动子，那么转录速率会响应于诱导剂而提高。与此不同的是，如果启动子为组成型启动子，那么其转录速率就不受诱导剂的调节。还已知一些可抑制的启动子。
“核心启动子”包括启动子功能所必需的核苷酸序列，包括TATA盒和转录起点。根据这一定义，核心启动子在缺少可增强活性或赋予组织特异性活性的特定序列时可能具有或不具有可检测的活性。
“调控元件”为调节核心启动子活性的核苷酸序列。例如，调控元件可包括能与下述的细胞因子结合的核苷酸序列，所述细胞因子可以使转录专一地或优先地在特定细胞、组织或细胞器中进行。这些类型的调控元件通常与以“细胞特异性”、“组织特异性”或“细胞器特异性”方式表达的基因相关联。
“增强子”是一种能提高转录效率的调控元件，所述转录效率的提高与增强子相对于转录起始位点的距离和方向没有关系。
“异源DNA”指的是并不天然存在于给定宿主细胞中的一种DNA分子或一群DNA分子。对于特定宿主细胞而言的异源DNA分子可以含有来源于宿主细胞物种的DNA(即内源DNA)，前提是宿主DNA与非宿主DNA(即外源DNA)相组合。例如，含有这样一种编码多肽的非宿主DNA区段的DNA分子就被认为是异源DNA分子，即所述非宿主DNA区段与包括转录启动子的宿主DNA区段有效连接。反过来，异源DNA分子可以包括与外源启动子有效连接的内源基因。作为另一实例，如果一种包括来源于野生型细胞的基因的DNA分子被引入缺少该野生型基因的突变体细胞中，则这种DNA分子也被认为是异源DNA。
“多肽”为通过肽键连接形成的氨基酸残基聚合物，包括天然形成的多肽和合成多肽。少于约10个氨基酸残基的多肽一般被称为“肽”。
“蛋白”是包括一个或多个多肽链的大分子。蛋白也可能含有非肽组分例如糖类基团。产生蛋白的细胞可能将糖类取代基和其他非肽类取代基引入到所述蛋白中，并且根据不同细胞类型可能会引入不同的取代基。本文中定义的蛋白是根据它们的氨基酸主链结构定义的；通常并不特别指明例如糖类基团等取代基，但是它们可以存在。
在宿主细胞的DNA表达的环境下，“异源”肽或多肽为由非宿主DNA分子编码的肽或多肽，即由异源DNA分子编码的肽或多肽。
“克隆载体”为能够在宿主细胞中自主复制的核酸分子，例如质粒、粘粒或噬菌体。克隆载体通常含有一个或少数几个限制性内切核酸酶识别位点，从而使得可以以确定性方式插入核酸分子而不丧失载体基本的生物学功能，也可以插入编码标记基因的核苷酸序列，所述标记基因适用于识别和筛选被所述克隆载体转化的细胞。标记基因通常包括能够提供四环素抗性或氨苄青霉素抗性的基因。
“表达载体”为编码能够在宿主细胞中表达的基因的核酸分子。通常，表达载体包括一个转录启动子、一个基因和一个转录终止子。基因的表达通常处于启动子的控制之下，该基因被称为与启动子“可操作连接”。类似地，如果一个调控元件能够调节一个核心启动子的活性，则称该调节元件与该核心启动子“可操作连接”。
“重组宿主”为含有异源核酸分子例如克隆载体或表达载体的细胞。在本文中，重组宿主的一个实例为通过表达载体产生zB7H6的细胞。相反地，zB7H6可以由作为zB7H6的“天然来源”的且不含有表达载体的细胞产生。
“整合转化体”为异源DNA被整合到其基因组DNA中的重组宿主细胞。
“融合蛋白”为包含至少两个互相源自不同蛋白的多肽片段的杂合蛋白。在这种情形下，“不同蛋白”是指每个蛋白对应于不同的基因座位。如果一个蛋白由对应于一个基因座位的等位基因编码，或者该蛋白与由这样的等位基因编码的蛋白有至少80％的序列同一性，那么该蛋白对应于该基因座位。源自不同蛋白的多肽片段在本文中还被称为相互是“异源的”。因此，例如，在包含zB7H6多肽片段(如所述细胞外结构域或者其功能性变体或片段)和来自非zB7H6的蛋白的第二多肽片段的融合蛋白的情形下，所述第二多肽片段在本文中还被称为“异源多肽片段”或“异源多肽”。这类异源多肽包括，例如免疫球蛋白恒定区和VASP结构域，如本文进一步描述的。
术语“受体”指的是可以与被称为“反受体”的生物活性分子相结合的细胞相关蛋白。这种相互作用介导了反受体对细胞的作用。受体可为膜结合受体、细胞溶质受体或核受体；单体受体(例如促甲状腺激素受体、β-肾上腺素能受体)或多聚体受体(例如PDGF受体、生长激素受体、IL-3受体、GM-CSF受体、G-CSF受体、红细胞生成素受体和IL-6受体)。膜结合受体的特征在于具有多结构域结构，包括胞外反受体结合结构域和通常参与信号转导的胞内效应结构域。在某些膜结合受体中，胞外反受体结合结构域和胞内效应结构域位于构成完整功能性受体的不同多肽上。
一般而言，反受体与受体的结合会导致受体的构象变化，所述构象变化会引起效应结构域和细胞内其他分子之间的相互作用，这又会导致细胞代谢的变化。通常与受体-反受体相互作用相关的代谢事件包括：基因转录、磷酸化、去磷酸化、环AMP产量提高、细胞钙的运动、膜脂类的运动、细胞粘附、肌醇脂类的水解和磷脂的水解。
“可溶性受体”是不与细胞膜结合的受体多肽。可溶性受体通常为没有跨膜结构域和细胞质结构域，也没有其他细胞膜连接方式例如通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)与细胞膜相连的反受体结合多肽。可溶性受体可包括附加的氨基酸残基，例如为便于纯化多肽而提供的亲和标签，或者用于提供多肽与底物的结合位点的亲和标签，或免疫球蛋白恒定区序列。许多细胞表面受体具有天然存在的可溶性对应物，它们是由蛋白水解产生的或由可变剪接的mRNA翻译产生。可溶性受体可为单体、同二聚体、异二聚体或多聚体的形式，多聚体受体通常包括不多于9个亚基、优选地包括不多于6个亚基、最优选地包括不多于3个亚基。当受体多肽没有足够的跨膜和胞内多肽区段部分来分别提供膜锚定或信号转导时，就称所述受体多肽基本上没有跨膜和胞内多肽区段。例如，zB7H6的代表性可溶性受体包括SEQ ID NO：17或19示出的可溶性受体。
术语“分泌信号序列”指的是编码这样一种肽的DNA序列，所述肽(“分泌肽”)作为一种较大多肽的一部分，指引所述较大多肽进入合成该多肽的细胞的分泌途径。所述较大多肽通常在所述分泌途径中被切割以除去分泌肽。
“分离的多肽”为基本上不含有夹杂的细胞组分的多肽，所述夹杂的细胞组分例如天然状态下与所述多肽共存的糖类、脂类或其他蛋白质性质的杂质。通常，分离的多肽制品所含有的所述多肽的纯度很高，即至少约80％纯度，至少约90％纯度、至少约95％纯度、高于95％纯度例如96％、97％或98％或者更高的纯度，或高于99％的纯度。显示某种具体蛋白制品含有分离多肽的一种方法是对所述蛋白质制品进行十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳并对所述凝胶进行考马斯亮蓝染色之后，出现单一条带。然而，术语“分离的”并不排除同一种多肽的不同物理形式的存在，例如二聚体形式或者可选择的糖基化或衍生化形式。
本文中使用的术语“氨基末端”和“羧基末端”指的是多肽中的位置。在上下文允许的情况下，在提及多肽的某一特定部分或序列时使用这些术语，用于表示接近的关系或相对位置。例如，位于多肽内的一段参考序列的羧基末端的某一段序列指的是所述序列接近所述参考序列的羧基末端，但并不一定是位于整个多肽的羧基末端。
术语“表达”指的是基因产物的生物合成。例如，对于结构基因而言，表达包括将所述结构基因转录为mRNA并将所述mRNA翻译为一个或多个多肽。
本文中使用的术语“剪接变体”指的是从一个基因转录而得的RNA的不同形式。剪接变体天然地是通过利用转录的RNA分子内的不同剪接位点而产生的，或者也有少数时候是利用独立转录的RNA分子之间的不同剪接位点产生，导致可能从一个相同基因会转录出几种mRNA。剪接变体可能编码具有不同氨基酸序列的多肽。本文中还使用术语“剪接变体”表示由基因转录而来的mRNA剪接变体所编码的多肽。
本文所使用的术语“免疫调节剂”包括细胞因子、干细胞生长因子、淋巴毒素、共刺激分子、造血因子等，还包括上述分子的合成类似物。
术语“互补体/抗互补体对”指的是在合适条件下形成非共价结合的稳定配对的不相同的部分。例如，生物素和亲和素(或链亲和素)为互补体/抗互补体对的典型成员。其他示例性的互补体/抗互补体对包括受体/反受体对、抗体/抗原(或半抗原或表位)对、正义/反义多核苷酸对等等。在随后需要互补体/抗互补体对解离的情况下，互补体/抗互补体对的结合亲和力优选地小于109M-1。
本文使用的术语“抗体”是指免疫球蛋白多肽和免疫球蛋白多肽的活性部分，即包含可免疫特异性结合于具体抗原(例如zB7H6的细胞外结构域)的抗原结合位点的免疫球蛋白家族的多肽或其片段。
“抗独特型抗体”为可与免疫球蛋白的可变区结构域结合的抗体。在本文中，抗独特型抗体可与抗zB7H6抗体的可变区结合，因此抗独特型抗体可以模拟zB7H6的表位。
“抗体片段”为抗体的一部分，例如F(ab’)2、F(ab)2、Fab’、Fab等等。不论结构如何，抗体片段都可以与完整抗体所识别的同一抗原相结合。例如，抗zB7H6单克隆抗体片段可以结合于zB7H6的表位。
术语“抗体”还包括基因工程生产的完整抗体或片段，例如嵌合抗体、人源化抗体、由重链和轻链可变区组成的“Fv”片段、由轻链可变区组成的多肽、轻链可变区和重链可变区通过肽连接物相连接的重组单链抗体(“scFv蛋白”)、由模拟高可变区的氨基酸残基组成的最小识别单位等等，以及合成的抗原结合肽或多肽。
“嵌合抗体”为这样一种重组蛋白，它含有来源于啮齿动物抗体的可变结构域和互补决定区，而抗体分子的其余部分来源于人抗体。
“人源化抗体”为这样一种重组蛋白，其中将单克隆抗体中的鼠类互补决定区从鼠类免疫球蛋白的重链可变区和轻链可变区转移到人可变结构域中。用于人治疗用途的来源于鼠类抗体(例如可以结合或中和人蛋白的鼠类抗体)的人源化抗体的构建是在本领域技术人员的能力范围之内的。
本文使用的术语“Fc片段”、“Fc区”或“Fc结构域”是同义词，是指负责结合细胞上抗体受体和补体的C1q组件的抗体部分。Fc代表“结晶片段”，易于形成蛋白晶体的抗体区段。最初通过蛋白水解消化描述的不同蛋白区段可定义免疫球蛋白的总体一般结构。如最初在文献中定义的，Fc区段由二硫键接的重链铰链区CH2和CH3结构域组成。然而，最近该术语已被应用于由CH3、CH2和至少部分铰链组成的单链，所述部分铰链足以与第二种这类链形成二硫键接的二体。免疫球蛋白的结构和功能的综述见Putnam，The Plasma Proteins，Vol.V(AcademicPress，Inc.，1987)，pp.49-140；and Padlan，Mol.Immunol.31：169-217，1994。如本文使用的，术语Fc包括天然序列的变体。
本文使用的术语“单链Fc”、“单链Fc结构域”和“scFc”是同义词，是指包含两个由柔性连接体连接的Fc结构域单体的多肽融合物，使得所述两个Fc单体能够二体化，以形成能够结合Fc受体的功能性二体Fc结构域。单链Fc多肽还记载于2008年4月18日提交的题为“SingleChain Fc，Methods of Making，and Methods of Treatment”的国际PCT专利申请No.US08/060852中，该申请的公开文本通过援引全文纳入本文中。
本文使用的术语“具有ADCC活性的Fc区”是指能够通过结合于表达Fc受体的细胞裂解免疫效应细胞(如NK细胞或CD8+T细胞)上的细胞裂解Fc受体(如FcγRIIIα)而介导抗体依赖的细胞毒性(ADCC)的Fc结构域。
术语“补体”概括性地是指正常血清中与抗原结合的抗体一块呈现裂解细胞的能力的组分。补体由一致地且顺次地作用以行使它们的效应的一组血清蛋白组成。
本文是用的术语“经典补体通路”和“经典补体系统”是同义词，是指用于激活补体的具体通路。该经典通路需要抗原-抗体复合体用于起始，并参与以次序的方式激活被命名为C1至C9的9种主要蛋白组分。对于激活过程中的多个步骤，产物是催化后续步骤的酶。这种级联通过相对小的初始信号提供对大量补体的放大和激活。
本文使用的术语“具有CDC活性的Fc区”是指能够通过结合C1q补体蛋白并激活经典补体系统而介导补体依赖的细胞毒性(CDC)的Fc结构域。
本文使用的术语“试剂”是指元素、化合物或其他分子实体，包括药物化合物、治疗化合物或药理化合物。试剂可以是天然的或合成的，或者二者的结合物。“治疗试剂”是指，单独或与其他试剂结合(例如前药转换酶与一种前药相结合)，对细胞或组织(例如表达zB7H6的细胞或组织，如表达zB7H6的癌细胞)发挥治疗(例如有益)效果的试剂。在本发明的一些方面中，“治疗试剂”是缀合于抗体以产生可用于治疗的缀合物的试剂。治疗剂的实例包括药物、毒素、免疫调节剂、螯合剂、硼化合物、光活化剂或染料以及放射性同位素。在一些变化方案中，用于与抗体缀合的治疗试剂是发挥细胞毒效应或细胞抑制效应的试剂。
在提及试剂对细胞的效应时，“细胞毒性效应”是指对所述细胞的杀伤。“细胞抑制效应”是指对细胞增殖的抑制。“细胞毒性试剂”是指这样的试剂，即所述试剂对细胞具有细胞性毒效应或细胞抑制效应，从而在细胞群中分别耗尽或抑制细胞生长。
“可检测标记”为与抗体部分缀合而产生可用于诊断的分子的分子或原子。可检测标记的实例包括螯合剂、光活化剂、放射性同位素、荧光试剂、顺磁性离子或其他标记部分。
本文使用的术语“亲和标签”指的是这样一种多肽片段，它可以与另一多肽连接，从而使得可以纯化或检测所述另一多肽或者提供使所述另一多肽与底物结合的位点。原则上可以使用任何具有可获得的抗体或其他特异性结合物的肽或蛋白作为亲和标签。亲和标签包括多组氨酸链、蛋白A(Nilsson et al.，EMBO J.4：1075(1985)；Nilsson et al.，Methods Enzymol.198：3，1991)、谷胱甘肽S转移酶(Smith and Johnson，Gene 67：31，1988)、Glu-Glu亲和标签(Grussenmeyer et al.，Proc Natl.Acad.Sci.USA 82：7952，1985)、P物质、FLAG肽(Hopp et al.，Biotechnology 6：1204，1988)、链亲和素结合肽或其他抗原性表位或结合结构域。通常可参见Ford et al.，Protein Expession and Purification2：95，1991。编码亲和标签的DNA分子是可从供应商(例如PharmaciaBiotech，Piscataway，NJ)处购买的。
“裸抗体”与抗体片段相对，表示未与治疗剂缀合的完整抗体。裸抗体包括多克隆抗体和单克隆抗体，以及某些重组抗体例如嵌合抗体和人源化抗体。
术语“单克隆抗体”是指源自单个细胞克隆(包括任何真核或原核细胞克隆或者噬菌体克隆)的抗体，不是用于产生它的方法。因此，本文使用的术语“单克隆抗体”并不限于通过杂交瘤技术制备的抗体。
本文所使用的术语“抗体组分”包括完整抗体和抗体片段。
“免疫缀合物”为抗体组分与治疗剂或可检测标记形成的缀合物。
本文所使用的术语“抗体融合蛋白”指的是包括一种抗体组分和一种zB7H6多肽组分的重组分子。抗体融合蛋白的实例包括这样一种蛋白，所述蛋白包括zB7H6的胞外结构域，还包括Fc结构域或抗原结合区域。
在真核细胞中，RNA聚合酶II催化结构基因的转录从而产生mRNA。可以设计核酸分子以使其包括RNA聚合酶II模板，在所述模板中RNA转录物具有与特定mRNA互补的序列。所述RNA转录物被称为“反义RNA”，编码该反义RNA的核酸分子被称为“反义基因”。反义RNA分子能够结合mRNA分子，导致对mRNA翻译的抑制。
“抑制性多核苷酸”是减少或阻止第二(靶)多核苷酸表达(转录或翻译)的DNA或RNA分子。抑制性多核苷酸包括反义多核苷酸、核酶和外源性指导序列。术语“抑制性多核苷酸”还包括编码实际抑制性种类的DNA和RNA分子，例如编码核酶的DNA分子。
“特异性针对zB7H6的反义寡核苷酸”或“zB7H6反义寡核苷酸”为具有下述序列的寡核苷酸：(a)所述序列能够与zB7H6基因的一部分形成稳定的三聚体，或(b)所述序列能够与zB7H6基因的mRNA转录物的一部分形成稳定的二聚体。
“核酶”为具有催化中心的核酸分子。该术语包括RNA酶、自剪接RNA、自切割RNA和执行上述催化功能的核酸分子。编码核酶的核酸分子被称为“核酶基因”。
“外源性指导序列”为能引导内源性核酶RNA酶P结合特定种类胞内mRNA并导致该mRNA被RNA酶P切割的核酸分子。编码外源性指导序列的核酸分子被称为“外源性指导序列基因”。
术语“变体zB7H6基因”指的是编码具有这样一种氨基酸序列的多肽的核酸分子，所述氨基酸血列为SEQ ID NO：2的一种变化形式。这类变体包括天然存在的zB7H6基因的多态性，以及含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的保守性氨基酸置换的合成基因。zB7H6基因的其他变体形式为含有本文所述的核苷酸序列的插入或缺失的核酸分子。可以通过例如在严格条件下，测定一种基因是否与具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列的核酸分子或其互补核酸分子杂交，从而识别变体zB7H6基因。
或者，可以通过序列比较识别变体zB7H6基因。如果在比对最大相符性时两个氨基酸序列的氨基酸残基相同，就称这两个氨基酸序列具有“100％的氨基酸序列同一性”。类似地，如果在比对最大相符性时两个核苷酸序列的核苷酸基相同，就称这两个核苷酸序列具有“100％的核苷酸序列同一性”。序列比较可以使用标准软件程序进行，例如由DNASTAR(Madison，Wisconsin)生产的LASERGENE生物信息学软件包中所含有的软件。其他通过测定最优比对而比较两个核苷酸或氨基酸序列的方法是本领域技术人员公知的(参见，例如，Peruski andPeruski，The Internet and the New Biology：Tools for Genomic andMolecular Research(ASM Press，Inc.1997)；Wu et al.(编著)，“Information Superhighway and Computer Databases of NucleicAcids and Proteins”in Methods in Gene Biotechnology 123-151(CRCPress，Inc.1997)；Bishop(编著)，Guide to Human Genome Computing，第2版(Academic Press，Inc.1998))。如果两个核苷酸序列或氨基酸序列相互具有至少80％、至少90％或至少95％的序列同一性，那么认为这两个序列具有“基本相似的序列同一性”或“基本的序列同一性”。下文将描述用于测定序列同一性的具体方法。
无论使用什么具体方法来识别变体zB7H6基因或变体zB7H6多肽，都可以根据变体基因或由变体基因编码的多肽与抗zB7H6抗体特异性结合的能力，而从功能上表征所述基因或多肽。还可通过变体zB7H6基因或变体zB7H6多肽结合于NKp30的能力来对其进行功能性表征，使用的是本文所述的生物学或生物化学测定方法。
本文中使用的术语“等位基因变体”指的是位于相同染色体基因座上的某一基因的任何两种或多种变化形式。等位基因变体天然地通过突变产生，并可能导致群体中的表型多态性。基因突变可能是沉默的(编码的多肽没有改变)，或者可能所编码的多肽的氨基酸序列有所改变。本文中使用的术语等位基因变体还指的是由基因的等位基因变体编码的蛋白质。
术语“直系同源物”指的是从一个物种获得的多肽或蛋白是从另一不同物种获得的多肽或蛋白的功能类似物。直系同源物之间的序列差异是物种形成的结果。
“旁系同源物”是由一种生物产生的不同但结构相关的蛋白质。据认为旁系同源物是通过基因复制产生的。例如，α-珠蛋白、β-珠蛋白和肌红蛋白彼此之间互为旁系同源物。
本文使用的“NK细胞活性”是指NK细胞的细胞裂解活性。本领域技术人员已知多种用于检测和/或监测这类活性的测定法，包括但不限于本文提供的实施例中描述的测定法。
本文使用的短语“zB7H6和NKp30的相互作用”是指直接的物理相互作用(如结合)，和/或功能性zB7H6受体与NK细胞上NKp30的这样的其他非直接相互作用，即这些非直接相互作用导致对zB7H6受体和/或NKp30的刺激以及相关的细胞内信号传递。
本文使用的术语“阻断剂”包括那些可干扰zB7H6和NKp30的相互作用的试剂，以及/或者那些可干扰zB7H6触发NK细胞活性的能力(如通过细胞裂解活性度量)的试剂。示例试剂包括功能阻断抗体，以及可阻断zB7H6与NKp30结合但不刺激NK细胞中zB7H6介导的信号传导的肽(例如zB7H6派生的肽、模拟肽、小分子等)。
本文使用的术语“模拟剂”包括那些可模拟zB7H6和NKp30的相互作用的试剂，以及/或者那些可增大、提高或增加zB7H6和/或NKp30触发NK细胞活性的能力的试剂。示例试剂包括zB7H6可溶性受体、可增大或提高zB7H6结合于NKp30的能力的肽或在刺激NKp30介导的信号传递中替代zB7H6的肽(例如B7H6派生的肽、模拟肽、小分子等)以及zB7H6抗独特型抗体。
本发明包括zB7H6多肽的功能性片段。在本发明的上下文中，zB7H6的“功能性片段”是指至少可特异性结合于NKp30的一部分zB7H6多肽。在一些实施方案中，zB7H6的功能性片段能够触发或提高NKp30介导的NK细胞激活；在另一些实施方案中，功能性片段能够阻断或降低NKp30介导的NK细胞激活。
本文使用的术语“zB7H6相关试剂”或“zB7H6相关组合物”是指可证明zB7H6功能性活性或对zB7H6功能性活性的抑制的试剂，或者可证明zB7H6特异性结合的试剂。这类试剂包括，例如可溶性zB7H6多肽、抗zB7H6抗体、抗zB7H6抗体-药物缀合物、zB7H6抗独特型抗体或其他zB7H6模拟剂、编码zB7H6的多核苷酸、抑制性多核苷酸等。
在提及试剂和组合物时，短语“证明zB7H6功能性活性”或“证明zB7H6活性”通常指zB7H6模拟剂(包括例如可溶性zB7H6多肽和zB7H6抗独特型抗体)，以及编码具有zB7H6功能性活性的多肽的多核苷酸。
在提及试剂和组合物时，短语“证明对zB7H6功能性活性的抑制”通常指zB7H6阻断剂(包括例如功能阻断性抗zB7H6抗体和可阻断zB7H6与NKp30结合但不刺激zB7H6介导的信号传导的肽)，以及减少或阻止zB7H6基因表达的核酸(即zB7H6抑制性多核苷酸)。
本文使用的术语“NK细胞相关的疾病和障碍”通常指NK细胞介导的疾病或障碍，以及以NK细胞活性不足为特征的疾病或障碍。
本文使用的短语“以NK细胞活性不足为特征的疾病或障碍”是指至少部分地涉及这样的病原性细胞的任何疾病或障碍，即这些病原性细胞可作为NK细胞的细胞裂解活性的靶，但在所述疾病或障碍中至少部分地由于逃避NK细胞介导的细胞毒性而显著。这类病原性细胞一般是那些没有I类MHC表达的细胞，例如某些肿瘤细胞或病毒感染细胞。因此，以NK细胞活性不足为特征的典型疾病或障碍是癌症和许多感染性疾病。如本文中进一步所述的，这类疾病和障碍特别适用于一些提高NK细胞活性的治疗方法。
本文使用的术语“NK细胞介导的疾病或障碍”是指任何具有至少部分地由NK细胞的细胞裂解活性介导的病理的疾病或障碍。这类疾病或障碍的一个实例是骨髓细胞(BMC)同种异体移植物的急性排斥。如本文中进一步所述的，这类疾病和障碍特别适用于一些抑制NK细胞活性的治疗方法。
在如本文所述通过将可溶性zB7H6多肽或抗体给予一个受试者来治疗NK细胞相关的疾病或障碍的情形中，术语“有效量”是指这类分子的这样的量，即该量足以在受试者中调节NK细胞介导的反应，以抑制NK细胞相关疾病或障碍的发生，或者改善NK细胞相关疾病或障碍的一种或多种症状。有效量的试剂依照本发明的方法以“有效的方案”给药。术语“有效方案”是指为了足以实现对所述疾病或障碍的治疗或预防，给予试剂的量和剂量频率的结合。
由于标准分析方法的不准确性，聚合物的分子量和长度都被理解为近似值。当这类值被表示为“大约”X或“近似”X时，应理解的是X表示的值应为实际值±10％。
Ⅲ.zB7H6多肽、核酸、载体、宿主细胞及相关的制备方法
本发明的zB7H6多肽通常包含zB7H6细胞外结构域(SEQ IDNO：2的第25-266号残基)或者其功能性变体或片段。例如，这类zB7H6多1肽可用在NK细胞活性的调节中，用在诸如癌症或感染性疾病的障碍的治疗中，以及用在筛选抗zB7H6与NKp30的功能性相互作用的方法中。通常，本发明的zB7H6多肽包含选自以下的多肽区：
(i)SEQ ID NO：2的zB7H6多肽的细胞外结构域(即SEQ IDNO：2的第25-266号残基)；
(ii)(i)的zB7H6细胞外结构域的功能性变体，与SEQ ID NO：2的第25-266号残基具有至少80％同一性的的变体；以及
(iii)(i)的zB7H6细胞外结构域或(ii)的结构域变体的功能性片段。
在一些实施方案中，zB7H6多肽为可溶性受体多肽。这类可溶形式的zB7H6没有功能性的跨膜结构域，并且一般还基本上没有细胞内多肽片段。在一些其他实施方案中，zB7H6为多肽细胞膜结合形式的zB7H6，例如包含功能性跨膜结构域或GPI键合的zB7H6多肽。细胞膜结合形式的zB7H6包括例如全长或基本全长形式的zB7H6蛋白，例如包含SEQ ID NO：2第25-454号残基或由SEQ ID NO：2第25-454号残基组成的多肽，或者其变体。
在包含功能性细胞外结构域变体的zB7H6多肽的一些实施方案中，所述变体与SEQ ID NO：2的第25-266号残基有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。类似地，在包含细胞外结构域变体的功能性片段的另一些实施方案中，所述片段源自与SEQ ID NO：2的第25-266号残基有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的变体。如之前指出的，在一些实施方案中，zB7H6多肽还可包含跨膜组分和细胞内结构域组分；在一些这类实施方案中，本发明的多肽与SEQ ID NO：2的第25-454号残基有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。
序列同一性百分数可通过常规方法确定。参见例如，Altschul et al.，Bull.Math.Bio.48：603，1986和Henikoff and Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915，1992。例如，使用空位缺口罚分10，空位延伸罚分1，并使用表1所示的Henikoff和Henikoff(如上述文献)的“BLOSUM62”评分矩阵，将两个氨基酸序列进行比对以优化比对分数(用标准单字母编码表示氨基酸)。同一性百分数按下式计算：([一致匹配的总数]/[较长序列的长度+为比对两序列而在较长序列中引入的空位数])(100)。
表1：BLOSUM62评分矩阵
   A  R  N  D  C  Q  E  G  H  I  L  K  M  F  P  S  T  W  Y  V
A  4
R  -1 5
N  -2 0  6
D  -2 -2 1  6
C  0  -3 -3 -3 9
Q  -1 1  0  0  -3 5
E  -1 0  0  2  -4 2  5
G  0  -2 0  -1 -3 -2 -2 6
H  -2 0  1  -1 -3 0  0  -2 8
I  -1 -3 -3 -3 -1 -3 -3 -4 -3 4
L  -1 -2 -3 -4 -1 -2 -3 -4 -3 2  4
K  -1 2  0  -1 -3 1  1  -2 -1 -3 -2 5
M  -1 -1 -2 -3 -1 0  -2 -3 -2 1  2  -1 5
F  -2 -3 -3 -3 -2 -3 -3 -3 -1 0  0  -3 0  6
P  -1 -2 -2 -1 -3 -1 -1 -2 -2 -3 -3 -1 -2 -4 7
S  1  -1 1  0  -1 0  0  0  -1 -2 -2 0  -1 -2 -1 4
T  0  -1 0  -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1 1  5
W  -3 -3 -4 -4 -2 -2 -3 -2 -2 -3 -2 -3 -1 1  -4 -3 -2 1  1
Y  -2 -2 -2 -3 -2 -1 -2 -3 2  -1 -1 -2 -1 3  -3 -2 -2 2  7
V  0  -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3 3  1  -2 1  -1 -2 -2 0  -3 -1 4
本领域技术人员了解有多种已知算法可以用于比对两个氨基酸序列。Pearson和Lipman的“FASTA”相似性搜索算法就是一种合适的蛋白质比对方法，可用于检测本文公开的氨基酸序列和一种推定的zB7H6变体的氨基酸序列之间的同一性水平。FASTA算法记载于Pearson and Lipman，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 85：2444(1988)和Pearson，Meth.Enzymol.183：63(1990)。简而言之，FASTA首先在不考虑保守性氨基酸置换、插入或缺失的条件下，通过识别查询序列(例如SEQ ID NO：2的第25-266号残基)和测试序列共有的、具有最高密度同一性(在ktup变量＝1时)或同一性对(在ktup变量＝2时)的区域，从而表征序列相似性。然后通过使用氨基酸置换矩阵比较所有配对的氨基酸的相似性，对具有最高密度同一性的十个区域进行再评分，并将各区域的末端“修剪”为仅包括那些对最高评分有贡献的残基。如果有一些序列的得分高于“阈(cutoff)”值(通过基于序列长度和ktup值预定的公式计算得出)，则检测修剪后的初始区域以确定这些区域是否参与形成有空位的近似比对。最后，使用改进的Needleman-Wunsch-Sellers算法(Needleman and Wunsch，J.Mol.Biol.48：444(1970)；Sellers，SIAM J.Appl.Math.26：787(1974))比对两个氨基酸序列的得分最高的区域，该算法中考虑了氨基酸插入和缺失。FASTA分析的示例性参数为：ktup＝1、空位缺口罚分＝10、空位延伸罚分＝1以及置换矩阵＝BLOSUM62。如Pearson，Meth.Enzymol.183：63(1990)的附录2所述，可以通过修改评分矩阵文件(“SMATRIX”)，将上述参数引入FASTA程序中。
也可以使用上述公开的比值，将FASTA用于测定核酸分子的序列同一性。对于核苷酸序列比对而言，ktup值可为1至6、优选地为3至6、最优选地为3，其他参数的设置同上所述。
本发明包括与SEQ ID NO：2第25-266号残基的氨基酸序列相比具有保守性氨基酸改变的可溶性zB7H6多肽。例如，可获得如下zB7H6变体：所述变体包括SEQ ID NO：2第25-266号残基的一个或多个氨基酸的置换，其中用烷基氨基酸置换zB7H6氨基酸序列中的烷基氨基酸、用芳香族氨基酸置换zB7H6氨基酸序列中的芳香族氨基酸、用含硫的氨基酸置换zB7H6氨基酸序列中的含硫氨基酸、用含羟基的氨基酸置换zB7H6氨基酸序列中的含羟基氨基酸、用酸性氨基酸置换zB7H6氨基酸序列中的酸性氨基酸、用碱性氨基酸置换zB7H6氨基酸序列中的碱性氨基酸，或用二元碱单羧基氨基酸置换zB7H6氨基酸序列中的二元碱单羧基氨基酸。在常见氨基酸中，例如，“保守性氨基酸置换”可用下列各组内的氨基酸互相置换来说明：
(1)甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸，(2)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸，(3)丝氨酸和苏氨酸，(4)天冬氨酸和谷氨酸，(5)谷氨酰胺和天冬酰胺，以及(6)赖氨酸、精氨酸和组氨酸。保守氨基酸改变的示例性组还显示于如下表2中：
表2：保守氨基酸置换
碱性    酸性      极性      疏水性    芳香族    小氨基酸
精氨酸  谷氨酸    谷氨酰胺  亮氨酸    苯丙氨酸  甘氨酸
赖氨酸  天冬氨酸  天冬酰胺  异亮氨酸  色氨酸    丙氨酸
组氨酸                      缬氨酸    酪氨酸    丝氨酸
                            甲硫氨酸            苏氨酸
                                                甲硫氨酸
BLOSUM62表为来源于蛋白质序列区段的约2,000次局部多重比对的氨基酸置换矩阵，代表了多于500组相关蛋白质的高度保守区域(Henikoffand Henikoff，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 89：10915(1992))。因此，可以使用BLOSUM62置换频率来确定可被引入到本发明氨基酸序列中的保守性氨基酸置换。虽然可以仅基于化学性质来设计氨基酸置换(如上所述的)，但是术语“保守性氨基酸置换”优选地指的是在BLOSUM62表中数值大于-1的那些置换。例如，如果某一氨基酸置换在BLOSUM62表中用数值为0、1、2或3表征，则该置换为保守性置换。根据这一系统，优选的保守性氨基酸置换在BLOSUM62表中的表征数值至少为1(例如1、2或3)，而更优选的保守性氨基酸置换在BLOSUM62表中的表征数值至少为2(例如2或3)。zB7H6的具体变体可表征为与相应氨基酸序列(例如SEQ ID NO：2的第25-266号残基)具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性，其中所述氨基酸序列的变化来自于一个或多个保守性氨基酸置换。
使用如下常规测定法可容易地鉴定功能性zB7H6变体或片段多肽，所述测定法即用于评估所述变体或片段特异性结合于NKp30(如人NKp30)的能力的常规测定法，以及/或者评估所述变体或片段触发NKp30介导的NK细胞激活的能力的测定法。例如，表达NKp30的细胞可通过FACS使用可溶性zB7H6多肽进行探测，对于所述可溶性zB7H6多肽，可使用对所述可溶性zB7H6多肽的一部分特异的第二试剂直接进行标记或检测(例如，荧光团缀合的链亲和素用于检测生物素化zB7H6多肽，或者荧光团缀合的IgG抗体用于检测包含Fc片段的zB7H6融合蛋白)。在另一些变体中，功能性zB7H6多肽可通过它们触发NK细胞抗靶细胞的细胞溶解活性的能力进行鉴定。用于评估zB7H6变体和片段的zB7H6相关功能的示例性测定法将在本文中进行进一步描述。
在一些变体中，可溶性zB7H6多肽为包含zB7H6细胞外结构域或其功能性变体或片段以及异源性多肽的融合蛋白。合适的异源性多肽包括免疫球蛋白重链恒定区。例如，在一些实施方案中，所述免疫球蛋白重链恒定区为Fc片段(如人Fc片段)，它含有两个恒定区结构域和一个铰链区域，但是不含可变区(参见，Sledziewski，AZ等人的美国专利No.6,018,026和5,750,375)。这类包含Fc片段的融合物通常以多聚体(通常为二聚体)分子的形式分泌，其中所述Fc的各部分彼此之间以二硫键连接，并且两个受体多肽在排布上彼此十分接近。例如，美国专利No.5,723,125(Chang等人)描述了一种包含人干扰素和人免疫球蛋白Fc片段的融合蛋白。干扰素的C端与Fc片段的N端通过一个肽连接体部分相连接。肽连接体的一个实例为主要含有T细胞惰性序列的肽，它是无免疫活性的。一种示例性的Fc部分为人γ4链，该链在溶液中稳定并且没有或几乎没有补体激活活性。其他合适的Fc部分包括没有或具有显著降低的效应物功能的人γ1链的变体，例如Fc4(SEQ ID NO：31)、Fc5(SEQ ID NO：32)、Fc6(SEQ IDNO：33)和Fc7(SEQ ID NO：34)，它们被显示于图13A-13C中。因此，在一些实施方案中，本发明提供了包含zB7H6细胞外结构域(或其功能性变体或片段)以及Fc片段(如人Fc片段或其变体)的zB7H6融合蛋白，其中zB7H6细胞外结构域(或其功能性变体或片段)的C端通过肽连接体与Fc片段的N端相连。
其他特别合适的用于产生可溶性B7H6融合蛋白的异源性多肽包括VASP结构域。VASP结构域在可溶性受体融合蛋白中的用途更详细地记载于美国专利申请公开文本No.2007/0254339，该申请通过援引的方式全文纳入本文。VASP结构域源自于在多个物种中存在的VASP基因。选择预计具有形成卷曲螺旋蛋白结构的能力的序列，这是因为该结构对于形成多聚体蛋白形式是重要的。本发明特别需要卷曲螺旋蛋白产生四体蛋白结构的能力。一个特别优选的实施方案利用了人VASP序列的第342-375号氨基酸，人VASP序列的全长多肽序列在SEQ ID NO：4中表示。编码人VASP蛋白的全长DNA序列在SEQ ID NO：3中列出。
以其他类型的多聚体形成序列例如亮氨酸拉链进行的工作已表明，有限数目的保守氨基酸置换(甚至在d残基处)在拉链序列中经常是被容许的，所述分子不会失去进行多聚体化的能力(Landschulz et al.，Science243：1681-1688，1989)。因此，在本发明的范围内考虑来自VASP结构域的天然序列的保守改变。例如，上文表2示出了预计可被卷曲螺旋结构容许的示例性保守改变。
如果将不止一种融合蛋白用于产生异源多聚体蛋白(如异源四体)，所使用的VASP结构域对于两融合蛋白可以是相同的结构域，或者是不同的VASP结构域，条件是所述结构域具有相互关联并形成多聚体蛋白的能力。
在一些实施方案中，所述VASP结构域连接于如SEQ ID NO：2的第25-266号残基所示的zB7H6细胞外结构域(或其功能性变体或片段)的C端。此外，所述VASP结构域可位于所述蛋白的中间，有效地形成具有以两段非VASP多肽片段为侧翼的VASP结构域的双融合蛋白，其中所述VASP结构域侧翼的至少一段多肽片段为如SEQ ID NO：2的第25-266号残基所示的zB7H6细胞外结构域(或其功能性变体或片段)。在一些变化方案中，所述VASP结构域侧翼的第二多肽片段为这样的多肽片段，即该多肽片段被设计以将所述可溶性受体靶向于具体细胞或组织，以有利于zB7H6的结合活性。
在可溶性zB7H6融合构建体中使用多聚体形成异源性多肽序列的一个结果是这样的能力，即通过形成多聚体的形式增加zB7H6对配体或反受体(如NKp30)的亲和力或亲合力。亲合力是指多个分子对较大分子的结合强度，示例性但非局限性的一情形是抗体对复合抗原的结合。亲和力是指简单的受体-配体体系的结合强度。这类特征将被改良，例如通过受体多聚化形成具有更好的zB7H6结合特征的结合位点。亲合力和亲和力可使用本领结构域普通技术人员熟知的标准测定法进行测量。如果多聚体可溶性zB7H6融合蛋白与配体或反受体的亲和力或亲合力值(例如，亲和常数或Ka)大于单体zB7H6多肽与所述配体或反受体的亲和力或亲合力值，那么就出现了亲和力或亲合力的改良。测量这些特征的另一些途径是平衡常数(Kd)，其中随着使用多聚体形成异源性多肽(如VASP四聚化结构域)改良亲和力或亲合力会出现平衡常数减小。
可溶性zB7H6融合蛋白的多肽片段(例如zB7H6细胞外结构域或其功能性变体或片段，以及与zB7H6异源的区段)可直接连接于另一蛋白以形成融合蛋白；或者，所述多肽片段可分开足够的距离，以确保这些蛋白可形成生物活性所需的正确二级和三级结构。合适的连接体序列将采用灵活扩展的构象，将不倾向于表现出形成能够与融合蛋白的功能性结构域相互作用的有序二级结构的倾向，并且将具有最少的还可能干涉融合结构域功能的疏水特征或带电荷特征。连接体序列应以15个残基的重复进行构建，因为产生生物活性蛋白时最好不要紧紧限制所述异源序列的N端或C端。除这些考虑外，所述连接体序列的长度可以有变化，而不显著影响所述融合蛋白的生物活性。连接体序列可被用于包括亲和标签和信号肽在内的融合蛋白(或表达构建体)的任意组件及所有组件之间。一个示例性的连接体是GSGG序列(SEQ ID NO：5)。
可溶性zB7H6融合蛋白还可包含亲和标签。这类标签不会改变融合蛋白的生物活性，是高度抗原性的，并且可提供可被特异性结合分子如单克隆抗体可逆结合的表位，有利于对所表达的融合蛋白的快速检测和纯化。如果蛋白在细菌例如大肠杆菌(E.coli)中产生，那么亲和标签还可赋予对细胞内降解的抗性。一个示例性亲和标签是FLAG标签(SEQ ID NO：6)或HIS6标签(SEQ ID NO：7)。利用该亲和标签进行纯化而产生融合蛋白的方法记载于美国专利No.5,011,912中。
在一些变化方案中，可溶性zB7H6受体包含一个“靶向结构域”，这个异源性多肽片段被设计用于将所述可溶性受体靶向至具体细胞或组织，用于促进zB7H6结合活性。例如，在一些实施方案中，所述可溶性融合蛋白包含可特异性将所述融合蛋白靶向至肿瘤细胞的多肽片段。特别适合用于将融合蛋白靶向至具体细胞或组织的异源性多肽区段包括识别与所述靶细胞或组织关联的细胞表面标记物的抗体或者其抗原结合片段。这些靶向结构域的使用可在靶组织(如肿瘤)周围提供局部高浓度的可溶性zB7H6受体，从而减少引起所需反应而必需给予的可溶性受体的量，以及使可能因非靶组织暴露于所述可溶性受体而导致的不良副作用最小化。zB7H6融合蛋白的靶向结构域部分结合于靶细胞的表面可增强zB7H6结合的NKp30在NK细胞表面上的交叉连接，从而还增强NKp30介导的对NK细胞抗所述靶细胞的活性的刺激。
例如，在肿瘤靶组织的情形下，靶向结构域可包括肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原(即肿瘤细胞表达但正常细胞不表达的抗原，或者肿瘤细胞中表达水平高于正常细胞的抗原)。这种抗原的实例包括表皮生长因子受体家族成员(例如EGFR和Her2)、癌胚抗原(CEA)、粘蛋白家族的成员(MUC1)、间皮素(mesothelin)、叶酸受体(follate receptor)等。也可能靶向造血性肿瘤特异性抗原或与造血性肿瘤相关的抗原，包括例如CD30、CD33、CD40、CD72等。抗所有这些抗原的抗体都被证实可用于或在临床试验中可用于治疗多种癌症。包含抗至少一种这些表面受体的抗体的zB7H6融合蛋白将使得有可能局部靶向所述分子，并且可能进一步有助于zB7H6结合的NKp30在NK细胞表面上的交叉连接，从而还增强NKp30介导的对NK细胞抗所述靶细胞的活性的刺激。
本发明还提供了多种其他的多肽融合物。例如，在一些实施方案中，zB7H6多肽可融合于两个或多个部分或结构域，例如一个用于纯化的亲和标签和一个靶向结构域。多肽融合物还可包含一个或多个切割位点，特别是在结构域之间。参见例如，Tuan et al.，Connective Tissue Research 34：1(1996)。
在一些变化方案中，zB7H6多肽还包含信号序列或前导序列。这些序列通常被利用使得所述融合蛋白在表达过程中被从宿主细胞中分泌，并且被称为前导序列、prepro序列或pre序列。虽然所述分泌信号序列可源自于zB7H6，但合适的信号序列还可源自于另一种分泌蛋白(例如美国专利No.5,641,655中所述的组织类型纤溶酶原激活剂(t-PA)信号序列)或者可以是从头合成的。可将所述分泌性信号序列可操作地连接于zB7H6编码序列，使得两条序列以正确的阅读框连接和定位，以将新合成的多肽指导至宿主细胞的分泌通路中。分泌性信号序列通常定位于编码目的多肽的核苷酸序列的5′端，但某些分泌性信号序列可位于目的核苷酸序列的其他位置(参见例如，Welch等人的美国专利No.5,037,743；Holland等人的美国专利No.5,143,830)。
虽然zB7H6的分泌性信号序列或由哺乳动物细胞产生的另一种蛋白(例如美国专利No.5,641,655中所述的组织型纤溶酶原激活剂信号序列)可用于在重组哺乳动物宿主中表达zB7H6，但是对于在酵母细胞中的表达优选酵母信号序列。合适的酵母信号序列的实例有源自酵母交配信息素α-因子(由MFα1基因编码)、转化酶(由SUC2基因编码)或酸性磷酸酯酶(由PHO5基因编码)的信号序列。参见例如，Romanos et al.，“Expressionof Cloned Genes in Yeast，”in DNA Cloning 2：A Practical Approach，2ndEdition，Glover and Hames(编著)，第123-167页(Oxford UniversityPress 1995)。
在一些变化方案中，zB7H6多肽经由键连接至一多聚体而被化学修饰。一般而言，所述多聚体是水溶性的，使得所述zB7H6多肽缀合物在水性环境如生理环境中不会沉淀。合适的多聚体的一个实例为这样的聚合物，即所述聚合物已经被修饰以具有单个反应性基团，例如活性酯用于酰化或者醛用于烷基化。在该方式中，聚合度可被控制，聚合体可以是分支的或非分支的。zB7H6多肽缀合物还可包含这种水溶性聚合物的混合物。用于产生包含多肽和水溶性聚合物部分的缀合物的一般方法在本领结构域中是已知的(参见例如，Karasiewicz等人的美国专利No.5,382,657；Greenwald等人的美国专利No.5,738,846；Nieforth et al.，Clin.Pharmacol.Ther.59：636，1996；Monkarsh et al.，Anal.Biochem.247：434，1997)。这类方法可应用于制备包含zB7H6的同源二聚体的、异源二聚体的或多聚体的可溶性受体缀合物。
zB7H6多肽缀合物的一个实例包含附着于zB7H6多肽的N末端的聚烷基氧化物部分。PEG是一种合适的聚烷基氧化物。作为一个实例，可以PEG修饰zB7H6，该方法被称为“聚乙二醇化”。zB7H6的聚乙二醇化可通过本领域中已知的任意聚乙二醇化反应进行(参见例如，EP 0 154 316；Delgado et al.，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9：249，1992；Duncan and Spreafico，Clin.Pharmacokinet.27：290，1994；Franciset al.，Int J Hematol 68：1，1998)。例如，聚乙二醇化可通过与活性聚乙二醇分子的酰化反应或者烷基化反应进行。在另一种方法中，通过将活化的PEG浓缩而形成zB7H6缀合物，在所述活化PEG中，PEG的末端羟基或氨基已被一种活化的连接体代替(参见例如，Karasiewicz等人的美国专利No.5,382,657)。对于聚乙二醇化反应，多聚物分子的分子量一般为约2kDa-约100kDa、约5kDa-约50kDa、约12kDa-约25kDa。水溶性聚合物与zB7H6的摩尔比例范围可通常为1∶1-100∶1。一般而言，水溶性聚合物与zB7H6的摩尔比例，对于多聚乙二醇化可为1∶1-20∶1，对于单聚乙二醇化为1∶1-5∶1。
例如，可使用zB7H6多肽从溶液中亲和纯化同种的反受体(如NKp30)，或者作为一种体外测定工具。例如，zB7H6反受体在生物样品中的存在可使用zB7H6-免疫球蛋白融合蛋白进行检测，其中所述zB7H6部分用于结合所述反受体，并且大分子例如蛋白A或Fc抗体用于将所述融合蛋白结合于固体载体上。这种系统可用于识别干扰zB7H6与其反受体(如NKp30)结合的激动剂和拮抗物。
