CN102093459B - 一种扯根菜提取物及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医药技术领域，是扯根菜提取物或从扯根菜提取物中分离到的化合物熊果酸、乔松素、东莨菪内酯、没食子酸、熊果酸-28-木糖-(1-3)-葡萄糖苷、乔松素-7-葡萄糖苷、乔松素-7-新橙皮糖苷、东莨菪苷或没食子酰葡萄糖苷的新用途。经药理、药效实验，本发明扯根菜提取物或上述各化合物能够明显降低小鼠急性肝损伤、酒精肝、病毒性肝炎及大鼠慢性肝纤维化等引起的AST、ALT和ALP的升高，对HepG2肿瘤细胞有显著抑制作用，并且可以降低血清中的胆固醇及甘油三酯含量。本发明扯根菜提取物或化合物制备方法简单，成本低廉，本发明为防治肝炎、肝损伤、肝纤维化、肝硬化、酒精肝、肝癌和高血脂相关的疾病提供了一种新的药物来源。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，是扯根菜提取物或从扯根菜提取物中分离得到的化合物在制备治疗和预防肝炎、肝损伤、肝纤维化、肝硬化、酒精肝、肝癌和高血脂疾病药物中的应用。
背景技术
扯根菜Penthorum chinense Pursh为虎耳草科扯根菜属植物，为苗族传统药物，分布较广，民间以全草入药，《中药大辞典》和《四川中药志》均有记载。其全草性温、味甘、无毒，具有清热、利尿、解毒、活血、平肝、健脾、祛黄疸等功效。并且对痈肿疔毒和毒蛇咬伤也有一定的功效。主治黄疸、水肿、跌打损伤。扯根菜的化学成分主要有2，4，6-三羟基苯甲酸、没食子酸、槲皮素、槲皮素-3-鼠李糖苷、乔松素-7-葡萄糖苷(详见冯浩，王智民等，赶黄草化学成分的研究，中国中药杂志，2001，26：260-261；张旭，杨明，赶黄草有效成分的研究，成都中医药大学学报，2002，25：46)等。但到目前为止，尚未见扯根菜提取物或上述化合物具有防治肝炎、肝损伤、肝硬化、高血脂、肝癌等疾病的药理活性的报道。
发明内容
本发明提供一种扯根菜提取物以及从扯根菜提取物中分离得到的化合物熊果酸(1)、乔松素(2)、东莨菪内酯(3)、没食子酸(4)、熊果酸-28-木糖-(1-3)-葡萄糖苷(5)、乔松素-7-葡萄糖苷(6)，乔松素-7-新橙皮糖苷(7)、东莨菪苷(9)、没食子酰葡萄糖苷(10)的新用途，即它们在制备防治肝炎、肝损伤、肝纤维化、肝硬化、酒精肝、肝癌和高血脂相关药物中的应用。上述9个化合物及从扯根菜提取物中分离到的另一个化合物槲皮素-3-鼠李糖苷(化合物8)的化学结构式分别为：
本发明的扯根菜提取物和化合物制备方法如下：
1.制备扯根菜提取物
将扯根菜干燥全草切碎后，用水或不超过70％的乙醇水溶液按常规渗漉提取或浸泡提取，提取液减压浓缩至无醇味的浸膏。然后用水混悬后通过D101大孔树脂柱，依次用水、50％乙醇和95％乙醇洗脱，分别得到水洗脱液、50％乙醇水洗脱液和95％乙醇水洗脱液，分别减压浓缩至无醇味的浸膏，其中50％乙醇水洗脱液减压浓缩后的浸膏为本发明扯根菜提取物。
2.制备上述10个化合物
(1)制备化合物1～4
将95％乙醇水洗脱部位的浸膏用硅胶H(60型，青岛海洋化工集团公司，下同)拌样，上硅胶H层析柱，以二氯甲烷∶甲醇为100∶1→50∶1→25∶1→10∶1→5∶1→2∶1→1∶1的溶剂系统进行梯度洗脱，每个极性的洗脱剂分别洗脱五个柱体积，根据薄层板(HSGF254，下同)检测，展开剂为二氯甲烷∶甲醇＝10∶1，紫外灯254nm荧光显色，根据洗脱液的不同将收集的洗脱液分为四份，分别减压浓缩至浸膏。将第一部分(二氯甲烷∶甲醇为100∶1→50∶1)浸膏用硅胶H拌样，上硅胶H层析柱，以石油醚∶乙酸乙酯＝10∶1的洗脱液常压等度恒速洗脱，根据薄层板检测，展开剂为石油醚∶乙酸乙酯＝8∶1，香草醛-浓硫酸乙醇溶液显色(浓硫酸∶乙醇＝1∶9，下同)，当薄层板上显示一个斑点时，表明洗脱液内的组分为纯的(下同)，收集纯的组分得到熊果酸(化合物1)。将第二部分(二氯甲烷∶甲醇为25∶1→10∶1)浸膏用硅胶H拌样，上硅胶H层析柱，以二氯甲烷∶甲醇＝20∶1的洗脱液常压等度恒速洗脱，根据薄层板检测，展开剂为二氯甲烷∶甲醇＝10∶1，紫外灯254nm荧光显色，收集纯的组分并分别用丙酮重结晶，得到乔松素(化合物2)。将第三部分(二氯甲烷∶甲醇为5∶1)浸膏用硅胶H拌样，上硅胶H层析柱，以二氯甲烷∶甲醇＝6∶1的洗脱液常压等度恒速洗脱，根据薄层板检测，展开剂为二氯甲烷∶甲醇＝5∶1，紫外灯254nm荧光显色，收集纯的组分，得到东莨菪内酯(化合物3)。将第四部分(二氯甲烷∶甲醇为2∶1→1∶1)浸膏用硅胶H拌样，上硅胶H层析柱，以二氯甲烷∶甲醇＝3∶1的洗脱液常压等度恒速洗脱，根据薄层板检测，展开剂为二氯甲烷∶甲醇＝2∶1，紫外灯254nm荧光显色，收集纯的组分，得到没食子酸(化合物4)。
(2)制备化合物5～10
将50％乙醇水洗脱部位的浸膏用硅胶H拌样，上硅胶H层析柱，以二氯甲烷∶甲醇为50∶1→25∶1→10∶1→5∶1→2∶1→1∶1的溶剂系统进行梯度洗脱，每个极性的洗脱剂分别洗脱五个柱体积，根据薄层板检测，展开剂为二氯甲烷∶甲醇＝10∶1，紫外灯254nm荧光显色，将洗脱液分为五份，分别减压浓缩成浸膏。将第一部分(二氯甲烷∶甲醇为50∶1→25∶1)浸膏用硅胶H拌样，上硅胶H层析柱，以二氯甲烷∶甲醇＝30∶1的洗脱液常压等度恒速洗脱，根据薄层板检测，展开剂为二氯甲烷∶甲醇＝20∶1，香草醛-浓硫酸乙醇溶液显色，收集纯的组分得到熊果酸-28-木糖-(1-3)-葡萄糖苷(化合物5)。将第二部分(二氯甲烷∶甲醇为10∶1)浸膏用硅胶H拌样，上硅胶H层析柱，以二氯甲烷∶甲醇＝20∶1的洗脱液常压等度恒速洗脱，根据薄层板检测，展开剂为二氯甲烷∶甲醇＝10∶1，紫外灯254nm荧光显色，依次收集纯的组分并分别用丙酮重结晶，得到乔松素-7-葡萄糖苷(化合物6)，乔松素-7-新橙皮糖苷(化合物7)。将第三部分(二氯甲烷∶甲醇为5∶1)浸膏用硅胶H拌样，上硅胶H层析柱，以二氯甲烷∶甲醇＝8∶1的洗脱液常压等度恒速洗脱，根据薄层板检测，展开剂为二氯甲烷∶甲醇＝6∶1，紫外灯254nm荧光显色，收集纯的组分，得到槲皮素-3-鼠李糖苷(化合物8)。将第四部分(二氯甲烷∶甲醇为2∶1)浸膏用硅胶H拌样，上硅胶H层析柱，以二氯甲烷∶甲醇＝5∶1的洗脱液常压等度恒速洗脱，根据薄层板检测，展开剂为二氯甲烷∶甲醇＝3∶1，紫外灯254nm荧光显色，收集纯的组分，得到东莨菪苷(化合物9)。将第五部分(二氯甲烷∶甲醇为1∶1)浸膏用硅胶H拌样，上硅胶H层析柱，以二氯甲烷∶甲醇＝4∶1的洗脱液常压等度恒速洗脱，根据薄层板检测，展开剂为二氯甲烷∶甲醇＝3∶1，紫外灯254nm荧光显色，收集纯的组分，得到没食子酰葡萄糖苷(化合物10)。
经药理、药效实验，本发明扯根菜提取物或上述化合物能够明显降低小鼠急性肝损伤、酒精肝、病毒性肝炎及大鼠慢性肝纤维化等引起的AST、ALT和ALP的升高，对HepG2肿瘤细胞有显著抑制作用，并且可以降低血清中的胆固醇及甘油三酯含量，因此可用于制备防治肝炎、肝损伤、肝纤维化、肝硬化、酒精肝、肝癌和高血脂相关的疾病的药物。
本发明扯根菜提取物或化合物制备方法简单，成本低廉，本发明为防治肝炎、肝损伤、肝纤维化，肝硬化、酒精肝、肝癌和高血脂相关的疾病的提供了一种新的药物来源。
具体实施方式：
现结合实施例对本发明作详细描述。