zB7H6多肽还可用于通过特异性结合细胞上的NKp30而在体外触发或增强信号，以及通过将它们肠胃外给药(如通过肌内注射、皮下注射或静脉注射)以将NKp30结合于细胞上并触发或增强NK细胞的NKp30介导的激活而在体内作为激动剂。例如，可溶性zB7H6融合蛋白可用于在体外触发或增强NK细胞的细胞裂解活性，或者用于离体或在体内触发或增强这种活性，以便治疗癌症或感染性疾病。这些用途及其他用途将在本文中进一步描述。
使用如本文描述的方法，本领域普通技术人员可制备本文描述的多种zB7H6多肽，包括包含SEQ ID NO：2第25-266号残基的zB7H6细胞外结构域的多肽，或者包含与SEQ ID NO：2第25-266号残基基本相同并保持其NKp30结合性质或其他功能性质的zB7H6细胞外结构域的多肽。本发明的zB7H6多肽通常通过重组产生，但这类多肽还可通过本领域中的其他常用方法(如多肽的合成产生或者通过从天然源分离zB7H6多肽)产生。重组体zB7H6受体多肽通常通过表达这样的多核苷酸而进行制备，所述多核苷酸含编码zB7H6多肽的DNA片段。例如，重组体zB7H6可溶性受体多肽通常可通过以下方式进行制备：表达包含编码SEQ ID NO：2的zB7H6多肽的细胞外结构域(SEQ ID NO：2的第25-266号连续氨基酸残基)或者其功能性变体或片段的截端DNA的多核苷酸。由于所制备的可溶性细胞外结构域多肽优选以基本上无跨膜和细胞内多肽片段，编码这种可溶性多肽的多核苷酸一般会没有编码跨膜和细胞内区段的区域。用于蛋白的重组体产生的方法在本领结构域中是公知的。
如上文所述，可溶性zB7H6多肽还可包括如本文中普遍公开的其他多肽片段。在可溶性zB7H6融合蛋白的情况下，这类实施方案还可通过本领域技术人员公知的方法进行制备。例如，融合蛋白的制备可通过以下方式进行：制备融合蛋白的每个组件并将它们进行化学缀合。例如，用于融合蛋白的酶切割或化学切割的一般方法记载于Ausubel(1995)第16-19至16-25页。或者，编码处于适当阅读框中的所述融合蛋白两组件的多核苷酸可使用已知技术产生，并使用例如本文中将进一步描述的方法重组地表达。
如上文指出的，zB7H6受体多肽通常可通过以下方式制备：表达包含编码zB7H6多肽的DNA区段的多核苷酸。对于可溶性蛋白的形式，所制备的细胞外结构域多肽优选以基本上没有跨膜和细胞内多肽片段。为了指导所述受体结构域从所述宿主细胞的输出，将所述受体DNA连接于编码分泌肽例如t-PA分泌肽的第二DNA区段上。在一些实施方案中，为了有利于所述分泌的受体结构域的纯化，可将C端延伸融合于所述受体多肽，所述C端延伸例如多组氨酸标签、P物质、FLAGTM肽(Hopp et al.，Biotechnology 6：1204-1210，1988；来自Eastman Kodak Co.，New Haven，CT)或者存在其抗体或其他特异性结合剂的另一种多肽或蛋白。
因此，在另一方面，本发明还提供了编码本文描述的任一zB7H6多肽的多核苷酸。通常，编码可溶性zB7H6多肽的多核苷酸可包含编码SEQ IDNO：2的第25-266号残基的细胞外zB7H6结构域或者其功能性变体或片段的多核苷酸区。在一些其他变化方案中，本发明的多核苷酸可编码细胞膜结合形式的zB7H6，例如包含SEQ ID NO：2第25-454号或第1-454号残基的多肽，或者它的功能性变体。在一个具体实施方案中，编码可溶性zB7H6多肽的多核苷酸可包含SEQ ID NO：1第73-798号或第1-798号核苷酸残基；编码SEQ ID NO：2第25-454号或第1-454号残基的多核苷酸实例包括包含SEQ ID NO：1第73-1362号或第1-1362号的多核苷酸。在一些变化方案中，本发明的多核苷酸还包括一个或多个编码zB7H6多肽的其他组件的多核苷酸区，例如zB7H6融合蛋白的异源性多肽组件、信号分泌序列和/或亲和标签。
如本领域技术人员可理解的，由于遗传密码子的简并性，可制备极大数目的核酸，它们都可编码本发明的zB7H6多肽。因此，如果给定zB7H6多肽的一条具体氨基酸序列，那么可通过以下方式制备任意数目的编码所述多肽的不同核酸：使用已知技术以不改变zB7H6多肽的氨基酸序列的方式改变所述序列的一个或多个密码子。
zB7H6编码cDNA可通过多种方法分离，例如通过以全长或部分人cDNA进行探测，或者基于所公开序列以一组或多组简并探针进行探测。还可使用聚合酶链式反应以从本文公开的代表性人zB7H6序列设计的引物克隆cDNA。此外，可将cDNA文库用于转化或转染宿主细胞，并以抗zB7H6多肽的抗体检测所需cDNA的表达。
例如，编码人zB7H6基因的核酸分子可通过使用基于SEQ ID NO：1的多核苷酸探针筛选人cDNA或基因组文库获得。上述技术是公知的标准技术，可以使用市售的克隆试剂盒完成。例如参见Ausubel et al.(编著)，ShortProtocols in Molecular Biology(第3版，John Wiley&Sons 1995)；Wu et al.，Methods in Gene Biotechnology，CRC Press，Inc.1997；Aviv and Leder，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 69：1408，1972；Huynh et al.，“Constructing andScreening cDNA Libraries in λgt10 andλgt11”in DNA Cloning：APractical Approach Vol.I，Glover(编著)，第49页(IRL Press，1985)。
编码人zB7H6基因的核酸分子可使用聚合酶链式反应(PCR)以具有基于zB7H6基因或cDNA的核苷酸序列的寡核苷酸引物获得。在下述文献中提供了用PCR筛选文库的一般性方法：例如，Yu et al.，“Use of thePolymerase Chain Reaction to Screen Phage Libraries”in  Methods inMolecular Biology，Vol.15：PCR Protocols：Current Methods andApplications(White(编著)，Humana Press，Inc.，1993)。此外，在下述文献中描述了使用PCR分离相关基因的技术：例如，Preston，“Use ofDegenerate Oligonucleotide Primers and the Polymerase Chain Reactionto Clone Gene Family Members”in Methods in Molecular Biology，Vol.15：PCR Protocols：Current Methods and Applications，White(编著)，Humana Press，Inc.1993。或者，可通过使用互为引物(mutually priming)的长寡核苷酸和本文所述的核苷酸序列合成核酸分子，来获得zB7H6基因(参见例如，Ausubel，见上文)。使用聚合酶链式反应的已知技术能够合成长度为至少两千个碱基的DNA分子(参见例如，Adang et al.，PlantMolec.Biol.21：1131，1993；Bambot et al.，PCR Methods and Applications2：266，1993，Dillon et al.，“Use of the Polymerase Chain Reaction for theRapid Construction of Synthetic Genes”in Methods in Molecular Biology，Vol.15：PCR Protocols：Current Methods and Applications，第263-268页(White(编著)，Humana Press，Inc.1993)和Holowachuk et al.，PCRMethods Appl.4：299，1995)。关于多核苷酸合成的综述可以参见例如，Glick and Pasternak，Molecular Biotechnology，Principles and Applicationsof Recombinant DNA(ASM Press 1994)；Itakura et al.，Annu.Rev.Biochem.53：323，1984和Climie et al.，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 87：633，1990。
如前述，本领结构域技术人员应容易地认识到，由于遗传密码子的简并性，这些多核苷酸分子中可能有许多种序列变体。因此，本发明考虑到了包括SEQ ID NO：1的简并核苷酸的编码zB7H6多肽的核酸分子以及它们的RNA等价物。涵盖给定氨基酸所有可能密码子的简并密码子在表3中列出。
表3：氨基酸及相应简并密码子
  氨基酸   单字母代码   密码子   简并密码子
  Cys   C   TGC TGT   TGY
  Ser   S   AGC AGT TCA TCC TCGTCT   WSN
  Thr   T   ACA ACC ACG ACT   CAN
  Pro   P   CCA CCC CCG CCT   CCN
  Ala   A   GCA GCC GCG GCT   GCN
  Gly   G   GGA GGC GGG GGT   GGN
  Asn   N   AAC AAT   AAY
  Asp   D   GAC GAT   GAY
  Glu   E   GAA GAG   GAR
  Gln   Q   CAA CAG   CAR
  His   H   CAC CAT   CAY
  Arg   R   AGA AGG CGA CGCCGG CGT   MGN
  Lys   K   AAA AAG   AAR
  Met   M   ATG   ATG
  Ile   I   ATA ATC ATT   ATH
  Leu   L   CTA CTC CTG CTT TTATTG   YTN
  Val   V   GTA GTC GTG GTT   GTN
  Phe   F   TTC TTT   TTY
  Tyr   Y   TAC TAT   TAY
  Trp   W   TGG   TGG
  Ter   TAA TAG TGA   TRR
  Asn|Asp   B   RAY
  Glu|Gln   Z   SAR
  Any   X   NNN
至于具体宿主细胞中的表达，不同的物种可能表现出“偏好密码子使用”。总体而言可参见Grantham et al.，Nucl.Acids Res.8：1893，1980；Haas et al.Curr.Biol.6：315，1996、Wain-Hobson et al.，Gene 13：355，1981；Grosjean and Fiers，Gene 18：199，1982；Holm，Nuc.Acids Res.14：3075，1986；Ikemura，J.Mol.Biol.158：573，1982；Sharp andMatassi，Curr.Opin.Genet.Dev.4：851，1994；Kane，Curr.Opin.Biotechnol.6：494，1995和Makrides，Microbiol.Rev.60：512，1996。本文所使用的术语“偏好密码子使用”或”偏好密码子”在本领域中是指在某一物种的细胞中最通常使用的蛋白质翻译密码子，因此偏好编码每种氨基酸的可能密码子(见表2)中的一种或几种密码子。例如，ACA、ACC、ACG或ACT都可能编码氨基酸苏氨酸(Thr)，但是在哺乳动物细胞中ACC是最常用的密码子；在其他物种例如昆虫细胞、酵母、病毒或细菌中，可能会偏好使用不同的Thr密码子。可以使用多种本领域已知的方法在本发明的多核苷酸中引入某一特定物种的偏好密码子。将偏好密码子序列引入重组DNA中可以例如通过使蛋白在特定细胞类型或物种中更有效地翻译，从而提高蛋白质的产量。因此，本文公开的简并密码子序列可以作为在本领域常用的和本文公开的各种细胞类型和物种中优化多核苷酸表达的模板。可以测试和优化含有偏好密码子的序列在各种物种中的表达，并如本文所公开地进行功能测试。
本领域技术人员应认识到，SEQ ID NO：1所公开的序列代表的是人zB7H6的一个等位基因，预计也会存在等位基因变异和可变剪接。可以通过使用标准技术探测来自不同个体的cDNA文库或基因组文库，从而克隆这一序列的等位基因变体。本文公开的核苷酸序列的等位基因变体，包括含有沉默突变的等位基因变体和突变导致氨基酸序列改变的等位基因变体，以及作为本文公开的氨基酸序列的等位基因变体的蛋白质，都在本发明的范围之内。从可变剪接的mRNA产生的cDNA分子，其编码仍保留SEQ ID NO：2的zB7H6多肽性质的zB7H6多肽(如SEQ ID NO：2第25-266号残基的细胞外结构域的保持NKp30结合能力的变体)，以及由这些cDNA和mRNA编码的多肽，也包括在本发明的范围之内。可以通过使用本领结构域已知的标准技术探测来自不同个体或组织的cDNA文库或基因组文库，从而克隆这些序列的等位基因变体和剪接变体。
变体zB7H6核酸分子可通过本领结构域中公知的技术进行识别。用于识别这类变体的合适标准包括(a)确定所编码的多肽与SEQ IDNO：2的氨基酸序列或者与其对应于SEQ ID NO：2第25-266号残基的B7H6细胞外结构域的区域之间的序列同一性或相似性；和(b)杂交测定。这类zB7H6核酸变体包括：(1)在严格洗涤条件下仍然能与具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列的核酸分子(或其互补物或包含SEQ IDNO：1第73-798号残基的片段)杂交的核酸分子，其中所述洗涤严格度等同于含0.1％SDS的0.5x-2x SSC，温度55-65℃；以及(2)编码的多肽与SEQ ID NO：2的氨基酸序列或与SEQ ID NO：2的第25-266号残基具有至少80％、至少85％、至少90％、％至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的核酸分子。或者，zB7H6变体可以被表征为：(1)在严格洗涤条件下仍然能与具有SEQ IDNO：1的核苷酸序列的核酸分子(或其互补物或包含SEQ ID NO：1第73-798号残基的片段)杂交的核酸分子，其中所述洗涤严格度等同于含0.1％SDS的0.5x-2x SSC，温度55-65℃；以及(2)编码的多肽与SEQID NO：2的氨基酸序列或与SEQ ID NO：2的第25-266号残基具有至少80％、至少85％、至少90％、％至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的核酸分子。
一般而言，所选择的严格条件为在确定的离子强度和pH值下比特定序列的热解链温度(Tm)低大约5℃。Tm为(在确定的离子强度和pH值下)50％的靶序列与完全匹配的探针杂交时的温度。在杂交后可以在严格条件下或在高度严格条件下洗涤核酸分子以除去未杂交的核酸分子。参见，例如，Sambrook et al.，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，第2版(Cold Spring Harbor Press 1989)；Ausubel et al.，(编著)，Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley and Sons，Inc.1987)；Berger and Kimmel(编著)，Guide to Molecular CloningTechniques，(Academic Press，Inc.1987)；和Wetmur，Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.26：227(1990))。序列分析软件例如OLIGO 6.0(LSR；Long Lake，MN)和Primer Premier 4.0(Premier BiosoftInternational；Palo Alto，CA)以及一些因特网网站都是可获得的工具，可以用于分析给定序列并基于用户确定的标准计算Tm。对于特定的多核苷酸杂交，本领域技术人员完全能够选择合适的杂交条件和洗涤条件。
序列同一性百分数可通过例如上文描述的常规方法容易地确定。
在一些实施方案中，zB7H6的变体的特征在于与相应氨基酸序列(如SEQ ID NO：2的第25-266号残基)有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性，其中氨基酸序列的变化由一个或多个保守氨基酸置换造成。例如可以通过用核苷酸置换SEQ ID NO：1中列出的核苷酸，在编码zB7H6的多核苷酸中引入保守氨基酸改变。可以通过寡核苷酸定向诱变、接头分区诱变、使用聚合酶链式反应的诱变等方法(参见Ausubel(1995)；和McPherson(编著)，Directed Mutagenesis：A Practical Approach(IRLPress 1991))，获得这类“保守性氨基酸”变体。如上文指出的，可通过与NKp30(如人NKp30)特异性结合的能力以及/或者评估所述变体或片段触发NKp30介导的NK细胞激活的测定法，来识别功能性zB7H6变体多肽。
本发明的zB7H6多肽还可包含非天然存在的氨基酸残基。非天然存在的氨基酸包括但不限于：反式3-甲基脯氨酸、2，4-甲醇基脯氨酸、顺式4-羟基脯氨酸、反式4-羟基脯氨酸、N-甲基甘氨酸、别苏氨酸、甲基苏氨酸、羟基乙基半胱氨酸、羟基乙基高半胱氨酸、硝基谷氨酰胺、同型谷氨酰胺(homoglutamine)、六氢哌啶羧酸、噻唑烷羧酸、脱氢脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸，3，3-二甲基脯氨酸、叔-亮氨酸、正缬氨酸、2-氮杂苯丙氨酸、3-氮杂苯丙氨酸、4-氮杂苯丙氨酸和4-氟苯丙氨酸。在本领域中，一些用于将非天然存在的氨基酸残基引入蛋白质的方法是已知的。例如，可以使用这样一种体外系统，该系统中使用化学氨基酰化抑制剂tRNA抑制了无义突变。合成氨基酸和氨基酰化tRNA的方法是本领域中已知的。通常，在一种含有大肠杆菌(E.coli)S30提取物以及市售的酶类和其他试剂的无细胞系统中，进行含有无义突变的质粒的转录和翻译。通过色谱法纯化蛋白质(参见例如，Robertson et al.，J.Am.Chem.Soc.113：2722，1991；Ellman et al.，Methods Enzymol.202：301，1991；Chung et al.，Science 259：806，1993和Chung et al.，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 90：10145，1993)。在第二种方法中，通过微注射突变mRNA和化学氨基酰化抑制剂tRNA，在非洲蟾蜍(Xenopus)卵母细胞中进行翻译(参见Turcatti et al.，J.Biol.Chem.271：19991，1996)。在第三种方法中，在不含有所要取代的天然氨基酸(例如苯丙氨酸)而含所需的非天然存在的氨基酸(例如2-氮杂苯丙氨酸、3-氮杂苯丙氨酸、4-氮杂苯丙氨酸或4-氟苯丙氨酸)的培养基中培养大肠杆菌细胞。非天然存在的氨基酸就被引入蛋白质中而替代了其天然对应物(参见Koide et al.，Biochem.33：7470，1994)。同时，可以通过体外化学修饰将天然存在的氨基酸残基转化为非天然存在的种类。可以将化学修饰与定点诱变相结合，以进一步扩展置换的范围(参见Wynn and Richards，Protein Sci.2：395，1993)。
可以用有限数量的非保守性氨基酸、不是由遗传密码子编码的氨基酸、非天然存在的氨基酸和非天然氨基酸置换zB7H6的氨基酸残基。
可以根据下述本领域已知的方法识别本发明多肽中的关键氨基酸，例如定点诱变或丙氨酸扫描(alanine-scanning)诱变(Cunninghamand Wells，Science 244：1081，1989；Bass et al.，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 88：4498，1991；Coombs and Corey，“Site-Directed Mutagenesisand Protein Engineering，”in Proteins：Analysis and Design 259-311(Angeletti编著，Academic Press，Inc.1998))。在丙氨酸扫描诱变技术中，在分子中的每个残基位置处都引入单个的丙氨酸突变，并测试所得的突变体分子的生物活性(例如NKp30结合及/或所述变体或片段触发NKp30介导的NK细胞激活的能力)，从而识别分子活性的关键氨基酸残基(参见例如，Hilton et al.，J.Biol.Chem.271：4699，1996)。
虽然可以使用序列分析来进一步确定zB7H6NKp30结合区，但是也可以通过对结构的物理分析来测定在zB7H6与NKp30结合中起作用的氨基酸，这可通过例如下述的方法并结合对推定的接触位点氨基酸的突变而测定：核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和力标记(参见例如，de Vos et al.，Science 255：306，1992；Smith et al.，J.Mol.Biol.224：899，1992和Wlodaver et al.，FEBS Lett.309：59，1992)。
可以用已知的诱变方法和筛选方法制备多个氨基酸置换并进行测试，所述方法例如Reidhaar-Olson和Sauer(Science 241：53，1988)或Bowie和Sauer(Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 86：2152，1989)中公开的方法。简而言之，以上著者公开的方法包括同时随机化多肽中的两个或多个位置、筛选功能性多肽，并随后对诱变的多肽测序以确定在每一位置上可以置换的范围。其他可以使用的方法包括噬菌体展示(参见例如，Lowman et al.，Biochem.30：10832，1991；Ladner等人的美国专利No.5,223,409；国际申请公布WO 92/06204(Huse))和区域定向诱变(参见例如，Derbyshire et al.，Gene 46：145，1986和Ner et al.，DNA7：127，1988)。
还可以通过DNA改组技术产生变体zB7H6核苷酸和多肽序列(参见例如，Stemmer，Nature 370：389，1994；Stemmer，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 91：10747，1994和国际申请公布WO 97/20078)。简而言之，通过将母体DNA的随机片段化，然后使用PCR进行重新组装来进行体外同源重组，从而产生随机引入的点突变，以产生变体DNA分子。这一技术可以通过使用母体DNA分子的家族(例如来自不同物种的等位基因变体或DNA分子)进行改进，以在过程中引入另外的可变性。对所需活性的选择或筛选，以及接着重复进行另外的诱变的和测定提供了序列的快速“进化”，这种进化是通过选择所需的突变并同时筛选掉有害的改变而实现的。
本文公开的诱变方法可以与高通量自动筛选方法相结合，以检测宿主细胞中克隆的诱变多肽的活性。可以使用现代化装置从宿主细胞中回收编码生物活性多肽(例如特异性结合NKp30的多肽)的诱变DNA分子，并对其快速测序。这些方法使得可以迅速确定目的多肽中个体氨基酸残基的重要性，并可以应用于未知结构的多肽。
如上文所述，本发明还包括zB7H6细胞外结构域的“功能性片段”和编码这类功能性片段的核酸分子。可以进行核酸分子的常规缺失分析，以获得编码zB7H6细胞外结构域的核酸分子的功能性片段。例如，可以用Bal31核酶来消化具有SEQ ID NO：1第73-798号残基的核苷酸序列的DNA分子，以获得一系列嵌套缺失。然后将所述片段插入表达载体的合适读码框中，分离所表达的多肽并测试其与NKp30结合的能力。或者可以不使用外切核酸酶消化而使用寡核苷酸定向诱变，来引入缺失或者终止密码子来说明所需片段的产生。或者可以使用聚合酶链式反应来合成zB7H6基因的特定片段。
这一通用方法可通过对干扰素的一端或两端截短的研究来举例说明(参见Horisberger and Di Marco，Pharmac.Ther.66：507，1995)。此外，用于蛋白质功能性分析的标准技术在下述文献中有所描述：例如，Treuter et al.，Molec.Gen.Genet.240：113，1993；Content et al.，“Expression and preliminary deletion analysis of the 42kDa 2-5Asynthetase induced by human interferon”in Biological InterferonSystems，Proceedings of ISIR-TNO Meeting on Interferon Systems 65-72(Cantell编著，Nijhoff 1987)；Herschman，“The EGF Receptor，”inControl of Animal Cell Proliferation，Vol.1，169-199(Boynton et al.编著，Academic Press 1985)；Coumailleau et al.，J.Biol.Chem.270：29270，1995；Fukunaga et al.，J.Biol.Chem.270：25291，1995；Yamaguchi etal.，Biochem.Pharmacol.50：1295，1995和Meisel et al.，Plant Molec.Biol.30：1，1996。
本发明还包括编码这样一种多肽的zB7H6多核苷酸的功能性片段，所述多肽与SEQ ID NO：2的氨基酸序列相比具有氨基酸改变的多肽(例如与SEQ ID NO：2的第25-266号残基相比有改变)。可以如上文所述地通过测定与所公开的核苷酸和氨基酸序列的同一性水平，基于结构来识别变体zB7H6基因。另一种基于结构识别变体基因的方法是测定一种编码潜在变体zB7H6基因的核酸分子是否能够与包括例如SEQ ID NO：1的核苷酸序列的核酸分子杂交。
通过将包含本文提供的多核苷酸序列的多核苷酸分子置于载体中，而扩增所述分子。可使用病毒载体和非病毒载体，包括质粒。质粒的选择将依赖于需要在其中进行扩增的细胞类型和扩增的目的。一些载体可用于扩增及制备大量的所需DNA序列。另一些载体适宜于在培养细胞中表达。还有另一些载体适宜于在整个动物或人体的细胞中转移及表达。选择合适的载体是本领域技术人员的能力能及的。许多这类载体可市购得到。通常借助DNA连接酶附着于载体中被切割的限制酶位点，将部分或全长多核苷酸插入至载体中。或者，可通过体内同源重组将所需的核苷酸序列插入。通常通过将同源区附着于所述载体中所需核苷酸序列的侧翼，实现这一点。例如，通过寡核苷酸的连接或者通过使用同时包含同源区和一部分所需核苷酸序列的引物的多聚酶链反应，添加所述同源区。
为了表达，可应用表达盒或体系。为了表达zB7H6基因，将编码所述多肽的核酸分子——可操作连接于在表达载体中控制转录表达的调节序列上——导入至宿主细胞中。除了转录调节序列例如启动子和增强子之外，表达载体还可包含翻译调节序列以及适合于选择携带所述表达载体的细胞的标记基因。由本发明多核苷酸编码的基因产物可在任何常规表达体系中表达，所述表达体系例如细菌体系、酵母体系、昆虫体系、两栖动物体系和哺乳动物体系。合适的载体和宿主细胞记载于例如美国专利No.5,654,173中。在所述表达载体中，所述zB7H6多肽编码多核苷酸适当地连接于调节序列，从而获得所需的表达性质。它们可包含启动子(附着于正义链的5′端或反义链的3′端)、增强子、终止子、操纵子、抑制子和诱导子。启动子可以是诱导型的或组成型的。在一些情形中可能序列使用条件激活的启动子，例如组织特异性或发育阶段特异性启动子。使用上文描述的用于连接于载体的技术，将它们连接于所需的核苷酸序列。可以使用本领域中已知的任意技术。因此，表达载体通常提供诱导型的或组成型的转录和翻译起始区以及转录和翻译终止区，其中编码区可以可操作地连接并且受转录起始区的转录控制。这些控制区对于编码所述zB7H6多肽的DNA可以是天然的，或者可以源自外部来源。
可将所述表达盒引入至多种载体中，例如质粒；BAC；YAC；细菌噬菌体，如λ、P1、M13等；植物或动物病毒载体(如基于逆转录病毒的载体、腺病毒载体)等，其中所述载体特征一般在于可提供对包含所述表达载体的细胞的选择能力。所述载体可保证染色体外维持，特别是作为质粒或病毒，或者保证整合至宿主染色体中。如果需要染色体外维持，那么可提供原始序列用于质粒的复制，所述质粒可以是低拷贝数或高拷贝数。许多标记物可用于选择，特别是那些可抵御毒素，更具体是抵御抗生素的标记物。所选择的具体标记物是依照宿主的性质进行选择的，其中在一些情况下，可采用营养缺陷型宿主和互补物。可使用任何常规方法引入DNA构建体，所述方法包括例如接合、细菌转化、钙沉淀的DNA、电穿孔、融合、转染、以病毒载体感染、基因枪等。
依赖于表达的目的，可将zB7H6多肽依照常规的方式在原核生物或真核生物中表达。为了大规模产生蛋白，单细胞生物如大肠杆菌、枯草杆菌(B.subtilis)、酵母(S.cerevisiae)，与杆状病毒载体结合的昆虫细胞或高等生物如脊椎动物特别是哺乳动物的细胞(如COS 7细胞、HEK 293、CHO、非洲蟾蜍(Xenopus)卵母细胞)可用作表达宿主细胞。因此，感兴趣的具体表达体系包括源自细菌、酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞的表达体系。细菌中的代表性表达体系包括，例如Chang et al.，Nature 275：615，1978；Goeddel et al.，Nature(1979)281：544，1979；Goeddel et al.，Nucleic Acids Res.8：4057，1980；EP 0036,776；美国专利No.4,551,433；DeBoer et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：21-25，1983；和Siebenlist et al.，Cell 20：269，1980中描述的那些。酵母中的代表性表达体系包括，例如Hinnen et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75：1929，1978；Ito et al.，J.Bacteriol.153：163，1983；Kurtz etal.，Mol.Cell.Biol.6：142，1986；Kunze et al.，J.Basic Microbiol.25：141，1985；Gleeson et al.，J.Gen.Microbiol.132：3459，1986；Roggenkamp etal.，Mol.Gen.Genet.202：302，1986；Das et al.，J.Bacteriol.158：1165，1984；De Louvencourt et al.，J.Bacteriol.154：737，1983；Van den Berget al.，Bio/Technology 8：135，1990；Kunze et al.，J.Basic Microbiol.25：141，1985；Cregg et al.，Mol.Cell.Biol.5：3376，1985；美国专利No.4,837,148和4,929,555；Beach and Nurse，Nature 300：706，1981；Davidow et al.，Curr.Genet.10：380，1985；Gaillardin et al.，Curr.Genet.10：49，1985；Ballance et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.112：284-289，1983；Tilburn et al.，Gene 26：205-221，1983；Yelton et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：1470-1474，1984；Kelly and Hynes，EMBO J.4：475479，1985；EP 0 244,234；and WO 91/00357中描述的那些。昆虫细胞中的代表性表达体系包括，例如美国专利No.4,745,051；Friesen et al.，“The Regulation of Baculovirus Gene Expression”，in：The Molecular Biology Of Baculoviruses(W.Doerfler，编著，1986)；EP0 127,839；EP 0 155,476；and Vlak et al.，J.Gen.Virol.69：765-776，1988；Miller et al.，Ann.Rev.Microbiol.42：177，1988；Carbonell et al.，Gene 73：409，1988；Maeda et al.，Nature 315：592-594，1985；Lebacq-Verheyden et al.，Mol.Cell.Biol.8：3129，1988；Smith et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：8844，1985；Miyajima et al.，Gene 58：273，1987；和Martin et al.，DNA 7：99，1988中描述的那些。多种杆状病毒株和变体以及来自宿主的相应容许昆虫宿主细胞记载于Lnckow et al.，Bio/Technology 6：47-55，1988；Miller et al.，Generic Engineering8：277-279，1986；和Maeda et al.，Nature 15：592-594，1985中。哺乳动物细胞中的代表性表达体系包括，例如Dijkema et al.，EMBO J.4：761，1985，Gorman et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79：6777，1982；Boshartet al.，Cell 41：521，1985；和美国专利No.4,399,216中描述的那些。例如，如Ham and Wallace，Meth.Enz.58：44，1979；Barnes and Sato，Anal.Biochem.102：255，1980；美国专利No.4,767,704，4,657,866，4,927,762，4,560,655，WO 90/103430，WO 87/00195，和美国专利No.RE 30,985中所述，哺乳动物表达的其他特征被促进。
本主题的核酸可用于产生遗传改变的非人动物或者在细胞系中生成位点特异性基因改变。术语“转基因的”意欲涵盖具有外加编码zB7H6多肽的DNA的遗传改变动物，或者具有编码可在宿主细胞中稳定传递的zB7H6多肽的外源DNA的遗传改变动物。可通过同源重组制备转基因动物。或者，可将核酸构建体随机插入至基因组中。用于稳定整合的载体包括质粒、反转录病毒或其他动物病毒、YAC等。感兴趣的是转基因哺乳动物，特别是啮齿动物(如大鼠、小鼠)。
用于同源重组的DNA构建体应包含至少一部分编码可溶性zB7H6多肽的DNA，并且应包括与靶基因座有同源性的区域。为了方便起见，用于阳性筛选和阴性筛选的标记物均被包括在内。通过同源重组产生具有靶向基因改变的细胞的方法是本领域中已知的。用于转染哺乳动物细胞的多种技术参见，例如Known et al.Methods in Enzymology185：527-537，1990。
对于胚胎干(ES)细胞，可应用ES细胞系，或者ES细胞可以是从宿主(如小鼠、大鼠、豚鼠)新鲜获取的。将这类细胞在合适的成纤维细胞饲养层上培养或在存在白血病抑制因子(LIF)的条件下培养。在ES细胞已被转化后，可将它们用于产生转基因动物。在转化后，将细胞在合适的培养基中置于饲养层上。可通过采用选择性培养基检测包含所述构建体的细胞。在使集落生长足够时间后，将它们挑选出并对同源重组的发生进行分析。然后，可将那些显示同源重组的集落用于胚胎操作和胚泡注射。胚泡获自4-6周龄的超排卵雌性。将ES细胞进行胰蛋白酶处理，并将改变的细胞注入至胚泡的囊胚腔中。在注入后，将胚泡送返至假孕雌性的各子宫角中。然后，使雌性至足月生产，并就具有所述构建体的突变体细胞对产仔进行筛选。通过展现不同表型的胚泡和ES细胞，嵌合的后代可被容易地检测。筛选所述嵌合动物中编码zB7H6多肽的DNA的存在情况，并将具有改变的雄性和雌性进行交配以产生纯合子的后代。转基因动物可以是任何非人动物，例如实验室动物或家养动物。转基因动物可用于确定候选药物在体内环境中的效果。
本发明还包括本文描述的重组体载体和包含所述载体的宿主细胞。通常，本发明的重组体载体和宿主细胞是分离的；然而，包含本发明的多核苷酸的宿主细胞可以是遗传改变的动物的一部分。
如果任一上述宿主细胞或者其他合适宿主细胞或生物体被用于复制和/或表达本发明的多核苷酸或核酸，那么所产生的复制核酸、RNA、表达的蛋白或多肽作为所述宿主细胞或生物体的产物落在本发明的范围内。可通过本领域中已知的任何合适方法回收所述产物。zB7H6多肽可作为单体或多聚体(如同二聚体、异二聚体、四聚体)产生。
因此，仍在另一方面中，本发明提供了一种使用本文描述的重组体宿主细胞制备可溶性zB7H6多肽的方法，所述可溶性zB7H6多肽包括其单体或多聚体(如同二聚体、异二聚体、四聚体)形式。这类方法通常包括，在可溶性zB7H6蛋白可表达的条件下培养以编码所述蛋白的表达载体转化或转染的宿主细胞，以及从所述宿主细胞回收所述可溶性zB7H6蛋白。用于回收原核生物和真核生物宿主细胞中重组体蛋白的技术通常是本领域中公知的。
例如，用于表达并回收哺乳动物细胞体系产生的外源蛋白的常规方法由例如Etcheverry，“Expression of Engineered Proteins in Mammalian CellCulture，”in Protein Engineering：Principles and Practice 163(Cleland etal.，编著，Wiley-Liss，Inc.1996)提供。用于回收细菌体系产生的外源蛋白的标准方法由例如Grisshammer et al.，“Purification of over-producedproteins from E.coli cells，”in DNA Cloning 2：Expression Systems，2ndEdition 59-92(Glover et al.，编著，Oxford University Press 1995)提供。用于从杆状病毒体系分离重组体蛋白的已有方法由例如Richardson(编著)，Baculovirus Expression Protocols(The Humana Press，Inc.1995)提供。
当在例如大肠杆菌的细菌中表达可溶性zB7H6多肽时，所述多肽可能通常以不溶性颗粒的形式保留在细胞质中，或者可能通过细菌分泌序列被定向至壁膜间隙。对于前一种情况，可以裂解细胞、回收颗粒并且使用例如异硫氰酸胍或尿素使其变性。然后通过稀释变性液(例如用含有尿素和还原型和氧化型谷胱甘肽的溶液进行透析，然后再用缓冲盐溶液进行透析)使变性的多肽重新折叠并二聚化。对于后一种情况，可以通过破碎细胞(例如超声破碎或渗透压破碎)使得壁膜间隙中的内容物释放并回收蛋白质，从而以从壁膜间隙中回收可溶性和功能性形式的所述多肽，这样就无需进行变性和重新折叠。
或者，可以使用完全固相合成法、局部固相合成法、片段缩合法或经典的溶液合成法来合成本发明的zB7H6多肽。这些合成方法是本领域技术人员公知的(参见例如，Merrifield，J.Am.Chem.Soc.85：2149，1963；Stewart et al.，“Solid Phase Peptide Synthesis”(第2版，PierceChemical Co.1984)；Bayer and Rapp，Chem.Pept.Prot.3：3，1986；Atherton et al.，Solid Phase Peptide Synthesis：A Practical Approach(IRL Press 1989)；Fields and Colowick，“Solid-Phase PeptideSynthesis，”Methods in Enzymology第289卷(Academic Press 1997)和Lloyd-Williams et al.，Chemical Approaches to the Synthesis of Peptidesand Proteins(CRC Press，Inc.1997))。完全化学合成策略的一些修改策略，例如“天然化学连接”和“表达的蛋白质连接”也是本领域中的标准方法(参见例如，Dawson et al.，Science 266：776，1994；Hackeng et al.，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 94：7845，1997；Dawson，Methods Enzymol.287：34，1997；Muir et al，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 95：6705，1998和Severinov and Muir，J.Biol.Chem.273：16205，1998)。
如前文所述，可溶性zB7H6多肽可以作为单体形式或以多种多聚体形式(如同二聚体、异二聚体、四聚体)的任一种产生。在重组产生异多聚体的情况下，所述异多聚体包含至少一条为本文所述可溶性zB7H6多肽的多肽链和至少另一条为可溶性非zB7H6多肽的多肽链，将宿主细胞以编码不同多肽链的不同表达载体转化或转染。在一些实施方案中，将相同的宿主细胞以编码异多聚体的不同链的不同表达载体转染或转化，然后从培养基中分离异多聚体蛋白；或者，可在不同宿主细胞群中分别产生编码不同多肽链的每种载体，随后在分离重组体蛋白后用于形成多聚体复合物。例如，可以仔细考虑的比例将不同多肽链组件组合，以产生所需的异多聚体分子。可将异多聚体的不同多肽链以多种标签序列(如His标签、FLAG标签和Glu-Glu标签)标记，以使得可对所产生分子的组成和纯度进行分析。在具体的实施方案中，所述异多聚体为异二聚体(例如其中一条多肽链为包含例如免疫球蛋白重链区的可溶性zB7H6融合蛋白的二聚体)，或异四聚体(例如其中一条多肽链为包含例如VASP结构域的可溶性zB7H6融合蛋白的四聚体)。
将本发明的多肽通常纯化至相对于污染性大分子(特别是其他蛋白和核酸)至少约80％的纯度，更通常至至少约90％的纯度，优选至至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％的纯度，并且不含有感染性物质和热原。本发明的多肽还可被纯化至药用级纯度，即大于99.9％的纯度。在某些制品中，纯化的多肽基本上不含有其他多肽，特别是不含有动物来源的其他多肽。
可以使用分级分离方法和/或常规纯化方法以获得从天然来源(例如人组织来源)纯化出的zB7H6多肽制品、合成的zB7H6多肽和从重组宿主细胞中纯化出的重组zB7H6多肽。通常，可以使用硫酸铵沉淀法和酸或促溶剂萃取法来对样本进行分级分离。示例性的纯化步骤可包括羟基磷灰石、分子筛、FPLC和反相高效液相色谱。合适的色谱介质包括衍生化的葡聚糖、琼脂糖、纤维素、聚丙烯酰胺和特制硅胶等等。PEI、DEAE、QAE和Q衍生物也是合适的。示例性色谱介质包括以苯基、丁基或辛基基团衍生化的介质，例如苯基-SepharoseFF(Pharmacia)、Toyopearl丁基650(Toso Haas，Montgomeryville，PA)、辛基-Sepharose(Pharmacia)等等；或者聚丙烯酸树脂例如Amberchrom CG 71(Toso Haas)等等。合适的固相载体包括玻璃珠、基于硅胶的树脂、基于纤维素的树脂、琼脂糖微球、交联的琼脂糖微球、聚苯乙烯微球、交联的聚丙烯酰胺树脂等等在其使用条件下不可溶的载体。可以用反应性基团对这些支持物进行修饰，所述反应性基因使得蛋白质可以通过氨基基团、羧基基团、巯基基团、羟基基团和/或糖部分与载体连接。
偶联化学方法的实例包括溴化氰活化、N-羟基琥珀酰亚胺活化、环氧化物活化、巯基活化、酰肼活化和用于碳二亚胺偶联化学法的羧基和氨基衍生物。上述和其他固体介质都是本领域公知并广泛使用的，均可从供应商处商购。用于多肽分离和纯化的具体方法的选择是常规的设计问题，并且部分地取决于所选择载体的性质。参见例如，AffinityChromatography：Principles & Methods(Pharmacia LKBBiotechnology 1988)和Doonan，Protein Purification Protocols(TheHumana Press 1996)。
用于zB7H6多肽分离和纯化的其他变化方法可由本领域技术人员设计得出。例如，通过免疫亲和纯化可将如下文得到的抗zB7H6抗体用于分离大量蛋白。
还可以利用特定的性质分离本发明的多肽。例如，可以使用固定化金属离子吸附色谱(IMAC)来纯化富含组氨酸的蛋白质，包括那些带有组氨酸标签的蛋白质。简而言之，首先使凝胶负载二价金属离子以形成螯合物(Sulkowski，Trends in Biochem.3：1，1985)。基于所使用的金属离子，富含组氨酸的蛋白质将以不同的亲和力吸附在这一基质上，然后可用竞争性洗脱、降低pH或使用强螯合剂的方法将它们洗脱下来。其他纯化方法包括使用凝集素亲和色谱和离子交换色谱纯化糖基化蛋白(参见例如，M.Deutscher，(编著)，Meth.Enzymol.182：529，1990)。在本发明的另外的实施方案中，可以构建目的多肽和亲和标签(例如麦芽糖结合蛋白，免疫球蛋白结构域)的融合体以便于纯化。此外，也可以利用zB7H6细胞外结构域的反受体结合性质进行zB7H6多肽的纯化；例如，可以使用亲和色谱方法，先将NKp30结合在柱上，然后zB7H6多肽将与柱结合，然后再使用标准色谱方法进行洗脱。
也可以通过如上所述的化学合成方法制备zB7H6多肽或其片段。zB7H6多肽可为单体或多聚体形式；糖基化或非糖基化形式；聚乙二醇化或非聚乙二醇化形式；并且可以含有或不含有起始的甲硫氨酸残基。
一旦产生后，可容易地使用常规测定法评估zB7H6多肽的功能。ZB7H6多肽与NKp30的结合是功能活性的一个度量值。例如，通过竞争与NKp30结合结构域的结合(即竞争性结合测定)，可确定这类结合活性。例如，竞争性结合测定的一种配置可使用经标记的可溶性NKp30受体(如包含NKp30细胞外结构域和缀合于生物素的Fc片段的融合蛋白)和表达天然形式zB7H6(例如具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽)的完整细胞。一种这类测定法在实施例7中有所描述。同时可测量可溶性zB7H6多肽与表达NKp30的细胞的结合。或者，不使用可溶性zB7H6或者表达天然形式zB7H6的完整细胞，技术人员可以替代结合于固相的纯化zB7H6。可使用标准方法进行竞争性结合测定。通过竞争性放射自显影平板结合测定或荧光激活细胞分选术可得到定性的或半定量的结果，或者可将Scatchard作图用于产生定量的结果。