实施例1.制备扯根菜化合物
本实验所用的扯根菜采集于四川成都。
1.制备扯根菜提取物
(1)扯根菜干燥全草50kg，切碎后用水按常规渗漉提取，提取液减压浓缩至无醇味的浸膏16kg。然后用水混悬后通过D101大孔树脂柱，依次用水、50％乙醇水溶液和95％乙醇水溶液洗脱，分别将洗脱液减压浓缩成浸膏，得到水洗脱部分浸膏3.5kg，50％乙醇水溶液洗脱部分浸膏10kg和95％乙醇水溶液洗脱部分浸膏2.5kg。其中50％乙醇水溶液洗脱部分浸膏为本发明的扯根菜提取物(下同)。
(2)扯根菜干燥全草50kg，切碎后用50％乙醇水溶液按常规渗漉提取，提取液减压浓缩至无醇味，得浸膏13.5kg。然后用水混悬后通过D101大孔树脂柱，依次用水、50％乙醇水溶液和95％乙醇水溶液洗脱，分别将洗脱液减压浓缩成浸膏，得到水洗脱部分浸膏1kg、50％乙醇水洗脱部分浸膏8.5kg和95％乙醇水洗脱部分浸膏4kg。
(3)扯根菜干燥根茎50kg，切碎后用70％乙醇水溶液按常规渗漉提取，提取液减压浓缩至无醇味的浸膏8.2kg。然后用水混悬后通过D101大孔树脂柱，依次用水、50％乙醇和95％乙醇洗脱，分别将洗脱液减压浓缩成浸膏，得到水洗脱部分浸膏0.5kg、50％乙醇水洗脱部分浸膏6kg和95％乙醇水洗脱部分浸膏1.7kg。
实施例2.制备化合物
取实施例1中(1)制备的95％乙醇水洗脱部分的浸膏3.5g，用硅胶H(60型，青岛海洋化工集团公司，下同)拌样，上硅胶H层析柱，以二氯甲烷∶甲醇为100∶1→50∶1→25∶1→10∶1→5∶1→2∶1→1∶1的溶剂系统进行梯度洗脱，每个极性的洗脱剂分别洗脱五个柱体积，根据薄层板(HSGF254，下同)检测，展开剂为二氯甲烷∶甲醇＝10∶1，紫外灯254nm荧光显色，根据洗脱液的不同，将收集的洗脱液分为四份，分别减压浓缩成浸膏。将第一部分(洗脱液为二氯甲烷∶甲醇＝100∶1→50∶1)浸膏800mg用硅胶H拌样，上硅胶H层析柱，以石油醚∶乙酸乙酯＝10∶1的洗脱液常压等度恒速洗脱，根据薄层板检测，展开剂为石油醚∶乙酸乙酯＝8∶1，香草醛-浓硫酸乙醇溶液显色，收集纯的组分，得到熊果酸24mg。将第二部分(二氯甲烷∶甲醇＝25∶1→10∶1洗脱液)浸膏1.8g用硅胶H拌样，上硅胶H层析柱，以二氯甲烷∶甲醇＝20∶1的洗脱液常压等度恒速洗脱，根据薄层板检测，展开剂为二氯甲烷∶甲醇＝10∶1，紫外灯254nm荧光显色，收集纯的组分并用丙酮重结晶，得到乔松素75mg。将第三部分(二氯甲烷∶甲醇为5∶1洗脱液)浸膏400mg用硅胶H拌样，上硅胶H层析柱，以二氯甲烷∶甲醇＝6∶1的洗脱液常压等度恒速洗脱，根据薄层板检测，展开剂为二氯甲烷∶甲醇＝5∶1，紫外灯254nm荧光显色，收集纯的组分，得到东莨菪内酯38mg。将第四部分(二氯甲烷∶甲醇为2∶1→1∶1洗脱液)浸膏500mg用硅胶H拌样，上硅胶H层析柱，以二氯甲烷∶甲醇＝3∶1的洗脱液常压等度恒速洗脱，根据薄层板检测，展开剂为二氯甲烷∶甲醇＝2∶1，紫外灯254nm荧光显色，收集纯的组分，得到没食子酸125mg。
将实施例1中(1)制备的50％乙醇水洗脱部分的浸膏6g用硅胶H拌样，上硅胶H层析柱，以二氯甲烷∶甲醇为50∶1→25∶1→10∶1→5∶1→2∶1→1∶1的溶剂系统进行梯度洗脱，每个极性的洗脱剂分别洗脱五个柱体积，根据薄层板检测，展开剂为二氯甲烷∶甲醇＝10∶1，紫外灯254nm荧光显色，根据洗脱液的不同，将收集的洗脱液分为五份，分别减压浓缩成浸膏。将第一部分(二氯甲烷∶甲醇为50∶1→25∶1洗脱液)浸膏500mg用硅胶H拌样，上硅胶H层析柱，以二氯甲烷∶甲醇＝30∶1常压等度恒速洗脱，根据薄层板检测，展开剂为二氯甲烷∶甲醇＝20∶1，香草醛-浓硫酸乙醇溶液显色，收集纯的组分，得到熊果酸-28-木糖-(1-3)-葡萄糖苷45mg。将第二部分(二氯甲烷∶甲醇为10∶1洗脱液)浸膏2g用硅胶H拌样，上硅胶H层析柱，以二氯甲烷∶甲醇＝20∶1常压等度恒速洗脱，根据薄层板检测，展开剂为二氯甲烷∶甲醇＝10∶1，紫外灯254nm荧光显色，依次收集纯的组分并分别用丙酮重结晶，得到乔松素-7-葡萄糖苷90mg，乔松素-7-新橙皮糖苷150mg。将第三部分(二氯甲烷∶甲醇为5∶1洗脱液)浸膏2.5g用硅胶H拌样，上硅胶H层析柱，以二氯甲烷∶甲醇＝8∶1常压等度恒速洗脱，根据薄层板检测，展开剂为二氯甲烷∶甲醇＝6∶1，紫外灯254nm荧光显色，收集纯的组分，得到槲皮素-3-鼠李糖苷268mg。将第四部分(二氯甲烷∶甲醇为2∶1洗脱液)浸膏500mg用硅胶H拌样，上硅胶H层析柱，以二氯甲烷∶甲醇＝5∶1常压等度恒速洗脱，根据薄层板检测，展开剂为二氯甲烷∶甲醇＝3∶1，紫外灯254nm荧光显色，收集纯的组分，得到东莨菪苷115mg。将第五部分(二氯甲烷∶甲醇为1∶1洗脱液)浸膏500mg用硅胶H拌样，上硅胶H层析柱，以二氯甲烷∶甲醇＝4∶1常压等度恒速洗脱，根据薄层板检测，展开剂为二氯甲烷∶甲醇＝3∶1，紫外灯254nm荧光显色，收集纯的组分，得到没食子酰葡萄糖苷252mg。
实施例3.制备化合物
将实施例1中(2)制备的95％乙醇水洗脱部分的浸膏3.5g用硅胶H拌样，上硅胶H层析柱，以二氯甲烷∶甲醇为100∶1→50∶1→25∶1→10∶1→5∶1→2∶1→1∶1的溶剂系统进行梯度洗脱，每个极性的洗脱剂分别洗脱五个柱体积，根据薄层板检测，展开剂为二氯甲烷∶甲醇＝10∶1，紫外灯254nm荧光显色，将收集的洗脱液分为四份并分别减压浓缩成浸膏。将第一部分(二氯甲烷∶甲醇为100∶1→50∶1洗脱液)浸膏800mg用硅胶H拌样，上硅胶H层析柱，以石油醚∶乙酸乙酯＝10∶1常压等度恒速洗脱，根据薄层板检测，展开剂为石油醚∶乙酸乙酯＝8∶1，香草醛-浓硫酸乙醇溶液显色，收集纯的组分，得到熊果酸30mg。将第二部分(二氯甲烷∶甲醇为25∶1→10∶1洗脱液)浸膏1.8g用硅胶H拌样，上硅胶H层析柱，以二氯甲烷∶甲醇＝20∶1常压等度恒速洗脱，根据薄层板检测，展开剂为二氯甲烷∶甲醇＝10∶1，紫外灯254nm荧光显色，收集纯的组分并用丙酮重结晶，得到乔松素88mg。将第三部分(二氯甲烷∶甲醇为5∶1洗脱液)浸膏400mg用硅胶H拌样，上硅胶H层析柱，以二氯甲烷∶甲醇＝6∶1常压等度恒速洗脱，根据薄层板检测，展开剂为二氯甲烷∶甲醇＝5∶1，紫外灯254nm荧光显色，收集纯的组分，得到东莨菪内酯45mg。将第四部分(二氯甲烷∶甲醇为2∶1→1∶1洗脱液)浸膏500mg用硅胶H拌样，上硅胶H层析柱，以二氯甲烷∶甲醇＝3∶1常压等度恒速洗脱，根据薄层板检测，展开剂为二氯甲烷∶甲醇＝2∶1，紫外灯254nm荧光显色，收集纯的组分，得到没食子酸103mg。
将实施例1中(2)制备的50％乙醇水洗脱部分的浸膏6g用硅胶H拌样，上硅胶H层析柱，以二氯甲烷∶甲醇为50∶1→25∶1→10∶1→5∶1→2∶1→1∶1的溶剂系统进行梯度洗脱，每个极性的洗脱剂分别洗脱五个柱体积，根据薄层板检测，展开剂为二氯甲烷∶甲醇(10∶1)，紫外灯254nm荧光显色，将收集的洗脱液分为五份，分别减压浓缩至浸膏。将第一部分(二氯甲烷∶甲醇为50∶1→25∶1洗脱液)浸膏500mg用硅胶H拌样，上硅胶H层析柱，以二氯甲烷∶甲醇＝30∶1常压等度恒速洗脱，根据薄层板检测，展开剂为二氯甲烷∶甲醇＝20∶1，香草醛-浓硫酸乙醇溶液显色，收集纯的组分，得到熊果酸-28-木糖-(1-3)-葡萄糖苷40mg。