还可使用这样的生物测定法测量zB7H6多肽的功能，即所述生物测定法可测量例如与NKp30功能相关的生物活性，包括例如NK细胞的细胞裂解测定。例如，如本文中所示，一些细胞系例如P815不可用作表达NKp30的NK-92细胞的好细胞裂解靶(参见例如，实施例7)。然而，例如通过以表达zB7H6的载体转染而在这些细胞中表达hzB7H6(SEQ ID NO：2)会使得细胞易受NK-92细胞攻击(参见id.)。因此，通过以下方式可容易地对zB7H6多肽——在细胞外结构域中具有一个或多个氨基酸置换、插入或缺失的zB7H6多肽——进行功能性活性筛选：在P815细胞中表达这类多肽，并使用NK-92细胞以公知的细胞裂解测定法中确定这类细胞是否易受NK细胞攻击。可用于评估zB7H6多肽功能的示例性NK-92细胞测定法在实施例7中描述，见下文。
用于评估zB7H6多肽功能的其他测定法包括，例如将可溶性zB7H6多肽加入至表达NKp30的NK细胞，以测试激活针对靶细胞(如P815)的NK细胞功能。用于评估抗NK细胞表面受体的抗体的NK细胞测定法已被Pende等人(J.Exp.Med.190：1505-1516，1999)描述，并且可容易地修改这类测定法以用于评估本文描述的可溶性zB7H6多肽的活性。
Ⅳ.抗zB7H6蛋白的抗体
在另一方面，本发明提供了可特异性结合于zB7H6的抗体。在优选的实施方案中，本发明的抗zB7H6抗体是可特异性结合于zB7H6的细胞外结构域(例如于具有SEQ ID NO：2的第25-266号残基表示的氨基酸序列的多肽片段)的分离抗体。在一些实施方案中，本发明的抗zB7H6抗体能够抑制zB7H6与人NKp30的相互作用；这类抗体可用于例如抑制与zB7H6与NKp30的相互作用相关的细胞事件或其他生理事件，包括例如zB7H6介导的和/或NKp30介导的细胞内信号传递以及相关效应物的功能(如NKp30介导的细胞裂解活性)。
例如，使用zB7H6表达载体的产物或分离自天然源的zB7H6作为抗原，可得到抗zB7H6抗体。特别有用的zB7H6抗体“特异性结合”于zB7H6。如果抗体表现出如下两种性质中的至少一种，那么可将抗体认为是特异性结合的：(1)抗体以阈值水平的结合活性结合于zB7H6，和(2)抗体与zB7H6相关多肽没有明显的交叉反应。
对于第一种特征而言，当抗体与zB7H6多肽、肽或表位的结合亲和力(Ka)为106M-1或更高、优选地为107M-1或更高、更优选地为108M-1或更高、最优选地为109M-1或更高时，则认为抗体是特异性结合抗体。抗体的结合亲和力可以容易地由本领域普通技术人员测定，例如可通过Scatchard分析测定(Scatchard，Ann.NY Acad.Sci.51：660，1949)。对于第二种性质而言，例如，当可通过标准蛋白质印迹分析检测到zB7H6，但是检测不到已知多肽时，认为抗体与相关多肽分子没有明显的交叉反应。已知相关多肽的实例包括已知的B7家族成员。
可以使用携带抗原性zB7H6表位的肽和多肽来产生抗zB7H6抗体。携带抗原性表位的肽和多肽通常含有一个由SEQ ID NO：2的氨基酸序列中所含的至少9个或15至约30个氨基酸构成的序列。然而，含有本发明的氨基酸序列的更大部分的肽或多肽——含有zB7H6多肽的30至50个氨基酸或含有任何长度最多至含有zB7H6多肽的整个氨基酸序列——也可以用于诱导与zB7H6多肽结合的抗体。优选地，应选择携带表位的肽的氨基酸序列以使得所述肽在水性溶剂中基本可溶(即所述序列包括相对多的亲水性残基，而通常应避免含有疏水性残基)。此外，也可能需要含有脯氨酸残基的氨基酸序列以用于产生抗体。
可使用Jameson-Wolf的方法，Jameson and Wolf(CABIOS 4：181，1988)，利用LASERGENE(DNASTAR；Madison，WI)的PROTEAN程序(3.14版)，来识别zB7H6中的潜在抗原性位点。在所述分析中使用默认的参数。
Jameson-Wolf方法通过结合六个进行蛋白质结构预测的主要子程序，预测潜在的抗原决定簇。例如，首先使用Hopp-Woods方法(参见Hopp et al.，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 78：3824，1981)来识别代表具有最高局部亲水性的区域的氨基酸序列(参数：平均七个残基)。在第二步中，使用Emini方法(参见Emini et al.，J.Virology 55：836，1985)来计算表面概率(参数：表面决定阈值(0.6)＝1)。第三步，使用Karplus-Schultz方法，Karplus and Schultz(Naturwissenschaften 72：212，1985)来预测主链的柔性(参数：柔性阈值(0.2)＝1)。在所述分析的第四步和第五步中，应用Chou-Fasman方法(参见Chou，“Prediction of ProteinStructural Classes from Amino Acid Composition，”in Prediction ofProtein Structure and the Principles of Protein Conformation 549-586(Fasman，编著，Plenum Press 1990))和Garnier-Robson方法(参见Garnier et al.，J.Mol.Biol.120：97，1978)对数据进行二级结构的预测(Chou-Fasman参数：构象表＝64种蛋白质；α区域阈值＝103；β区域阈值＝105；Garnier-Robson参数：α和β决定常数＝0)。在第六个子程序中，结合了柔性参数和亲水性/溶剂趋近性因子以确定表面轮廓值，并命名为“抗原性指数”。最后，对抗原性指数应用峰扩展函数，所述函数通过分别附加各自峰值的例如20％、40％、60％或80％对主要表面峰值进行扩展以补偿因表面区域相对于内部区域的流动性所产生的附加自由能。然而，由于螺旋区域柔性较小，因此这种计算方法不适用于位于螺旋区域中的任意主要峰。
可以使用本领域技术人员公知的方法制备如下所述的多克隆抗体，所述多克隆抗体针对重组体zB7H6蛋白或者针对从天然来源分离的zB7H6(参见例如，Green et al.，“Production of Polyclonal Antisera，”in Immunochemical Protocols第1-5页(Manson，编著，HumanaPress 1992)；Williams et al.，“Expression of foreign proteins in E.coliusing plasmid vectors and purification of specific polyclonalantibodies，”in DNA Cloning 2：Expression Systems，第2版第15页(Glover et al.，编著，Oxford University Press 1995))。可通过使用佐剂来增加zB7H6多肽的免疫原性，所述佐剂例如alum(氢氧化铝)或弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂。可用于免疫的多肽也包括融合体多肽，例如zB7H6或其一部分与免疫球蛋白多肽或与麦芽糖结合蛋白融合形成的融合体。多肽免疫原可为全长分子或其一部分。如果所述多肽部分为“半抗原类型”，则优选地将该部分与大分子载体(例如钥孔戚血蓝素(KLH)、牛血清清蛋白(BSA)或破伤风类毒素)相连接或结合以用于免疫。
虽然多克隆抗体通常是在动物体内产生，例如在马、牛、狗、鸡、大鼠、小鼠、兔、豚鼠、山羊或绵羊体内产生，但是本发明的抗zB7H6抗体也可以来源于类人灵长类抗体。在狒狒体内产生可用于诊断和治疗用抗体的通用技术可参见例如，Goldenberg等人的国际专利申请公布WO 91/11465和Losman et al.，Int.J.Cancer 46：310，1990。
或者，可以产生抗zB7H6单克隆抗体。例如，针对具体抗原的啮齿类动物单克隆抗体可通过本领结构域技术人员已知的方法获得(参见例如，Kohler et al.，Nature 256：495(1975)；Coligan et al.(编著)，Current Protocols in Immunology，Vol.1 2.5.1-2.6.7(John Wiley&Sons1991)[“Coligan”]；Picksley等人“Production of monoclonal antibodiesagainst proteins expressed in E.coli”，in DNA Cloning 2：ExpressionSystems，2nd Edition 93(Glover et al.编著，Oxford University Press1995))。在一些变化方案中，单克隆抗体可通过下述步骤获得：用含有zB7H6基因产物(例如包含SEQ ID NO：2第25-266号残基的多肽或者由SEQ ID NO：2第25-266号残基组成的多肽)的组合物注射小鼠，取血清样本以确认抗体的产生，取出脾脏以获得B-淋巴细胞，将B-淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤细胞，克隆杂交瘤细胞，筛选产生针对所述抗原的抗体的阳性克隆，培养产生针对抗原的抗体的克隆，以及从杂交瘤细胞培养物中分离抗体。
抗zB7H6抗体还可以是人单克隆抗体或派生自其的抗体。人单克隆抗体可由转基因小鼠获得，所述转基因小鼠经过基因工程改造而能够针对抗原性刺激进行应答从而产生特异性的人抗体。在这种技术中，将人重链和轻链基因座元件引入小鼠品系中，所述小鼠品系来源于在内源性重链和轻链基因座中含有定向中断的胚胎干细胞系。转基因小鼠可以合成特异性针对人抗原的人抗体，并且所述小鼠可以用于产生分泌人抗体的杂交瘤细胞。由转基因小鼠获得人抗体的方法在例如Green et al.，Nature Genet.7：13，1994；Lonberg et al.，Nature 368：856，1994；和Taylor et al.，Int.Immun.6：579，1994中有所描述。
可以通过多种通用技术从杂交瘤细胞培养物中分离和纯化单克隆抗体。这类分离技术包括使用蛋白A Sepharose的亲和色谱、分子筛色谱和离子交换色谱(参见例如，Coligan第2.7.1-2.7.12页以及第2.9.1-2.9.3页；Baines等人，″Purification of Immunoglobulin G(IgG)″in Methods in Molecular Biology(第10卷)第79-104页，(The HumanaPress，Inc.1992))。
在一些实施方案中，抗B7H6抗体是包含完整(全)抗体的抗原结合结构域的抗体片段。这类抗体片段可通过例如对抗体的蛋白酶促水解而获得。可通过使用常规方法对完整抗体进行胃蛋白酶消化或木瓜蛋白酶消化，而获得抗体片段。例如，可通过使用胃蛋白酶对抗体进行酶促切割以提供被称为F(ab’)2的5S片段而产生抗体片段。还可以使用巯基还原试剂对这一片段进一步切割，从而产生3.5S的Fab’单价片段。任选地，在切割反应中可以使用巯基封闭基团，所述巯基是由于二硫键断裂而产生的。或者，使用胃蛋白酶的酶促切割可直接产生两个单价的Fab片段和一个Fc片段。上述方法在例如下述的文献中有所描述：Goldenberg的美国专利No.4,331,647；Nisonoff et al.，ArchBiochem.Biophys.89：230，1960；Porter，Biochem.J.73：119，1959；Edelman et al.，in Methods in Enzymology(第1卷)第422页(Academic Press 1967)；和ColiganColigan，第2.8.1-2.8.10页和第2.10.-2.10.4页。
也可以使用其他切割抗体的方法，例如分离重链以形成单价的轻链-重链片段、对片段进行进一步切割，或者其他酶技术、化学技术或遗传技术，只要所得的片段能够与可被完整抗体识别的抗原相结合即可。
例如，Fv片段包括VH和VL链的联合体。这种联合可能是非共价的，例如在Inbar et al.，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 69：2659，1972中有所描述。或者，可变链可以以分子间二硫键的形式连接，或通过例如戊二醛的化学试剂相交联(参见例如，Sandhu，Crit.Rev.Biotech.12：437，1992)。
Fv片段可包括通过肽连接体相连接的VH和VL链。可通过构建包含编码由寡核苷酸连接的VH和VL结构域的DNA序列的结构基因，从而制备这些单链抗原结合蛋白(scFv)。将所述结构基因插入到表达载体中，然后将所述表达载体引入宿主细胞例如大肠杆菌中。重组宿主细胞合成由肽连接体桥连两个v结构域的单链多肽。用于产生scFv的方法在例如Whitlow et al.，Methods：ACompanion to Methods inEnzymology 2：97，1991中有所描述(也可参见，Bird et al.，Science242：423，1988；Ladner等人的美国专利No.4,946,778；Pack et al.，Bio/Technology 11：1271，1993和Sandhu，见上文)。例如，可通过在体外使淋巴细胞暴露于zB7H6多肽并在噬菌体或类似载体中筛选抗体展示文库(例如通过使用固定化或被标记的zB7H6蛋白质或肽)来获得scFV。
抗体片段的另一种形式为编码单个互补决定区(CDR)的肽。CDR肽(“最小识别单位”)可通过构建编码目的抗体的CDR的基因而获得。可通过例如使用聚合酶链式反应从产生抗体的细胞的RNA来合成可变区，从而制备这类基因(参见例如，Larrick et al.，Methods：ACompanion to Methods in Enzymology 2：106，1991；Courtenay-Luck，“Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies”in MonoclonalAntiodies：Production，Engineering and Clinical Application第166页(Ritter et al.编著，Cambridge University Press 1995)；和Ward等人，“Genetic Manipulation and Expression of Antibodies”in MonoclonalAntiodies：Principles and Applications第137页(Birch et al.，编著，Wiley-Liss，Inc.1995))。
或者，抗zB7H6抗体可来源于“人源化的”单克隆抗体。人源化单克隆抗体是通过将来自小鼠免疫球蛋白重链和轻链可变区的小鼠互补决定区转移至人可变区结构域中而产生的。然后将人抗体的典型残基替换至鼠类相应物的框架区中。使用来源于人源化单克隆抗体的抗体组分避免了可能与鼠类恒定区的免疫原性相关的潜在问题。用于克隆鼠类免疫球蛋白可变结构域的通用技术在例如Orlandi et al.，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 86：3833，1989中有所描述。用于产生人源化单克隆抗体的技术在例如下列的文献中有所描述：Jones et al.，Nature321：522，1986；Carter et al.，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 89：4285，1992；Sandhu，Crit.Rev.Biotech.12：437，1992；Singer et al.，J.Immun.150：2844，1993；Sudhir(编著)，Antibody Engineering Protocols(Humana Press，Inc.1995)；Kelley，“Engineering TherapeuticAntibodies”in Protein Engineering：Principles and Practice第399-434页，(Cleland et al.，编著，John Wiley&Sons，Inc.1996)；和Queen等人的美国专利No.5,693,762。
在一些变化方案中，抗zB7H6抗体包括Fc区，它包含免疫球蛋白(Ig)重链的CH2和CH3结构域，并通常包含部分Ig铰链区。Fc负责IgG的两个十分需要的性质：效应物功能的募集和长血清半衰期。对抗体附着于其上的靶细胞的杀伤能力来源自如下事件：分别通过Fc结合于Fc受体和补体蛋白C1q而激活免疫效应物通路(ADCC)和补体通路(CDC)。这种结合被主要位于下铰链区和上CH2结构域的残基介导(参见例如，Wines et al.，J.Immunol.164：5313，2000；Woof andBurton，Nature Reviews 4：1，2004)。IgG在血清中的长半衰期是通过CH2和CH3结构域中的氨基酸与新生Fc受体FcRn之间pH依赖型相互作用来介导(参见例如，Getie and Ward，Immunology Today 18：592，1997；Petkova et al.，Int.Immunol.18：1759，2006)。
因此，在包含Fc区的抗zB7H6抗体的一些实施方案中，Fc区具有ADCC和/或CDC活性。这类抗体特别适用于介导对表达zB7H6的靶细胞(例如癌症细胞或病毒感染细胞)进行杀伤。在另一些实施方案中，抗zB7H6抗体可包含没有一种或多种效应物功能(例如没有ADCC和/或CDC活性)的Fc区。例如，可以通过向天然Fc区序列中引入一个或多个氨基酸置换，使得Fc区不结合细胞裂解性Fc受体和/或C1q补体蛋白或者与细胞裂解性Fc受体和/或C1q补体蛋白的结合显著降低，从而获得没有效应物功能的或具有显著降低的效应物功能的Fc区。没有效应物功能的或具有显著降低的效应物功能的特别合适的Fc区包括例如，图13A-13C中所示的Fc4(SEQ ID NO：31)、Fc5(SEQ ID NO：32)、Fc6(SEQ ID NO：33)和Fc7(SEQ ID NO：34)。
在包含Fc区的一些实施方案中，所述Fc区为单链Fc(scFc)，它包含由柔性连接体连接的两个Fc结构域单体，使得两Fc单体能够二聚化以形成功能性的二体Fc结构域。例如，在包含scFc的抗zB7H6抗体的一些变化方案中，所述抗体包含与所述scFc部分融合的单链Fv(scFv)，其中所述scFv部分可特异性地结合于zB7H6。单链Fc多肽(包括包含scFc和一个或多个抗原结合结构域(如scFv)的融合多肽)还在2008年4月18日提交题为“Single Chain Fc，Methods of Making，and Methods ofTreatment”的国际PCT专利申请No.US08/060852中有所描述，该申请的公开文本通过援引的方式全文纳入本文。
此外，可以使用本领域中已知的方法和本文所述的方法对本发明的抗zB7H6抗体或抗体片段聚乙二醇化。
可生成抗独特型抗体，用于抗对zB7H6细胞外结构域(例如，对SEQ ID NO：2第25-266号残基)特异的抗zB7H6抗体。在一些变化方案中，抗独特型抗体可抗能够抑制zB7H6与人NKp30的相互作用的抗zB7H6抗体；这类抗独特型抗体可模拟zB7H6结合NKp30的能力，并且在优选的实施方案中，能够触发或增强NKp30介导的NK细胞激活。可通过标准技术使用抗zB7H6抗体或抗体片段免疫动物，而制备多克隆抗独特型抗体(参见例如，Green et al.，“Production ofPolyclonal Antisera，”in Methods In Molecular Biology：Immunochemical Protocols 1-12(Manson编著，Humana Press 1992)。还可参见Coligan，第2.4.1-2.4.7页)。或者，可通过上述技术使用抗zB7H6抗体或抗体片段作为免疫原来制备单克隆抗独特型抗体。再或者，可以使用上述技术制备人源化抗独特型抗体或类人灵长类抗独特型抗体。制备抗独特型抗体的方法在例如下述的文献中有所描述：Irie的美国专利No.5,208,146；Greene等人的美国专利No.5,637,677；和Varthakavi and Minocha，J.Gen.Virol.77：1875，1996。
可将抗zB7H6抗体与可检测标记相缀合，以形成抗zB7H6免疫缀合物。合适的可检测标记包括例如放射性同位素、荧光标记、化学发光标记、酶标记、生物发光标记或胶体金。制备和检测这类带有可检测标记的免疫缀合物的方法是本领结构域技术人员公知的，并且将在下文更详细叙述。
可检测标记可为能通过放射自显影检测的放射性同位素。对本发明目的特别有用的同位素为3H、125I、131I、35S和14C。
抗zB7H6免疫缀合物还可以用荧光化合物进行标记。通过将免疫缀合物暴露在合适波长的光下，并检测产生的荧光，可以确定荧光标记抗体的存在。荧光标记化合物包括异硫氰酸荧光素、罗丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二醛和荧胺。
或者，可通过将抗体组分与化学发光化合物相偶联，而使抗zB7H6免疫缀合物带有可检测的标记。通过检测化学反应过程中产生的光的存在来确定带有化学发光标签的免疫缀合物的存在。化学发光标记化合物的实例包括鲁米诺、异鲁米诺、芳香族吖啶酯、咪唑、吖啶盐和草酸酯。
类似地，可以使用生物发光化合物来标记本发明的抗zB7H6免疫缀合物。生物发光是存在于生物系统中的一类化学发光，其中催化性蛋白提高了化学发光反应的效率。通过检测发光来确定生物发光蛋白的存在。可用于标记的生物发光化合物包括萤光素、萤光素酶和水母发光蛋白。
或者，可通过将抗zB7H6抗体组分与酶连接，而使抗zB7H6免疫缀合物带有可检测的标记。当抗zB7H6抗体-酶缀合物与合适的底物一起孵育时，酶部分与底物反应以产生可检测的化学部分，所述检测可通过例如分光光度法、荧光法或目测法进行。可用于可检测地标记多特异性免疫缀合物的酶的实例包括：β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶和碱性磷酸酶。
本领域技术人员应当知晓能够根据本发明使用的其他合适的标记。可以使用本领域已知的标准技术将标记物部分结合到抗zB7H6抗体上。用于这方面的一般方法在下列文献中有所描述：Kennedy et al.，Clin.Chim.Acta70：1，1976；Schurs et al.，Clin.Chim.Acta 81：1，1977；Shih et al.，Int′l J.Cancer 46：1101，1990；Stein et al.，Cancer Res.50：1330，1990；和Coligan，见上文。
此外，可使用与亲和素、链亲和素和生物素缀合的抗zB7H6抗体来增加免疫化学检测的便利性和通用性(参见例如，Wilchek et al.(编著)，“Avidin-Biotin Technology，”Methods In Enzymology(第184卷)(Academic Press 1990)和Bayer等人，“Immunochemical Applications ofAvidin-Biotin Technology”in Methods In Molecular Biology(第10卷)第149-162页(Manson编著，The Humana Press，Inc.1992))。
用于进行免疫测定的方法是公知的(参见例如，Cook and Self，“Monoclonal Antibodies in Diagnostic Immunoassays，”in MonoclonalAntibodies：Production，Engineering，and Clinical Application 180-208(Ritter and Ladyman编著，Cambridge University Press 1995)；Perry，“TheRole of Monoclonal Antibodies in the Advancement of ImmunoassayTechnology，”in Monoclonal Antibodies：Principles and Applications107-120(Birch and Lennox编著，Wiley-Liss，Inc.1995)；Diamandis，Immunoassay(Academic Press，Inc.1996))。
本发明还考虑到了用于对zB7H6基因表达进行免疫诊断测定的试剂盒。这类试剂盒包括至少一个含抗zB7H6抗体的容器。试剂盒还可包括装有能指示zB7H6抗体的存在的一种或多种试剂的另一容器。这类指示试剂的实例包括可检测标记，例如放射性标记、荧光标记、化学发光标记、酶标记、生物发光标记和胶体金等等。试剂盒还可包括指导使用者使用zB7H6抗体检测zB7H6蛋白的工具。例如，文字说明书可能会说明包装内的抗体或抗体片段可用于检测zB7H6。文字资料可直接印在容器上，或者可以以包装套件的形式提供。
Ⅴ.抗zB7H6抗体-药物缀合物
在一些方面中，本发明提供了一种抗zB7H6抗体-药物缀合物。本文使用的“抗zB7H6抗体-药物缀合物”是指与治疗剂缀合的抗zB7H6抗体(如第Ⅳ部分中所述，见上文)。当这类抗zB7H6抗体-药物缀合物在给予至受试者(例如具有zB7H6表达性癌症的受试者)时——通常在将这类抗zB7H6抗体-药物缀合物单独给予但也可与其他治疗剂相结合给予时——其可对表达zB7H6的细胞产生临床的有益效果。
在典型的实施方案中，抗zB7H6抗体与细胞毒性剂缀合，使得所产生的抗体-药物缀合物在被细胞吸收或内化时对表达zB7H6的细胞(例如表达zB7H6的癌细胞)发挥细胞毒效应或细胞裂解效应。特别适合与抗体缀合的物质是化学治疗剂、前药转换酶、放射性同位素或化合物或者毒素。例如，抗zB7H6抗体可与细胞毒性剂缀合，所述细胞毒性剂例如化学治疗剂(见下文)或毒素(例如细胞抑制剂或杀细胞剂，如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素或白喉毒素)。可用于与抗zB7H6抗体缀合的另外试剂的实例在下文提供。
在另一些实施方案中，zB7H6抗体与前药转换酶缀合。可使用已知的方法将前药转换酶重组地融合于所述抗体，或者化学地缀合于所述抗体。示例性的前药转换酶有羧肽酶G2、β-葡糖醛酸糖苷酶、青霉素-v-酰胺酶、青霉素-G-酰胺酶、β-内酰胺酶、β-葡糖苷酶、硝基还原酶和羧肽酶A。
用于将治疗剂缀合于蛋白(特别是于抗体)的技术是公知的(参见例如，Arnon et al.，“Monoclonal Antibodies For ImmunotargetingOf Drugs In Cancer Therapy，”in Monoclonal Antibodies And CancerTherapy(Reisfeld et al.编著，Alan R.Liss，Inc.，1985)；Hellstrom et al.，“Antibodies For Drug Delivery，”in Controlled Drug Delivery(Robinson et al.编著，Marcel Deiker，Inc.，第二版1987)；Thorpe，“Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：AReview，”in Monoclonal Antibodies′84：Biological And ClinicalApplications(Pinchera et al.编著，1985)；“Analysis，Results，andFuture Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled AntibodyIn Cancer Therapy，”in Monoclonal Antibodies For Cancer DetectionAnd Therapy(Baldwin et al.编著，Academic Press，1985)；和Thorpeet al.，1982，Immunol.Rev.62：119-58。也参见例如，PCT公开文本WO89/12624)。
在一些变化方案中，根据本文中描述的方法，抗zB7H6抗体-药物缀合物被内化至表达zB7H6的细胞并且在表达zB7H6的细胞中积聚，其中抗体-药物缀合物发挥治疗效果(例如细胞毒效应或细胞抑制效应)。用于测定积聚和积聚速率的方法见于例如题为“Drug Conjugatesand Their Use for Treating Cancer，an Autoimmune Disease or anInfectious Disease.”的WO 2004/010957。
在典型的实施方案中，当使用与治疗剂(例如药物或前药转换酶)缀合的抗zB7H6抗体时，所述试剂在被待治疗的表达zB7H6的细胞(例如表达zB7H6的癌细胞)内化时优选是有活性的。在另一些实施方案中，抗zB7H6抗体-药物缀合物不被内化，该药物通过与细胞膜结合而有效发挥治疗效果(例如对表达zB7H6的细胞的耗尽或生长抑制)。
为了使治疗剂在表达zB7H6的细胞(例如表达zB7H6的癌细胞)之外的活性最小化，除非治疗剂被从所述抗体上切下(例如通过水解或者通过切割试剂)，否则它通常被以降低其活性的方式缀合。在这类实施方案中，以这样的可切割连接体将所述治疗剂附着于所述抗体上，即该连接体在表达zB7H6的细胞的细胞内环境中对切割敏感，但对细胞外环境基本不敏感，这使得所述缀合物在被表达zB7H6的细胞内化(例如，在内体(endosomal)环境中或者例如借助pH敏感性或蛋白酶敏感性在溶酶体(lysosomal)环境中，或者在胞膜窖(caveolea)中)时会被从抗体上切下(参见第Ⅴ(A)节，见下文)。
再者，在一些实施方案中，抗体-药物缀合物可包含相对于质膜荷电的治疗剂，从而进一步使得所述试剂在被细胞内化后穿过质膜的能力最小化。本文使用的“荷电试剂”所指的试剂(a)是极化的，使得该试剂的一个区域相对于质膜带电荷，或者(b)相对于质膜具有净电荷。
通常，抗zB7H6抗体-药物缀合物是基本上纯化的(例如基本没有限制其效果或产生不良副作用的物质)。在一些具体实施方案中，抗zB7H6抗体-药物缀合物为40％的纯度，更通常约50％的纯度，最通常约60％的纯度。在另一些具体实施方案中，所述抗CD70ADC抗体或ADC衍生物抗体为至少约60-65％、65-70％、70-75％、75-80％、80-85％、85-90％、90-95％或95-98％的纯度。在另一个具体实施方案中，所述抗CD70ADC抗体或ADC衍生物为约99％的纯度。
A.连接体
通常，抗zB7H6抗体-药物缀合物在治疗剂和抗zB7H6抗体之间包含一连接体区。如上文指出的，在一些实施方案中，所述连接体在细胞内条件下是可切割的，使得可在细胞内环境中切割所述连接体以将治疗剂从所述抗体上释放。
例如，在一些实施方案中，所述连接体可被细胞内环境(例如在溶酶体、内体或胞膜窖中)中存在的切割剂切割。连接体可以为例如可被细胞内肽酶或蛋白酶切割的肽基连接体，所述蛋白酶包括但不限于溶酶体蛋白酶或内体蛋白酶。通常，肽基连接体的长度为至少2个氨基酸或至少3个氨基酸。切割剂可包括组织蛋白酶B和D以及纤溶酶，已知它们都可水解二肽药物衍生物，导致活性药物在靶细胞内的释放(参见例如，Dubowchik and Walker，Pharm.Therapeutics83：67-123，1999)。最典型的是可被表达zB7H6的细胞中存在的酶切割的肽基连接体。例如，可以使用可被硫醇依赖性蛋白酶组织蛋白酶B切割的肽基连接体(例如Phe-Leu连接体或Gly-Phe-Leu-Gly连接体)，所述组织蛋白酶B在癌性组织中高表达。其他的这类连接体在例如美国专利No.6,214,345中有所述。在具体实施方案中，可被细胞内蛋白酶切割的肽基连接体为缬氨酸-瓜氨酸连接体或苯丙氨酸-赖氨酸连接体(参见例如，美国专利No.6,214,345，该专利描述了用缬氨酸-瓜氨酸连接体合成多柔比星(doxorubicin))。使用细胞内蛋白水解释放治疗剂的一个优点是，所述试剂当被缀合时通常会被削弱并且所述缀合物的血清稳定性通常较高。
在另一些实施方案中，可切割的连接体是pH敏感的，即在一些pH值下对水解敏感。通常，pH敏感的连接体在酸性条件下是可水解的。例如，可以使用可在溶酶体中水解的酸不稳定连接体(例如腙、缩氨基脲、氨硫脲、顺式乌头酰胺、原酸酯、缩醛、缩酮等)(参见例如，美国专利No.5,122,368；5,824,805；5,622,929；Dubowchik andWalker，Pharm.Therapeutics 83：67-123，1999；Neville et al.，Biol.Chem.264：14653-14661，1989)。这类连接体在中性pH条件下(例如在血液的pH下)是相对稳定的，但在接近于溶酶体pH的低于5.5或5.0的pH下是不稳定的。在一些实施方案中，所述可水解的连接体为硫醚连接体(例如通过酰基腙键附着于所述治疗剂上的硫醚(参见例如，美国专利No.5,622,929))。
在又一些实施方案中，连接体在还原条件下是可切割的(例如二硫化物连接体)。本领域中已知多种二硫化物连接体，包括例如可使用SATA(N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰硫基乙酸酯)、SPDP(N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯)、SPDB(N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫代)丁酸酯)、SMPT(N-琥珀酰亚胺基-氧羰基-α-甲基-a-(2-吡啶-二硫代)甲苯)、SPDB和SMPT形成的二硫化物连接体(参见例如，Thorpeet al.，Cancer Res.47：5924-5931，1987；Wawrzynczak et al.，inImmunoconjugates：Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapyof Cancer(C.W.Vogel编著，Oxford U.Press，1987。也参见美国专利No.4,880,935)。
在又一些变化方案中，连接体为丙二酸酯连接体(Johnson et al.，Anticancer Res.15：1387-93，1995)、马来酰亚胺苯甲酰连接体(Lau etal.，Bioorg-Med-Chem.3：1299-1304，1995)或3′-N-酰胺类似物(Lau etal.，Bioorg-Med-Chem.3：1305-12，1995)。
通常，连接体对细胞外环境基本不敏感。本文在连接体上下文中使用的“对细胞外环境基本不敏感”是指当细胞外环境中(例如在血浆中)存在抗体-药物缀合物时，在抗体-药物缀合物样品中不超过约20％，通常不超过约15％，更通常不超过约10％，甚至更通常不超过约5％，不超过约3％，或者不超过约1％的连接体被切断。可以通过例如以下方式确定连接体是否对细胞外环境基本不敏感：将血浆分别与(a)抗体-药物缀合物(“抗体-药物缀合物样品”)和(b)等摩尔量的未缀合抗体或治疗剂(“对照样品”)孵育预定的时长(例如2、4、8、16或24小时)，然后将抗体-药物缀合物样品中存在的未缀合抗体或治疗剂的量与对照样品中存在的未缀合抗体或治疗剂的量进行比较，所述未缀合抗体或治疗剂的量是例如通过高效液相色谱测量。
在一些变化方案中，连接体可启动细胞的内化。在一些实施方案中，连接体在缀合于治疗剂时(即在抗体-药物缀合物的连接体-治疗剂部分的情形下)可启动细胞的内化。在又一些实施方案中，连接体在缀合于治疗剂和抗zB7H6抗体二者时(即在抗体-药物缀合物的情形下)可启动细胞的内化。
可以用于本发明的组合物和方法的多种连接体在例如题为“DrugConjugates and Their Use for Treating Cancer，an AutoimmuneDisease or an Infectious Disease.”的WO 2004/010957中有描述。
B.治疗剂
根据本发明，可将对表达zB7H6的细胞发挥治疗效果的任何试剂用作治疗剂，用于与抗zB7H6抗体缀合。在一些实施方案中，例如为了治疗表达zB7H6的癌症，所述治疗剂为细胞毒性剂。
有用的细胞毒性剂类包括例如，抗微管蛋白剂、auristatin、DNA小沟结合剂、DNA复制抑制剂、烷基化剂(如铂络合物，如顺铂(cis-platin)、单(铂)、双(铂)和三核铂络合物和卡铂)、蒽环类、抗生素、抗叶酸物、抗代谢药物、化学治疗增敏剂、倍癌霉素、依托泊苷、氟化嘧啶、离子载体、lexitropsin、亚硝基脲、顺铂(platinol)、预形成的化合物、嘌呤抗代谢药物、嘌呤霉素、辐射增敏剂、类固醇、紫杉烷、拓扑异构酶抑制剂、长春碱等。
个体的细胞毒性剂包括例如，雄激素、氨茴霉素(AMC)、天冬酰胺酶、5-氮杂胞苷、硫唑嘌呤、博莱霉素、白消安、丁基硫堇亚胺、喜树碱、卡铂、卡莫司汀(BSNU)、CC-1065、苯丁酸氮芥、顺铂、秋水仙素、环磷酰胺、阿糖胞苷、阿糖胞(cytidine arabinoside)、松胞菌素B、达卡巴嗪、更生霉素(原放线菌素)、柔红霉素、氮烯咪胺、多西他赛、多柔比星、雌激素、5-氟脱氧尿苷、5-氟脲嘧啶、短杆菌肽D、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、伊立替康、洛莫司汀(CCNU)、氮芥、美法仑、6-巯嘌呤、甲氨蝶呤、光神霉素、丝裂霉素C、米托蒽醌、硝基咪唑、紫杉醇、普卡霉素、甲基苄肼、链脲佐菌素、替尼泊苷(tenoposide)、6-硫鸟嘌呤、噻替哌(thioTEPA)、拓扑替康、长春碱、长春新碱、长春瑞滨、VP-16和VM-26。
特别合适的细胞毒性剂包括例如，海兔毒素(如auristatin E、AFP、MMAF、MMAE)、DNA小沟结合剂(如烯二炔(enediyne)和lexitropsin)、倍癌霉素、紫杉烷(如紫杉醇和多西他赛)、嘌呤霉素、长春碱、CC-1065、SN-38、拓扑替康、吗啉代多柔比星、根瘤菌素、氰基吗啉代多柔比星、棘霉素、考布他汀(combretastatin)、纺锤菌素、埃博霉素A和B、雌莫司汀、隐藻素、西马多丁、美登类化合物、discodermolide、软珊瑚醇(eleutherobin)和米托蒽醌。
在一些实施方案中，细胞毒性剂为常规的化学治疗剂，例如多柔比星、紫杉醇、美法仑、长春碱、甲氨蝶呤、丝裂霉素C或依托泊苷。另外，可以将有效的试剂例如CC-1065类似物、刺袍霉素(calicheamicin)、美登素(maytansine)、多拉司他汀10(dolastatin10)的类似物、根瘤菌素和海葵毒素(palytoxin)与抗表达zB7H6的抗体相连接。
在具体的变化方案中，细胞毒性剂或细胞抑制剂为auristatin E(在本领域中也被称为多拉司他汀-10)或其衍生物。通常，auristatin E衍生物为例如在auristatin E和酮酸之间形成的酯。例如，auristatin E可以与对乙酰基苯甲酸或苯甲酰戊酸反应，以分别产生AEB和AEVB。其他常见的auristatin衍生物包括AFP(二甲基缬氨酸-缬氨酸-dolaisoleuine-dolaproine-苯丙氨酸-对苯二胺)、MMAF(dovaline-缬氨酸-dolaisoleunine-dolaproine-苯丙氨酸)和MAE(单甲基auristatin E)。auristatin E及其衍生物的合成和结构在以下文献中有描述：美国专利申请公开文本No.20030083263；国际专利公开文本No.WO 2002/088172和WO 2004/010957；以及美国专利No.6,884,869；6,323,315；6,239,104；6,034,065；5,780,588；5,665,860；5,663,149；5,635,483；5,599,902；5,554,725；5,530,097；5,521,284；5,504,191；5,410,024；5,138,036；5,076,973；4,986,988；4,978,744；4,879,278；4,816,444；和4,486,414。
在另一些变化方案中，细胞毒性剂为DNA小沟结合剂(参见例如，美国专利No.6,130,237)。例如，在一些实施方案中，该小沟结合剂为CBI化合物。在另一些实施方案中，该小沟结合剂为烯二炔(例如刺袍霉素)。
在一些实施方案中，抗体-药物缀合物包含抗微管蛋白剂。抗微管蛋白剂的实例包括例如，紫杉烷(例如
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(紫杉醇)、(多西他赛))、T67(Tularik)、长春花生物碱(vinca alkyloids)(例如长春新碱、长春碱、长春地辛和长春瑞滨)以及海兔毒素(例如auristatinE、AFP、MMAF、MMAE、AEB、AEVB)。其他抗微管蛋白剂包括例如，浆果赤霉素衍生物、紫杉烷类似物(例如埃博霉素A和B)、诺考达唑(nocodazole)、秋水仙素和秋水仙酰胺(colcimid)、雌莫司汀、隐藻素、西马多丁、美登类化合物、考布他汀、discodermolide和软珊瑚醇。在一些实施方案中，该细胞毒性剂为另一组抗微管蛋白剂——美登类化合物。例如，在具体的实施方案中，该美登类化合物为美登素或DM-1(ImmunoGen，Inc.；see also Chari et al.，Cancer Res.52：127-131，1992)。
在另一些实施方案中，该细胞毒性剂为抗代谢物。该抗代谢物可以为例如嘌呤拮抗物(例如硫唑嘌呤(azothioprine)或霉酚酸酯)、二氢叶酸还原酶抑制剂(例如甲氨蝶呤)、阿昔洛韦(acyclovir)、更昔洛韦(gangcyclovir)、齐多呋定(zidovudine)、阿糖腺苷(vidarabine)、利巴韦林(ribavarin)、叠氮胸苷(azidothymidine)、阿糖胞、金刚烷胺、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、碘脱氧尿苷(iododeoxyuridine)、poscarnet或曲氟尿苷(trifluridine)。
C.抗zB7H6抗体-药物缀合物的形成
抗zB7H6抗体-药物缀合物的生成可通过本领域技术人员已知的任何技术实现。简而言之，抗zB7H6抗体-药物缀合物包含抗zB7H6抗体、药物以及任选的连接药物和抗体的连接体。有许多不同的反应可用于将药物与抗体共价连接。这经常通过抗体分子的氨基酸残基的反应实现，所述氨基酸残基包括赖氨酸的胺基、谷氨酸和天冬氨酸的游离羧酸基团、半胱氨酸的巯基以及芳香氨基酸的多个部分。一种最常用的共价连接的非特异性方法为碳二亚胺反应，将化合物的羧基(或氨基)与抗体的氨基(或羧基)连接。另外，双功能剂例如二醛或亚氨酸酯已被用于将化合物的氨基与抗体分子的氨基连接。将药物连接于抗体还可使用西佛氏碱反应。该方法涉及对含二醇或羟基的药物的高碘酸盐氧化，从而形成醛，该醛随后与抗体分子反应。通过与抗体分子的氨基形成西佛氏碱而发生连接。还可以将异硫氰酸酯用作偶联剂，将药物与抗体共价连接。其他的技术是本领域技术人员已知的，并且在本发明的范围内。这类技术的非限制性实例在例如美国专利No.5,665,358；5,643,573；和5,556,623中有所记载。
在一些实施方案中，在合适的条件下将作为连接体前体的中间体与所述药物反应。在一些实施方案中，将反应基团用于所述药物和/或所述中间体上。随后在合适的条件下将所述药物和所述中间体之间反应的产物或衍生的药物与抗zB7H6抗体反应。
D.细胞毒活性或细胞抑制活性的测定
在一些实施方案中，抗zB7H6抗体-药物缀合物包含缀合于细胞毒性剂的抗zB7H6抗体，使得所述抗体-药物缀合物对表达zB7H6的细胞(例如表达zB7H6的癌细胞)发挥细胞毒效应或细胞抑制效应。可用于测定抗zB7H6抗体-药物缀合物的细胞毒效应或细胞抑制效应的表达zB7H6的细胞可以是培养细胞系，例如表5种列出的那些细胞系，见下文。一旦抗zB7H6抗体-药物缀合物被确定对表达zB7H6的细胞发挥细胞毒性作用或细胞抑制作用，可以在合适的动物模型中评价其治疗价值。在优选的实施方案中，包含细胞毒性剂的抗zB7H6抗体-药物缀合物可用于治疗表达zB7H6的癌症。可以用于评价本发明的抗体-药物缀合物的治疗效果的多种癌症的示例性动物模型在第VI(B)部分和实施例21-27中描述，见下文。
确定试剂是否对细胞发挥细胞抑制效应或细胞毒效应的方法在本领域中是公知的。这类方法的示例性实例在下文描述。对表达zB7H6的细胞的任何这些效应的确定可表明，抗zB7H6抗体-药物缀合物可用于治疗或预防这样的疾病或障碍，所述疾病或障碍具有由表达zB7H6的细胞异常生长或激活(至少部分)介导的病理，例如表达zB7H6的癌症。
为了确定抗zB7H6抗体-药物缀合物是否对表达zB7H6的细胞发挥细胞抑制效应，可使用胸苷掺入测定。例如，可以将96孔板中密度为5000细胞/孔的表达zB7H6的细胞培养72小时的时间，并且在72小时的最后8小时暴露于0.5μCi的3H-胸苷，在存在或不存在抗体-药物缀合物的情况下测量掺入至培养细胞中的3H-胸苷。
为了确定细胞毒性，可以测量坏死或凋亡(程序性细胞死亡)。坏死通常伴有质膜通透性增加、细胞膨胀和质膜破裂。凋亡的一般特征在于膜起泡、细胞质凝聚和内源性内切核酸酶的活化。
细胞的生存力可以通过确定细胞对染料例如中性红、锥虫蓝或ALAMARTM蓝的摄取进行测量(参见例如，Page et al.，Intl.J.ofOncology 3：473-476，1993)。在这类测定中，将细胞在含染料的培养基中孵育，洗涤细胞并通过光谱光度测量法测量剩余染料，剩余染料反应了细胞对染料的摄取。蛋白结合染料磺酰罗丹明B(SRB)也可以用于测量细胞毒性(Skehan et al.，J.Nat′l Cancer Inst.82：1107-12，1990)。
或者，可将四唑盐例如MTT用于通过检测活细胞而非死细胞来测定哺乳动物细胞存活和增殖的定量热测量测定法中(参见例如，Mosmann，J.Immunol.Methods 65：55-63，1983)。
可以通过测量例如DNA片段化对凋亡进行定量。已有用于体外定量测量DNA片段化的商业化光度测量方法。包括TUNEL(它可检测经标记的核苷酸向片段化的DNA中的掺入)和基于ELISA的测定法的这类测定法的实例在Biochemica，1999，第2期，第34-37页(RocheMolecular Biochemicals)中有描述。
还可以通过测量细胞形态的变化测定凋亡。例如，对于坏死，可以通过测量对一些染料(例如荧光染料如吖啶橙或溴化乙啶)的摄取确定质膜完整性的丧失情况。用于测量凋亡细胞数目的方法在以前已被Duke and Cohen，Current Protocols In Immunology(Coligan et al.编著，1992，第3.17.1-3.17.16页)描述。还可以将细胞以DNA染料(例如吖啶橙、溴化乙啶或碘化丙啶)标记，并观察细胞的染色质凝聚和沿内核膜的边缘化。可被测量以确定凋亡的其他形态变化包括例如细胞质凝聚，细胞膜起泡增加和细胞收缩。
可以在培养物的吸附部分和“浮游”部分二者中都测量凋亡细胞的存在情况。例如，两部分都可以通过以下方式收集：除去上清液，以胰蛋白酶消化吸附的细胞，在离心洗涤步骤后(例如，10分钟，2000rpm)将制品合并，并测定凋亡(例如通过测量DNA片段化)。(参见例如，Piazza et al.，Cancer Research 55：3110-16，1995)。
Ⅵ.使用方法
A.综述
在另一方面，本发明提供了调节表达NKp30的细胞的活性(例如细胞裂解活性)的方法，所述表达NKp30的细胞包括例如自然杀伤(NK)细胞和T细胞(如CD8+T细胞)。这类方法包括，例如用于治疗与表达NKp30的细胞的活性升高或降低有关的疾病或障碍的方法。在一些实施方案中，所述方法包括将表达NKp30的细胞与其量可触发NKp30介导的活性(例如细胞裂解活性)的zB7H6多肽或能够模拟zB7H6与NKp30相互作用的试剂(例如zB7H6抗独特型抗体)相接触。zB7H6多肽可以为溶解形式或固定形式(例如结合于细胞膜)；例如，在具体的变化方案中，提高NKp30表达细胞活性的方法包括，将表达NKp30的细胞与这样的分离的可溶性多肽相接触，即该可溶性多肽包含具有与SEQ ID NO：2的第25-266号残基表示的氨基酸序列至少90％或至少95％序列同一性的多肽片段；或者将表达NKp30的细胞与表达结合于细胞膜的重组体zB7H6多肽的细胞相接触。在另一些变化方案中，所述方法包括，在存在表达NKp30的细胞的情况下将表达功能性zB7H6的细胞与有效量的抗zB7H6抗体或能够干涉zB7H6与NKp30相互作用的其他试剂相接触。这类方法可以在体外、离体或在体内进行。
在一些优选的变化方案中，提供了调节NK细胞活性的方法，所述方法包括例如用于治疗与NK细胞活性升高或降低有关的疾病或障碍的方法。在一些实施方案中，所述方法包括将NK细胞与其量可触发NKp30介导的NK细胞的细胞裂解活性的zB7H6多肽或能够模拟zB7H6与NKp30相互作用的试剂(例如zB7H6抗独特型抗体)相接触。zB7H6多肽可以为溶解形式或固定形式(例如结合于细胞膜)；例如，在具体的变化方案中，提高NK细胞活性的方法包括，将人NK细胞与这样的分离的可溶性多肽相接触，即该可溶性多肽包含具有与SEQ ID NO：2的第25-266号残基表示的氨基酸序列至少90％或至少95％序列同一性的多肽片段；或者将人NK细胞与表达结合于细胞膜的重组体zB7H6多肽的细胞相接触。在另一些变化方案中，所述方法包括，在存在NK细胞的情况下将表达功能性zB7H6的细胞与有效量的抗zB7H6抗体或能够干涉zB7H6与NKp30相互作用的其他试剂相接触。这类方法可以在体外、离体或在体内进行。
在另一些实施方案中，提供了调节表达NKp30的T细胞的活性的方法，包括例如用于治疗与表达NKp30的T细胞的活性升高或降低有关的疾病或障碍的方法。一些T细胞包括CD8+T细胞已被证明可表达NKp30(参见例如，Srivastava and Srivastava，Leuk.Res.30：37-46，2006)。因此，在一些实施方案中，所述方法包括将表达NKp30的T细胞(例如CD8+T细胞)与其量可触发NKp30介导的T细胞活性(例如细胞裂解活性)的zB7H6多肽或能够模拟zB7H6与NKp30相互作用的试剂(例如zB7H6抗独特型抗体)相接触。zB7H6多肽可以为溶解形式或固定形式(例如结合于细胞膜)；例如，在具体的变化方案中，提高表达NKp30的T细胞活性的方法包括，将表达NKp30的T细胞与这样的分离的可溶性多肽相接触，即该可溶性多肽包含具有与SEQ ID NO：2的第25-266号残基表示的氨基酸序列至少90％或至少95％序列同一性的多肽片段；或者将表达NKp30的T细胞与表达结合于细胞膜的重组体zB7H6多肽的细胞相接触。在另一些变化方案中，所述方法包括，在存在表达NKp30的T细胞的情况下将表达功能性zB7H6的细胞与有效量的抗zB7H6抗体或能够干涉zB7H6与NKp30相互作用的其他试剂相接触。这类方法可以在体外、离体或在体内进行。
如上文指出的，在具体的变化方案中，所述方法是一种治疗与NK细胞活性有关的疾病或障碍的方法。例如，在一些实施方案中，所述方法包括向这样的受试者给予有效量的可溶性zB7H6多肽或能够模拟zB7H6与NKp30相互作用的试剂(例如zB7H6抗独特型抗体)，即该受试者患有以自然杀伤(NK)细胞活性不足为特征的疾病或障碍(例如癌症和感染性疾病)或者出现这类疾病或障碍的风险增大。在另一些实施方案中，所述方法包括向这样的受试者给予有效量的抗zB7H6抗体或能够干涉zB7H6与NKp30相互作用的其他试剂，即该受试者患有NK细胞介导的疾病或障碍(例如，NK细胞介导的同种异体移植物排斥如NK细胞介导的骨髓细胞(BMC)同种异体移植物排斥)或者出现这类疾病或障碍的风险增大。
在一些变化方案中，将可溶性zB7H6多肽用作免疫刺激剂，用于癌症治疗。已知多种分泌的幸免疫调节蛋白可通过刺激免疫系统在而动物模型中刺激抗肿瘤反应(参见generally Rosenberg(编著)，Principles and practice of the biologic therapy of cancer(LippincottWilliams&Wilkins，Philadelphia，PA，第3版.2000))。例如，IL-2和IFN-α可用于治疗转移性黑素瘤和肾细胞癌(参见例如，Atkins et al.，J.Clin.Oncol.17：2105-16，1999；Fyfe et al.，J.Clin.Oncol.13：688-96，1995；Jonasch and Haluska，Oncologist 6：34-55，2001)。对这些细胞因子的推测作用机制包括，增强CD8+T细胞和NK细胞对肿瘤细胞的直接杀伤。本文描述的可溶性zB7H6受体可用于通过诱导NKp30介导的细胞裂解活性，以类似方式增强NK细胞或CD8+T细胞对肿瘤的直接杀伤。
可溶性zB7H6多肽还可用作免疫刺激剂，用于治疗感染性疾病包括例如病毒感染。NK细胞组成抵御入侵病原体的第一道防线，并且通常在病毒感染的早期被激活(参见例如，Ahmad and Alvarez，J.Leukoc.Biol.76：743-759，2004；Shresta et al.，Virology 319：262-273，2004)。CD8+T细胞也已被证明在介导对感染性病原体的免疫反应中表现出发挥作用(参见例如，Wong and Palmer，Annu.Rev.Immunol.21：29-70，2003)。现在对感染性疾病的治疗包括已知促进特别是NK和T细胞活性的免疫系统刺激物。这类治疗包括，例如将IL-2用作HIV感染的治疗剂(参见例如，Smith，AIDS 15 Suppl 2：S28-35，2001)，以及在治疗HCV感染中使用IFN-α(参见例如，Ahmad and Alvarez，见上文)。通过可提高NK细胞活性的免疫调节蛋白治疗感染性疾病的前景被这样的观察结果进一步证实，该结果即HCV感染个体中疗法的效果与其对NK细胞活性的提高相关：在所述疗法没有增加NK细胞反应的个体中，没有观察到病毒血症的减少(参见van Thiel et al.，Dig.Dis.Sci.39：970-976，1994；Wozniakowska-Gesicka et al.，Pol.Merkuriusz Lek.8：376-377，2000；Bonavita et al.，Int.J.Tissue React.15：11-16，1993)。因此，能够刺激NKp30介导的NK或CD8+T细胞活性的可溶性zB7H6多肽可用于启动NK介导的或CD8+-T细胞介导的抗病原(例如抗病毒)防御机制，以治疗感染性疾病。
在另一些变化方案中，可将抗zB7H6抗体用于抑制NK细胞介导的骨髓同种异体移植物排斥。骨髓移植(BMT)已经成为治疗多种恶性血液病的通用治疗方法。然而，异体移植物BMT的效力受到一些障碍(例如对移植物的排斥)的限制。有大量证据表明，NK细胞是骨髓同种异体移植物移植的障碍，并且表明在小鼠中它们可单独介导特异性的BMC排斥(参见例如，Murphy et al.，J.Exp.Med.165：1212-1217，1987；Murphy et al.，J.Exp.Med.166：1499-1509，1987；Murphy et al.，J.Immunol.144：3305-3311，1990；Murphy et al.，Eur.J.Immunol.20：1729-1734，1990；Murphy et al.，Immunol.Rev.181：279-289，2001)。在临床上，在这样的SCID患者中观察到的同种异体移植物抗性造成了来自供体的NK细胞的高活性，即该SCID患者已接受耗尽T细胞的HLA错配的BMT而没有形成细胞减少性病症(参见O’Reilly et al.，Vox.Sang.51：81-86，1986)。因此，如本文所述，可以将抗zB7H6的细胞外结构域并能够抑制zB7H6与NKp30相互作用的抗体在BMT过程中用于抑制NK细胞抗同种异体移植物的细胞裂解活性，从而治疗或预防BMC同种异体移植物排斥。
在又一些实施方案中，可将抗zB7H6抗体用于诱导抗表达zB7H6的细胞(例如表达zB7H6的癌细胞)的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)。抗体疗法在癌症治疗中已特别成功，这是因为一些肿瘤显示独特的抗原、谱系特异性抗原或相对于正常细胞过量存在的抗原。实验证据证明，zB7H6——相对于正常组织——被多种源自肿瘤的细胞系高表达，所述细胞系包括源自结肠癌、肝癌、宫颈癌、肺癌、胰腺癌或前列腺癌的细胞系，以及源自多种血液癌症(例如原血细胞性白血病、B细胞性淋巴瘤、单核细胞性淋巴瘤、红白血病、伯基特淋巴瘤或慢性髓细胞性白血病)的细胞系。这些证据表明，zB7H6为新型的肿瘤特异性或肿瘤相关抗原，并且可以将抗zB7H6抗体用作抗肿瘤治疗物。与单克隆抗体疗法的抗肿瘤活性相关的一个机制是抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。在ADCC中，单克隆抗体可结合于靶细胞(例如癌细胞)，表达所述单克隆抗体的受体的特异性效应细胞(例如NK细胞、CD8+T细胞、单核细胞、粒细胞)可结合所述单克隆抗体/靶细胞复合体，导致靶细胞死亡。
因此，在一些实施方案中，将包含具有效应物功能的Fc区的抗zB7H6抗体用于诱导抗表达zB7H6的细胞的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)。用于诱导ADCC的方法通常包括，将表达zB7H6的细胞与有效量的包含具有ADCC活性的Fc区的抗zB7H6抗体相接触，其中该接触步骤在存在表达具有细胞裂解活性的Fc受体的细胞裂解免疫效应细胞情况下进行。表达细胞裂解性Fc受体(例如FcγRIIIα或CD16)的免疫效应物细胞包括，例如NK细胞和一些CD8+T细胞。用于诱导CDC的方法一般包括将表达zB7H6的细胞与有效量的包含具有CDC活性的Fc区的抗zB7H6抗体相接触，其中该接触步骤在存在补体的情况下进行。可被靶向以使用这类方法进行杀伤的表达zB7H6的细胞包括，例如癌细胞如结肠癌细胞、肝癌细胞、宫颈癌细胞、肺癌细胞、胰腺癌细胞、前列腺癌细胞、原血细胞性白血病细胞、B细胞性淋巴瘤细胞、单核细胞性淋巴瘤细胞、红白血病细胞、伯基特淋巴瘤细胞、慢性髓细胞性白血病细胞等。
在相关的实施方案中，将包含具有效应物功能的Fc区的抗zB7H6抗体用于在受试者中治疗表达zB7H6的癌症。这类方法通常包括向受试者给予有效量的包含具有ADCC活性和/或CDC活性的Fc区的抗zB7H6抗体。可特别顺应于使用这类方法治疗的表达zB7H6的癌包括例如结肠癌、肝癌、宫颈癌、肺癌、胰腺癌或前列腺癌，以及血液的癌症，例如原血细胞性白血病、B细胞性淋巴瘤、单核细胞性淋巴瘤、红白血病、伯基特淋巴瘤和慢性髓细胞性白血病。
在又一些实施方案中，将抗zB7H6抗体-药物缀合物(参见第V节，见上文)用于将治疗剂送递至表达zB7H6的细胞，所述试剂在发挥治疗效果。在利用抗zB7H6抗体-药物缀合物的一些优选变化方案中，所述治疗剂是对表达zB7H6的细胞(例如表达zB7H6的癌细胞)发挥细胞毒效应或细胞抑制效应的细胞毒性剂。如上文指出的，实验证据证明，zB7H6——相对于正常组织——被多种源自肿瘤的细胞系高表达，所述细胞系包括源自结肠癌、肝癌、宫颈癌、肺癌、胰腺癌或前列腺癌的细胞系，以及源自多种血液癌症(例如原血细胞性白血病、B细胞性淋巴瘤、单核细胞性淋巴瘤、红白血病、伯基特淋巴瘤或慢性髓细胞性白血病)的细胞系。该证据表明，zB7H6为新型的肿瘤特异性或肿瘤相关抗原，可用于在癌症治疗中具有治疗效果的靶向试剂，特别是可耗尽或抑制肿瘤细胞生长的细胞毒性剂。因此，在一些实施方案中，将包含缀合于细胞毒性剂的抗zB7H6抗体的抗zB7H6抗体-药物缀合物用于治疗表达zB7H6的癌症。
在本文描述的治疗方法的每个实施方案中，将所述可溶性zB7H6多肽、抗体或其他zB7H6相关试剂(包括例如zB7H6多核苷酸或抗zB7H6抗体-药物缀合物)以与这样的常规方法一致的方式送递，即该常规方法与对有待治疗的疾病或障碍的治疗相关。根据本文公开的，将有效量的试剂给予需要这类治疗的受试者中，持续足以预防或治疗所述疾病或障碍的时间并且在足以预防或治疗所述疾病或障碍的条件下。
用于给予本文描述的可溶性zB7H6多肽、抗体或其他zB7H6相关试剂的受试者除包括已患有NK细胞相关疾病或障碍的患者外，还包括处于形成NK细胞活性相关的具体疾病或障碍的高风险中的患者。在一些实施方案中，所述受试者已被诊断为具有所述有待治疗的疾病或障碍。再者，可以在治疗过程中对受试者在所述疾病或障碍方面的任何变化进行监视(例如，所述疾病或障碍临床症状的增加或减少)。同时，在一些变化方案中，所述受试者没有患另外一种这样的疾病或障碍，即该疾病或障碍需要涉及模拟或阻断zB7H6与同种受体相互作用的治疗。
在预防应用中，将药物组合物或药物以这样的量给予对具体疾病敏感的或处于患有具体疾病风险中的患者，即该量足以消除或降低所述疾病风险或者延迟所述疾病发病。在治疗应用中，将组合物或药物以这样的量给予疑似患有或已患有这类疾病的患者，即该量足以治愈或者至少部分地阻止所述疾病及其并发症的症状。足以实现这一点的量是指治疗有效的或药物有效的剂量或量。在预防方案和治疗方案中，都通常以多个剂量给予试剂，直至达到足够的反应(例如触发合适的NK细胞活性或者抑制不适当的NK细胞活性)。通常，可监测所述反应，并且如果所需的反应开始消失，则给予重复剂量。
为了识别用于根据本发明的方法的受试患者，可以采用通用的筛选方法来确定与具体NK细胞相关障碍有关的风险因素，或者以确定在受试者中被识别的已有障碍的状态。这类方法包括例如，确定一个体是否具有已被诊断患有一种具体疾病的亲戚。筛选方法还可以包括例如常规的诊断检查，以确定已知具有遗传成分的具体疾病的家族状态(例如，在BMT的情况下，临床研究已表明一些HLA-C等位基因的存在与BM同种异体移植物排斥的风险增加相关[参见Scott et al.，Blood 92：48644871，1998]，并且还已知多种癌具有一些遗传成分)。癌的遗传成分包括例如，正在转化的多基因(例如Ras、Raf、EGFR、cMet等)中的突变、一些HLA和杀伤物抑制受体(KIR)分子的存在或缺失或者这样的机制，所述机制即癌细胞通过该机制能够直接或间接地调节对细胞如NK细胞和T细胞的免疫抑制(参见例如，Ljunggren and Malmberg，Nature Rev.Immunol.7：329-339，2007；Boyton and Altmann，Clin.Exp.Immunol.149：1-8，2007)。对于该目的，常规可以采用核苷酸探针来识别携带与具体目的疾病相关的遗传标记物的个体。另外，本领域中已知大量免疫学方法可用于识别具体疾病的标记物。例如，在本领域中有且公知多种采用单克隆抗体探针来检测与具体肿瘤相关的抗原的ELISA免疫测定法。可按照已知的患者症状、年龄因子、相关风险因子等的指示进行筛选。这些方法使得临床医生可常规地选择需要本文描述的方法进行治疗的患者。根据这些方法，对NK细胞活性的调节可作为独立的治疗程序进行，或者作为其他治疗的补充、附属或并列的治疗方案进行。
为了给药，可将zB7H6多肽、抗体或其他zB7H6相关试剂配制成药物组合物。包含可溶性zB7H6多肽、抗zB7H6抗体或其他试剂的药物组合物可以依照制备药用组合物的已知方法进行配制，以此将所述治疗分子在混合物中与可药用载体结合。如果一种组合物的给药可以被接受患者耐受，那么该组合物被认为是“可药用的载体”。无菌磷酸盐缓冲盐水是可药用载体的一个实例。其他合适的载体是本领域技术人员公知的(参见例如，Gennaro(编著)，Remington′s PharmaceuticalSciences(Mack Publishing Company，19th ed.1995))。制剂还可包含一种或多种赋形剂、防腐剂、增溶剂、缓冲试剂、阻止病毒表面上蛋白丢失的白蛋白等。
将包含zB7H6多肽、抗体或其他zB7H6相关试剂的药物组合物以有效量给予受试者。根据本发明的方法，可将所述多肽、抗体或其他试剂通过多种给药模式给予受试者，包括例如通过肌肉、皮下、静脉、心房内(intratrial)、关节内、肠胃外、鼻内、肺内、透皮、胸膜内、鞘内和口服的给药途径。为了进行预防和治疗，可以将所述试剂以单次推注给药方式长时间的连续送递(例如连续透皮送递)给药，或者以重复的给药方案给药(例如以小时、日或周为基础)。
在本文中对有效剂量的确定通常是基于随后进行人临床试验的动物模型研究，并且受以下事件的指导：确定在模型受试者中显著减少受试者疾病或障碍的发生或严重度的有效剂量和给药方案。本发明的组合物的有效剂量取决于许多不同因素，所述因素包括给药途径、靶位点、患者的生理状态、患者是人还是动物、服用的其他药物、疗法是预防性的还是治疗性的，以及所述组合物本身的具体活性及其在所述个体中诱发所需反应的能力。患者通常是人，但患者在一些疾病中可以是非人的动物。通常调整剂量方案，以提供最佳的治疗反应，即以优化安全性和有效性。因此，治疗或预防有效量还是这样的量，即在该量下任何不需要的副效应被调节NKp30介导的NK细胞活性的有益效果盖过。可溶性zB7H6多肽或抗体的给药剂量通常为约0.1μg至100mg/kg或1μg/kg至约50mg/kg受试者体重的区间，更通常为10μg至5mg/kg受试者体重的区间。在更具体的实施方案中，所述试剂的有效量为约1μg/kg-约20mg/kg、约10μg/kg-约10mg/kg或者约0.1mg/kg-约5mg/kg。该区间内的剂量可通过单次给药或多次给药达到，所述多次给药包括例如每一天或每天给药、每周给药、隔周给药或每月给药。例如，在一些变化方案中，一种方案包括初次给药以及随后多次以周或隔周间隔的后续给药。另一种方案包括初次给药以及随后以月或隔月间隔的多次后续给药。或者，给药可以基于这样的指示无规律地进行，该指示即通过监视NK细胞活性和/或所述疾病或障碍的临床症状得到。
药物组合物的剂量可以由主治医师调整，以在靶位维持所需的浓度。例如，如果选择静脉内送递模式，那么所述试剂在靶组织处血液中的局部浓度可以为每升约1-50纳摩组合物，有时每升约1.0至每升10、15或25纳摩，这取决于受试者的状态和目标的测量反应。可以基于送递模式选择较高或较低浓度，例如透皮送递相对于送递至黏膜表面。剂量还应基于给药制剂的释放速率调整，例如鼻喷剂相对于散剂、持续释放的口服或注射颗粒、透皮制剂等。例如，为了达到相同的血清浓度水平，(在标准条件下)具有5纳摩的释放速率的缓释颗粒应以约2倍于具有10纳摩的释放速率的颗粒的剂量的剂量给药。
含有可溶性zB7H6多肽、抗体或其他zB7H6相关组合物的药物组合物可以以液体形式、气溶胶形式或固体形式提供。液体形式的实例为可注射溶液、气雾剂、滴剂、局部应用溶液和口服悬液。示例性的固体形式包括胶囊、片剂和控释形式。控释形式的实例有微量渗透泵和植入物(参见例如，Bremer et al.，Pharm.Biotechnol.10：239，1997；Ranade，“Implants in Drug Delivery，”in Drug Delivery Systems 95-123(Ranade and Hollinger，编著，CRC Press 1995)；Bremer et al.，“Protein Delivery with Infusion Pumps，”in Protein Delivery：PhysicalSystems 239-254(Sanders and Hendren，编著，Plenum Press 1997)；Yewey et al.，“Delivery of Proteins from a Controlled ReleaseInjectable Implant，”in Protein Delivery：Physical Systems 93-117(Sanders and Hendren，编著，Plenum Press 1997))。其他固体形式包括乳剂、糊剂和其他局部应用形式等。
脂质体提供了一种通过例如以下给药途径将治疗性多肽送递至受试者的方法：静脉内、腹膜内、鞘内、肌内、皮下，或口服给药、吸入给药或鼻内给药。脂质体是由一个或多个被脂质双层包围的水性区室组成的微囊(一般参见Bakker-Woudenberg et al.，Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis.12(Suppl.1)：S61，1993；Kim，Drugs 46：618，1993；Ranade，“Site-Specific Drug Delivery Using Liposomes asCarriers，”in Drug Delivery Systems 3-24(Ranade and Hollinger，编著，CRC Press 1995))。脂质体在组成上与细胞膜类似，因此脂质体可以用于安全地给药并且是可生物降解的。根据制备方法的不同，脂质体可为单层的或多层的，脂质体的直径大小可为0.02μm至10μm以上。脂质体中可包封多种试剂：分配于脂双层中的疏水性试剂和分配于内部水性空间中的亲水性试剂(参见例如，Machy et al.，Liposomes InCell Biology And Pharmacology(John Libbey 1987)和Ostro et al.，American J.Hosp.Pharm.46：1576，1989)。此外，还可以通过改变脂质体的大小、脂双层的数目、液体组分以及改变脂质体的荷电特征和表面特性，从而控制被包封药物的治疗利用度。
脂质体可吸附在基本所有类型的细胞上，并缓慢释放所包封的药剂。或者，所吸附的脂质体可被吞噬性细胞内吞。内吞作用之后脂质体脂质会在溶酶体内被降解而释放所包封的药物(参见Scherphof et al.，Ann.N.Y.Acad.Sci.446：368，1985)。在静脉内给药之后，小脂质体(0.1至1.0μm)通常被主要位于肝脏和脾中的网状内皮系统的细胞摄取，而大于3.0μm的脂质体会在肺部沉积。可以利用这种网状内皮系统的细胞优先摄取较小脂质体的特性来将化学治疗剂送递到巨噬细胞和肝脏肿瘤中。
可以通过一些方法来绕过所述网状内皮系统，所述方法包括用大剂量的脂质体颗粒饱和或用药物手段选择性地使巨噬细胞失活(参见Claassen et al.，Biochim.Biophys.Acta 802：428，1984)。此外，已显示在脂质体膜中掺入糖脂衍生磷脂或聚乙二醇衍生磷脂可以显著地降低网状内皮系统的摄取(参见Allen et al.，Biochim.Biophys.Acta 1068：133，1991；Allen et al.，Biochim.Biophys.Acta 1150：9，1993)。
还可以通过改变磷脂组分或在脂质体中插入受体或反受体，从而制备靶向于特定细胞或器官的脂质体。例如，已有人使用用高含量的非离子型表面活性剂制备的脂质体来靶向于肝脏(参见例如，JapanesePatent 04-244，018 to Hayakawa et al.；Kato et al.，Biol.Pharm.Bull.16：960，1993)。这些制剂是通过下述过程制备：将大豆磷脂酰胆碱、α-生育酚和乙氧基氢化蓖麻油(HCO-60)在甲醇中混合；将混合物在真空中浓缩；然后将混合物在水中重溶。已显示二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)与大豆衍生化甾醇葡萄糖苷混合物(SG)和胆固醇(Ch)的脂质体制剂可以靶向于肝脏(参见，Shimizu et al.，Biol.Pharm.Bull.20：881，1997)。
或者，可以在脂质体表面结合各种靶向反受体，例如抗体、抗体片段、糖类、维生素类和转运蛋白。例如，可以用支链型半乳糖脂类衍生物修饰脂质体，以使其靶向于脱唾液酸糖蛋白(半乳糖)受体，该受体专一地在肝脏细胞的表面表达(参见Kato and Sugiyama，Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst.14：287，1997；Murahashi et al.，Biol.Pharm.Bull.20：259，1997)。在一种更常用的组织靶向手段中，用特异性针对目标细胞上表达的反受体的生物素化抗体对所述目标细胞进行预标记(参见Harasym et al.，Adv.Drug Deliv.Rev.32：99，1998)。在游离抗体被从血浆中清除之后，给予链亲和素缀合的脂质体。在另一种方法中，直接将靶向抗体连接到脂质体上(参见Harasym et al.，见上文)。
可以使用标准的蛋白质微包封技术将多肽和抗体包封在脂质体内(参见例如，Anderson et al.，Infect.Immun.31：1099，1981；Anderson etal.，Cancer Res.50：1853，1990和Cohen et al.，Biochim.Biophys.Acta1063：95，1991；Alving et al.“Preparation and Use of Liposomes inImmunological Studies，”in Liposome Technology(第III卷)317(Gregoriadis，编著，CRC Press，第二版1993)；Wassef et al.，Meth.Enzymol.149：124，1987)。如上所述，可用于治疗的脂质体可含有多种组分。例如，脂质体可含有聚乙二醇的脂类衍生物(参见Allen et al.，Biochim.Biophys.Acta 1150：9，1993)。
可以设计可降解的聚合物微球来保持治疗性蛋白较高的全身水平。使用例如下述的可降解聚合物来制备微球，所述聚合物例如聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLG)、聚酸酐、聚原酸酯、不可生物降解的乙酸乙基乙烯酯聚合物，其中蛋白质被捕获在聚合物中(参见例如，Gombotzand Pettit，Bioconjugate Chem.6：332，1995；Ranade，“Role ofPolymers in Drug Delivery，”in Drug Delivery Systems 51-93(Ranadeand Hollinger，编著，CRC Press 1995)；Roskos and Maskiewicz，“Degradable Controlled Release Systems Useful for Protein Delivery，”in Protein Delivery：Physical Systems 45-92(Sanders and Hendren，编著，Plenum Press 1997)；Bartus et al.，Science 281：1161，1998；Putneyand Burke，Nature Biotechnology 16：153，1998；Putney，Curr.Opin.Chem.Biol.2：548，1998)。聚乙二醇(PEG)包被的纳米颗粒还可以作为用于静脉内送递治疗性蛋白的载体(参见例如，Gref et al.，Pharm.Biotechnol.10：167，1997)。
本领结构域技术人员也可以如下述文献所述地设计其他剂型，所述文献例如，Ansel and Popovich，Pharmaceutical Dosage Forms andDrug Delivery Systems(Lea&Febiger，第5版1990)；Gennaro(编著)，Remington′s Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Company，第19版1995)，和Ranade and Hollinger，Drug Delivery Systems(CRCPress 1996)。
zB7H6多肽可用于基因疗法。基因疗法在广义上可定义为遗传物质向细胞内转移，以短暂地或永久地改变细胞的表型。正在开发多种方法，用于将细胞因子、肿瘤抗原和另外的共刺激分子通过基因疗法送递至肿瘤患者中的特定位置(参见Rosenberg(编著)，Principles andpractice of the biologic therapy of cancer(Lippincott Williams&Wilkins，Philadelphia，PA，第3版2000))。可以将这些方法修改为使用zB7H6DNA或RNA。
因此，在一些实施方案中，可通过以下方式调节受试者中NK细胞的反应：给予编码zB7H6蛋白(包括例如本文描述的可溶性zB7H6多肽)的核酸。使用这类zB7H6编码核酸，可以按照上文的一般性描述治疗以NK细胞活性不足为特征的疾病或障碍。在核酸疗法的情况下，可将zB7H6多肽表达为可溶性受体，该可溶性受体从细胞分泌出，以与如上述直接给予受试者的可溶性zB7H6多肽类似的方式诱导NKp30介导的效应。或者，zB7H6多肽可以以这样的方式表达，该方式即保持与所述蛋白在其中表达的细胞的表面相连(例如与功能性跨膜结构域或GPI键合)；这类实施方案特别可用于促进向具体细胞或组织的靶向，以保持NKp30介导的局部效应。
用于治疗方法中的编码zB7H6多肽的核酸可以为DNA或RNA。通常将编码zB7H6多肽的核酸区段连接于调节元件例如启动子和增强子，这使得DNA区段可在患者的目标靶细胞中表达。为了在血液细胞中表达——这是通过表达zB7H6多肽而诱导NK细胞介导的反应所需的，来自轻链或重链免疫球蛋白基因的启动子和增强子元件或者CMV主要中早期启动子和增强子适合于指导表达。经常将所连接的调节元件和编码序列克隆至载体中。
可用大量的病毒载体体系，包括反转录病毒体系(参见例如，Lawrie and Tumin，Cur.Opin.Genet.Develop.3，102-109，1993)；腺病毒载体(参见例如，Bett et al.，J.Virol.67，5911，1993)；腺伴随病毒载体(参见例如，Zhou et al.，J.Exp.Med.179，1867，1994)；来自痘病毒家族包括牛痘病毒和鸟痘病毒的病毒载体、来自α病毒属的病毒载体例如源自辛德毕斯病毒和塞姆利基森林病毒(Sindbis andSemliki Forest Viruses)的病毒载体(参见例如，Dubensky et al.，J.Virol.70，508-519，1996)；以及乳头瘤病毒(Ohe et al.，Human GeneTherapy 6，325-333，1995；WO 94/12629(Woo et al.)；Xiao&Brandsma，Nucleic Acids.Res.24，2630-2622，1996)。
还可以将核酸用于降低细胞中功能性表达zB7H6的的水平。例如，在治疗性方法中使用的核酸可包括例如，抑制性多核苷酸(例如反义多核苷酸、小抑制RNA(siRNA)、核酶和外源性指导序列)，以及编码zB7H6显性负变体的核酸。这类核酸可用于通过降低NKp30与功能性zB7H6相互作用的水平而在受试者中抑制zB7H6活性。
可以将编码zB7H6多肽的DNA或含有其的载体包装至脂质体中。合适的脂质和相关类似物在US 5,208,036、5,264,618、5,279,833和5,283,185中有描述。还可以将编码zB7H6多肽的载体和DNA以颗粒载体吸收，或者连接于颗粒载体，所述颗粒载体的实例包括聚甲基丙烯酸甲酯聚合物、聚丙交酯和聚丙交酯-乙交酯共聚物(参见例如，McGee et al.，J.Micro Encap.，1996)。
通过向个体的患者给药，通常通过全身给药(例如静脉注入、腹膜内注入、鼻注入、胃注入、真皮内注入、肌肉注入、皮下注入或颅内注入)或者外部施用(参见例如，US 5,399,346)，可以将基因治疗载体或裸DNA送递于体内。还可以使用基因枪给予DNA(参见Xiao&Brandsma，见上文)。可以将编码多肽的DNA沉淀于显微金属珠的表面上。将微投射体以震动波或膨胀氦气加速，并穿透组织至几个细胞层的厚度。例如，Agacetus，Inc.Middleton WI制造的AccelTM基因送递装置(AccelTM Gene Delivery Device)是合适的。或者，可以简单地通过将裸DNA以化学的或机械的刺激点于皮肤上，使所述DNA通过皮肤进入血液中(参见例如，WO 95/05853)。
在又一个变化方案中，可以将编码zB7H6多肽的载体送递至离体细胞，例如从个体患者外植的细胞(例如淋巴细胞、骨髓抽取物、组织生检物)或者全能供体造血干细胞，然后通常在对已整合所述载体的细胞进行选择后，将所述细胞再植入患者中。
在一些实施方案中，所述方法可另外涉及使用特异性识别靶细胞或组织的病毒或其他送递载体(例如肿瘤靶向病毒或特异性识别肿瘤细胞的其他载体)。
本文描述的药物组合物还可用于组合疗法的情况。本文使用的术语“组合疗法”是指对受试者给予至少一个治疗有效剂量的zB7H6相关组合物和另一种试剂。所述zB7H6相关组合物可以是例如，可溶性zB7H6多肽、抗zB7H6抗体(包括例如抗zB7H6抗体-药物缀合物)、zB7H6模拟剂例如zB7H6抗独特型抗体、编码zB7H6的多核苷酸、抑制性多核苷酸，或者表现zB7H6生物活性、抑制zB7H6生物活性或特异性结合于zB7H6的其他试剂(例如在将治疗剂靶向表达zB7H6的细胞的情况)。
例如，对于癌症免疫疗法，可以将有zB7H6生物活性的组合物用作免疫刺激剂与化学治疗、辐射和骨髓脱离相结合。zB7H6多肽及具有zB7H6生物活性的其他试剂可以与常规类型的化学治疗或辐照协同地起作用。例如，在淋巴瘤和肾细胞癌的临床前模型中，IL-2与多柔比星(Ehrke et al.，Cancer Immunol.Immunother.42：221-30，1996)相结合，或者IL-2(Younes et al.，Cell Immunol.165：243-51，1995)或IFN-α(Nishisaka et al.，Cytokines Cell Mol Ther.6：199-206，2000)与辐照相结合提供了优于使用单个试剂的结果。在该情形下，zB7H6多肽和zB7H6模拟剂还可降低肿瘤负荷，并使得化学治疗物更有效地杀伤。另外，致死剂量的化学治疗物或辐照之后进行骨髓移植或干细胞重建可将肿瘤负荷降低至足够小的水平(例如微小残留病)，以使zB7H6介导的抗肿瘤效应更好地发挥。这种类型的治疗方案的实例包括使用IL-2和IFN-α，以在骨髓脱离和移植后改变抗癌反应(Porrataet al.，Bone Marrow Transplant.28：673-80，2001；Slavin and Nagler，Cancer J.Sci.Am.Suppl 1：S59-67，1997；Fefer et al.，Cancer J.Sci.Am.Suppl 1：S48-53，1997)。在淋巴瘤和其他癌症的情形下，根据zB7H6相关组合物相对于所述一种或多种化学治疗剂的应用时间，可以施用所述zB7H6相关组合物以直接地与化学治疗剂对肿瘤细胞的效应协同作用，或者可以在所述化学物刺激免疫系统后施用。本领域技术人员可以设计方案来利用两种可能情况的优点。
可以将表现zB7H6生物活性的本发明的组合物与其他免疫调节化合物结合使用，所述免疫调节化合物包括多种细胞因子、共刺激分子和共抑制分子。例如，当具有zB7H6活性的组合物与其他类型的免疫调节分子一块使用的时候，可以在患者中提高zB7H6在介导抗癌反应中的NK细胞刺激活性。这些分子可包括但不限于，使用其他细胞因子。例如，IL-2和IL-12的结合使用可在T细胞淋巴瘤、鳞状细胞癌和肺癌中显示有益效果(参见Zaki et al.，J.Invest.Dermatol.118：366-71，2002；Li et al.，Arch.Otolaryngol.Head Neck Surg.127：1319-24，2001；Hiraki et al.，Lung Cancer 35：329-33，2002)。另外，可将具有zB7H6活性的组合物与这样的试剂相结合，即该试剂可共刺激出现于基于免疫的效应细胞上的多种细胞表面分子，例如激活CD137(参见Wilcox et al.，J.Clin.Invest.109：651-9，2002)orinhibition of CTLA4(Chambers et al.，Ann.Rev.Immunol.19：565-94，2001)。或者，可将具有zB7H6活性的组合物与这样的试剂相结合，即该试剂可通过与TRAIL相关受体相互作用而诱导肿瘤细胞凋亡(参见例如，Takeda et al.，J.Exp.Med.195：161-9，2002；Srivastava，Neoplasia 3：535-46，2001)。这类试剂包括TRAIL配体、TRAIL配体-Ig融合物、TRAIL抗体等。
在其他变化方案中，将具有zB7H6活性的组合物与单克隆抗体结合使用。这类组合疗法特别可用于癌症的治疗，其中使用单克隆抗体正在成为针对许多肿瘤的标准做法，所述肿瘤包括非霍奇金淋巴瘤(利妥昔单抗(rituximab)或
Figure GPA00001146410700841
)、几种形式的白血病(吉妥单抗(gemtuzumab)或
Figure GPA00001146410700842
)、乳腺细胞癌(曲妥珠单抗(Trastuzumab)或)以及结肠癌(西妥昔单抗(cetuximab)或
Figure GPA00001146410700844
)。抗体通过介导抗癌症效应的一个机制是通过被称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的过程，其中免疫基础细胞(包括NK细胞、巨噬细胞和中性粒细胞)杀伤那些被抗体复合物结合的细胞。因此，由于zB7H6在触发NKp30介导的NK细胞活性中的免疫调节性，可以将它用于提高抗体疗法的效力。这种类型的治疗范例的实例包括RITUXANTM(利妥昔单抗)与用于治疗霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤的IL-2、IL-12或IFN-α的结合使用(参见Keilholz et al.，Leuk.Lymphoma 35：641-2，1999；Ansell et al.，Blood 99：67-74，2002；Carson et al.，Eur.J.Immunol.31：3016-25，2001；Sacchi et al.，Haematologica 86：951-8.，2001)。
药物组合物可作为试剂盒提供，所述试剂盒包括含本文描述的治疗性多肽或多核苷酸的容器。所提供的治疗性分子形式为为例如用于单剂量或多剂量的可注射溶液，或者在注射前重组的无菌散剂。或者，这种试剂盒可以包含干粉分散器、液体气雾剂产生器或喷雾器，用于施用治疗性多肽或多核苷酸。这种试剂盒还可包含有关药物组合物的说明和用法的文字信息。例如，这类信息可包括这样的陈述，即zB7H6组合物禁用于已知对zB7H6超敏感的患者。
B.癌症治疗
1.癌症的类型
如本文所述，zB7H6是刺激性NK细胞受体NKp30的激活配体。照这样，在一些变化方案中，可将具有拮抗zB7H6对NKp30的活性的试剂用作癌症治疗的免疫调节剂，所述试剂通过诱导NKp30介导的NK细胞细胞裂解活性增强NK细胞的直接肿瘤杀伤。另外，如本文描述的研究所示，zB7H6在多种肿瘤来源的细胞上表达。因此，在其他变化方案中，可将抗zB7H6抗体通过以下方式用于对表达zB7H6的细胞的直接杀伤，即通过Fc与Fc受体和补体蛋白C1q的结合激活ADCC或CDC通路。在又一些变化方案中，可将包含缀合于抗zB7H6抗体的细胞毒性剂的抗zB7H6抗体-药物缀合物用于将细胞毒性剂送递至表达zB7H6的癌细胞，其中所述细胞毒性剂通过耗尽癌细胞或抑制癌细胞的生长发挥治疗效果。
如下表4列出适用于本发明的治疗的一些癌症，主要按靶组织排列。
表4：示例性癌症类型列表
1.头颈癌
a.脑癌
b.口腔癌
c.口咽癌
d.鼻咽癌
e.下咽部癌
f.鼻腔和鼻旁窦癌
g.喉癌
h.唇癌
2.肺癌
a.非小细胞癌
b.小细胞癌
3.胃肠道癌
a.结直肠癌
b.胃癌
c.食管癌
d.肛门癌
e.肝外胆管癌
f.Vater壶腹癌
g.胃肠道间质瘤(GIST)
4.肝癌
a.肝细胞腺瘤
b.肝细胞癌
5.乳腺癌
6.妇科癌
a.宫颈癌
b.卵巢癌
c.阴道癌
d.外阴癌
e.妊娠滋养细胞瘤
f.子宫癌
7.尿道癌
a.肾癌
b.前列腺癌
c.膀胱癌
d.阴茎癌
e.尿道癌
8.膀胱癌
9.神经肿瘤
a.星形细胞瘤和胶质瘤
b.原发性CNS淋巴瘤
c.髓母细胞瘤
d.生殖细胞肿瘤
e.视网膜母细胞瘤
10.内分泌肿瘤
a.甲状腺癌
b.胰腺癌
1)胰岛细胞瘤
a)胰岛素瘤
b)胰升糖素瘤
c.嗜铬细胞瘤
d.肾上腺癌
e.类癌肿瘤
f.副甲状腺癌
g.松果腺肿瘤
11.皮肤癌
a.恶性黑色素瘤
b.鳞状细胞癌
c.基底细胞癌
d.卡波西氏内瘤(Kaposi’s Sarcoma)
12.骨癌
a.骨母细胞瘤
b.骨软骨瘤
c.骨肉瘤
13.结缔组织肿瘤
a.软骨母细胞瘤
b.软骨瘤
14.造血恶性肿瘤
a.非霍奇金淋巴瘤
1)B细胞淋巴瘤
2)T细胞淋巴瘤
3)未分化淋巴瘤
b.白血病
1)慢性髓细胞细胞性白血病
2)毛细胞白血病
3)慢性淋巴细胞白血病
4)慢性髓单核细胞性白血病
5)急性髓细胞性白血病
6)急性淋巴母细胞白血病
c.骨髓增生性疾病
1)多发性骨髓瘤
2)原发性血小板增多症
3)有骨髓化生的骨髓纤维化
4)嗜酸性细胞增多综合症
5)慢性嗜酸性粒细胞白血病
6)真性红细胞增多症
d.霍奇金淋巴瘤
15.儿童癌症
a.白血病和淋巴瘤
b.脑癌
c.神经母细胞瘤
d.Wilms瘤(肾母细胞瘤)
e.横纹肌肉瘤
f.视网膜母细胞瘤
16.免疫治疗敏感的癌症
a.黑色素瘤
b.肾癌
c.白血病、淋巴瘤和骨髓瘤
d.乳腺癌
e.前列腺癌
f.结直肠癌
g.宫颈癌
h.卵巢癌
i.肺癌
下文进一步详述了以上列出的一些癌症，包括用于评估根据本发明的zB7H6相关试剂对肿瘤反应的效应的一些相关动物模型。
a.慢性髓样白血病
慢性髓样白血病(CML)是一种主要感染成年人的不常见癌症类型。它是一种粒细胞(一种主要的白细胞类型)的癌症。在CML中会产生许多粒细胞，并且它们在不成熟且不能正确地发挥作用时被释放至血液中。不成熟的白细胞被称为母细胞。其他类型的血细胞的产生也被中断。白细胞在正常情况下以有序和受控的方式修复并再生它们自身，但该过程在慢性髓样白血病中失去控制，细胞持续不正常地分裂和成熟。该疾病通常形成很慢，这是为什么被称为“慢性”髓样白血病的原因。
因为CML形成(发展)缓慢，所以难以在其早期阶段检测到它。有时只是在为了其他原因进行血液试验时发现到它。CML的症状经常是模糊的且非特异性的，并且由骨髓中异常白细胞数目增加和正常白细胞数目减少引起：在腹部左侧有胀感或轻微的肿块。这是因为，在CML中，脾可能变大。脾是一种在腹部左侧位于肋骨正下方的器官。它过滤细胞并清除衰老的红细胞。脾肿胀还可造成对胃的压力，这会导致消化不良和食欲不振，由于红细胞不足(贫血)一些人会感觉疲倦并看起来脸色苍白，由于血液中血小板数目较低一些人会注意到他们更容易流血或瘀伤。除了比正常人更容易瘀伤之外，还可出现一种特定类型的瘀伤。它通常出现在腿上或口中，由小血样点组成，被称为瘀点。女性会发现她们的月经颜色变得很深。然而，这些症状和症候不常出现，一些人可注意到有普遍的瘙痒。慢性髓样白血病可在任何年龄发生，但中年人和老年人更常患此病。它很少出现在儿童中(cancerbacup因特网网站)。可以使用移植于免疫缺陷小鼠中的人CML细胞，例如在人肿瘤异种移植模型中评价试剂(例如抗zB7H6抗体-药物缀合物)对肿瘤反应的效应(参见例如，Ren，Leukemia andLymphoma 8：1549-1561，2002；Van Etten，Blood Cells Mol.Dis.27：201-205，2001；Wong and Witte，Oncogene 20：5644-5659，2001)。
b.多发性骨髓瘤
多发性骨髓瘤是一种影响一些被称为浆细胞的白细胞的癌症类型。如果癌症涉及浆细胞，那么身体会持续产生越来越多的这种细胞。不需要的浆细胞被称为骨髓瘤细胞，它们都是不正常的并且都是严格相同的。骨髓瘤细胞倾向聚集于骨髓中和硬的骨外部分中。有时，它们仅聚集在一个骨中，形成被称为浆细胞瘤的单个团块或肿瘤。然而，在大多数情况下，骨髓瘤细胞聚集于许多骨中，经常形成许多肿瘤并导致其他问题。如果发生这种情况，那么该疾病被称为多发性骨髓瘤。
因为患有多发性骨髓瘤的人具有异常大数目的相同浆细胞，所以它们还具有过多的一种类型的抗体。这些骨髓瘤细胞和抗体可造成大量严重的医学问题。(1)随着骨髓瘤细胞数目的增加，它们会破坏骨并使骨变弱，导致疼痛并有时会导致骨折。骨痛可使患者移动困难。(2)当骨受损时，钙会释放至血液中。这会导致高钙血症——血液中的钙太多。高钙血症会导致无食欲、恶心、口干、疲倦、肌无力、烦躁和意识错乱。(3)骨髓瘤细胞会阻止骨髓形成正常浆细胞和对免疫系统重要的其他白细胞。患者将不能对抗感染和疾病。(4)所述癌细胞还会阻止新的红细胞的生长，导致贫血。贫血患者会感觉非常疲劳和虚弱。以及(5)多发性骨髓瘤患者的肾可能具有严重问题。过多抗体蛋白和钙可以阻止肾正确地过滤并清除血液。多发性骨髓瘤的症状取决于该疾病的发展程度。在该疾病的早期阶段，可能没有症状。当症状出现时，患者通常有骨痛，通常在背部或肋骨处。患者还会有骨断裂、虚弱、疲倦、体重减轻或重复感染。当疾病恶化时，症状可包括恶心、呕吐、便秘、小便困难以及腿部虚弱或麻木(国家癌症研究所的因特网网站)。可以在免疫缺陷小鼠的人肿瘤异种移植模型中评价试剂(例如抗zB7H6抗体-药物缀合物)对肿瘤反应的效应，例如Miyakawa et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.313：258-62，2004中所描述的。
c.非霍奇金淋巴瘤