将第二部分(二氯甲烷∶甲醇为10∶1洗脱液)浸膏2g用硅胶H拌样，上硅胶H层析柱，以二氯甲烷∶甲醇＝20∶1常压等度恒速洗脱，根据薄层板检测，展开剂为二氯甲烷∶甲醇＝10∶1，紫外灯254nm荧光显色，依次收集纯的组分并分别用丙酮重结晶，得到乔松素-7-葡萄糖苷141mg，乔松素-7-新橙皮糖苷68mg。将第三部分(二氯甲烷∶甲醇为5∶1洗脱液)浸膏2.5g用硅胶H拌样，上硅胶H层析柱，以二氯甲烷∶甲醇＝8∶1常压等度恒速洗脱，根据薄层板检测，展开剂为二氯甲烷∶甲醇＝6∶1，紫外灯254nm荧光显色，收集纯的组分，得到槲皮素-3-鼠李糖苷145mg。将第四部分(二氯甲烷∶甲醇为2∶1洗脱液)浸膏500mg用硅胶H拌样，上硅胶H层析柱，以二氯甲烷∶甲醇＝5∶1常压等度恒速洗脱，根据薄层板检测，展开剂为二氯甲烷∶甲醇＝3∶1，紫外灯254nm荧光显色，收集纯的组分，得到东莨菪苷80mg。将第五部分(二氯甲烷∶甲醇为1∶1洗脱液)浸膏500mg用硅胶H拌样，上硅胶H层析柱，以二氯甲烷∶甲醇＝4∶1常压等度恒速洗脱，根据薄层板检测，展开剂为二氯甲烷∶甲醇＝3∶1，紫外灯254nm荧光显色，收集纯的组分，得到没食子酰葡萄糖苷124mg。
实施例4.制备化合物
将实施例1中(3)95％乙醇水洗脱部分的浸膏3.5g用硅胶H拌样，上硅胶H层析柱，以二氯甲烷∶甲醇为100∶1→50∶1→25∶1→10∶1→5∶1→2∶1→1∶1的溶剂系统进行梯度洗脱，每个极性的洗脱剂分别洗脱五个柱体积，根据薄层板检测，展开剂为二氯甲烷∶甲醇＝10∶1，紫外灯254nm荧光显色，将收集的洗脱液分为四份，分别减压浓缩至浸膏。将第一部分(二氯甲烷∶甲醇为100∶1→50∶1洗脱液)浸膏800mg用硅胶H拌样，上硅胶H层析柱，以石油醚∶乙酸乙酯＝10∶1常压等度恒速洗脱，根据薄层板检测，展开剂为石油醚∶乙酸乙酯＝8∶1，香草醛-浓硫酸乙醇溶液显色，收集纯的组分，得到熊果酸35mg。将第二部分(二氯甲烷∶甲醇为25∶1→10∶1洗脱液)浸膏1.8g用硅胶H拌样，上硅胶H层析柱，以二氯甲烷∶甲醇＝20∶1常压等度恒速洗脱，根据薄层板检测，展开剂为二氯甲烷∶甲醇＝10∶1，紫外灯254nm荧光显色，收集纯的组分并用丙酮重结晶，得到乔松素101mg。将第三部分(二氯甲烷∶甲醇为5∶1洗脱液)浸膏400mg用硅胶H拌样，上硅胶H层析柱，以二氯甲烷∶甲醇＝6∶1常压等度恒速洗脱，根据薄层板检测，展开剂为二氯甲烷∶甲醇＝5∶1，紫外灯254nm荧光显色，收集纯的组分，得到东莨菪内酯43mg。将第四部分(二氯甲烷∶甲醇为2∶1→1∶1洗脱液)浸膏500mg用硅胶H拌样，上硅胶H层析柱，以二氯甲烷∶甲醇＝3∶1常压等度恒速洗脱，根据薄层板检测，展开剂为二氯甲烷∶甲醇＝2∶1，紫外灯254nm荧光显色，收集纯的组分，得到没食子酸74mg。
将实施例1中(3)50％乙醇水洗脱部分的浸膏6g用硅胶H拌样，上硅胶H层析柱，以二氯甲烷∶甲醇为50∶1→25∶1→10∶1→5∶1→2∶1→1∶1的溶剂系统进行梯度洗脱，每个极性的洗脱剂分别洗脱五个柱体积，根据薄层板检测，展开剂为二氯甲烷∶甲醇＝10∶1，紫外灯254nm荧光显色，将收集的洗脱液分为五份，分别减压浓缩至浸膏。将第一部分(二氯甲烷∶甲醇为50∶1→25∶1洗脱液)浸膏500mg用硅胶H拌样，上硅胶H层析柱，以二氯甲烷∶甲醇＝30∶1常压等度恒速洗脱，根据薄层板检测，展开剂为二氯甲烷∶甲醇＝20∶1，香草醛-浓硫酸乙醇溶液显色，收集纯的组分，得到熊果酸-28-木糖-(1-3)-葡萄糖苷53mg。