非霍奇金淋巴瘤是一种类型的淋巴系统癌症。有两种主要的淋巴瘤类型。一种类型称为霍奇金氏病(命名自首次描述它的霍奇金博士)。另一种称为非霍奇金淋巴瘤。有大约20种不同类型的非霍奇金淋巴瘤。对于大多数霍奇金氏病的情形，生检中都发现了已知作为Reed-Sternberg细胞的具体细胞。该细胞不常出现在其他淋巴瘤中，因此它们被称为非霍奇金淋巴瘤。这看起来可能没有很大差别，但这是重要的，原因是对霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤的治疗可能差别很大。
非霍奇金淋巴瘤的第一症候经常为颈、腋窝或腹股沟的淋巴结的无痛肿胀。其他症状可包括以下中的任一种：盗汗或无因高温(发烧)；无食欲、无因体重减轻和过度疲劳；儿童可能发展成咳嗽或气喘。他们还可能抱怨腹痛，或者你可能发现你的孩子腹部有肿块或者全身皮肤持续瘙痒(cancerbacup因特网网站)。可以在类似于Ansell et al.，Leukemia 18：616-23，2004中描述的非霍奇金淋巴瘤异种移植模型中评价试剂(例如抗zB7H6抗体-药物缀合物)对肿瘤反应的效应。
最常用的非霍奇金淋巴瘤分类是REAL分类系统(Ottensmeier，Chemico-Biological Interactions 135-136：653-664，2001)。已经鉴定了特异性的免疫标记物，用于对淋巴瘤分类。例如，滤泡淋巴瘤标记物包括CD20+、CD3-、CD10+、CD5-；小淋巴细胞淋巴瘤标记物包括CD20+、CD3-、CD10-、CD5+、CD23+；边缘区B细胞淋巴瘤标记物包括CD20+、CD3-、CD10-、CD23-；弥漫性大B细胞淋巴瘤标记物包括CD20+、CD3-；套细胞淋巴瘤标记物包括CD20+、CD3-、CD10-、CD5+、CD23+；外周T细胞淋巴瘤标记物包括CD20-、CD3+；原发性纵隔大B细胞淋巴瘤标记物包括CD20+、CD3-；淋巴母细胞淋巴瘤标记物包括CD20-、CD3+、Tdt+；以及伯基特淋巴瘤标记物包括CD20+、CD3-、CD10+、CD5-(Decision Resourses，Non-HodgkinsLymphoma，Waltham，MA.，Feb.2002)。
国际工作分类(International Working Formulation)对非霍奇金淋巴瘤(NHL)的临床分类将疾病分为以下亚型：(1)低级(无痛)疾病，包括小淋巴细胞的，对应于慢性淋巴细胞白血病(SC)；滤泡的，主要是小裂细胞的滤泡(FSC)；滤泡的，混合型小裂细胞和大细胞(FM)；(2)中级疾病，包括滤泡的，主要是大细胞(FL)；弥散的，小裂细胞(DSC)；弥散混合型，小细胞和大细胞(DM)；弥散的，大裂或非裂细胞(DL)；以及(3)高级疾病，包括免疫母细胞的，大细胞(IBL)；淋巴母细胞的，曲折核或非曲折核细胞(LL)；和小非裂细胞，伯基特型或非伯基特型(SNC)；(The Non-Hodgkin′sLymphoma Pathologic Classification Project，Cancer 49：2112-35，1982)。一般将Ann Arbor Staging体系用于区分患有NHL的患者的阶段。Ⅰ期表示侵入单个淋巴结区域或局部侵入单个外淋巴器官或部位。Ⅱ期表示侵入在隔膜同侧的两个或多个淋巴结区域或局部侵入核外部位或器官以及在隔膜同侧的一个或多个淋巴结区域。Ⅲ期表示侵入隔膜两侧的淋巴结区域，可能伴随局部侵入核外部位或器官。Ⅳ期是指弥散性或散布性侵入一个或多个远距离的核外器官，伴随或不伴随侵入淋巴结(“Lymphoid neoplasms，”in American Joint Committeeon Cancer.：AJCC Cancer Staging Manual.第6版，New York，NY：Springer，2002，第393-406页)。已证明利妥昔单抗可有效用于治疗无痛和滤泡淋巴瘤(Boye et al.，Annals of Oncol.14：520-535，2003)。
d.宫颈癌
宫颈是子宫的颈部，开口于阴道。宫颈癌(Cervical cancer)也称为宫颈癌瘤(cervical carcinoma)，从宫颈表面的异常细胞发展而来。宫颈癌是感染女性的最常见癌症之一。宫颈癌之前通常是宫颈表面细胞中的发育异常、癌变前变化。这些异常细胞可发展成侵润癌。一旦癌症出现，它就可以发展经过四阶段。这些阶段由癌症的扩散程度定义。癌症扩散越多，治疗的范围可能越广。存在两种主要的宫颈癌类型：(1)鳞状类型(表皮样癌)：这是最常见的类型，占宫颈癌的约80％-85％。该癌症可由性传播疾病引起。一种这样的性病是引起尖锐湿疣的人乳头状瘤病毒。该癌性肿瘤在宫颈上生长并生长至宫颈中。该癌症通常始于宫颈表面，并且可通过巴氏涂片(Pap smear)在早期阶段进行诊断。(2)腺癌：该类型的宫颈癌发展自宫颈沟中的宫颈腺中的组织。早期宫颈癌通常不产生症状。该癌症通常通过巴氏涂片和骨盆检查来检验。晚期阶段的宫颈癌会产生异常的阴道出血，或者在意外时间(例如月经期间、性交后或绝经后)的排出物带血丝。异常阴道排出物可能浑浊或带血，或者可包含有异味的粘液。该癌症的晚期阶段会引起疼痛(University of Michigan Health System因特网网站)。可以在类似于Downs et al.，Gynecol.Oncol.98：203-10，2005；和Li et al.，Int.J.Gynecol.Cancer 15：301-7，2005中描述的人肿瘤异种移植模型中评价试剂(例如抗zB7H6抗体-药物缀合物)对肿瘤反应的效应。
e.头颈肿瘤
头颈的大多数癌症是癌瘤类型(特别是鳞状细胞癌)。头颈癌始于形成口、鼻、咽喉或耳的内层的细胞或者形成覆盖舌的表面层的细胞。然而，头颈癌可从其他类型的细胞发展而来。淋巴瘤可从淋巴系统的细胞发展而来。肉瘤可从构成肌肉、软骨或血管的支持细胞发展而来。黑色素瘤始于为眼睛和皮肤提供颜色的称为黑色素细胞的细胞。头颈癌的症状取决于其所处的部位——例如，舌癌可导致有些话语不清。最常见的症状是数周不能愈合的头或颈部的溃疡或疮区域；吞咽困难或者在咀嚼或吞咽时疼痛；呼吸或说话困难，例如呼吸有持续噪音、语言不清或声音嘶哑；口腔感觉麻木；持续鼻塞或鼻出血；持续耳痛、耳鸣或听觉困难；口腔或颈部肿胀或肿块；面部或上颌疼痛；在吸烟或咀嚼烟草的人中，癌前变化可能出现在口腔内层或舌上。这可表现为持久的白色斑(白斑病)或红色斑(红斑病)。它们通常不痛，但有时可能会疼或者会出血(Cancerbacup因特网网站)。可以在类似于Kuriakose et al.，Head Neck 22：57-63，2000；Cao et al.，Clin.Cancer Res.5：1925-34，1999；Braakhuis et al.，Cancer Res.51：211-4，1991；和Baker，Laryngoscope 95：43-56，1985中描述的人头颈肿瘤异种移植模型中评价试剂(例如抗zB7H6抗体-药物缀合物)对肿瘤反应的效应。
f.脑癌
始于脑组织的肿瘤称为原发性脑肿瘤。原发性脑肿瘤根据细胞的类型或其起始的脑部分进行命名。最常见的原发性脑肿瘤为胶质瘤。该瘤始于神经胶质细胞。有许多类型的胶质瘤。(1)星形细胞瘤——产生于称为星形胶质细胞的星状神经胶质细胞的肿瘤。在成年人中，星形细胞瘤最常见地产生于大脑。在儿童中，该肿瘤出现在脑干、大脑和小脑中。Ⅲ期星形细胞瘤有时称作退行发育性星形细胞瘤。Ⅳ期星形细胞瘤通常称作多形性恶性胶质瘤。(2)脑干胶质瘤——该肿瘤出现在脑的最下部分。最常在幼儿和中年人中诊断出脑干胶质瘤。(3)室管膜瘤——该肿瘤产生自排列在脑室或脊髓的中央管中的细胞。这些肿瘤最常出现于儿童和年轻成人中。(4)少突神经胶质瘤——这种不常见肿瘤产生自制造覆盖和保护神经的脂肪物质的细胞。该肿瘤通常出现在大脑中。该肿瘤生长缓慢，通常不扩散至周围脑组织中。该肿瘤最常见于中年人中。脑肿瘤的症状取决于肿瘤大小、类型和位置。当肿瘤压迫神经或破坏某脑区时会导致症状。当脑膨胀或颅骨中积水时也会导致症状。脑肿瘤的最常见症状有：头痛(通常在早晨较重)；恶心或呕吐；说话、视觉或听觉的变化；平衡或行走困难；情绪、性格或集中注意力的能力的变化；记忆困难；肌肉痉挛或颤搐(癫痫发作或惊厥)；以及臂或腿的麻木或麻刺感(国家癌症研究所的因特网网站)。可以在类似于Bello et al.，Clin.Cancer Res.8：3539-48，2002中描述的人胶质瘤异种移植模型中评价试剂(例如抗zB7H6抗体-药物缀合物)对肿瘤反应的效应。
g.甲状腺癌
乳头状甲状腺癌和滤泡甲状腺癌占所有甲状腺癌的80％-90％。两种类型都始于甲状腺的滤泡细胞。大多数乳头状甲状腺癌和滤泡甲状腺癌倾向于缓慢生长。如果这些甲状腺癌在早期被检测到，大多数可被成功地治疗。髓样甲状腺癌占甲状腺癌病例的5％-10％。这种癌产生自C细胞，而非滤泡细胞。如果在髓样甲状腺癌扩散至身体其他部分之前被发现并进行治疗，那么很容易控制它。退行发育性甲状腺癌是最少见的甲状腺癌类型(病例的仅1％-2％)。这种癌产生自滤泡细胞。所述癌细胞是高度异常的，并且难以识别。这种类型的癌症通常很难以控制，原因是所述癌细胞倾向于很快速地生长和转移。早期甲状腺癌经常不引起症状。但随着癌生长，症状可包括：亚当氏喉结附近的颈前方的肿块或小结；声音嘶哑或难以以正常声音说话；淋巴结肿胀，尤其是在颈部；吞咽或呼吸困难；或者喉或颈疼痛(国家癌症研究所的因特网网站)。可以在类似于Quidville et al.，Endocrinology 145：2561-71，2004中描述的人肿瘤异种移植模型中评价试剂(例如抗zB7H6抗体-药物缀合物)对肿瘤反应的效应。
h.干癌
有两种不同类型的原发肝癌。最常见的类型被称为肝瘤或肝细胞癌(HCC)，产生于肝的主要细胞(肝细胞)。该类型主要限制于肝脏，但该类型有时也扩散至其他器官。该类型大多出现于患有被称为肝硬化的肝疾病的人中。还有一种被称为纤维板层样肝瘤(Fibrolamellar hepatoma)的较罕见肝瘤亚型，该亚型出现于年幼的人中，并且与以前的肝疾病有关。另一种类型的原发肝癌称为胆管癌或胆管细胞癌，这是因为该类型始于胆管的内层细胞。发生肝瘤的大多数人通常也有被称为肝硬化的病症。肝硬化为由多种原因引起的整个肝脏的细小疤，所述原因包括感染和长时间过量饮入乙醇。然而，仅少部分患有肝硬化的人会发展成原发肝癌。乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒的感染可导致肝癌，并且也是引起硬化的原因，硬化会增加形成肝瘤的风险。患有被称为血色病(haemochromatosis)的罕见病症的人发展成肝瘤的机会较大，血色病可导致铁在体内过度沉积。本发明的zB7H6相关试剂(例如可溶性zB7H6多肽或抗zB7H6抗体-药物缀合物)可用于对与肝细胞癌相关的至少一种病症或症状进行治疗、预防、抑制其进展、延迟其发作以及/或者降低严重性或抑制。肝细胞癌可能与肝炎(例如甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎和丁型肝炎)感染有关或无关。可以在类似于Zhou et al.，Clin.Cancer Res.9：6030-7，2003；和Huynh et al.，J.Cell Mol.Med.2008(在Blackwell Synergy网站电子公布为“Postprint，”10.1111/j.1582-4934.2008.00364.x，2008)中描述的人肿瘤异种移植模型中评价试剂(例如抗zB7H6抗体-药物缀合物)对肿瘤反应的效应。
i.肺癌
可以在人小细胞/非小细胞肺癌异种移植模型中评价试剂(例如抗zB7H6抗体-药物缀合物)对肿瘤反应的效应。简而言之，将人肿瘤移植至免疫缺陷小鼠中，并将这些小鼠以试剂例如抗zB7H6抗体-药物缀合物单独地或与其他试剂结合处理。治疗的效果可以通过评估肿瘤生长进行证明(Nemati et al.，Clin Cancer Res.6：2075-86，2000；和Hu etal.，Clin.Cancer Res.10：7662-70，2004)。
2.目标和对实体瘤的抗肿瘤活性
虽然每个方案均可不同地定义对肿瘤反应的评估，但示例性的指导方针可见于Clinical Research Associates Manual(SouthwestOncology Group，CRAB，Seattle，WA，October 6，1998，updatedAugust 1999)(“CRA手册”)。依照CRA手册(参见第7章，“ResponseAccessment”)，肿瘤反应是指减少或消除所有可测量的病灶或转移。疾病在以下情况下通常被认为是可测量的，即通过医学照相或X射线、计算机轴断层摄影术(CT)、磁共振成象(MRI)或触诊，它包含具有清楚确定边界的二维可测量病灶。可评估的疾病所指的疾病包括一维的可测量病灶、边界不清楚的团块、两直径都小于0.5cm的病灶、在扫描时两直径中任一个均小于切点之间距离的病灶、直径小于2cm的可触知病灶或者骨疾病。不可评估的疾病包括胸腔积液、腹水和由间接证据证明的疾病。以前辐照过的、没有进展的病灶通常也被认为是不可评估的。
对于评估实体瘤反应的方案，需要客观状态的标准。代表性的标准包括下列：(1)完全反应(CR)，定义为所有可测量的和可评估的疾病完全消失；无新的病灶；无疾病相关症状；无不可评估的疾病的迹象；(2)部分反应(PR)，定义为所有可测量病灶垂直直径乘积之和与基线相比的减小大于或等于50％；可评估疾病的无进展；无新的病灶；适用于患有至少一个可测量病灶的患者；(3)进展，定义为可测量病灶的乘积之和比作为基线的使用相同技术观察到的最小和大50％或增大10cm2、任何可评估的疾病明显恶化、任何已消失的病灶重现、出现任何新的病灶或者由于死亡或病症恶化(除非与该癌症无关)而无法进行评估；(4)稳定或无反应，定义为不符合CR、PR或进展(参见，Clinical Research Associates Manual，见上文)。
肿瘤学领结构域公认的其他目标包括总体存活率(OS)、无病存活率(DFS)、客观反应率(ORR)、至进展的时间(TTP)和无进展存活率(PFS)。(参见，Guidance for Industry：Clinical TrialEndpoints for the Approval of Cancer Drugs and Biologics，April 2005，Center for Drug Evaluation and Research，FDA，Rockville，MD)。
3.组合癌症疗法
如上文详述，在一些实施方案中，将zB7H6多肽、抗体或其他zB7H6相关试剂与第二试剂组合使用，用于治疗疾病或障碍。如果用于治疗癌症，可将本发明的zB7H6多肽、抗体或其他试剂(包括例如抗zB7H6抗体-药物缀合物)与常规癌症疗法(例如手术、放射线疗法、化学疗法或其结合)组合使用。在一些方面中，与根据本发明的zB7H6相关试剂一起用于组合癌症疗法的其他治疗剂包括抗血管生成剂。在另一些方面中，用于组合疗法的其他治疗剂包括某些参与肿瘤生长的因子(例如EGFR、ErbB2(Her2)、ErbB3、ErbB4或TNF)的拮抗物。在一些方面中，将根据本发明的试剂与细胞因子(例如刺激抗肿瘤的免疫反应的细胞因子)共同给药。特别适用于癌症治疗的示例性组合疗法在下文中进一步详述。
a.靶向肿瘤相关抗原的抗体
如前文指出的，抗体疗法已被特别成功地用于癌症治疗，原因是一些肿瘤显示独特抗原、谱系特异性抗原，或者相对于正常细胞过量存在的抗体。与单克隆抗体疗法的抗肿瘤活性有关的一个机制是抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。在ADCC中，单克隆抗体结合于靶细胞(例如癌细胞)，并且表达单克隆抗体受体的特异性效应细胞(例如NK细胞、单核细胞、粒细胞)结合于所述单克隆抗体/靶细胞复合体，导致靶细胞死亡。因此，在本发明的一些变化方案中，将具有抗癌有效性的zB7H6多肽、抗体或其他zB7H6相关试剂与抗肿瘤相关抗原的单克隆抗体同时给药。在这些变化方案中，其中抗zB7H6抗体被用于经ADCC或CDC诱导抗肿瘤活性，或者对使用抗zB7H6抗体-药物缀合物的情况，用在所述组合中的单克隆抗体应为针对第二肿瘤特异性或肿瘤相关抗原的抗体。MAb的剂量和给药方案是基于共同给药的具体抗体所具有的药物动力学性质和毒性动力学性质，并且应优化这些效应，同时使得任何与zB7H6多肽、抗体或其他zB7H6相关试剂给药相关的毒性降至最低。
当第一轮治疗失败时，可能需要本文描述的zB7H6相关试剂和抗肿瘤相关抗原的单克隆抗体的组合疗法，并且其被认为是第二轮治疗。本发明还提供了在这样的患者群体中使用所述组合作为第一轮疗法，即该患者群体是最新被诊断的且以前未接受过抗癌药物治疗的患者(“新患者(de novo patients)”)和以前未接受过任何单克隆抗体疗法的患者(“未曾服药的患者(
Figure GPA00001146410700971
patients)”)。
在不存在任何直接抗体介导的对肿瘤细胞的ADCC或CDC的情况下，还可将本文描述的zB7H6相关试剂与抗肿瘤相关抗原的单克隆抗体一块用于组合疗法中。例如，阻断在免疫系统中抑制信号的抗体可导致免疫应答提高。实例包括(1)抗具有抑制性功能的B7R家族分子(例如细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)、程序性死亡-1(PD-1)、B和T淋巴细胞弱化子(BTLA))的抗体；(2)抗抑制性细胞因子(如IL-10、TGFβ)的抗体；以及(3)耗尽或抑制抑制性细胞(如抗CD25或抗CTLA-4)的抗体。例如，据认为在小鼠和人中抗CTLA4MAb都可抑制免疫压抑调节性T细胞(Treg)的功能或者抑制通过使T细胞上的CTLA-4结合于APC或肿瘤细胞上的B7-1或B7-2分子而传递的抑制性信号。
表6不完全列出了已被批准或正被检验可能用于根据本发明的组合疗法的单克隆抗体。
表6：用于与PDGFRβ和/或VEGF-A拮抗物组合使用的单克隆抗体治疗物。
靶   药物名   临床适应症   公司
TRAIL-R1   HGS-ETR1   癌症   HGS
TRAIL-R2   HGS-ETR2   实体瘤   HGS
CD40   SGN40   MM   Seattle Genetics
HER2   Herceptin   乳腺癌   Genentech
EGF-R   ABX-EGF   CRC、NSCLC、RCC   Abgenix
EGF-R   EMD72000   实体瘤   Merck
EGF-R   MDX-214   EGF-R-阳性肿瘤   Medarex
EGF-R   Erbitux   CRC   Imclone
α5β3整联蛋白   Vitaxin   银屑病、前列腺癌   AME/Lilly
CD152   CTLA-4   癌症   Medarex
CD49e   Integrinα5   癌症   Protein DesignLabs
MUC18(TIM样)   ABX-MA1   黑色素瘤
TAG-72粘蛋白   Anatumomab   癌症
CD3   Ecromeximab   黑色素瘤   Kyowa Hakko
CD64(Fc GR1)   AntiCD64   癌症   Medarex
CEA   CEA-Cide   癌症   Immunomedics
EpCAM   Panorex   结肠直肠癌   Centocor
Lewis-Y-Ag   SGN15   癌症   Seattle Genetics
b.酪蛋白激酶抑制剂
在一些实施方案中，将本文描述的zB7H6多肽、抗体或其他zB7H6相关试剂与酪蛋白激酶抑制剂结合使用。酪蛋白激酶是催化γ磷酸基团从三磷腺苷转移至靶蛋白的酶。可以将酪蛋白激酶分类为受体和非受体蛋白酪蛋白激酶。酪蛋白激酶在多种正常细胞过程(包括通过生长受体的激活)中发挥重要的功能，并影响多种细胞类型的增殖、存活和生长。另外，据认为酪蛋白激酶可启动肿瘤细胞增殖，诱导抗凋亡效应，并启动血管发生和转移。除了通过生长因子激活外，通过体细胞突变进行的蛋白激酶激活是肿瘤发生的常见机制。已鉴定的一些突变在B-Raf激酶、FLt3激酶、BCR-ABL激酶、c-KIT激酶、表皮生长因子(EGFR)和PDGFR通路中。Her2、VEGFR和c-Met是另一些参与癌症进展和肿瘤发生的重要受体酪蛋白激酶(RTK)通路。由于大量的细胞过程由酪蛋白激酶起始，所以酪蛋白激酶已被鉴定为抑制剂的关键靶。
酪蛋白激酶抑制剂(TKI)是在细胞内发挥作用的小分子，与三磷腺苷(ATP)竞争对受体和非受体酪蛋白激酶的催化酪蛋白激酶结构域的结合。该竞争性结合可阻断下游信号传递的起始，导致与这些信号传递事件如生长、存活或血管发生相关的效应物功能。使用一种结构和计算方法，从大量医学化学组合文库中鉴定了可抑制酪蛋白激酶的大量化合物。
据认为大部分TKI可通过直接抑制肿瘤细胞或者通过抑制血管发生而抑制肿瘤的生长。而且，一些TKI可通过家族受体影响信号传递，所述TKI包括索拉非尼(sorafenib)和舒尼替尼(sunitinib)。在一些情况下，已经证明TKI可激活树突细胞和其他固有免疫细胞如NK细胞的功能。最近已经在动物模型中报道了伊马替尼(imatinib)的这一功能。伊马替尼是一种TKI，已被证明可增强树突细胞和NK细胞的杀伤活性(综述请参见，Smyth et al.，NEJM 354：2282，2006)。
BAY 43-9006(索拉非尼，)和SU11248(舒尼替尼，
Figure GPA00001146410700992
)是两种这类TKI，最近已被批准用于转移性肾细胞癌(RCC)。大量其他TKI用于多种类型癌症发展的晚期和早期阶段。其他TKI包括但不限于：甲磺酸伊马替尼(Imatinib mesylate)(
Figure GPA00001146410700993
Novartis)；吉非替尼(Gefitinib)(
Figure GPA00001146410700994
AstraZeneca)；盐酸埃罗替尼(Erlotinibhydrochloride)(
Figure GPA00001146410700995
Genentech)；凡德他尼(Vandetanib)(
Figure GPA00001146410700996
AstraZeneca)、替吡法尼(Tipifarnib)(
Figure GPA00001146410700997
Janssen-Cilag)；达沙替尼(Dasatinib)(
Figure GPA00001146410701001
Bristol MyersSquibb)；洛那法尼(Lonafarnib)(
Figure GPA00001146410701002
Schering Plough)；琥珀酸瓦他拉尼(Vatalanib succinate)(Novartis，Schering AG)；拉帕替尼(Lapatinib)(
Figure GPA00001146410701003
GlaxoSmithKline)；尼罗替尼(Nilotinib)(Novartis)；来他替尼(Lestaurtinib)(Cephalon)；盐酸帕唑帕尼(Pazopanib hydrochloride)(GlaxoSmithKline)；阿西替尼(Axitinib)(Pfizer)；卡纽替尼二盐酸盐(Canertinib dihydrochloride)(Pfizer)；培利替尼(Pelitinib)(National Cancer Institute，Wyeth)；坦度替尼(Tandutinib)(Millennium)；伯舒替尼(Bosutinib)(Wyeth)；司马沙尼(Semaxanib)(Sugen，Taiho)；AZD-2171(AstraZeneca)；VX-680(Merck，Vertex)；EXEL-0999(Exelixis)；ARRY-142886(ArrayBioPharma，AstraZeneca)；PD-0325901(Pfizer)；AMG-706(Amgen)；BIBF-1120(Boehringer Ingelheim)；SU-6668(Taiho)；CP-547632(OSI)；(AEE-788(Novartis)；BMS-582664(Bristol-Myers Squibb)；JNK-401(Celgene)；R-788(Rigel)；AZD-1152HQPA(AstraZeneca)；NM-3(Genzyme Oncology)；CP-868596(Pfizer)；BMS-599626(Bristol-Myers Squibb)；PTC-299(PTC Therapeutics)；ABT-869(Abbott)；EXEL-2880(Exelixis)；AG-024322(Pfizer)；XL-820(Exelixis)；OSI-930(OSI)；XL-184(Exelixis)；KRN-951(KirinBrewery)；CP-724714(OSI)；E-7080(Eisai)；HKI-272(Wyeth)；CHIR-258(Chiron)；ZK-304709(Schering AG)；EXEL-7647(Exelixis)；BAY-57-9352(Bayer)；BIBW-2992(Boehringer Ingelheim)；AV-412(AVEO)；YN-968D1(Advenchen Laboratories)；米哚妥林(Midostaurin)(Novartis)；哌立福辛(Perifosine)(AEterna Zentaris，Keryx，National Cancer Institute)；AG-024322(Pfizer)；AZD-1152(AstraZeneca)；ON-01910Na(Onconova)；和AZD-0530(AstraZeneca)。
c.化学疗法的组合
在一些实施方案中，将zB7H6多肽、抗体或其他zB7H6相关试剂与一种或多种化学治疗剂组合给药。化学治疗剂具有不同的作用模式，例如通过影响DNA或RNA并干涉细胞周期复制。作用于DNA水平或RNA水平的化学治疗剂的实例有抗代谢物(例如硫唑嘌呤、阿糖胞苷、磷酸氟达拉滨、氟达拉滨、吉西他滨(Gemcitabine)、阿糖胞苷、克拉屈滨(Cladribine)、卡培他滨6-巯基嘌呤(capecitabine6-mercaptopurine)、6-硫鸟嘌呤、甲氨蝶呤，5-氟尿嘧啶和羟基脲(hyroxyurea)；烷化剂(例如美法仑、白消安、顺铂、卡铂、环磷酰胺、异磷酰胺、氮烯唑胺(Dacarabazine)、甲基苄肼(Procarbazine)、苯丁酸氮芥、噻替哌、洛莫司汀、替莫唑胺(Temozolamide))；抗有丝分裂剂(例如长春瑞滨、长春新碱，、长春碱、多西他赛、紫杉醇)；拓扑异构酶抑制剂(例如阿霉素(Doxorubincin)、安吖啶(Amsacrine)、伊立替康、柔红霉素、表柔比星、丝裂霉素、米托蒽醌、伊达比星、替尼泊苷(Teniposide)、依托泊苷、拓扑替康)；抗生素(例如放线菌素和博来霉素)；天门冬酰胺酶；蒽环类或紫杉烷。
d.放射疗法的组合
在一些变化方案中，将zB7H6多肽、抗体或其他zB7H6相关试剂与放射疗法一块给药。可以以辐射或放射性药物治疗一些肿瘤。辐射疗法通常用于治疗不可切除的或不可动手术的肿瘤和/或肿瘤转移。放射治疗通常以三种方式进行。外部束辐照在远离身体处给予，包括γ射线(60Co)和X射线。进程疗法使用诸如60Co、137Cs、192Ir或125I的源与靶组织一块或者与靶组织相接触。
e.激素试剂的组合
在一些实施方案中，将zB7H6多肽、抗体或其他zB7H6相关试剂与激素或抗激素药组合给药。一些癌症与激素依赖性有关，包括例如卵巢癌、乳腺癌和前列腺癌。激素依赖性癌症治疗可包括使用抗雄激素化合物或抗雌激素化合物。用于癌症疗法的激素和抗激素药包括磷酸雌莫司汀、磷酸聚雌醇、雌二醇、阿纳托唑(Anastrozole)、依西美坦、来曲唑、三苯氧胺、乙酸甲地孕酮、乙酸甲羟孕酮、奥曲肽(Octreotide)、乙酸环丙氯地孕酮、比卡鲁胺(Bicaltumide)、氟他胺、曲普瑞林(Tritorelin)、亮丙瑞林(Leuprorelin)、戈舍瑞林(Buserelin)和布舍瑞林(Goserelin)。
VII.筛选方法
在另一方面，本发明提供了筛选zB7H6与NKp30相互作用的激动剂或拮抗物的方法。通常，这类筛选拮抗物的方法包括如下步骤：(a)在存在NKp30多肽的情况下将一种试剂与zB7H6多肽相接触；(b)检测所述zB7H6多肽与NKp30多肽的相互作用的量度；以及(c)确定步骤(b)中测量的zB7H6/NKp30相互作用的水平相对于在无所述试剂的情况下测量的对照zB7H6和NKp30多肽相互作用的水平是否显著低，照这样，如果zB7H6/NKp30相互作用的水平较低，那么将该试剂鉴定为zB7H6与NKp30相互作用的拮抗物。
筛选激动剂的方法通常包括如下步骤：(a)在存在NKp30多肽的情况下将一种试剂与zB7H6多肽相接触；(b)检测所述zB7H6多肽与NKp30多肽相互作用的量度；以及(c)确定步骤(b)中测量的zB7H6/NKp30相互作用的水平相对于在无所述试剂的情况下测量的对照zB7H6和NKp30多肽相互作用的水平是否显著高，照这样，如果zB7H6/NKp30相互作用的水平较高，那么将该试剂鉴定为zB7H6与NKp30的相互作用的激动剂。
对zB7H6与NKp30相互作用的测量可包括，例如检测zB7H6结合于NKp30，以及zB7H6多肽触发NKp30介导的细胞活性(例如细胞裂解活性)的能力，或检测NKp30多肽触发zB7H6介导的细胞活性的能力。为了鉴定zB7H6/NKp30相互作用的激动剂，特别是如果对所述相互作用的量度为NKp30介导的或zB7H6介导的细胞活性的水平，所述方法还可以包括另外的对照，以确定在不存在zB7H6多肽或NKp30多肽的情况下，所述试剂是否能够诱导所述细胞活性，照这样，如果所述试剂在不存在zB7H6多肽或NKp30多肽的情况下能够诱导所述细胞活性，那么该试剂不是zB7H6与NKp30的相互作用的激动剂。
用于所述筛选方法中的zB7H6多肽通常应包含zB7H6细胞外结构域，或者其功能性变体或片段。因此，用于所述筛选方法中的zB7H6多肽通常应包含选自以下的多肽区：
(i)SEQ ID NO：2的zB7H6多肽的细胞外结构域(即SEQ IDNO：2的第25-266号残基)；
(ii)(i)的zB7H6细胞外结构域的功能性变体，所述变体与SEQID NO：2的第25-266号残基具有至少80％的同一性；以及
(iii)(i)的zB7H6细胞外结构域或(ii)的结构结构域变体的功能性片段。
在典型变化方案中，zB7H6多肽可包含zB7H6SEQ ID NO：2的细胞外结构域(即SEQ ID NO：2的第25-266号残基)，或者与SEQ IDNO：2的第25-266号残基有至少90％或95％序列同一性的功能性变体。zB7H6多肽可以是本文公开的可溶性zB7H6受体。在另一些变化方案中，zB7H6多肽为在细胞上表达的膜结合形式的zB7H6(例如，在重组体细胞上表达的具有GPI键合的zB7H6多肽或具有功能性跨膜结构域的zB7H6多肽，如SEQ ID NO：2的zB7H6多肽)。
类似地，用于所述筛选方法中的NKp30多肽通常应包含NKp30的细胞外结构域，或者其功能性变体或片段。NKp30多肽通常为人NKp30多肽或源自人NKp30的多肽。NKp30多肽可以是可溶性NKp30受体或膜结合形式的NKp30。在一些变化方案中，NKp30是在细胞上表达的全长NKp30蛋白(例如全长人NKp30)；这类实施方案特别适用于将NKp30介导的细胞裂解活性用作函数读数来检测zB7H6与NKp30的相互作用等。
在利用在重组体细胞上表达的zB7H6或NKp30多肽的一些变化方案中，将编码zB7H6或NKp30受体的cDNA或基因与其表达所需的其他遗传元件(例如转录启动子)相结合，并将所产生的表达载体插入至宿主细胞中。选择表达所述DNA并产生功能性受体的细胞，并将这些细胞用于多种筛选体系中。单体、同源二体、异源二体和多聚体受体复合物的每个组分均可在同一细胞中表达。还可以将单体、同源二体、异源二体和多聚体受体复合物的组分融合于跨膜结构域或其他膜融合部分，以使得复合体可装配且转染子可筛选。在一些实施方案中，zB7H6多肽和NKp30多肽中的每一种均在单独的宿主细胞中表达。或者，zB7H6和NKp30多肽中仅一种在细胞中表达。
在动物模型体系中，可以通过将候选试剂给予动物使细胞与候选试剂相接触。所述候选试剂可以通过输滴或注射等经口、静脉给药。
用于筛选的试剂可以包括具有通过非共价键相互作用与生物分子(特别是蛋白)在结构上相互作用的可能性的任意试剂，所述非共价键为例如氢键、离子键、范德华吸引力或疏水相互作用。因此，许多类型的试剂可通过本发明的方法筛选。合适的候选试剂包括例如，小分子、核酸、肽、模拟肽、合成化合物和/或天然化合物。
用于筛选的试剂可以包括肽和/或核酸的随机和/或半随机文库。在一些在宿主细胞中表达重组体zB7H6或NKp30的变化方案中，可以通过将表达体系的细胞与一种核酸试剂相接触而筛选所述核酸。在一个具体实例中，可以将基因组文库或cDNA文库引入至一群表达zB7H6或NKp30的重组体细胞中并在所述细胞中表达，以鉴定降低或提高zB7H6与NKp30相互作用的遗传试剂。
在另一些实施方案中，待筛选的试剂可为模拟肽。术语“模拟肽”是指这样的合成化学化合物，即该化合物具有与蛋白、多肽或肽基本相同的结构和功能特征。肽类似物通常在制药工业中用作非肽药物，具有类似于模板肽的性质。这类非肽化合物称为“肽模拟物”或“模拟肽”(参见例如，Fauchere，J.Adv.Drug Res.15：29，1986；Veber andFreidinger TINS第392页，1985；和Evans et al.，J.Med.Chem.30：1229，1987)。在结构上类似于可用于治疗的肽的肽模拟物可用于产生等价的或者增强的治疗或预防效果。通常，模拟肽在结构上类似于范例多肽(例如具有所需生物活性或药理活性的多肽)，但具有一个或多个任选被选自例如以下的键代替的肽键：--CH2NH--、--CH2S--、--CH2--CH2--、--CH.＝CH--(顺式及反式)、--COCH2--、--CH(OH)CH2--和--CH2SO--。所述模拟物可以是完全由合成的、非天然氨基酸类似物构成，或者是一种部分天然肽氨基酸和部分非天然的氨基酸类似物的嵌合分子。所述模拟物还可以整合天然氨基酸保守替换，条件是这类替换也不会显著改变该模拟物的结构和/或活性。
用于筛选的试剂还可以来自合成和/或天然化合物的文库。一个实例是被FDA批准的人可用的化合物的文库。另外，合成化合物文库可从许多公司购得，所述公司包括Maybridge Chemical Co.(Trevillet，Cornwall，UK)、Comgenex(Princeton，N.J.)、Brandon Associates(Merrimack，N.H.)和Microsource(New Milford，Conn.)，罕见化学品文库(rare chemical library)可获自Aldrich(Milwaukee，Wis.)。
组合文库是可获得的并且/或者可以制备的。或者，细菌、真菌、植物和动物提取物形式的天然化合物文库也是可获得的，例如从PanLaboratories(Bothell，Wash.)或MycoSearch(N.C.)获得；或者是可制备的。还可以将从天然源例如动物、细菌、真菌、植物源(包括叶和皮)分离的化合物作为候选试剂加以筛选。
其他合适的试剂包括反义分子、核酶和抗体(包括单链抗体和Fv片段)。例如，可结合于翻译或转录起始位点或剪接点的反义分子可以是候选试剂。另外，可容易地通过常规化学、物理和生物化学手段改变天然的和合成产生的文库和化合物。
可以以快速且有效的方式进行这类文库(包括组合产生的文库例如肽文库)的筛选，以筛选大量相关和/或无关的化合物。组合方法还可通过以下方式使其自身快速地演化出可能的治疗剂：以活性化合物而非其他不需要化合物为模型，产生第二、第三和第四代化合物。
组合化学品文库的制备和筛选是本领结构域技术人员熟知的。这类组合化学品文库包括但不限于肽文库(参见例如，美国专利No.5,010,175；Furka，Int.J.Pept.Prot.Res.37：487-93，1991；Houghton etal.，Nature 354：84-88，1991)。还可以使用生成多样化学品文库的其他化学试剂。这类化学试剂包括但不限于：拟肽(参见例如，PCT公开文本No.WO 91/19735)、所编码的肽(参见例如，PCT公开文本WO93/20242)、随机生物寡聚物(参见例如，PCT公开文本No.WO92/00091)、苯二氮平(benzodiazepines)(参见例如，美国专利No.5,288,514；Baum，C&EN，Jan 18，1993，第33页)、diversomer例如乙内酰脲、苯二氮平和二肽(参见例如，Hobbs et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 90：6909-13，1993)、插烯多肽(参见例如，Hagihara et al.，J.Amer.Chem.Soc.114：6568，1992)、具有葡萄糖支架的非肽肽模拟物(参见例如，Hirschmann et al.，J.Amer.Chem.Soc.114：9217-18，1992)、模拟有机合成的小化合物文库(参见例如，Chen et al.，J.Amer.Chem.Soc.116：2661，1994)、寡氨基甲酸(参见例如，Cho et al.，Science261：1303，1993)、肽酰磷酸酯(参见例如，Campbell et al.，J.Org.Chem.59：658，1994)、核酸文库(参见例如，Ausubel et al.，见上文；Sambrook，见上文)、肽核酸文库(参见例如，美国专利No.5,539,083)、抗体文库(参见例如，Vaughn et al.，Nature Biotechnology，14：309-14，1996和PCT/US96/10287)、糖文库(参见例如，Liang et al.，Science274：1520-22，1996；美国专利No.5,593,853)、小有机分子文库例如类异戊二烯(参见例如，美国专利No.5,569,588)、噻唑啉酮和间噻嗪酮(参见例如，美国专利No.5,549,974)、吡咯烷(参见例如，美国专利No.5,525,735和5,519,134)、吗啉代化合物(参见例如，美国专利No.5,506,337)等等。
用于制备组合文库的装置是可市购的(参见例如，357MPS，390MPS，Advanced Chem Tech，Louisville Ky.；Symphony，Rainin，Woburn，Mass.；433A Applied Biosystems，Foster City，Calif.；9050Plus，Millipore，Bedford，Mass.)。另外，许多组合文库本身是可市购的(参见例如，ComGenex，Princeton，N.J.；Tripos，Inc.，St.Louis，Mo.；3D Pharmaceuticals，Exton，Pa.；Martek Biosciences，Columbia，Md.；etc.)。
可以对通过任一前述筛选方法初次鉴定的试剂进行进一步测试，以评估表观活性。例如，可以以合适的动物模型或离体人细胞进行后续评估。为使用动物模型体系的体内评估，这类方法的基本形式可以涉及，将初始筛选过程中鉴定的试剂给予作为NK细胞相关疾病或障碍模型的动物，然后确定NK细胞活性是否被调节，或者所述疾病或障碍的其他临床症状是否有减轻。评估研究中使用的动物模型为任意类型的哺乳动物。合适的动物的具体实例包括但不限于灵长类、小鼠和大鼠。
通过如下的非限制性实施例进一步描述本发明。
实施例1：以可溶性NKp30/VASP抑制NK-92对K562靶的细胞 裂解活性
以NK-92细胞作为对K562靶的效应物进行细胞裂解测定。
将NK-92细胞以HBSSF(Hank’s缓冲盐水(无Ca、Mg)+5％FBS)洗涤1次，并以1.35x106/ml的密度重悬浮于HBSSF中(获得27∶1的比例)。将150μl的经洗涤的细胞铺板于U形底96孔板第一排中，并连续稀释(1∶3)于HBSSF中。
将K562靶细胞以HBSSF洗涤1次，并以1x106细胞/ml在37℃下在10μM钙黄绿素AM分子探针#C1430(将4mM储液以2.5μl/ml溶于DMSO中，4mM＝4mg/ml)中标记60分钟。将经标记的细胞在HBSSF中洗涤2次，并将1x106细胞重悬浮于20ml HBSSF中(5000细胞/100μl)。将100μl悬浮的靶细胞加入稀释的效应物中，以获得200ul的总体积。还将可溶形式的NKp30(NKp30/VASP A1683F)以2μg/ml的浓度加入至一些组的连续稀释孔中。
将效应物和靶细胞以500rpm离心2分钟，在37℃下孵育3小时，以1500rpm离心5分钟，然后将100μl上清液转移至新的平底96孔板中。将包含所转移的上清液的平底板在荧光计上以485nm的激发波长和535nm的发射波长读数1秒。
如图1中所示，可溶性NKp30/VASP A1683F抑制了NK-92细胞抗K562靶的细胞裂解活性(参见图1A)。其他VASP对照无效应，表明NK-92裂解K562靶的能力依赖于NKp30。
在独立的细胞裂解测定实验中，将可溶性NKp30/VASP以不同浓度(0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0和16.0μg/ml)加入包含NK-92效应物和K562靶(9∶1的效应物∶靶比例)的孔中。该实验的结果证明了，可溶性NKp30可以剂量依赖的方式抑制NK-92细胞的裂解作用(参见图1B)。这些结果表明K562细胞上存在NKp30的配体，并支持进一步的研究。
实施例2：可溶性NKp30可特异性结合K562细胞
以可溶形式的NKp30(包含NKp30的细胞外结构域和鼠类Fc片段的NKp30/mFc2(SEQ ID NO：8))通过FACS探测K562细胞。将K562细胞以1.6x106细胞/ml(160,000细胞/样品)的浓度重悬浮于PBS/2％FBS中。等分成100μl等分样品，并向每等份中加入1μl的全人IgG(Jackson#009-000-003)。将NKp30/mFc2探针以2μg/ml的浓度加入，同时加入10μg/ml肝素和100倍过量的VASP蛋白(NKp30/VASP或对照VASP蛋白，人zB7R1/VASP(SEQ ID NO：12)或B7-DC/VASP(SEQ ID NO：13))。将细胞在冰上孵育1小时，并以2ml冷PBS洗涤。将经洗涤的细胞重悬浮于100μl添加1μlPE单克隆IgG抗体(Jackson 115-116-071)的PBS/2％FBS中，并在冰上孵育30分钟。然后将细胞以2ml冷PBS洗涤2次，重悬浮于500μl的PBS中，并在FACSCalibur上分析PE染色。
如图2中所示，NKp30/mFc2结合于K562细胞(“非竞争性”)。该结合可被NKp30/VASP竞争，但不被对照VASP蛋白(“hzB7R1/Vasp”和“B7-DC/Vasp”)竞争，证明NKp30/mFc2对K562细胞的结合是特异性的。
在独立的FACS实验中，以缀合于生物素的NKp30/mFc2(NKp30/mFc2-生物素，4μg/ml)探测K562细胞和BaF3细胞。对于这些研究，将PE缀合的链亲和素(BD Pharmingen 554061)用作二级试剂。该实验的结果证明了，NKp30/mFc2可结合于K562细胞，但不结合于BaF3细胞(参见图3)。
实施例3：K562细胞和生物素化NKp30/mFc2的交联
在鉴定K562细胞上NKp30配体的尝试中，将K562细胞与生物素化NKp30/mFc2交联，然后进行免疫沉淀和质谱测定。
分析了4个样品，1个目的样品和3个阴性对照样品。目的样品为与生物素化NKp30/mFc2一块孵育的K562细胞。3个阴性对照样品为无NKp30的K562细胞，以及有或无NKp30的BaF3细胞。将100x106细胞在PBS中洗涤1次，在存在或不存在2μg/ml NKp30/mFc2-生物素的条件下重悬浮于2ml结合缓冲液(RPMI，3mg/ml BSA，20mMHEPES)中，并在冰上孵育2小时。将细胞洗涤(在结合缓冲液中洗涤1次，在PBS中洗涤1次)，重悬浮于1ml交联剂(3mm BS3[Pierce21580])中，并在室温下孵育30分钟。然后加入7.5μl的2M Tris(pH7.4)，得到终Tris浓度15mM，并将细胞在室温下孵育15分钟。将细胞在PBS中洗涤2次，然后在冰上于1ml RIPA/1％TX-100/0.1％SDS中裂解5分钟(RIPA缓冲液：20mM Tris pH 7.4，150mM NaCl，2mM EGTA，1mM NaV04，1mM β-甘油磷酸酯，1片/25mls CompleteMini Protease inhibitor cocktail tablet(Roche 10946900))。以50μl的链亲和素琼脂糖(Pierce 20347)孵育裂解上清液，在4℃下振动裂解上清液2小时。将链亲和素琼脂糖在PBS中洗涤3次。通过在7.5μlNupage样品缓冲液(Invitrogen NP0007)、19.5μlH20和3μl还原剂(Invitrogen NP0004)中重悬浮链亲和素琼脂糖，然后煮沸10分钟，洗脱结合的蛋白。然后将样品分成两个半份，将每个半份用两片相同的4-12％NuPage凝胶(约40x106细胞/道)之一电泳。还将未交联的NKp30/mFc2-生物素(100ng、33ng、11ng和3.6ng)作为对照用这些凝胶电泳。将两个凝胶中的一个用于串联质谱分析，而将另一个用于蛋白质印迹分析。
对于蛋白质印迹分析，在蛋白质印迹转移缓冲液(0.025MTris/0.186M甘氨酸/20％(v/v)甲醇)中以600mAmp的恒流将蛋白转移至硝酸纤维素膜(Invitrogen LC2000)，持续45分钟。然后在室温下将硝酸纤维素膜以封闭缓冲液Western A(0.097％Tris Base(w/w)/0.661％Tris HCl(w/w)/0.186％EDTA(w/w)/0.05％Igepal(v/w)/0.877％NaCl(w/w)/0.25％明胶l(w/w))封闭1小时。在室温下将封闭的膜以链亲和素-HRP(1∶8000，Pierce 21126)探测1小时，然后以PBS洗涤3次。在室温下将经洗涤的膜在10ml ECL A+B缓冲液(Amersham RPN2209)中孵育1分钟，包装于wrap中，并暴露于x射线薄膜。5秒钟的暴露得到了图4中显示的结果。如图4中所示，仅检测到了以NKp30/mFc2-生物素探测的K562细胞的高分子量信号。将对应于该高分子量带的蛋白从相应NuPage凝胶切下，用于串联质谱分析。
实施例4：通过对NKp30相互作用蛋白的LC-MS/MS蛋白组学分 析鉴定zB7H6
导论
将K562细胞与生物素化NKp30/mFc2一块孵育，通过共价结合与化学交联剂的相互作用来保持任何相互作用(参见实施例3，见上文)。通过使用自动搜索算法将串联质谱与肽序列进行匹配，差分质谱可鉴定独特蛋白。在该分析中，将搜索算法X！Tandem用于鉴定NKp30/mFc2与K562细胞相互作用特有的蛋白。
材料和方法
分析了4个样品，1个目的样品和3个阴性对照样品。目的样品为与生物素化NKp30/mFc2一块孵育的K562细胞。3个阴性对照样品为无NKp30的K562细胞，以及有或无NKp30的BaF3细胞。将每个样品与化学交联剂反应，以共价连接任何蛋白-蛋白相互作用，并且通过以链亲和素琼脂糖沉淀将生物素化组分分离并收集。
将包含生物素化组分的链亲和素纯化级分通过SDS-PAGE电泳分离。进行蛋白质印迹并以链亲和素-HRP探测(参见实施例3，见上文)。对第二凝胶进行考马斯染色。图5A和5B显示了考马斯染色的凝胶和相应的蛋白质印迹。
切下16个凝胶带。这些带对应于图5A中描绘出的区11-14、21-24、31-34和41-44。以TCEP还原这些凝胶带中的蛋白质(25μl，25mM，80℃，15分钟)，以IAM对所产生的游离半胱氨酸加帽(25μl，100mM，25℃，2小时)，并以胰蛋白酶消化所述样品(Promega V5111，lot18889904，10μl，20μg/mL，37℃，18小时)。将得到的肽从凝胶块提取，干燥并再次溶解于20μL的0.1％FA中。将5μl所得肽混合物用在包装于约10cm的50um熔融二氧化硅中的Magic C18AQ 3μm，200A树脂分离。将洗脱的肽在LTQ Ion Trap质谱仪上分析。在质谱仪上的分析由10个扫描循环组成。在第一次扫描中，获得了400-2000m/z的全MS扫描。后续的扫描通过MS/MS分析了9个最强的离子。动态排除避免了分析过的离子在其首次MS/MS分析后15秒至30秒被靶向进行MS/MS分析。
使用Bioworks将原始数据文件转换成文本文件。使用自动搜索算法X！Tandem以所得到的文本文件对人ipi数据库进行搜索。
结果和讨论
如前文指出的，蛋白质印迹和考马斯染色的凝胶显示于图5A和5B中。在蛋白质印迹中，独特带出现在包含目的样品的带中，所述条带在大于生物素化NKp30/mFc2的分子量的分子量处(约50kDa)(参见图5B)。这表明，这些带是交联于K562细胞表面上的结合配对物的生物素化NKp30。在相应的考马斯染色的凝胶中(参见图5A)，带11包含在蛋白质印迹中被鉴定为缀合于K562细胞表面上结合配对物的NKp30。从凝胶的该区段鉴定的、但在相应阴性对照带(带21、31和41)中未鉴定到的蛋白的列表可以见于表7。对基因组数据库的分析将这些蛋白中的一种鉴定为推定的蛋白DKFZp686O24166。由LC-MS/MS鉴定的三种肽在推定蛋白DKFZP686I21167的氨基酸序列中的定位可以见于图6中。还对所有谱进行手工检查，以确认由X！Tandem产生的肽/蛋白鉴定结果。
表7：在凝胶带11中鉴定的独特蛋白
蛋白名   由LC-MS/MS鉴定的独特肽
  天然细胞毒性触发受体3   3
  推定的蛋白DKFZP686I21167   3
  网蛋白6   6
  阴离子依赖型甘露糖-6-磷酸受体前体   13
  NKp30/Fc2   8
结论
NKp30/mFc2和推定的蛋白DKFZP686I21167仅在这样的样品中被鉴定到，即在其中NKp30/mFc2可与K562细胞相互作用。这些数据支持推定的蛋白DKFZP686I21167作为NKp30的结合配对物。
实施例5：对zB7H6序列和基因结构的分析，以及对zB7H6作为 B7家族成员的鉴定
基于B7家族基因作谱，将推定的蛋白DKFZP686I21167鉴定为B7家族细胞受体的一个成员。其基因结构图为信号-2-IgV-2-IgC-2-TMD-0-LgEx(参见图7)。该图的细胞外区域与B7基因结构模型匹配，包括以下的特征性外显子模式：其中第一外显子编码前导序列、第二外显子编码IgV结构域且第三外显子编码IgC结构域。B7家族基因结构的另一个特征是外显子的相位：在对应于细胞外结构域的区域中，B7家族成员显示在外显子1至4之间保守的相位2(参见id)。部分地基于将DKFZP686I21167鉴定为B7家族成员，将该蛋白在内部命名为zB7H6。zB7H6的细胞质区域与Gag多蛋白有44％的同源性，并且它包含可能的信号传递基序例如SaYtpL(ITIM)、YqlQ(SH2)和PdaPilPvsP(SH3)(参见图7)。因此，它除了可触发pNKp30之外还可能具有其他功能。
对公共EST数据库的搜索鉴定了对应于zB7H6的至少20种人EST，但无小鼠EST或mRNA。对于所有其他物种(例如小鼠、大鼠、狗、牛)仅有预测的序列。在细胞内区域中，人和除猿之外的其他物种的预测肽之间没有相似性。
实施例6：人zB7H6表达构建体
对应于DKFZp686O24166(命名为zB7H6)的cDNA克隆CT#102296购自German Cancer Research Center，Heidelberg，Germany。
经PCR、限制性消化和连接构建包含编码全长人zB7H6(SEQ IDNO：2)的多核苷酸的表达质粒。使用CT#102296为模板并使用引物zc58067(SEQ ID NO：9)和zc58401(SEQ ID NO：10)，通过PCR分离人zB7H6cDNA片段，所述分离的人zB7H6cDNA片段在5’端和3’端的侧翼区对应于人zB7H6插入点侧翼的载体序列。
将PCR反应混合物用1％琼脂糖凝胶进行电泳，并使用QIAquickTM Gel Extraction Kit(Qiagen，Valencia，CA)将对应于插入片段大小的带进行凝胶提取。在37℃下将所产生的纯化PCR产物以EcoRI和XhoI消化2小时，并进行1％琼脂糖凝胶电泳以用于如上述的带纯化。在37℃下将质粒pZP-7NX以EcoRI和XhoI消化2小时，并跑1％琼脂糖凝胶，用于如上述的带纯化。在室温下将2μl的PCR产物和1μl的切割pZP-7NX在2μl10X连接缓冲液、14μlH20和1μlT4DNA连接酶(Promega，Madison，WI)中连接2小时，总体积20μl。使用设定为25uF、300ohm和2100伏特的Gene Pulser II电穿孔仪(BioRad，Hercules，CA)将1μl的连接物电穿孔至Electromax DH10B(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。将100μl的转化物铺板于LB AMP平板(LB肉汤(Lennox)、1.8％BactoTM琼脂(Difco)、100mg/L氨苄青霉素)上。
将个体菌落在2ml LB 100mg/L氨苄青霉素培养基中培养过夜，并使用质粒微型试剂盒(Qiagen，Valencia，CA.)进行微提取。将所述微提取物以BamHI和BglII消化，并将具有正确的1.152kB插入片段的克隆进行DNA测序。将所述正确的构建物命名为pZP-7NX hzB7H6。
实施例7：全长zB7H6在P815和BaF3细胞中的表达：zB7H6可 特异性结合于NKp30并且能够触发NK细胞活性
将经确证序列正确的克隆zB7H6(pZP-7NX hzB7H6)通过电穿孔再次引入至electromax DH10B中，然后扩大至200ml LB+amp的过夜培养物，使用Qiagen kit#12183从该培养物中纯化DNA。将40μg的DNA通过以HindIII消化线性化，并进行乙醇沉淀。使用如下方案将该DNA电穿孔至P815和BaF3细胞中。将P815细胞以Optimem无血清培养基(Invitrogen，Carlsbad，CA)洗涤2次，并以1x107细胞/ml重悬浮于Optimem中。将800μl细胞转移至包含来自上文的线性化DNA的试管中，并在室温下孵育15分钟。将DNA/细胞混合物转移至4mm电穿孔容器中，并以800μF和300伏特振动。在孵育1分钟后，将细胞以1180μF和300伏特再次振动。在于1mg/ml遗传霉素(Geneticin)(Invitrogen 1013-027)中选择之前在37℃下将细胞孵育过夜，并通过以0.3细胞/孔的有限稀释度铺板产生克隆。通过FACS筛选随机选择的克隆对可溶形式的NKp30(NKp30/VASP；SEQID NO：11)的结合。将最高选择克隆用于FACS结合竞争测定和细胞裂解测定中。
使用以3x106/ml重悬浮的和以100μl/样品等分至终计数为300000细胞/样品的BaF3细胞进行FACS结合竞争测定。将1μl全鼠IgG(Jackson 015-000-003)加入每个样品，然后以2μg/ml加入NKp30/mFc2-A647标记的探针。在待包括竞争的样品中，以100倍过量加入未标记的探针，并将样品在冰上孵育1小时。将样品以冷PBS洗涤1次，并在FACSCalibur上分析样品对可溶性NKp30/mFc2-A647的结合。
FACS结合竞争测定的结果显示于图8A和8B中。可溶性NKp30/VASP-A647结合于以hzB7H6表达载体电穿孔的细胞，但不结合于包含空载体对照物的对照细胞。在存在100倍过量的无关NKp30/VASP的情况下未观察到NKp30/VASP-A647染色(参见图8A)，在存在100倍过量的无关VASP蛋白的情况下观察到了NKp30/VASP-A647染色(参见图8B)。
以NK-92细胞作为抗P815靶的效应物进行细胞裂解测定。将NK-92细胞以HBSSF(Hank’s缓冲盐水(无Ca、Mg)+5％FBS)洗涤1次，并以1.35x106/ml重悬浮于HBSSF中(获得27∶1的比例)。将150μl的经洗涤细胞铺板于U形底96孔板第一排中，并连续稀释(1∶3)于HBSSF中。将P815靶细胞以HBSSF洗涤1次，并以1x106细胞/ml在37℃下在10μM钙黄绿素AM分子探针#C1430(将4mM储液以2.5μl/ml溶于DMSO，4mM＝4mg/ml)中标记60分钟。将经标记的细胞在HBSSF中洗涤2次，并将1x106细胞重悬浮于20mlHBSSF中(5000细胞/100μl)。将100μl悬浮的靶细胞加入稀释的效应物中，以获得200μl的总体积(27∶1、9∶1、3∶1和1∶1的效应物∶靶比例)。还将活化的抗NKp30单克隆抗体以2μg/ml的浓度加入至一些组的连续稀释孔中。
将效应物和靶细胞以500rpm离心2分钟，在37℃下孵育3小时，以1500rpm离心5分钟，然后将100μl悬液转移至新的平底96孔板中。将包含所转移的上清液的平底板在荧光计上以485nm的激发波长和535nm的发射波长读数1秒。
NK-92细胞不裂解野生型P815细胞或以两种非触发对照蛋白(hIgSF1(SEQ ID NO：14)和hB7H1(SEQ ID NO：15))转染的P815细胞，而加入活化的抗NKp30单克隆抗体触发了重定向裂解。转染hCD86(Azuma et al.，Nature 366：76，1993)或zB7H6触发了P815细胞的直接杀伤。
这些结果证明了zB7H6可特异性结合于NKp30并能够触发细胞裂解活性。
实施例8：人zB7H6/mFc2的克隆和构建
经PCR扩增、限制性消化和连接构建包含编码人zB7H6细胞外结构域的多核苷酸和小鼠Fc2部分的表达质粒。使用SEQ CT#102296为模板并使用引物zc50437(SEQ ID NO：20)和zc50438(SEQ IDNO：21)，通过PCR分离人zB7H6细胞外结构域的DNA片段，所述分离人zB7H6细胞外结构域的DNA片段在5’端和3’端的侧翼序列对应于人zB7H6插入点侧翼的载体序列和小鼠Fc2序列。
将PCR反应混合物用1％琼脂糖凝胶电泳，并使用QIAquickTMGel Extraction Kit(Qiagen，Valencia，CA)将对应于插入片段大小的带进行凝胶提取。所使用的初始质粒为作为基础载体的pZMP21，具有构建于其中的小鼠Fc2部分。质粒pZMP21为哺乳动物表达载体，包含具有MPSV启动子、用于插入编码序列的多个限制性位点、终止密码子、大肠杆菌复制起始点的表达盒；包含SV40启动子、增强子和复制起始点、DHFR基因和SV40终止子的哺乳动物可选择标记物表达单元；以及在酿酒酵母(S.cerevisiae)中选择和复制需要的URA3和CEN-ARS序列。它构建自pZP9(以登记号98668，保藏于美国典型菌种收藏所(American Type Culture Collection)，10801UniversityBoulevard，Manassas，VA 20110-2209)，具有取自pRS316(以登记号77145保藏于美国典型菌种收藏所，10801University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209)的酵母遗传元件、来自脊髓灰质炎病毒的内核糖体进入位点(IRES)元件和在跨膜结构域C末端截短的CD8的细胞外结构域。将质粒hBTLA mFc2pZMP21以EcoR1/BglII消化以切下人BTLA，并用于与PCR插入物连接。
在室温下将2μl的PCR产物和1μl的切割pZMP21在2μl10X连接缓冲液、14μlH20和1μlT4DNA连接酶(Promega，Madison，WI)中连接2小时，总体积20μl。使用设定为25uF、300ohm和2100伏特的Gene Pulser II电穿孔仪(BioRad，Hercules，CA)将1μl的连接物电穿孔至Electromax DH10B(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。将100μl的转化物铺板于LB AMP平板(LB肉汤(Lennox)、1.8％BactoTM琼脂(Difco)、100mg/L氨苄青霉素)上。通过以EcoRI和KpnI限制性消化筛选菌落，将显示预计的1.596kB的插入片段的克隆进行DNA测序。将正确的构建体命名为hB7H6mFc2pZMP21。编码hzB7H6/mFc2的DNA序列显示为SEQ ID NO：16；hzB7H6/mFc2的氨基酸序列显示为SEQ ID NO：17。
实施例9：zB7H6/VASP的克隆和构建
人血管舒张剂激活的磷蛋白(VASP)被Kiihnel等人(Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 101：17027，2004)描述。VASP核苷酸序列和氨基酸序列以SEQ ID NO：3和4提供。使用寡核苷酸zc50629(SEQ ID NO：22)和寡核苷酸ZC 50630(SEQ ID NO：23)，通过固相合成法合成两重叠寡核苷酸，它们编码人VASP蛋白的四体化结构域的正义链和反义链。将这些寡核苷酸在55℃下退火，并以寡核苷酸引物zc50955(SEQ IDNO：24)和zc50956(SEQ ID NO：25)通过PCR扩增。
将扩增的DNA用1.5％琼脂糖凝胶分级，然后依照制造商的方案(Qiagen，Valiencia，CA)使用Qiagen凝胶分离试剂盒分离。通过酵母重组将分离的DNA插入至BglII切割的pzmp21载体中。DNA测序确认预计的载体序列，将其命名为pzmp21VASP-His6。
以寡聚物zc58284(SEQ ID NO：26)和zc58419(SEQ ID NO：27)通过PCR扩增从CT#102296生成人zB7H6的细胞外结构域。将PCR反应混合物用1％琼脂糖凝胶进行电泳，并使用QIAquickTM GelExtraction Kit(Qiagen，Valencia，CA)将对应于插入片段大小的带进行凝胶提取。在37℃下，将所生成的纯化PCR产物以EcoRI和BglII消化2个小时，用1％琼脂糖凝胶进行电泳以用于如上文所述进行带纯化。通过连接将分离的片段插入至EcoRI/BglII切割的pZMP21VASP-His6载体中。在室温下将2μl的PCR产物和1μl的切割pZMP21VASP-His6在2μl 10X连接缓冲液、14μl H20和1μl T4DNA连接酶(Promega，Madison，WI)中连接2小时，总体积20μl。使用设定为25uF、300ohm和2100伏特的Gene Pulser II电穿孔仪(BioRad，Hercules，CA)将1μl的连接物电穿孔至Electromax DH10B(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。将100μl的转化物铺板于LB AMP平板(LB肉汤(Lennox)、1.8％BactoTM琼脂(Difco)、100mg/L氨苄青霉素)上。
将个体菌落在2ml LB AMP培养基中培养过夜，并使用质粒微型试剂盒(Qiagen，Valencia，CA.)进行微提取。将所述微提取物以BamHI和BglII消化，并将具有正确的1.152kB插入片段的克隆进行DNA测序。将所述正确的构建物命名为pZMP21hzB7H6VASP-His6。编码pZMP21hzB7H6VASP-His6的DNA序列显示为SEQ ID NO：18；hzB7H6/VASP-His6的氨基酸序列显示为SEQ ID NO：19。
实施例10：zB7H6/mFc2在CHO细胞中的稳定转染和表达
在37℃下，将3组50μg的hB7H6mFc2pZMP21构建体的每组以25单位的Pvu I消化3小时，然后以IPA沉淀并在1.5mL微离心管中离心下去。将上清液从沉淀物中倒出，并将沉淀物以0.5mL的70％乙醇洗涤。将所述管在微离心机中在13,000RPM下离心15分钟，并将上清液从沉淀物中倒出。然后在无菌环境下将沉淀物再悬浮于1ml的ZF1培养基中，使之在60℃下孵育15分钟并使之冷却至室温。在3个管的每一个中将5E65xSA APFDXB11CHO细胞离心下去，并使用DNA培养基溶液重悬浮。将DNA/细胞混合物置于4mm间隙的电击杯中并使用如下参数电穿孔：950μF、高电容和300V。然后将电击杯的内容物取出、合并并且以ZF1培养基稀释至25mL，并置于125mL摇瓶中。将该摇瓶置于37℃、6％CO2下的培养箱中的振荡器上，并以120RPM振荡。
对细胞系进行营养选择，在随后的步骤扩增至200nM甲氨蝶呤(MTX)，然后至500nM MTX。通过以抗小鼠IgG2a抗体和抗小鼠IgG H+L抗体探测的蛋白质印迹确认表达，然后扩大细胞系，并随后进行蛋白纯化。
实施例11：zB7H6/VASP在CHO细胞中的稳定转染和表达
在37℃下，将3组50μg的pZMP21hzB7H6VASP-His6构建体的每组以25单位的Pvu I消化3小时，然后以IPA沉淀并在1.5mL微离心管中离心下去。将上清液从沉淀物中倒出，并将沉淀物以0.5mL的70％乙醇洗涤。将所述管在微离心机中在13,000RPM下离心15分钟，并将上清液从沉淀物中倒出。然后在无菌环境下将沉淀物再悬浮于1ml的ZF1培养基中，使之在60℃下孵育15分钟并使之冷却至室温。在3个管的每一个中将5E65xSA APFDXB11CHO细胞离心下去，并使用DNA培养基溶液重悬浮。将DNA/细胞混合物置于4mm间隙的电击杯中并使用如下参数电穿孔：950μF、高电容和300V。然后将电击杯的内容物取出、合并并且以ZF1培养基稀释至25mL，并置于125mL摇瓶中。将该摇瓶置于37℃、6％CO2下的培养箱中的振荡器上，并以120RPM振荡。
对细胞系进行营养选择，随后的步骤扩增至200nM甲氨蝶呤(MTX)，然后至500nM MTX。通过以抗6-His抗体探测的蛋白质印迹确认表达，然后扩大细胞系，并随后进行蛋白纯化。
实施例12：zB7H6在人原代NK细胞中触发细胞裂解活性
以人原代NK细胞作为抗P815靶的效应物进行细胞裂解测定。以标记Miltenyi#130-092-657的磁珠使用阴性选择从人外周血纯化NK细胞。在补充10ng/ml人IL-2(R&D#202-IL-010)的RPMI/10％FBS中将这些纯化的NK细胞过夜培养。然后将NK细胞以HBSSF(Hank’s缓冲盐水(无Ca、Mg)+5％FBS)洗涤1次，并以1.35x106/ml重悬浮于HBSSF中(获得27∶1的比例)。将150μl的经洗涤的细胞铺板于U形底96孔板第一排中，并连续稀释(1∶3)于HBSSF中。将P815靶细胞以HBSSF洗涤1次，并以1x106细胞/ml在37℃下在10μM钙黄绿素AM分子探针#C1430(将4mM储液以2.5μl/ml溶于DMSO，4mM＝4mg/ml)中标记60分钟。将标记的细胞在HBSSF中洗涤2次，并将1x106细胞重悬浮于20ml HBSSF中(5000细胞/100μl)。将100ul悬浮的靶细胞加入稀释的效应物中，以获得200ul的总体积(27∶1、9∶1、3∶1和1∶1的效应物∶靶比例)。还将活化抗NKp30单克隆抗体以2μg/ml的浓度加入至一些组的连续稀释孔中。将NKp30的可溶mFc形式以2μg/ml的浓度加入至一些组的连续稀释孔中，并将无关蛋白HHLA2/mFc2以相同浓度加入至不同组中。
将效应物和靶细胞以500rpm离心2分钟，在37℃下孵育3小时，以1500rpm离心5分钟，然后将100μl上清液转移至新的平底96孔板中。将包含所转移的上清液的平底板在荧光计上以485nm的激发波长和535nm的发射波长进行读数1秒。
NK细胞以低水平裂解野生型P815细胞，而以zB7H6转染的P815细胞被以接近于由活化的抗NKp30单克隆抗体触发的重定向杀伤的水平裂解。可溶性NKp30将zB7H6转染的P815的裂解抑制至大约背景水平，而加入HHLA2/mFc2无效应。
实施例13：鼠zB7H6多克隆抗体的生成
免疫
以人zB7H6免疫5只3月龄雌性BALB/c小鼠(Charles RiverLaboratories，Wilmington，MA)。根据制造商的说明书，首先通过皮下注射以约50μg的融合VASP、6His和缀合BSA(SJAS 9Aug07)的经纯化重组体人zB7H6(在CHO DXB 115SA中产生的ZGI，Lot#A1980F)与
Figure GPA00001146410701181
-P佐剂(MVP Laboratories INC，Omaha，NE)免疫小鼠。在该初次免疫后，对每只小鼠经皮下途径另外给予50μg溶于
Figure GPA00001146410701182
-P佐剂中的人zB7H6，每两周一次并持续9周的时间。在第3和第4次免疫后7天，经眶后网状组织取小鼠血，并从血中分离血清用于分析其结合人zB7H6的能力。
直接测定
使用直接型ELISA测定评估了抗血清中抗人zB7H6抗体结合人zB7H6(lot#A1980F)的能力。在该测定中，首先用溶于涂覆缓冲液(0.1M Na2CO3，pH 9.6)中浓度为1μg/mL的人zB7H6(lot#A1980F)以100μL/孔涂敷96孔聚苯乙烯ELISA板的孔。在4℃下将板孵育过夜，之后将未结合受体吸出并将板以300μL/孔的洗涤缓冲液(PBS-土温：0.137M NaCl，0.0022M KCl，0.0067M Na2HPO4，0.0020MKH2PO4，0.05％v/w聚山梨酯20，pH 7.2)洗涤2次。将孔以200μL/孔的封闭缓冲液(PBS-土温和1％w/v牛血清白蛋白(BSA))封闭1小时，之后以洗涤缓冲液将板洗涤2次。制备血清的连续10倍稀释物(在1％的BSA的PBS-土温溶液中)，以1∶100的初始稀释度开始，至1∶100,000的范围。将正常小鼠血清作为对照物。然后将每个稀释度双份样品转移至测定板中，100μL/孔，以结合人zB7H6。在室温下孵育1小时后，将孔吸空并如上述将板洗涤2次。然后将辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠κ抗体(SouthernBiotech，Birmingham，Alabama)以1∶5,000的稀释度加入每个孔中，100μL/孔，并在室温下将板孵育1小时。在除去未结合的HRP缀合的抗体后将板洗涤2次，向每个孔中加入100μL/孔的四甲基联苯胺(TMB)(BioFX Laboratories，OwingsMills，MD)，并在室温下将板孵育2.5分钟。通过加入100μL/孔的TMB终止试剂(BioFX Laboratories，Owings Mills，MD)终止颜色变化，在Molecular Devices Spectra MAX 340装置上以450nm读取孔的吸光度值。
来自所有小鼠的免疫血清都显示强的抗VASP反应和抗zB7H6反应。将血清合并并且如上文所述纯化抗zB7H6抗体。
zB7H6多克隆抗体的纯化
将来自以zB7H6C(VASP)H6激发的小鼠的血清混合，以35mMNaPO4、120mM NaCl、pH 7.2进行1∶1(v/v)稀释，并进行0.2μm无菌过滤，然后(经批量的方法)加载于偶联zB7H6(mFc2)的CNBr活化的SepharoseTM 4B(GE Healthcare，Piscataway，NJ)上。在加载所述稀释血清之前，以20倍柱体积(大约50ml)的35mM NaPO4、120mM NaCl、pH 7.2预平衡所护CNBr活化的SepharoseTM 4B树脂。稀释血清与偶联树脂的比例为2.8∶1(v/v)。
在5℃下和环境温度下进行色谱过程。具体地，在5℃下，使用摇晃平台将所述稀释血清加载于偶联zB7H6(mFc2)的CNBr活化的SepharoseTM 4B树脂上(捕获步骤)。在将血清/树脂浆液倒入空的玻璃Econo柱(Bio-Rad，Hercules，CA)后，在环境温度下(大约22℃)进行洗涤步骤和随后的洗脱步骤。以15倍柱体积(大约37.5ml)的35mM NaPO4、120mM NaCl、pH 7.2(经重力流)洗涤柱。然后以100mM glycine、pH 2.7对结合的抗体(经重力流)进行pH洗脱。收集0.5ml的级分并立即以0.05ml的2.0M Tris-HCl、pH 8.0中和。基于来自NanoDrop(Thermo Scientific，Fremont，CA)的A280读数收集级分并将其合并。然后，在柱再生/平衡后将保留的流过液再次应用于偶联zB7H6(mFc2)的CNBr活化的SepharoseTM 4B树脂。将该分批/洗脱循环重复2次。
将相应的纯化物的合并级分合并，然后使用预装的SephadexTMG-25Superfine柱、HiTrapTM柱(GE Healthcare，Piscataway，NJ)相对于35mM NaPO4、120mM NaCl、pH 7.2脱盐(缓冲液交换)。收集0.5ml的级分。通过在AKTA Explorer上的A280读数测定这些级分的合并物。然后对合并的、脱盐部分进行0.22μm无菌过滤，之后分成等份并于-80℃下保存。
实施例14：小鼠抗zB7H6多克隆抗体活性和特异性的评估
依照制造商的说明书，使用Alexafluor-A647抗体标记试剂盒(Invitrogen A30009)将小鼠抗zB7H6亲和性纯化的多克隆抗体与Alexa-647荧光标记物缀合。在有或无100倍过量的未标记竞争物的情况下，以1μg/ml的抗zB7H6-A647抗体探测150,000细胞/样品的野生型或zB7H6转染的P815细胞。将细胞在冰上孵育1小时，以2ml的冰冷却PBS洗涤1次，然后在FACSCalibur装置上通过流式细胞术读数。将结合记作平均荧光强度(MFI)。该研究表明，抗zB7H6-A647抗体可结合于zB7H6转染的P815细胞(MFI≈600)，但不结合于野生型(未转染的)P815细胞(MFI≈25)。该结合可被100倍过量的未标记抗体竞争(MFI≈40)，但不被100倍过量的同种型对照抗体竞争(MFI≈500)。
小鼠抗zB7H6多克隆抗体还可用于NKp30/mFc2-生物素结合于P815转染物的竞争结合测定。在100μl PBS/2％FBS中，以1μg/ml的NKp30/mFc2-生物素探测150,000个野生型或zB7H6转染的P815细胞。以100倍过量加入未标记的抗zB7H6多克隆抗体或其他对照抗体或可溶性受体。将细胞在冰上孵育1小时，以2ml的冰冷却PBS洗涤1次，然后以1μg/ml的链亲和素-PE(BD：554061)在冰上染色15分钟。将细胞以冷PBS再次洗涤，之后在FACSCalibur装置上通过流式细胞术读数。将结合记作平均荧光强度(MFI)。该研究表明，NKp30/mFc2-生物素可结合于zB7H6转染的细胞(MFI≈825)，但不结合于野生型P815细胞(MFI＜15)。经标记的NKp30/mFc2的结合可被未标记的抗zB7H6抗体和NKp30/mFc2竞争(MFI≈25)，但不被同种型对照抗体竞争(MFI≈775)。
实施例15：对NK-92抗有可溶性蛋白的K562和P815zB7H6靶 的细胞裂解活性的抑制
以NK-92细胞作为抗K562和P815zB7H6靶的效应物进行细胞裂解测定。
将NK-92细胞以HBSSF(Hank’s缓冲盐水(无Ca、Mg)+5％FBS)洗涤1次，并以1.35x106/ml重悬浮于HBSSF中(获得27∶1的比例)。将150μl的经洗涤的细胞铺板于U形底96孔板第一排中，并连续稀释(1∶3)于HBSSF中。
将K562和P815zB7H6靶细胞以HBSSF洗涤1次，并以1x106细胞/ml在37℃下在10μM钙黄绿素AM分子探针#C1430(将4mM储液以2.5μl/ml溶于DMSO中，4mM＝4mg/ml)中标记60分钟。将经标记的细胞在HBSSF中洗涤2次，并将1x106细胞重悬浮于20mlHBSSF中(5000细胞/100μl)。将100μl悬浮的靶细胞加入稀释的效应物中，以获得200ul的总体积。还将可溶形式的NKp30(NKp30/VASP四体受体)、VASP对照(B7H3/VASP；SEQ IDNO：[28])、抗zB7H6多克隆抗体(E10607)或无关抗体以5μg/ml的浓度加入至一些组的连续稀释孔中。
将效应物和靶细胞以500rpm离心2分钟，在37℃下孵育3小时，以1500rpm离心5分钟，然后将100μl上清液转移至新的平底96孔板中。将包含所转移的上清液的平底板在荧光计上以485nm的激发波长和535nm的发射波长读数1秒。
如图10中所示，可溶性NKp30/VASP和抗zB7H6多克隆抗体抑制了效应物与靶比例为9∶1的NK-92细胞抗K562和P815zB7H6靶的细胞裂解活性(参见图10)。抑制还出现在27∶1和3∶1的靶与效应物比例。VASP和无关抗体对照无效应。这些数据表明，NK-92裂解K562和P815zB7H6靶的能力是NKp30介导的，并且还依赖于zB7H6。
实施例16：可溶性NKp30可特异性地结合K562、P815zB7H6 和293F细胞
用包含NKp30的细胞外结构域和鼠类Fc片段的可溶形式的生物素化NKp30(NKp30/mFc2)通过FACS探测K562、P815zB7H6和293F细胞。将细胞以1.5x106细胞/ml(150,000细胞/样品)的浓度重悬浮于PBS/2％FBS中。将样品等分成100μl的小份，加入的100μg/ml的人类全IgG(Jackson#009-000-003)以用于FC受体阻断。将NKp30/mFc2-生物素探针以2μg/ml的浓度加入，同时加入100倍过量的VASP蛋白(NKp30/VASP或人zB7R6/VASP)或者对照VASP蛋白(B7H3/VASP)。将细胞在冰上孵育1小时，并以2ml冷PBS洗涤。将洗涤的细胞重悬浮于100μl添加1μl/ml链亲和素-PE(BD：554061)的PBS/2％FBS中，并在冰上孵育15分钟。然后将细胞以1ml冷PBS洗涤，重悬浮于250μl的PBS中，并在FACSCalibur上分析PE染色。
如图11中所示，NKp30/mFc2-生物素可结合于K562、293F和P815zB7H6细胞(“非竞争性”)。该结合被NKp30/VASP和zB7H6/VASP竞争，但不被对照VASP蛋白(B7H3/VASP)竞争，证明NKp30/mFc2对K562、P815zB7H6和293F细胞的结合是特异性的。对于MCF-7、Aspc-1、A549和HL-60肿瘤细胞系很少或未出现结合。
实施例17：抗zB7H6抗体可特异性地结合K562、P815zB7H6和 293F细胞
用A647缀合形式的抗zB7H6小鼠多克隆抗体(E10607)探测K562、P815、P815zB7H6和293F细胞。将细胞以1.5x106细胞/ml(150,000细胞/样品)的浓度重悬浮于PBS/2％FBS中。将样品等分成100μl，带有包括用于FC受体阻断的100μg/ml全人IgG(Jackson#009-000-003)。将zB7H6-A647抗体以2μg/ml的浓度加入，同时加入100倍过量的VASP蛋白(zB7R6/VASP)或者对照VASP蛋白(B7H3/VASP)。将细胞在冰上孵育1小时，并以2ml冷PBS洗涤。然后将细胞重悬浮于250μl的PBS中，并在FACSCalibur上分析APC染色。
如图12中所示，抗zB7H6抗体可结合于K562、P815zB7H6和293F细胞，但不结合于未转染的P815细胞(“非竞争性”)。该结合被zB7H6/VASP竞争，但不被对照VASP蛋白(B7H3/VASP)竞争，证明抗zB7H6-A647抗体对K562、P815zB7H6和293F细胞的结合是特异性的。对于MCF-7、Aspc-1、A549和HL-60肿瘤细胞系很少或未出现结合。这些数据和NKp30/mFc2-生物素结合数据一块表明NKp30/mFc-生物素结合与zB7H6表达的对应。
实施例18：正常人组织的定量实时PCR分析
在正常人组织中用定量实时聚合酶式链反应(qRT-PCR)测定zB7H6mRNA信使水平。zB7H6引物和探针购自ABI，使用它们的专有软件生成带有FAM报告染料并被设计跨外显子/内含子结合区的引物，以避免扩增基因组DNA。在以初始为100ng的5log稀释系列的293F cDNA上，将该引物(ABI：Hs02340611_m1)和持家基因HPRT1的引物(ABI：4333768-0712016)一块用于评估实验。将293F cDNA浓度的Log值相对于δ循环阈值(δCt)作图得到了式Y＝-0.02571x+3.504的统计学拟合线，表明zB7H6引物和探针组的效率与HPRT1近似，使得Log2Ct计算有效(通过评估实验被定义为δCt与log输入cDNA的斜率的绝对值＜0.1)。对293F稀释系列中的每个浓度进行非逆转录酶(-RT)对照，以确认不存在来自基因组DNA的扩增。正常组织qPCR阵列购自Origene(Origene HMRT102)。由制造商将该阵列中来自多聚A RNA的第一cDNA链相对于GAPDH标准化。将冻干的样品重悬浮于30μl去离子H20中，并分开13.5μl加入如下两个反应的每一个中：HPRT1RT-PCR和zB7H6RT-PCR。在ABI 7900HTRT-PCR装置上，使用900nM的引物和250nM探针重复反应3次，反应体系为10μl。尽管HPRT1持家基因在所有样品中都有扩增，zB7H6引物在48个正常组织样品中均未出现扩增。另外，293F阳性对照cDNA出现zB7H6扩增，表明qRT-PCR反应正确地进行。
实施例19：肿瘤细胞系的定量实时PCR分析
qRT-PCR还被用于评估来自一组不同来源的肿瘤细胞系的zB7H6mRNA。依照制造商的说明书，使用RNeasy Midi柱(Qiagen75142)从细胞生成总RNA。依照制造商的说明书，使用InvitrogenSuperscript III Kit(Invitrogen 11752-250)通过逆转录1μgRNA合成第一cDNA链。将与如上文实施例18中所述的同样的引物和探针组用于分析来自肿瘤系的19.3ng第一cDNA链。Daudi细胞被观察到具有低水平的NKp30/mFc2和抗zB7H6抗体结合，在不同的3天以这种细胞将3种不同反应重复进行3次得到0.079的Log2Ct平均值；因此，在qRT-PCR测定中将0.07作为定义zB7H6阳性的阈值。所测定的118个细胞系中23个呈现zB7H6信使的表达。表达zB7H6的肿瘤细胞系在如下表8中列出。
表8：zB7H6阳性肿瘤细胞系
细胞系      来源        2^Ct
NCI-H716    结肠        0.152
hct15       结肠        0.219
hct116      结肠        0.070
ht29        结肠        0.160
HEP3B2.1.7  肝          0.071
HuH7        肝          0.075
C3a         肝          0.249
hepg2       肝          0.146
Hela        宫颈        0.097
SHP-77      肺          0.076
NCI-H441    肺          0.152
BxPC3       胰腺        0.983
细胞系    来源                2^Ct
Aspc-1    胰腺                0.074
LN-CAP-FG 前列腺              0.095
C
HL-60     原血细胞性白血病    0.080
GRANTA51  B细胞淋巴瘤         0.115
9
DOHH2     B细胞淋巴瘤         0.088
U-937     单核细胞性淋巴瘤    0.184
HEL92.1.7 红白血病            0.098
Daudi     伯基特淋巴瘤        0.079
K562      慢性髓细胞性白血病  0.080
293F                          0.091
MV-4-11                       0.130
实施例20：用于评估抗zB7H6抗体或抗体-药物缀合物抗肿瘤生 长有效性的BxPC3胰腺癌模型
为了测试抗zB7H6抗体或抗体-药物缀合物在小鼠中是否对肿瘤生长有活性，在第0天将BxPC3胰肿瘤皮下注射给小鼠组。一旦肿瘤长至150-200mm3，然后将1mg/Kg-30mg/Kg的对照试剂、抗zB7H6抗体或抗zB7H6抗体-药物缀合物注射小鼠组(n＝10/组)，1-3次/周，持续3周。以3次/周的频率监测肿瘤体积，持续5周。与以对照试剂注射的小鼠相比，以抗zB7H6抗体或抗体-药物缀合物注射的小鼠的显著小的肿瘤可表明所述拮抗物对于肿瘤生长抑制的有效性。
研究设计：在第0天将2x106BxPC-3细胞在右胁腹皮下注射给8-10周龄雌性C.B-17SCID小鼠(Charles River Laboratories)。从肿瘤大小为150-200mm3开始，将1mg/Kg-30mg/Kg的对照试剂、抗zB7H6抗体或抗zB7H6抗体-药物缀合物腹腔内注射给小鼠组(n＝10/组)，1-3次/周，持续3周。使用测径器测量计以3次/周的频率监测肿瘤体积，持续5周。使用式1/2＊(B)2＊L计算肿瘤体积(mm3)。
实施例21：使用抗zB7H6抗体或抗体-药物缀合物在体内抑制人 肝细胞癌细胞生长
为了评估抗zB7H6抗体或抗体-药物缀合物在体内抗人肝细胞癌细胞的抗肿瘤活性，在第0天将HuH7或C3A肝细胞癌细胞注射给BALB/c裸小鼠组。在第5-33天，隔天(EOD)通过腹腔内注射或肿瘤周围注射对携带肿瘤的小鼠组(n＝10/组)给予5-75μg的抗zB7H6抗体或抗体-药物缀合物。以3次/周的频率监测肿瘤体积，持续6周。抗zB7H6抗体或抗体-药物缀合物对肿瘤生长的抑制表明，各个蛋白在体内对人肝细胞癌有抑制效应。
研究设计：在第0天将6x106HuH7或C3A细胞在右胁腹皮下注射给8周龄雌性BALB/c裸小鼠(Charles River Laboratories)。在第5-33天，将5μg-75μg的抗zB7H6抗体或抗zB7H6抗体-药物缀合物腹腔内或肿瘤周围注射给小鼠组(n＝10/组)。注射总体积为200μl。使用测径器测量计以3次/周的频率监测肿瘤体积，持续6周。使用式1/2＊(B)2＊L计算肿瘤体积(mm3)。
实施例22：使用抗zB7H6抗体或抗体-药物缀合物在体内抑制人 前列腺癌细胞生长
为了评估抗zB7H6抗体或抗体-药物缀合物在体内抗人前列腺癌细胞的抗肿瘤活性，在第0天将PC-3或DU-145前列腺癌细胞注射给BALB/c裸小鼠组。在第5-33天，隔天(EOD)通过腹腔内注射或肿瘤周围注射对携带肿瘤的小鼠组(n＝10/组)给予5-75μg的抗zB7H6抗体或抗zB7H6抗体-药物缀合物。以3次/周的频率监测肿瘤体积，持续6周。抗zB7H6抗体或抗体-药物缀合物对肿瘤生长(体积或重量)的抑制表明，各个蛋白在体内对人前列腺癌有抑制效应。
研究设计：在第0天将10x106PC-3或6x106DU-145细胞在右胁腹或在前列腺叶中原位地皮下注射给8周龄雌性BALB/c裸小鼠(Charles River Laboratories)。在第5-33天，将5μg-75μg的抗zB7H6抗体或抗zB7H6抗体-药物缀合物腹腔内或肿瘤周围(仅皮下模式)注射给小鼠组(n＝10/组)。注射总体积为200μl。对于皮下肿瘤，使用测径器测量计以3次/周的频率监测肿瘤生长，持续6周。使用式1/2＊(B)2＊L计算肿瘤体积(mm3)。对于原位肿瘤，在研究结束时将小鼠处死并对肿瘤称重，以使得可进行肿瘤负荷评估。
实施例23：使用抗zB7H6抗体或抗体-药物缀合物在体内抑制人 结肠癌细胞生长
为了评估抗zB7H6抗体或抗体-药物缀合物在体内抗人结肠癌细胞的抗肿瘤活性，在第0天将DLD-1或HCT-116结肠癌细胞注射给BALB/c裸小鼠组。在第5-33天，隔天(EOD)通过腹腔内注射或肿瘤周围注射对携带肿瘤的小鼠组(n＝10/组)给予5-75μg的抗zB7H6抗体或抗zB7H6抗体-药物缀合物。以3次/周的频率监测肿瘤体积，持续6周。抗zB7H6抗体或抗体-药物缀合物对肿瘤生长(体积或重量)的抑制表明，各个蛋白在体内对人结肠癌有抑制效应。
研究设计：在第0天将6x106DLD-1或HCT-116细胞在右胁腹或在结肠壁中原位地皮下注射给8周龄雌性BALB/c裸小鼠(CharlesRiver Laboratories)。在第5-33天，将5μg-75μg的抗zB7H6抗体或抗zB7H6抗体-药物缀合物腹腔内或肿瘤周围(仅皮下模式)注射给小鼠组(n＝10/组)。注射总体积为200μl。对于皮下肿瘤，使用测径器测量计以3次/周的频率监测肿瘤生长，持续6周。使用式1/2＊(B)2＊L计算肿瘤体积(mm3)。对于原位肿瘤，在研究结束时将小鼠处死并对肿瘤称重，以使得可进行肿瘤负荷评估。
实施例24：使用抗zB7H6抗体或抗体-药物缀合物在体内抑制人 胰腺癌细胞生长
为了评估抗zB7H6抗体或抗体-药物缀合物在体内抗人胰腺癌细胞的抗肿瘤活性，在第0天将BxPC-3或HPAF-II胰腺癌细胞注射给BALB/c裸小鼠组。在第5-33天，隔天(EOD)通过腹腔内注射或肿瘤周围注射对携带肿瘤的小鼠组(n＝10/组)给予5-75μg的抗zB7H6抗体或抗zB7H6抗体-药物缀合物。以3次/周的频率监测肿瘤体积，持续6周。抗zB7H6抗体或抗体-药物缀合物对肿瘤生长(体积或重量)的抑制表明，各个蛋白在体内对人胰腺癌有抑制效应。
研究设计：在第0天将6x106BxPC-3或HPAF-II细胞在右胁腹或在胰脏叶中原位地皮下注射给8周龄雌性BALB/c裸小鼠(CharlesRiver Laboratories)。在第5-33天，将5μg-75μg的抗zB7H6抗体或抗zB7H6抗体-药物缀合物腹腔内或肿瘤周围(仅皮下模式)注射给小鼠组(n＝10/组)。注射总体积为200μl。对于皮下肿瘤，使用测径器测量计以3次/周的频率监测肿瘤生长，持续6周。使用式1/2＊(B)2＊L计算肿瘤体积(mm3)。对于原位肿瘤，在研究结束时将小鼠处死并对肿瘤称重，以使得可进行肿瘤负荷评估。
实施例25：使用抗zB7H6抗体或抗体-药物缀合物在体内抑制B 细胞淋巴瘤
通过在生长培养基中传代在体外维持人B淋巴瘤细胞系。在PBS中彻底洗涤细胞，以除去培养基组分。
给SCID小鼠经尾静脉注射100微升体积的(通常)1x106人淋巴瘤细胞。可在预研究中根据经验确定最佳的注射细胞数目，以使得肿瘤始终具有所需的动力学性质。通过皮下植入
Figure GPA00001146410701271
渗透微型泵(ALZET，Cupertino，CA)或者通过每天腹腔内注入抗zB7H6抗体或抗体-药物缀合物或载体，从第二天开始进行抗zB7H6抗体或抗体-药物缀合物治疗。监测小鼠的存活情况和明显的病态。除将呈现重大病态例如后腿瘫痪的小鼠处死外，还将体重降低超过初始体重20％的小鼠处死。根据所使用的淋巴瘤细胞系，未处理小鼠通常在3-6周内死亡。对于分泌IgG或IgM的B细胞淋巴瘤，还可以通过每周取血并以ELISA测量血清人免疫球蛋白水平，监测疾病的进展。
抗zB7H6抗体或抗体-药物缀合物剂量反应/IM-9模型
将1x106IM-9细胞注射给小鼠，并在第二天植入28日渗透微型泵。这些泵装载有如下浓度的抗zB7H6抗体或抗体-药物缀合物进行送递：每天0、0.12、1.2或12微克，每个剂量组8只小鼠。小鼠对肿瘤细胞系的防御随抗体或抗体-药物缀合物的剂量增加而增加，这表明抗zB7H6抗体或抗体-药物缀合物的效应是剂量依赖性的。在实验结束后存活的小鼠没有疾病迹象，其血清中无可检测到的人IgG。
这些数据可证明，抗zB7H6抗体或抗zB7H6抗体-药物缀合物在SCID小鼠淋巴瘤模型中的有效性与在体内抑制淋巴瘤细胞系生长的能力有关。
实施例26：使用抗zB7H6抗体或抗体-药物缀合物在体内抑制源 自B细胞的肿瘤
通过经微型渗透泵恒量注入给予抗zB7H6抗体或抗zB7H6抗体-药物缀合物，可产生与所述泵中包含的抗体或抗体-药物缀合物浓度成比例的稳态血清浓度。在无菌状态下，将0.22ml含有浓度为2mg/ml或0.2mg/ml的抗zB7H6抗体或抗体-药物缀合物的磷酸盐缓冲的盐水(pH 6.0)装载于Alzet微型渗透泵(型号2004；Alza corporation PaloAlto，CA)中。通过在背部皮肤中的1cm切口将泵皮下植入小鼠体内，并以无菌的伤口闭合器封闭皮肤。这些泵被设计成在28天的时间中以每小时0.25μl的速度送递其内含物。该给药方法导致注入肿瘤细胞的小鼠的存活率明显提高(下文)。
抗zB7H6抗体或抗体-药物缀合物在体内对源自B细胞的肿瘤的效应
使用本文描述的小鼠肿瘤异种移植模型在体内测试抗zB7H6抗体或抗体-药物缀合物的效应。待测试的异种移植模型为人淋巴样干细胞系IM-9(ATCC No.CRL159)。将C.B-17SCID小鼠(雌性C.B-17/IcrHsd-scid；Harlan，Indianapolis，Indiana)分成4组。在第0天，从培养物收集IM-9细胞(ATCC No.CRL159)，并将其通过尾静脉静脉注射至所有小鼠中(每鼠约1,000,000细胞)。在第1天，将包含测试制品或对照制品的微型渗透泵皮下植入小鼠中。对第1-3组的小鼠(每组n＝9)送递抗zB7H6抗体或抗体-药物缀合物：第1组包含2.0mg/mL抗体或抗体-药物缀合物，每天送递12μg；第2组包含0.20mg/mL，每天送递1.2μg；第3组包含0.02mg/mL，每天送递0.12μg。第4组中的小鼠(n＝9)为对照，以载体(PBS pH 6.0)处理。
与载体处理的小鼠相比，处理组(例如12μg/天或1.2μg/天)存活率的提高表明，抗zB7H6抗体或抗体-药物缀合物具有在体内降低B细胞肿瘤细胞的效应。
从上文的描述可以认识到，虽然本文出于说明的目的描述了本发明的具体实施方案，但是在不偏离本发明主旨和范围的前提下可以进行各种改变。因此，本发明仅受所附权利要求书限制。在本文中所引用的所有出版物、专利和专利申请的全部内容均通过援引的方式纳入本文，并用于所有目的。
序列表
<110>C.S.勃兰特
J.J.肯尼迪
W.徐
E.C.易
B.A.福克斯
Z.高
P.V.西瓦库玛
 