将第二部分(二氯甲烷∶甲醇为10∶1洗脱液)浸膏2g用硅胶H拌样，上硅胶H层析柱，以二氯甲烷∶甲醇＝20∶1常压等度恒速洗脱，根据薄层板检测，展开剂为二氯甲烷∶甲醇＝10∶1，紫外灯254nm荧光显色，依次收集纯的组分并分别用丙酮重结晶，得到乔松素-7-葡萄糖苷258mg，乔松素-7-新橙皮糖苷60mg。将第三部分(二氯甲烷∶甲醇为5∶1洗脱液)浸膏2.5g用硅胶H拌样，上硅胶H层析柱，以二氯甲烷∶甲醇＝8∶1常压等度恒速洗脱，根据薄层板检测，展开剂为二氯甲烷∶甲醇＝6∶1，紫外灯254nm荧光显色，收集纯的组分，得到槲皮素-3-鼠李糖苷157mg。将第四部分(二氯甲烷∶甲醇为2∶1洗脱液)浸膏500mg用硅胶H拌样，上硅胶H层析柱，以二氯甲烷∶甲醇＝5∶1常压等度恒速洗脱，根据薄层板检测，展开剂为二氯甲烷∶甲醇＝3∶1，紫外灯254nm荧光显色，收集纯的组分，得到东莨菪苷65mg。将第五部分(二氯甲烷∶甲醇为1∶1洗脱液)浸膏500mg用硅胶H拌样，上硅胶H层析柱，以二氯甲烷∶甲醇＝4∶1常压等度恒速洗脱，根据薄层板检测，展开剂为二氯甲烷∶甲醇＝3∶1，紫外灯254nm荧光显色，收集纯的组分，得到没食子酰葡萄糖苷120mg。
本发明扯根菜提取物成分分析：经反复硅胶柱层析，获得5个量大的化合物，这5个化合物的结构式分别如下：
即乔松素-7-葡萄糖苷(6)，乔松素-7-新橙皮糖苷(7)、槲皮素-3-鼠李糖苷(8)、东莨菪苷(9)、没食子酰葡萄糖苷(10)。
HPLC含量检测：
色谱柱：Agilent-ODS(5μm，4.6×250mm)；流速：1.0ml/min；检测波长：254nm，柱温：30℃；色谱分析时间：60min。
流动相条件：乙腈-水(含0.1％的冰醋酸)
| 时间min | 0 | 10 | 20 | 40 | 60 |
| 乙腈含量％ | 5 | 5 | 20 | 50 | 65 |
经HPLC定量测定，在实施例1中(1)、(2)、(3)所制备的扯根菜提取物中，上述5个化合物的含量之和均占扯根菜提取物的50％以上，化合物乔松素-7-葡萄糖苷、乔松素-7-新橙皮糖苷、槲皮素-3-鼠李糖苷、东莨菪苷和没食子酰葡萄糖苷的含量比依次为(1)3∶5∶9∶4∶9；(2)7∶3∶7∶4∶6；(3)9∶2∶5∶2∶4。
因此，本发明扯根菜提取物的主要成分为乔松素-7-葡萄糖苷、乔松素-7-新橙皮糖苷、槲皮素-3-鼠李糖苷、东莨菪苷和没食子酰葡萄糖苷。
结构鉴定：
将实施例1中制备的10个化合物经过1H和13C-NMR谱和质谱分析，并与文献对照，分别确定为已知化合物熊果酸(详见邓世明，田庆等，时珍国医国药，2010，21：1919-1920)、乔松素(详见Tanaka M.et al.，Chem.Pharm.Bull.，1985，33：2602)、东莨菪内酯(详见赵莹，刘飞等，中药材，2010，33：555-556)、没食子酸(详见张丽娟，廖尚高等，时珍国医国药，2010，21：1946-1947)、熊果酸-28-木糖-(1-3)-葡萄糖苷(李钦，沈月毛等，林产化学与工业，2008，28：92-94)、乔松素-7-葡萄糖苷(详见冯浩，王智民等，中国中药杂志，2001，26：260-262)，乔松素-7-新橙皮糖苷(详见屠鹏飞，罗青等，中草药，2002，33：300-302)、槲皮素-3-鼠李糖苷(详见Markham K.R.et al.，Tetrahedron，1978，34：1389)、东莨菪苷(详见徐立，稽长久等，蚕叶科学，2008，34：593-596)、没食子酰葡萄糖苷(详见谭菁菁，赵庆春等，中草药，2010，41：1245-1248)。
药理、药效实验
一、对四氯化碳引起的小鼠急性肝损伤的保护作用
1、实验动物及方法：
实验动物由中国人民解放军第二军医大学动物中心提供(下同)；实验所用的扯根菜提取物和化合物由实施例1制备(下同)。