<120>B7家族成员zB7H6及相关的组合物和方法
 
<130>07-20PC
<160>34
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
 
<210>1
<211>1365
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
 
<400>1
atgacgtgga gggctgccgc ctccacgtgc gcggcgctcc tgattctgct gtgggcgctg 60
acgaccgaag gtgatctgaa agtagagatg atggcagggg ggactcagat cacacccctg 120
aatgacaatg tcaccatatt ctgcaatatc ttttattccc aacccctcaa catcacgtct 180
atgggtatca cctggttttg gaagagtctg acgtttgaca aagaagtcaa agtctttgaa 240
ttttttggag atcaccaaga ggcattccga cctggagcca ttgtgtctcc atggaggctg 300
aagagtgggg acgcctcact gcggctgcct ggaatccagc tggaggaagc aggagagtac 360
cgatgtgagg tggtggtcac ccctctgaag gcacagggaa cagtccagct tgaagttgtg 420
gcttccccag ccagcagatt gttgctggat caagtgggca tgaaagagaa tgaagacaaa 480
tatatgtgtg agtcaagtgg gttctaccca gaggctatta atataacatg ggagaagcag 540
acccagaagt ttccccatcc catagagatt tctgaggatg tcatcactgg tcccaccatc 600
aagaatatgg atggcacatt taatgtcact agctgcttga agctgaactc ctctcaggaa 660
gaccctggga ctgtctacca gtgtgtggta cggcatgcgt ccttgcatac ccccttgagg 720
agcaacttta ccctgactgc tgctcggcac agtctttctg aaactgagaa gacagataat 780
ttttccattc attggtggcc tatttcattc attggtgttg gactggtttt attaattgtt 840
ttgattcctt ggaaaaagat atgtaacaaa tcatcttcag cctatactcc tctcaagtgc 900
attctgaaac actggaactc ctttgacact cagactctga agaaagagca cctcatattc 960
ttttgcactc gggcatggcc gtcttaccag ctgcaggatg gggaggcttg gcctcctgag 1020
ggaagtgtta atattaatac tattcaacaa ctagatgttt tctgcagaca ggagggcaaa 1080
tggtccgagg ttccttatgt gcaagccttc tttgccttgc gagacaaccc agatctttgt 1140
cagtgttgta gaattgaccc tgctctccta acagttacat caggcaagtc catagatgat 1200
aattccacaa agtctgagaa acaaacccct agggaacact cggatgcagt tccggatgcc 1260
ccaatccttc ctgtctcccc tatctgggaa cctcctccag ccacaacatc aacaactcca 1320
gttctatcct cccaaccccc aactttactg ttacccctac agtaa                 1365
 
<210>2
<211>454
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
 
<400>2
Met Thr Trp Arg Ala Ala Ala Ser Thr Cys Ala Ala Leu Leu Ile Leu
1                5                  10                  15
Leu Trp Ala Leu Thr Thr Glu Gly Asp Leu Lys Val Glu Met Met Ala
            20                  25                  30
Gly Gly Thr Gln Ile Thr Pro Leu Asn Asp Asn Val Thr Ile Phe Cys
        35                  40                  45
Asn Ile Phe Tyr Ser Gln Pro Leu Asn Ile Thr Ser Met Gly Ile Thr
    50                  55                  60
Trp Phe Trp Lys Ser Leu Thr Phe Asp Lys Glu Val Lys Val Phe Glu
65                  70                  75                  80
Phe Phe Gly Asp His Gln Glu Ala Phe Arg Pro Gly Ala Ile Val Ser
                85                  90                  95
Pro Trp Arg Leu Lys Ser Gly Asp Ala Ser Leu Arg Leu Pro Gly Ile
            100                 105                 110
Gln Leu Glu Glu Ala Gly Glu Tyr Arg Cys Glu Val Val Val Thr Pro
        115                 120                 125
Leu Lys Ala Gln Gly Thr Val Gln Leu Glu Val Val Ala Ser Pro Ala
    130                 135                 140
Ser Arg Leu Leu Leu Asp Gln Val Gly Met Lys Glu Asn Glu Asp Lys
145                 150                 155                 160
Tyr Met Cys Glu Ser Ser Gly Phe Tyr Pro Glu Ala Ile Asn Ile Thr
                165                 170                 175
Trp Glu Lys Gln Thr Gln Lys Phe Pro His Pro Ile Glu Ile Ser Glu
            180                 185                 190
Asp Val Ile Thr Gly Pro Thr Ile Lys Asn Met Asp Gly Thr Phe Asn
        195                 200                 205
Val Thr Ser Cys Leu Lys Leu Asn Ser Ser Gln Glu Asp Pro Gly Thr
    210                 215                 220
Val Tyr Gln Cys Val Val Arg His Ala Ser Leu His Thr Pro Leu Arg
225                 230                 235                 240
Ser Asn Phe Thr Leu Thr Ala Ala Arg His Ser Leu Ser Glu Thr Glu
                245                 250                 255
Lys Thr Asp Asn Phe Ser Ile His Trp Trp Pro Ile Ser Phe Ile Gly
            260                 265                 270
Val Gly Leu Val Leu Leu Ile Val Leu Ile Pro Trp Lys Lys Ile Cys
        275                 280                 285
Asn Lys Ser Ser Ser Ala Tyr Thr Pro Leu Lys Cys Ile Leu Lys His
    290                 295                 300
Trp Asn Ser Phe Asp Thr Gln Thr Leu Lys Lys Glu His Leu Ile Phe
305                 310                 315                 320
Phe Cys Thr Arg Ala Trp Pro Ser Tyr Gln Leu Gln Asp Gly GluAla
                325                 330                 335
Trp Pro Pro Glu Gly Ser Val Asn Ile Asn Thr Ile Gln Gln Leu Asp
            340                 345                 350
Val Phe Cys Arg Gln Glu Gly Lys Trp Ser Glu Val Pro Tyr Val Gln
        355                 360                 365
Ala Phe Phe Ala Leu Arg Asp Asn Pro Asp Leu Cys Gln Cys Cys Arg
    370                 375                 380
Ile Asp Pro Ala Leu Leu Thr Val Thr Ser Gly Lys Ser Ile Asp Asp
385                 390                 395                 400
Asn Ser Thr Lys Ser Glu Lys Gln Thr Pro Arg Glu His Ser Asp Ala
                405                 410                 415
Val Pro Asp Ala Pro Ile Leu Pro Val Ser Pro Ile Trp Glu Pro Pro
            420                 425                 430
Pro Ala Thr Thr Ser Thr Thr Pro Val Leu Ser Ser Gln Pro Pro Thr
        435                 440                 445
Leu Leu Leu Pro Leu Gln
    450
 
<210>3
<211>2207
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
 
<400>3
ccccttcctg tggggttcat tggggcatcc cctttctgct gcaggaacct ctcatcagac 60
cgcctgaggg aagcggcgcc cggagacccg ccccggcccg gtccacattc tccccaggaa 120
gccggactct atggggcggg accctggggg agcctgagcc gagcccggag ccagccccga 180
acccctgaac ctccagccag gggcgccccg ggagcagcca gcccgtgggc gagccgcccg 240
cccgccgagc agccatgagc gagacggtca tctgttccag ccgggccact gtgatgcttt 300
atgatgatgg caacaagcga tggctccctg ctggcacggg tccccaggcc ttcagccgcg 360
tccagatcta ccacaacccc acggccaatt cctttcgcgt cgtgggccgg aagatgcagc 420
ccgaccagca ggtggtcatc aactgtgcca tcgtccgggg tgtcaagtat aaccaggcca 480
cccccaactt ccatcagtgg cgcgacgctc gccaggtctg gggcctcaac ttcggcagca 540
aggaggatgc ggcccagttt gccgccggca tggccagtgc cctagaggcg ttggaaggag 600
gtgggccccc tccaccccca gcacttccca cctggtcggt cccgaacggc ccctccccgg 660
aggaggtgga gcagcagaaa aggcagcagc ccggcccgtc ggagcacata gagcgccggg 720
tctccaatgc aggaggccca cctgctcccc ccgctggggg tccaccccca ccaccaggac 780
ctccccctcc tccaggtccc cccccacccc caggtttgcc cccttcgggg gtcccagctg 840
cagcgcacgg agcaggggga ggaccacccc ctgcaccccc tctcccggca gcacagggcc 900
ctggtggtgg gggagctggg gccccaggcc tggccgcagc tattgctgga gccaaactca 960
ggaaagtcag caagcaggag gaggcctcag gggggcccac agcccccaaa gctgagagtg 1020
gtcgaagcgg aggtggggga ctcatggaag agatgaacgc catgctggcc cggagaagga 1080
aagccacgca agttggggag aaaaccccca aggatgaatc tgccaatcag gaggagccag 1140
aggccagagt cccggcccag agtgaatctg tgcggagacc ctgggagaag aacagcacaa 1200
ccttgccaag gatgaagtcg tcttcttcgg tgaccacttc cgagacccaa ccctgcacgc 1260
ccagctccag tgattactcg gacctacaga gggtgaaaca ggagcttctg gaagaggtga 1320
agaaggaatt gcagaaagtg aaagaggaaa tcattgaagc cttcgtccag gagctgagga 1380
agcggggttc tccctgacca cagggaccca gaagacccgc ttctcctttc cgcacacccg 1440
gcctgtcacc ctgctttccc tgcctctact tgacttggaa ttggctgaag acacaggaat 1500
gcatcgttcc cactccccat cccacttgga aaactccaag ggggtgtggc ttccctgctc 1560
acacccacac tggctgctga ttggctgggg aggcccccgc ccttttctcc ctttggtcct 1620
tcccctctgc catccccttg gggccggtcc ctctgctggg gatgcaccaa tgaaccccac 1680
aggaaggggg aaggaaggag ggaatttcac attcccttgt tctagattca ctttaacgct 1740
taatgccttc aaagttttgg tttttttaag aaaaaaaaat atatatatat ttgggttttg 1800
ggggaaaagg gaaatttttt tttctctttg gttttgataa aatgggatgt gggagttttt 1860
aaatgctata gccctgggct tgccccattt ggggcagcta tttaagggga ggggatgtct 1920
caccgggctg ggggtgagat atccccccac cccagggact ccccttccct ctggctcctt 1980
ccccttttct atgaggaaat aagatgctgt aactttttgg aacctcagtt ttttgatttt 2040
ttatttgggt aggttttggg gtccaggcca ttttttttac cccttggagg aaataagatg 2100
agggagaaag gagaagggga ggaaacttct cccctcccac cttcaccttt agcttcttga 2160
aaatgggccc ctgcagaata aatctgccag tttttataaa aaaaaaa               2207
 
<210>4
<211>380
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
 
<400>4
Met Ser Glu Thr Val Ile Cys Ser Ser Arg Ala Thr Val Met Leu Tyr
 1               5                  10                  15
Asp Asp Gly Asn Lys Arg Trp Leu Pro Ala Gly Thr Gly Pro Gln Ala
            20                  25                  30
Phe Ser Arg Val Gln Ile Tyr HisAsn Pro Thr Ala Asn Ser Phe Arg
        35                  40                  45
Val Val Gly Arg Lys Met Gln Pro Asp Gln Gln Val Val Ile Asn Cys
    50                  55                  60
Ala Ile Val Arg Gly Val Lys Tyr Asn Gln Ala Thr Pro Asn Phe His
65                  70                  75                  80
Gln Trp Arg Asp Ala Arg Gln Val Trp Gly Leu Asn Phe Gly Ser Lys
                85                  90                  95
Glu Asp Ala Ala Gln Phe Ala Ala Gly Met Ala Ser Ala Leu Glu Ala
            100                 105                 110
Leu Glu Gly Gly Gly Pro Pro Pro Pro Pro Ala Leu Pro Thr Trp Ser
        115                 120                 125
Val Pro Asn Gly Pro Ser Pro Glu Glu Val Glu Gln Gln Lys Arg Gln
    130                 135                 140
Gln Pro Gly Pro Ser Glu His Ile Glu Arg Arg Val Ser Asn Ala Gly
145                 150                 155                 160
Gly Pro Pro Ala Pro Pro Ala Gly Gly Pro Pro Pro Pro Pro Gly Pro
                165                 170                 175
Pro Pro Pro Pro Gly Pro Pro Pro Pro Pro Gly Leu Pro Pro Ser Gly
            180                 185                 190
Val Pro Ala Ala Ala His Gly Ala Gly Gly Gly Pro Pro Pro Ala Pro
        195                 200                 205
Pro Leu Pro Ala Ala Gln Gly Pro Gly Gly Gly Gly Ala Gly Ala Pro
    210                 215                 220
Gly Leu Ala Ala Ala Ile Ala Gly Ala Lys Leu Arg Lys Val Ser Lys
225                 230                 235                 240
Gln Glu Glu Ala Ser Gly Gly Pro Thr Ala Pro Lys Ala Glu Ser Gly
                245                 250                 255
Arg Ser Gly Gly Gly Gly Leu Met Glu Glu Met Asn Ala Met Leu Ala
            260                 265                 270
Arg Arg Arg Lys Ala Thr Gln Val Gly Glu Lys Thr Pro Lys Asp Glu
        275                 280                 285
Ser Ala Asn Gln Glu Glu Pro Glu Ala Arg Val Pro Ala Gln Ser Glu
    290                 295                 300
Ser Val Arg Arg Pro Trp Glu Lys Asn Ser Thr Thr Leu Pro Arg Met
305                 310                 315                 320
Lys Ser Ser Ser Ser Val Thr Thr Ser Glu Thr Gln Pro Cys Thr Pro
                325                 330                 335
Ser Ser Ser Asp Tyr Ser Asp Leu Gln Arg Val Lys Gln Glu Leu Leu
            340                 345                 350
Glu Glu Val Lys Lys Glu Leu Gln Lys Val Lys Glu Glu Ile Ile Glu
        355                 360                 365
Ala Phe Val Gln Glu Leu Arg Lys Arg Gly Ser Pro
    370                 375                 380
 
<210>5
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>多肽连接体
 
<400>5
Gly Ser Gly Gly
 1
 
<210>6
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<23>FLAG标签
 
<400>6
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
 1               5
 
<210>7
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>六组氨酸标签
 
<400>7
His His His His His His
 1               5
 
<210>8
<211>365
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>NKp30/mFc2
 
<400>8
Met Ala Trp Met Leu Leu Leu Ile Leu Ile Met Val His Pro Gly Ser
 1               5                  10                  15
Cys Ala Leu Trp Val Ser Gln Pro Pro Glu Ile Arg Thr Leu Glu Gly
            20                  25                  30
Ser Ser Ala Phe Leu Pro Cys Ser Phe Asn Ala Ser Gln Gly Arg Leu
        35                  40                  45
Ala Ile Gly Ser Val Thr Trp Phe Arg Asp Glu Val Val Pro Gly Lys
    50                  55                  60
Glu Val Arg Asn Gly Thr Pro Glu Phe Arg Gly Arg Leu Ala Pro Leu
65                  70                  75                  80
Ala Ser Ser Arg Phe Leu His Asp His Gln Ala Glu Leu His Ile Arg
                85                  90                  95
Asp Val Arg Gly His Asp Ala Ser Ile Tyr Val Cys Arg Val Glu Val
            100                 105                 110
Leu Gly Leu Gly Val Gly Thr Gly Asn Gly Thr Arg Leu Val Val Glu
        115                 120                 125
Lys Glu His Pro Glu Pro Arg Ser Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro
    130                 135                 140
Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile
145                 150                 155                 160
Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile
                165                 170                 175
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln
            180                 185                 190
Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln
        195                 200                 205
Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu
    210                 215                 220
Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Ala Phe Ala Cys Ala
225                 230                 235                 240
Val Asn Asn Lys Asp Leu ProAla Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys
                245                 250                 255
Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro
            260                 265                 270
Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr
        275                 280                 285
Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys
    290                 295                 300
Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
305                 310                 315                 320
Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val
                325                 330                 335
Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn
            340                 345                 350
His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys
        355                 360                 365
<210>9
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>寡核苷酸引物
 
<400>9
tcaggaattc gcaagatgac gtggagggct gccgcc    36
 
<210>10
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>寡核苷酸引物
 
<400>10
ctgactcgag ttactgtagg ggtaacagta a    31
 
<210>11
<211>187
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>NKp30/VASP
 