昆明种小鼠130只，体重：18～22g，分为13组，每组10只，分别为：空白对照组，模型对照组，阳性对照组(阳性对照药为联苯双酯)，扯根菜提取物组，化合物1(熊果酸)、化合物2(乔松素)、化合物3(东莨菪内酯)、化合物4(没食子酸)、化合物5(熊果酸-28-木糖-(1-3)-葡萄糖苷)、化合物6(乔松素-7-葡萄糖苷)、化合物7(乔松素-7-新橙皮糖苷)、化合物9(东莨菪苷)和化合物10(没食子酰葡萄糖)组。将药物配成溶液，溶剂为0.5％的西黄蓍胶水溶液，按小鼠体重灌胃给药，阳性对照组给药剂量为200mg/kg，扯根菜提取物组给药剂量为1000mg/kg，各化合物组给药剂量均为100mg/kg，灌胃体积按体重为0.2ml/10g，口服给药，每天一次，连续3天，。空白对照组和模型对照组灌胃等体积的蒸馏水。除空白对照组以外，其余各组在第3天给药后1h按体重腹腔注射0.1％四氯化碳10ml/kg，18小时后各组摘眼球采血，离心血清测定天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)和碱性磷酸酶(ALP)。
2、实验结果结果见表1。
表1本发明对四氯化碳引起肝损伤的保护作用血液生化指标
与模型对照组比较：**p＜0.01 ****p＜0.001
由表1可见，扯根菜提取物或各化合物连续给药3天，均能明显抑制四氯化碳引起的AST、ALT和ALP的升高，其作用接近或好于阳性药联苯双酯。
二、对乙醇诱导的酒精肝的防治作用
1、实验动物及方法：
小鼠130只，体重：18～22g，随机分成13组，每组10只，分组同上，即空白对照组、模型对照组、阳性对照组、扯根菜提取物组和化合物9个组。将药物分别配成溶液，溶剂为0.5％的西黄蓍胶水溶液。模型对照组按体重灌胃0.2ml/10g蒸馏水和0.25ml的50％乙醇，空白对照组灌胃等体积蒸馏水，阳性对照组按体重灌胃0.2ml/10g联苯双酯(200mg/kg)和0.25ml的50％乙醇，扯根菜提取物组按体重灌胃0.2ml/10g提取物(1000mg/kg)和0.25ml的50％乙醇，各化合物组分别按体重灌胃0.2ml/10g相应化合物(100mg/kg)和0.25ml的50％乙醇。每天一次，共十天。
2、观察指标：
末次给药后禁食16小时，称重，摘除眼球取血，分离血清，测定ALT，AST。
3、实验结果：结果见表2。
表2本发明对小鼠乙醇诱导的肝损伤血清转氨酶的影响
与正常组比较：*P＜0.01；与模型组比较：**P＜0.01
由表2可见，本发明扯根菜提取物或各化合物对乙醇诱导的小鼠酒精肝损伤均有明显治疗作用，可明显降低小鼠血清中ALT、AST，因此本发明扯根菜提取物或各化合物可用于制备防治酒精性肝病的药物。
三、对四氯化碳诱发的大鼠慢性肝纤维化的作用
1、实验动物及方法：
雄性Wister大鼠130只，体重180～230g，随机分为13组，每组10只，分组同上，即空白对照组、模型对照组、阳性对照组、扯根菜提取物组和化合物9个组。除空白对照组外，其余各组动物均每周皮下注射10％的CCl4(5ml/Kg)1次，共12周；将药物分别配成溶液，溶剂为0.5％的西黄蓍胶水溶液，从开始注射CCl4起，按体重灌胃给药，扯根菜提取物组剂量为750mg/kg，各化合物组剂量均为75mg/kg，阳性对照组(联苯双酯)剂量为150mg/Kg，每天一次，共12周。
2、观察指标
a.给药12周后，按ELSA试剂盒方法测定血清中天冬氨酸氨基转氨酶(AST)、丙氨酸氨基转氨酶(ALT)、血清总蛋白(TP)、微量白蛋白(ALB)的含量；
b.取肝组织，HE染色，作病理组织学检查，计算胶原容积积分(CVF)。