<400>11
Met Ala Trp Met Leu Leu Leu Ile Leu Ile Met Val His Pro Gly Ser
 1               5                  10                  15
Cys Ala Leu Trp Val Ser Gln Pro Pro Glu Ile Arg Thr Leu Glu Gly
            20                  25                  30
Ser Ser Ala Phe Leu Pro Cys Ser Phe Asn Ala Ser Gln Gly Arg Leu
        35                  40                  45
Ala Ile Gly Ser Val Thr Trp Phe Arg Asp Glu Val Val Pro Gly Lys
    50                  55                  60
Glu Val Arg Asn Gly Thr Pro Glu Phe Arg Gly Arg Leu Ala Pro Leu
65                  70                  75                  80
Ala Ser Ser Arg Phe Leu His Asp His Gln Ala Glu Leu His Ile Arg
                85                  90                  95
Asp Val Arg Gly His Asp Ala Ser Ile Tyr Val Cys Arg Val Glu Val
            100                 105                 110
Leu Gly Leu Gly Val Gly Thr Gly Asn Gly Thr Arg Leu Val Val Glu
        115                 120                 125
Lys Glu His Pro Glu Pro Arg Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
    130                 135                 140
Asp Leu Gln Arg Val Lys Gln Glu Leu Leu Glu Glu Val Lys Lys Glu
145                 150                 155                 160
Leu Gln Lys Val Lys Glu Glu Ile Ile Glu Ala Phe Val Gln Glu Leu
                165                 170                 175
Arg Gly Ser Gly Gly His His His His His His
            180                 185
 
<210>12
<211>195
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>zB7R1/VASP
 
<400>12
Met Arg Trp Cys Leu Leu Leu Ile Trp Ala Gln Gly Leu Arg Gln Ala
 1               5                  10                  15
Pro Leu Ala Ser Gly Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn
            20                  25                  30
Ile Ser Ala Glu Lys Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser
        35                  40                  45
Ser Thr Thr Ala Gln Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln
    50                  55                  60
Leu Leu Ala Ile Cys Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser
65                  70                  75                  80
Phe Lys Asp Arg Val Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln
                85                  90                  95
Ser Leu Thr Val Asn Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr
            100                 105                 110
Tyr Pro Asp Gly Ala Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu
        115                 120                 125
Ser Ser Val Ala Glu His Gly Ala Arg Phe Gln Ile Glu Pro Arg Ser
    130                 135                 140
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asp Leu Gln Arg Val Lys Gln Glu
145                 150                 155                 160
Leu Leu Glu Glu Val Lys Lys Glu Leu Gln Lys Val Lys Glu Glu Ile
                165                 170                 175
Ile Glu Ala Phe Val Gln Glu Leu Arg Gly Ser Gly Gly His His His
            180                 185                 190
His His His
        195
 
<210>13
<211>276
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>B7DC/VASP
 
<400>13
Met Ile Phe Leu Leu Leu Met Leu Ser Leu Glu Leu Gln Leu His Gln
 1               5                  10                  15
Ile Ala Ala Leu Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Glu Leu Tyr Ile Ile
            20                  25                  30
Glu His Gly Ser Asn Val Thr Leu Glu Cys Asn Phe Asp Thr Gly Ser
        35                  40                  45
His Val Asn Leu Gly Ala Ile Thr Ala Ser Leu Gln Lys Val Glu Asn
    50                  55                  60
Asp Thr Ser Pro His Arg Glu Arg Ala Thr Leu Leu Glu Glu Gln Leu
65                  70                  75                  80
Pro Leu Gly Lys Ala Ser Phe His Ile Pro Gln Val Gln Val Arg Asp
                85                  90                  95
Glu Gly Gln Tyr Gln Cys Ile Ile Ile Tyr Gly Val Ala Trp Asp Tyr
            100                 105                 110
Lys Tyr Leu Thr Leu Lys Val Lys Ala Ser Tyr Arg Lys Ile Asn Thr
        115                 120                 125
His Ile Leu Lys Val Pro Glu Thr Asp Glu Val Glu Leu Thr Cys Gln
    130                 135                 140
Ala Thr Gly Tyr Pro Leu Ala Glu Val Ser Trp Pro Asn Val Ser Val
145                 150                 155                 160
Pro Ala Asn Thr Ser His Ser Arg Thr Pro Glu Gly Leu Tyr Gln Val
               165                 170                 175
Thr Ser Val Leu Arg Leu Lys Pro Pro Pro Gly Arg Asn Phe Ser Cys
            180                 185                 190
Val Phe Trp Asn Thr His Val Arg Glu Leu Thr Leu Ala Ser Ile Asp
        195                 200                 205
Leu Gln Ser Gln Met Glu Pro Arg Thr His Pro Thr Trp Glu Pro Arg
    210                 215                 220
Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asp Leu Gln Arg Val Lys Gln
225                 230                 235                 240
Glu Leu Leu Glu Glu Val Lys Lys Glu Leu Gln Lys Val Lys Glu Glu
                245                 250                 255
Ile Ile Glu Ala Phe Val Gln Glu Leu Arg Gly Ser Gly Gly His His
            260                 265                 270
His His His His
        275
 
<210>14
<211>687
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
 
<400>14
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
1                5                  10                  15
Ala Val Phe Val Ser Leu Ser Gln Glu Ile His Ala Glu Leu Arg Arg
            20                  25                  30
Phe Arg Arg Thr Pro Lys Pro Glu Leu Trp Ala Glu Thr Asn Phe Pro
        35                  40                  45
Leu Ala Pro Trp Lys Asn Leu Thr Leu Trp Cys Arg Ser Pro Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Thr Lys Glu Phe Val Leu Leu Lys Asp Gly Thr Gly Trp Ile Ala
65                  70                  75                  80
Thr Arg Pro Ala Ser Glu Gln Val Arg Ala Ala Phe Pro Leu Gly Ala
                85                  90                  95
Leu Thr Gln Ser His Thr Gly Ser Tyr His Cys His Ser Trp Glu Glu
            100                 105                 110
Met Ala Val Ser Glu Pro Ser Glu Ala Leu Glu Leu Val Gly Thr Asp
        115                 120                 125
Ile Leu Pro Lys Pro Val Ile Ser Ala Ser Pro Thr Ile Arg Gly Gln
    130                 135                 140
Glu Leu Gln Leu Arg Cys Lys Gly Trp Leu Ala Gly Met Gly Phe Ala
145                 150                 155                 160
Leu Tyr Lys Glu Gly Glu Gln Glu Pro Val Gln Gln Leu Gly Ala Val
                165                 170                 175
Gly Arg Glu Ala Phe Phe Thr Ile Gln Arg Met Glu Asp Lys Asp Glu
            180                 185                 190
Gly Asn Tyr Ser Cys Arg Thr His Thr Glu Lys Arg Pro Phe Lys Trp
        195                 200                 205
Ser Glu Pro Ser Glu Pro Leu Glu Leu Val Ile Lys Glu Mer Tyr Pro
    210                 215                 220
Lys Pro Phe Phe Lys Thr Trp Ala Ser Pro Val Val Thr Pro Gly Ala
225                 230                 235                 240
Arg Val Thr Phe Asn Cys Ser Thr Pro His Gln His Met Ser Phe Ile
                245                 250                 255
Leu Tyr Lys Asp Gly Ser Glu Ile Ala Ser Ser Asp Arg Ser Trp Ala
            260                 265                 270
Ser Pro Gly Ala Ser Ala Ala His Phe Leu Ile Ile Ser Val Gly Ile
        275                 280                 285
Gly Asp Gly Gly Asn Tyr Ser Cys Arg Tyr Tyr Asp Phe Ser Ile Trp
    290                 295                 300
Ser Glu Pro Ser Asp Pro Val Glu Leu Val Val Thr Glu Phe Tyr Pro
305                 310                 315                 320
Lys Pro Thr Leu Leu Ala Gln Pro Gly Pro Val Val Phe Pro Gly Lys
                325                 330                 335
Ser Val Ile Leu Arg Cys Gln Gly Thr Phe Gln Gly Met Arg Phe Ala
            340                 345                 350
Leu Leu Gln Glu Gly Ala His Val Pro Leu Gln Phe Arg Ser Val Ser
        355                 360                 365
Gly Asn Ser Ala Asp Phe Leu Leu His Thr Val Gly Ala Glu Asp Ser
    370                 375                 380
Gly Asn Tyr Ser Cys I1e Tyr Tyr Glu Thr Thr Met Ser Asn Arg Gly
385                 390                 395                 400
Ser Tyr Leu Ser Met Pro Leu Met Ile Trp Val Thr Gly Leu Leu Pro
                405                 410                 415
Lys Pro Ser Leu Leu Ala Gln Pro Gly Pro Met Val Ala Pro Gly Glu
            420                 425                 430
Asn Met Thr Leu Gln Cys Gln Gly Glu Leu Pro Asp Ser Thr Phe Val
        435                 440                 445
Leu Leu Lys Glu Gly Ala Gln Glu Pro Leu Glu Gln Gln Arg Pro Ser
    450                 455                 460
Gly Tyr Arg Ala Asp Phe Trp Met Pro Ala Val Arg Gly Glu Asp Ser
465                 470                 475                 480
Gly Ile Tyr Ser Cys Val Tyr Tyr Leu Asp Ser Thr Pro Phe Ala Ala
                485                 490                 495
Ser Asn His Ser Asp Ser Leu Glu Ile Trp Val Thr Asp Lys Pro Pro
            500                 505                 510
Lys Pro Ser Leu Ser Ala Trp Pro Ser Thr Met Phe Lys Leu Gly Lys
        515                 520                 525
Asp Ile Thr Leu Gln Cys Arg Gly Pro Leu Pro Gly Val Glu Phe Val
    530                 535                 540
Leu Glu His Asp Gly Glu Glu Ala Pro Gln Gln Phe Ser Glu Asp Gly
545                 550                 555                 560
Asp Phe Val Ile Asn Asn Val Glu Gly Lys Gly Ile Gly Asn Tyr Ser
                565                 570                 575
Cys Ser Tyr Arg Leu Gln Ala Tyr Pro Asp Ile Trp Ser Glu Pro Ser
            580                 585                 590
Asp Pro Leu Glu Leu Val Gly Ala Ala Gly Pro Val Ala Gln Glu Cys
        595                 600                 605
Thr Val Gly Asn Ile Val Arg Ser Ser Leu Ile Val Val Val Val Val
    610                 615                 620
Ala Leu Gly Val Val Leu Ala Ile Glu Trp Lys Lys Trp Pro Arg Leu
625                 630                 635                 640
Arg Thr Arg Gly Ser Glu Thr Asp Gly Arg Asp Gln Thr Ile Ala Leu
                645                 650                 655
Glu Glu Cys Asn Gln Glu Gly Glu Pro Gly Thr Pro Ala Asn Ser Pro
            660                 665                 670
Ser Ser Thr Ser Gln Arg Ile Ser Val Glu Leu Pro Val Pro Ile
        675                 680                 685
 
<210>15
<211>290
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
 
<400>15
Met Arg Ile Phe Ala Val Phe Ile Phe Met Thr Tyr Trp His Leu Leu
 1               5                  10                  15
Asn Ala Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr
            20                  25                  30
Gly Ser Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu
        35                  40                  45
Asp Leu Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile
    50                  55                  60
Ile Gln Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser
65                  70                  75                  80
Tyr Arg Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn
                85                  90                  95
Ala Ala Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr
            100                 105                 110
Arg Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val
        115                 120                 125
Lys Val Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val
    130                 135                 140
Asp Pro Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr
145                 150                 155                 160
Pro Lys Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser
                165                 170                 175
Gly Lys Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn
            180                 185                 190
Val Thr Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr
        195                 200                 205
Cys Thr Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu
    210                 215                 220
Val Ile Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Thr His
225                 230                 235                 240
Leu Val Ile Leu Gly Ala Ile Leu Leu Cys Leu Gly Val Ala Leu Thr
                245                 250                 255
Phe Ile Phe Arg Leu Arg Lys Gly Arg Met Met Asp Val Lys Lys Cys
            260                 265                 270
Gly Ile Gln Asp Thr Asn Ser Lys Lys Gln Ser Asp Thr His Leu Glu
        275                 280                 285
Glu Thr
    290
 
<210>16
<21l>1500
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>zB7H6/mFc2
 
<400>16
atgacgtgga gggctgccgc ctccacgtgc gcggcgctcc tgattctgct gtgggcgctg 60
acgaccgaag gtgatctgaa agtagagatg atggcagggg ggactcagat cacacccctg 120
aatgacaatg tcaccatatt ctgcaatatc ttttattccc aacccctcaa catcacgtct 180
atgggtatca cctggttttg gaagagtctg acgtttgaca aagaagtcaa agtctttgaa 240
ttttttggag atcaccaaga ggcattccga cctggagcca ttgtgtctcc atggaggctg 300
aagagtgggg acgcctcact gcggctgcct ggaatccagc tggaggaagc aggagagtac 360
cgatgtgagg tggtggtcac ccctctgaag gcacagggaa cagtccagct tgaagttgtg 420
gcttccccag ccagcagatt gttgctggat caagtgggca tgaaagagaa tgaagacaaa 480
tatatgtgtg agtcaagtgg gttctaccca gaggctatta atataacatg ggagaagcag 540
acccagaagt ttccccatcc catagagatt tctgaggatg tcatcactgg tcccaccatc 600
aagaatatgg atggcacatt taatgtcact agctgcttga agctgaactc ctctcaggaa 660
gaccctggga ctgtctacca gtgtgtggta cggcatgcgt ccttgcatac ccccttgagg 720
agcaacttta ccctgactgc tgctcggcac agtctttctg aaactgagaa gacagataat 780
ttttccattc attggtggcc tgagcccaga tctcccacaa tcaagccctg tcctccatgc 840
aaatgcccag cacctaacct cgagggtgga ccatccgtct tcatcttccc tccaaagatc 900
aaggatgtac tcatgatctc cctgagcccc atagtcacat gtgtggtggt ggatgtgagc 960
gaggatgacc cagatgtcca gatcagctgg tttgtgaaca acgtggaagt acacacagct 1020
cagacacaaa cccatagaga ggattacaac agtactctcc gggtggtcag tgccctcccc 1080
atccagcacc aggactggat gagtggcaaa gctttcgcat gcgcggtcaa caacaaagac 1140
ctcccagcgc ccatcgagag aaccatctca aaacccaaag ggtcagtaag agctccacag 1200
gtatatgtct tgcctccacc agaagaagag atgactaaga aacaggtcac tctgacctgc 1260
atggtcacag acttcatgcc tgaagacatt tacgtggagt ggaccaacaa cgggaaaaca 1320
gagctaaact acaagaacac tgaaccagtc ctggactctg atggttctta cttcatgtac 1380
agcaagctga gagtggaaaa gaagaactgg gtggaaagaa atagctactc ctgttcagtg 1440
gtccacgagg gtctgcacaa tcaccacacg actaagagct tctcccggac tccgggtaaa 1500
 
<210>17
<211>500
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>zB7H6/mFc2
 
<400>17
Met Thr Trp Arg Ala Ala Ala Ser Thr Cys Ala Ala Leu Leu Ile Leu
 1               5                  10                  15
Leu Trp Ala Leu Thr Thr Glu Gly Asp Leu Lys Val Glu Met Met Ala
            20                  25                  30
Gly Gly Thr Gln Ile Thr Pro Leu Asn Asp Asn Val Thr Ile Phe Cys
        35                  40                  45
Asn Ile Phe Tyr Ser Gln Pro Leu Asn Ile Thr Ser Met Gly Ile Thr
    50                  55                  60
Trp Phe Trp Lys Ser Leu Thr Phe Asp Lys Glu Val Lys Val Phe Glu
65                  70                  75                  80
Phe Phe Gly Asp His Gln Glu Ala Phe Arg Pro Gly Ala Ile Val Ser
                85                  90                  95
Pro Trp Arg Leu Lys Ser Gly Asp Ala Ser Leu Arg Leu Pro Gly Ile
            100                 105                 110
Gln Leu Glu Glu Ala Gly Glu Tyr Arg Cys Glu Val Val Val Thr Pro
        115                 120                 125
Leu Lys Ala Gln Gly Thr Val Gln Leu Glu Val Val Ala Ser Pro Ala
    130                 135                 140
Ser Arg Leu Leu Leu Asp Gln Val Gly Met Lys Glu Asn Glu Asp Lys
145                 150                 155                 160
Tyr Met Cys Glu Ser Ser Gly Phe Tyr Pro Glu Ala Ile Asn Ile Thr
                165                 170                 175
Trp Glu Lys Gln Thr Gln Lys Phe Pro His Pro Ile Glu Ile Ser Glu
            180                 185                 190
Asp Val Ile Thr Gly Pro Thr Ile Lys Asn Met Asp Gly Thr Phe Asn
        195                 200                 205
Val Thr Ser Cys Leu Lys Leu Asn Ser Ser Gln Glu Asp Pro Gly Thr
    210                 215                 220
Val Tyr Gln Cys Val Val Arg His Ala Ser Leu His Thr Pro Leu Arg
225                 230                 235                 240
Ser Asn Phe Thr Leu Thr Ala Ala Arg His Ser Leu Ser Glu Thr Glu
                245                 250                 255
Lys Thr Asp Asn Phe Ser Ile His Trp Trp Pro Glu Pro Arg Ser Pro
            260                 265                 270
Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Glu
        275                 280                 285
Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu
    290                 295                 300
Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
305                 310                 315                 320
Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu
                325                 330                 335
Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr
            340                 345                 350
Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser
        355                 360                 365
Gly Lys Ala Phe Ala Cys Ala Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro
    370                 375                 380
Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln
385                 390                 395                 400
Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val
                405                 410                 415
Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val
            420                 425                 430
Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu
        435                 440                 445
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg
    450                 455                 460
Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val
465                 470                 475                 480
Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg
                485                 490                 495
Thr Pro Gly Lys
           500
 
<210>18
<211>969
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>zB7H6/VASP
 
<400>18
atgacgtgga gggctgccgc ctccacgtgc gcggcgctcc tgattctgct gtgggcgctg 60
acgaccgaag gtgatctgaa agtagagatg atggcagggg ggactcagat cacacccctg 120
aatgacaatg tcaccatatt ctgcaatatc ttttattccc aacccctcaa catcacgtct 180
atgggtatca cctggttttg gaagagtctg acgtttgaca aagaagtcaa agtctttgaa 240
ttttttggag atcaccaaga ggcattccga cctggagcca ttgtgtctcc atggaggctg 300
aagagtgggg acgcctcact gcggctgcct ggaatccagc tggaggaagc aggagagtac 360
cgatgtgagg tggtggtcac ccctctgaag gcacagggaa cagtccagct tgaagttgtg 420
gcttccccag ccagcagatt gttgctggat caagtgggca tgaaagagaa tgaagacaaa 480
tatatgtgtg agtcaagtgg gttctaccca gaggctatta atataacatg ggagaagcag 540
acccagaagt ttccccatcc catagagatt tctgaggatg tcatcactgg tcccaccatc 600
aagaatatgg atggcacatt taatgtcact agctgcttga agctgaactc ctctcaggaa 660
gaccctggga ctgtctacca gtgtgtggta cggcatgcgt ccttgcatac ccccttgagg 720
agcaacttta ccctgactgc tgctcggcac agtctttctg aaactgagaa gacagataat 780
ttttccattc attggtggcc tgagcccaga tctggttccg gaggctccgg tggctccgac 840
ctacagaggg tgaaacagga gcttctggaa gaggtgaaga aggaattgca gaaagtgaaa 900
gaggaaatca ttgaagcctt cgtccaggag ctgaggggtt ccggtggcca tcaccatcac 960
catcactga                                                         969
 
<210>19
<211>322
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>zB7H6/VASP
 
<400>19
Met Thr Trp Arg Ala Ala Ala Ser Thr Cys Ala Ala Leu Leu Ile Leu
 1               5                  10                  15
Leu Trp Ala Leu Thr Thr Glu Gly Asp Leu Lys Val Glu Met Met Ala
            20                  25                  30
Gly Gly Thr Gln Ile Thr Pro Leu Asn Asp Asn Val Thr Ile Phe Cys
        35                  40                  45
Asn Ile Phe Tyr Ser Gln Pro Leu Asn Ile Thr Ser Met Gly Ile Thr
    50                  55                  60
Trp Phe Trp Lys Ser Leu Thr Phe Asp Lys Glu Val Lys Val Phe Glu
65                  70                  75                  80
Phe Phe Gly Asp His Gln Glu Ala Phe Arg Pro Gly Ala Ile Val Ser
                85                  90                  95
Pro Trp Arg Leu Lys Ser Gly Asp Ala Ser Leu Arg Leu Pro Gly Ile
            100                 105                 110
Gln Leu Glu Glu Ala Gly Glu Tyr Arg Cys Glu Val Val Val Thr Pro
        115                 120                 125
Leu Lys Ala Gln Gly Thr Val Gln Leu Glu Val Val Ala Ser Pro Ala
    130                 135                 140
Ser Arg Leu Leu Leu Asp Gln Val Gly Met Lys Glu Asn Glu Asp Lys
145                 150                 155                 160
Tyr Met Cys Glu Ser Ser Gly Phe Tyr Pro Glu Ala Ile Asn Ile Thr
                165                 170                 175
Trp Glu Lys Gln Thr Gln Lys Phe Pro His Pro Ile Glu Ile Ser Glu
            180                 185                 190
Asp Val Ile Thr Gly Pro Thr Ile Lys Asn Met Asp Gly Thr Phe Asn
        195                 200                 205
Val Thr Ser Cys Leu Lys Leu Asn Ser Ser Gln Glu Asp Pro Gly Thr
    210                 215                 220
Val Tyr Gln Cys Val Val Arg His Ala Ser Leu His Thr Pro Leu Arg
225                 230                 235                 240
Ser Asn Phe Thr Leu Thr Ala Ala Arg His Ser Leu Ser Glu Thr Glu
                245                 250                 255
Lys Thr Asp Asn Phe Ser Ile His Trp Trp Pro Glu Pro Arg Ser Gly
            260                 265                 270
Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asp Leu Gln Arg Val Lys Gln Glu Leu
        275                 280                 285
Leu Glu Glu Val Lys Lys Glu Leu Gln Lys Val Lys Glu Glu Ile Ile
    290                 295                 300
Glu Ala Phe Val Gln Glu Leu Arg Gly Ser Gly Gly His His His His
305                 310                 315                 320
His His
 
<210>20
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>寡核苷酸引物
 
<400>20
tccacaggtg tccagggaat tcaccatgca tggctggctg ctc    43
 
<210>21
<211>46
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>寡核苷酸引物
 
<400>21
agggcttgat tgtgggagat ctgggctcgg cagtctggaa ctgagc    46
<210>22
<211>104
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>寡核苷酸引物
 
<400>22
acgcttccgt agatctggtt ccggaggctc cggtggctcc gacctacaga gggtgaaaca 60
ggagcttctg gaagaggtga agaaggaatt gcagaaagtg aaag                  104
 
<210>23
<211>104
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>寡核苷酸引物
 
<400>23
aaggcgcgcc tctagatcag tgatggtgat ggtgatggcc accggaaccc ctcagctcct 60
ggacgaaggc ttcaatgatt tcctctttca ctttctgcaa ttcc                  104
 
<210>24
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>寡核苷酸引物
 
<400>24
ctcagccagg aaatccatgc cgagttgaga cgcttccgta gatctgg    47
 
<210>25
<211>46
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>寡核苷酸引物
 
<400>25
ggggtgggta caaccccaga gctgttttaa ggcgcgcctc tagatc    46
 
<210>26
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>寡核苷酸引物
 
<400>26
ttgacatcca ctttgccttt ctctccacag gtgtccaggg aattcgcaaa tgacgtggag 60
ggc tgccgcc                                                       70
 
<210>27
<211>72
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
 
<400>27
caccctctgt aggtcggagc caccggagcc tccggaacca gatctgggct caggccacca 60
atgaatggaa aa                                                     72
 
<210>28
<211>514
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>B7H3/VASP
 
<400>28
Met Leu Arg Arg Arg Gly Ser Pro Gly Met Gly Val His Val Gly Ala
 1               5                  10                  15
Ala Leu Gly Ala Leu Trp Phe Cys Leu Thr Gly Ala Leu Glu Val Gln
            20                  25                  30
Val Pro Glu Asp Pro Val Val Ala Leu Val Gly Thr Asp Ala Thr Leu
        35                  40                  45
Cys Cys Ser Phe Ser Pro Glu Pro Gly Phe Ser Leu Ala Gln Leu Asn
    50                  55                  60
Leu Ile Trp Gln Leu Thr Asp Thr Lys Gln Leu Val His Ser Phe Ala
65                  70                  75                  80
Glu Gly Gln Asp Gln Gly Ser Ala Tyr Ala Asn Arg Thr Ala Leu Phe
                85                  90                  95
Pro Asp Leu Leu Ala Gln Gly Asn Ala Ser Leu Arg Leu Gln Arg Val
            100                 105                 110
Arg Val Ala Asp Glu Gly Ser Phe Thr Cys Phe Val Ser Ile Arg Asp
        115                 120                 125
Phe Gly Ser Ala Ala Val Ser Leu Gln Val Ala Ala Pro Tyr Ser Lys
    130                 135                 140
Pro Ser Met Thr Leu Glu Pro Asn Lys Asp Leu Arg Pro Gly Asp Thr
145                 150                 155                 160
Val Thr Ile Thr Cys Ser Ser Tyr Gln Gly Tyr Pro Glu Ala Glu Val
                165                 170                 175
Phe Trp Gln Asp Gly Gln Gly Val Pro Leu Thr Gly Asn Val Thr Thr
            180                 185                 190
Ser Gln Met Ala Asn Glu Gln Gly Leu Phe Asp Val His Ser Ile Leu
        195                 200                 205
Arg Val Val Leu Gly Ala Asn Gly Thr Tyr Ser Cys Leu Val Arg Asn
    210                 215                 220
Pro Val Leu Gln Gln Asp Ala His Ser Ser Val Thr Ile Thr Pro Gln
225                 230                 235                 240
Arg Ser Pro Thr Gly Ala Val Glu Val Gln Val Pro Glu Asp Pro Val
                245                 250                 255
Val Ala Leu Val Gly Thr Asp Ala Thr Leu Arg Cys Ser Phe Ser Pro
            260                 265                 270
Glu Pro Gly Phe Ser Leu Ala Gln Leu Asn Leu Ile Trp Gln Leu Thr
        275                 280                 285
Asp Thr Lys Gln Leu Val His Ser Phe Thr Glu Gly Arg Asp Gln Gly
    290                 295                 300
Ser Ala Tyr Ala Asn Arg Thr Ala Leu Phe Pro Asp Leu Leu Ala Gln
305                 310                 315                 320
Gly Asn Ala Ser Leu Arg Leu Gln Arg Val Arg Val Ala Asp Glu Gly
                325                 330                 335
Ser Phe Thr Cys Phe Val Ser Ile Arg Asp Phe Gly Ser Ala Ala Val
            340                 345                 350
Ser Leu Gln Val Ala Ala Pro Tyr Ser Lys Pro Ser Met Thr Leu Glu
        355                 360                 365
Pro Asn Lys Asp Leu Arg Pro Gly Asp Thr Val Thr Ile Thr Cys Ser
    370                 375                 380
Ser Tyr Arg Gly Tyr Pro Glu Ala Glu Val Phe Trp Gln Asp Gly Gln
385                 390                 395                 400
Gly Val Pro Leu Thr Gly Asn Val Thr Thr Ser Gln Met Ala Asn Glu
                405                 410                 415
Gln Gly Leu Phe Asp Val His Ser Val Leu Arg Val Val Leu GlyAla
            420                 425                 430
Asn Gly Thr Tyr Ser Cys Leu Val Arg Ash Pro Val Leu Gln Gln Asp
        435                 440                 445
Ala His Gly Ser Val Thr Ile Thr Gly Gln Pro Met Thr Phe Ser Gly
    450                 455                 460
Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asp Leu Gln Arg Val Lys Gln Glu Leu
465                 470                 475                 480
Leu Glu Glu Val Lys Lys Glu Leu Gln Lys Val Lys Glu Glu Ile Ile
                485                 490                 495
Glu Ala Phe Val Gln Glu Leu Arg Gly Ser Gly Gly His His His His
            500                 505                 510
His His
 
<210>29
<211>232
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
 
<400>29
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
 1               5                  10                  15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
            20                  25                  30
Lys Asp Thr Leu Met Ile SerArg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
        35                  40                  45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val LysPhe Asn Trp Tyr Val
    50                  55                  60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys ProArg Glu Glu Gln
65                  70                  75                  80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
                85                  90                  95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
            100                 105                 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
        115                 120                 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro SerArgAsp Glu Leu Thr
    130                 135                 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145                 150                 155                 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
                165                 170                 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
            180                 185                 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
        195                 200                 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
    210                 215                 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225                 230
 
<210>30
<211>232
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>Fc-488
 
<400>30
Glu Pro Arg Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
 1               5                  10                  15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
            20                  25                  30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
        35                  40                  45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
    50                  55                  60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65                  70                  75                  80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
                85                  90                  95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
            100                 105                 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
        115                 120                 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
    130                 135                 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145                 150                 155                 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
                165                 170                 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
            180                 185                 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
        195                 200                 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
    210                 215                 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225                 230
 
<210>31
<211>232
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>Fc-4
 
<400>31
Glu Pro Arg Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
 1               5                  10                  15
Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
            20                  25                  30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
        35                  40                  45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
    50                  55                  60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65                  70                  75                  80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
                85                  90                  95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
            100                 105                 110
Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
        115                 120                 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
    130                 135                 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145                 150                 155                 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
                165                 170                 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
            180                 185                 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
        195                 200                 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
    210                 215                 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225                 230
 
<210>32
<211>232
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>Effector function minus Fc(Fc5)
 
<400>32
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
 1               5                  10                  15
Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
            20                  25                  30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
        35                  40                  45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
    50                  55                  60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65                  70                  75                  80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
                85                  90                  95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
            100                 105                 110
Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
        115                 120                 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
    130                 135                 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145                 150                 155                 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
                165                 170                 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
            180                 185                 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
        195                 200                 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
    210                 215                 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225                 230
 
<210>33
<211>231
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>Fc6
 
<400>33
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
 1               5                  10                  15
Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
            20                  25                  30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
        35                  40                  45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
    50                  55                  60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65                  70                  75                  80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
                85                  90                  95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
            100                 105                 110
Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
        115                 120                 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp G1u Leu Thr
    130                 135                 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145                 150                 155                 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
                165                 170                 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
            180                 185                 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
        195                 200                 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
    210                 215                 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
225                 230
 
<210>34
<211>232
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>Fc7
 
<400>34
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
 1               5                  10                  15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
            20                  25                  30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
        35                  40                  45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
    50                  55                  60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65                  70                  75                  80
Tyr Glu Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
                85                  90                  95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
            100                 105                 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
        115                 120                 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
    130                 135                 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145                 150                 155                 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
                165                 170                 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
            180                 185                 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
        195                 200                 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
    210                 215                 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225                 230

Claims (74)

1.一种分离的可溶性多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO：2的第25-266号残基表示的氨基酸序列有至少90％的序列同一性的多肽片段，其中所述多肽能够特异性地结合于人NKp30。
2.权利要求1的多肽，其中所述多肽片段具有SEQ ID NO：2的第25-266号残基表示的氢基酸序列。
3.权利要求1的多肽，所述多肽为可溶性融合蛋白。
4.权利要求3的多肽，其中所述多肽片段具有SEQ ID NO：2的第25-266号残基表示的氢基酸序列。
5.权利要求3的多肽，所述多肽还包含免疫球蛋白重链恒定区。
6.权利要求5的多肽，其中所述免疫球蛋白重链恒定区为Fc片段。
7.权利要求5的多肽，其中所述免疫球蛋白重链恒定区为选自IgG、IgM、IgE、IgA和IgD的同种型。
8.权利要求7的多肽，其中所述IgG同种型为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
9.权利要求3的多肽，所述多肽还包含VASP结构域。
10.一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含：
编码权利要求1-9任一项中的多肽的多核苷酸区段。
11.一种包含权利要求10的多核苷酸的载体。
12.一种包含如下可操作连接的元件的表达载体：
一个转录起始区；
一个编码权利要求1-9任一项中的多肽的DNA区段；和
一个转录终止区。
13.一种包含权利要求12的表达载体的宿主细胞。
14.一种产生可溶性zB7H6多肽的方法，所述方法包括：
在所述多肽可表达的条件下培养权利要求13的宿主细胞；以及
回收所表达的多肽。
15.一种分离的抗体，所述抗体可特异性结合于具有SEQ ID NO：2的第25-266号残基表示的氨基酸序列的多肽片段。
16.权利要求15的分离抗体，其中所述抗体可抑制zB7H6与人NKp30的相互作用。
17.权利要求15的抗体，所述抗体为单克隆抗体。
18.权利要求17的抗体，所述抗体为人单克隆抗体或人源化的单克隆抗体。
19.权利要求17的抗体，所述抗体为单链抗体。
20.权利要求16-19任一项的抗体，其中所述抗体包含具有ADCC活性和CDC活性中至少一种的Fc区。
21.权利要求20的抗体，其中所述Fc区为单链Fc(scFc)。
22.一种药物组合物，所述药物组合物包含：
权利要求16-21任一项的抗体；和
可药用的载体。
23.一种提高人自然杀伤(NK)细胞活性的方法，所述方法包括：
将人NK细胞与表达重组的膜结合zB7H6多肽的细胞相接触，所述zB7H6多肽包含与SEQ ID NO：2的第25-266号残基表示的氨基酸序列有至少90％的序列同一性的多肽片段，并且其中所述zB7H6多肽能够特异性地结合于人NKp30。
24.权利要求23的方法，其中所述多肽片段具有SEQ ID NO：2的第25-266号残基表示的氢基酸序列。
25.一种降低人自然杀伤(NK)细胞抗表达zB7H6的细胞的活性的方法，所述方法包括：
在存在人NK细胞的情况下，将表达功能性zB7H6的细胞与有效量的一种这样的抗体相接触，所述抗体可特异性结合于具有SEQ ID NO：2的第25-266号残基表示的氨基酸序列的多肽片段，其中所述抗体可抑制zB7H6与人NKp30的相互作用。
26.一种治疗受试者体内的骨髓细胞(BMC)同种异体移植物排斥的方法，所述方法包括：
以有效抑制NK细胞活性并从而治疗所述急性BMC同种异体移植物排斥的量给予所述人受试者一种这样的抗体，所述抗体可特异性结合于具有SEQ ID NO：2的第25-266号残基表示的氨基酸序列的多肽片段，其中所述抗体可抑制zB7H6与人NKp30的相互作用。
27.权利要求25或26的方法，其中所述抗体为单克隆抗体。
28.权利要求27的方法，其中所述抗体为人单克隆抗体或人源化的单克隆抗体。
29.权利要求27的方法，其中所述抗体为单链抗体。
30.一种筛选能够拮抗zB7H6与NKp30的相互作用的拮抗物的方法，所述方法包括：
(a)在存在NKp30多肽的情况下，将一种试剂与zB7H6多肽相接触；
(b)检测所述zB7H6多肽与所述NKp30多肽的相互作用的量度；
(c)确定步骤(b)中测量的zB7H6/NKp30相互作用水平是否显著低于在无所述试剂的情况下测量的对照zB7H6和NKp30多肽的相互作用水平，如果在存在所述试剂的条件下zB7H6/NKp30相互作用水平较低，那么所述试剂被鉴定为能够拮抗zB7H6与NKp30的相互作用的拮抗物。
31.一种筛选刺激zB7H6与NKp30的相互作用的激动剂的方法，所述方法包括：
(a)在存在NKp30多肽的情况下，将一种试剂与zB7H6多肽相接触；
(b)检测所述zB7H6多肽与所述NKp30多肽的相互作用的量度；
(c)确定步骤(b)中测量的zB7H6/NKp30相互作用水平是否显著高于在无所述试剂的情况下测量的对照zB7H6和NKp30多肽的相互作用水平，如果在存在所述试剂的条件下zB7H6/NKp30相互作用水平较高，那么所述试剂被鉴定为能够刺激zB7H6与NKp30的相互作用的激动剂。
32.一种抗体-药物缀合物，所述抗体-药物缀合物包含：
一种可特异性结合于具有SEQ ID NO：2的第25-266号残基表示的氨基酸序列的多肽片段的抗体，其中所述抗体与细胞毒性剂缀合。
33.权利要求32的抗体-药物缀合物，其中所述抗体为单克隆抗体。
34.权利要求33的抗体-药物缀合物，其中所述抗体为人单克隆抗体或人源化的单克隆抗体。
35.权利要求33的抗体-药物缀合物，其中所述抗体为单链抗体。
36.权利要求32的抗体-药物缀合物，其中所述细胞毒性剂选自抗微管剂、DNA小沟结合剂、DNA小沟烷化剂、倍癌霉素(duocarmycin)和嘌呤霉素(puromycin)。
37.权利要求36的抗体-药物缀合物，其中所述抗微管剂选自多拉司他汀(dolastatin)、长春碱、鬼臼毒素、紫杉烷(taxane)、浆果赤霉素衍生物、隐藻素(cryptophysin)、美登类化合物(maytansinoid)和考布他汀(combretastatin)。
38.权利要求32的抗体-药物缀合物，其中所述抗体经连接体缀合于所述细胞毒性剂。
39.权利要求38的抗体-药物缀合物，其中所述连接体在细胞内环境下是可切割的。
40.权利要求39的抗体-药物缀合物，其中所述可切割的连接体为可被细胞内蛋白酶切割的肽连接体。
41.权利要求40的抗体-药物缀合物，其中所述细胞内蛋白酶为溶酶体蛋白酶或内体蛋白酶。
42.权利要求40的抗体-药物缀合物，其中所述肽连接体为二肽连接体。
43.权利要求42的抗体-药物缀合物，其中所述二肽连接体为缬氨酸-瓜氨酸连接体或苯丙氨酸-赖氨酸连接体。
44.权利要求39的抗体-药物缀合物，其中所述可切割的连接体在低于5.5的pH下是可水解的。
45.权利要求44的抗体-药物缀合物，其中所述可水解的连接体为腙连接体。
46.权利要求39的抗体-药物缀合物，其中所述可切割的连接体为二硫化物连接体。
47.一种药物组合物，所述药物组合物包含：
权利要求32-46任一项中所述的抗体-药物缀合物；和
至少一种可药用载体。
48.一种在包含表达zB7H6的细胞的细胞群中耗尽所述表达zB7H6的细胞或抑制所述表达zB7H6的细胞生长的方法，所述方法包括：
将所述表达zB7H6的细胞与有效量的权利要求32-46任一项中的抗体-药物缀合物相接触。
49.一种在受试者中治疗表达zB7H6的癌的方法，所述方法包括：
给予所述受试者有效量的权利要求32-46任一项中的抗体-药物缀合物。
50.权利要求49的方法，其中所述表达zB7H6的癌为结肠癌、肝癌、宫颈癌、肺癌、胰腺癌或前列腺癌。
51.权利要求49的方法，其中所述表达zB7H6的癌为原血细胞性白血病、B细胞淋巴瘤、单核细胞性淋巴瘤、红白血病、伯基特淋巴瘤(Burkitt′s lymphoma)或慢性髓细胞性白血病。
52.一种诱导针对表达zB7H6的细胞的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的方法，所述方法包括：
将所述表达zB7H6的细胞与有效量的一种这样的抗体相接触，所述抗体可特异性结合于具有SEQ ID NO：2的第25-266号残基表示的氨基酸序列的多肽片段，其中该接触在存在表达具有ADCC活性的Fc受体的NK细胞或CD8+T细胞的条件下进行，并且其中所述抗体包含能够结合所述Fc受体的Fc区。
53.权利要求52的方法，其中所述抗体为单克隆抗体。
54.权利要求53的方法，其中所述抗体为人单克隆抗体或人源化的单克隆抗体。
55.权利要求53的方法，其中所述抗体为单链抗体。
56.权利要求52-55任一项的方法，其中所述Fc区为单链Fc(scFc)。
57.权利要求52-56任一项的方法，其中所述表达zB7H6的细胞为癌细胞。
58.权利要求57的方法，其中所述癌细胞为结肠癌细胞、肝癌细胞、宫颈癌细胞、肺癌细胞、胰腺癌细胞或前列腺癌细胞。
59.权利要求57的方法，其中所述癌细胞为原血细胞性白血病细胞、B细胞淋巴瘤细胞、单核细胞性淋巴瘤细胞、红白血病细胞、伯基特淋巴瘤细胞或慢性髓细胞性白血病细胞。
60.一种诱导针对表达zB7H6的细胞的补体依赖细胞毒性(CDC)的方法，所述方法包括：
将所述表达zB7H6的细胞与有效量的一种这样的抗体相接触，所述抗体可特异性结合于具有SEQ ID NO：2的第25-266号残基表示的氨基酸序列的多肽片段，其中该接触在存在补体的情况下进行，并且其中所述抗zB7H6抗体包含具有CDC活性的Fc区。
61.权利要求60的方法，其中所述抗体为单克隆抗体。
62.权利要求61的方法，其中所述抗体为人单克隆抗体或人源化的单克隆抗体。
63.权利要求61的方法，其中所述抗体为单链抗体。
64.权利要求60-63任一项的方法，其中所述Fc区为单链Fc(scFc)。
65.权利要求60-63任一项的方法，其中所述表达zB7H6的细胞为癌细胞。
66.权利要求65的方法，其中所述癌细胞为结肠癌细胞、肝癌细胞、宫颈癌细胞、肺癌细胞、胰腺癌细胞或前列腺癌细胞。
67.权利要求65的方法，其中所述癌细胞为原血细胞性白血病细胞、B细胞淋巴瘤细胞、单核细胞性淋巴瘤细胞、红白血病细胞、伯基特淋巴瘤细胞或慢性髓细胞性白血病细胞。
68.一种在受试者中治疗表达zB7H6的癌的方法，所述方法包括：
给予所述受试者有效量的一种这样的抗体，所述抗体可特异性结合于具有SEQ ID NO：2的第25-266号残基表示的氨基酸序列的多肽片段，其中所述抗体包含具有ADCC活性和CDC活性中至少一种的Fc区。
69.权利要求68的方法，其中所述抗体为单克隆抗体。
70.权利要求69的方法，其中所述抗体为人单克隆抗体或人源化的单克隆抗体。
71.权利要求69的方法，其中所述抗体为单链抗体。
72.权利要求68-71任一项的方法，其中所述Fc区为单链Fc(scFc)。
73.权利要求68-72任一项的方法，其中所述表达zB7H6的癌为结肠癌、肝癌、宫颈癌、肺癌胞、胰腺癌或前列腺癌。
74.权利要求68-72任一项的方法，其中所述表达zB7H6的癌为原血细胞性白血病、B细胞淋巴瘤、单核细胞性淋巴瘤、红白血病、伯基特淋巴瘤或慢性髓细胞性白血病。
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