3、实验结果
结果见表3和表4。
表3.本发明提取物或化合物对CCl4所致大鼠慢性肝损伤后的肝功能影响
与模型对照组比较，**P＜0.01
表4.本发明提取物或化合物对CCl4所致大鼠慢性肝损伤后的胶原容积积分的影响
与模型对照组比较，**P＜0.01
由表3和表4可见，本发明扯根菜提取物或各化合物对CCl4所致的大鼠慢性肝纤维化有明显治疗作用。
四、对病毒性肝炎肝损伤的保护作用
本发明所选用的D-氨基半乳糖(D-GaIN)诱发的肝损伤，与病毒性肝炎的肝损伤相当一致，故可替代病毒性肝炎肝损伤模型(详见张明，动物医学进展，2010，31：121)。
1、实验材料与方法
昆明种小鼠130只，体重18～22g，雌雄各半，随机分成13组，每组10只。分组同上，给药剂量见表5。采用等容积不等浓度药液灌胃给药，每天1次，连续4天。第3天给药前1小时，按体重小鼠腹腔注8％D-GaIN 800mg/kg，注射后20h眼眶取血，分离血清，测定ALT和AST。
2、实验结果结果见表5。
表5本发明提取物或化合物对D-氨基半乳糖致小鼠急性肝损伤的影响
与模型对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01
由表5可见，本发明扯根菜提取物或各化合物能明显减轻D-氨基半乳糖所致小鼠急性肝损伤，其防治效果接近阳性对照药联苯双酯，故对病毒性肝炎肝损伤具有保护作用。
五、对小鼠病毒性肝炎、自身免疫性肝病免疫功能的影响
1、实验材料与方法
ConA是一种在人体内对肝细胞有特异性毒性作用的植物凝集素，是一种能在体外激活T细胞的丝裂原，其活化T淋巴细胞而致免疫性肝损伤是该动物模型的基本病理特点。该模型适合研究人类病毒性肝炎、自身免疫性肝病等的病理机制和进行抗肝损伤的药物筛选(详见张明，动物医学进展，2010，31：121)。
SPF级昆明种雌性小白鼠110只，体重：18～22g，分为11组，设空白对照组、扯根菜提取物组、9个化合物组(分组同上)。药物分别配成溶液，溶剂为0.5％的西黄蓍胶水溶液，灌胃给药，剂量见表6，空白对照组灌胃相同体积的蒸馏水，受试时间为30天。小鼠称重后处死，无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank′s液的小平皿中，制成单个细胞悬液。经200目筛网过滤，Hank′s液洗3次。将细胞悬浮于2ml的完全培养液中，用CASY DT细胞计数仪计数，调整脾细胞浓度为3×106个/ml。将细胞悬液加入24孔培养板中，每孔1ml，加75μlConA液(相当于7.5μg/ml)，置5％C02，37℃培养72h。培养结束前4h，每孔吸去上清0.7ml，加0.7ml无血清RPMI 1640培养液，同时加入MTT(5mg/ml)50μl/孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入1ml酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶溶解，加于96孔培养板中，作3个平行样，以570nm波长测定光密度值。
2、实验结果结果见表6。
表6.本发明扯根菜提取物或化合物对小鼠脾淋巴细胞转化反应的影响
与空白对照组比较，*P＜0.05
由表6可见，本发明扯根菜提取物组或各化合物组光密度差值均高于空白对照组，且有统计学意义(P＜0.05)。表明本发明扯根菜提取物或化合物对病毒性肝炎、自身免疫性肝病等导致的肝损伤有明显的防治作用。
六、对HepG2肿瘤细胞的体外抗肿瘤作用
1、实验材料与方法
MTT方法测定
原理：MTT(3-(4，5-dimethyl-2-thiazoyl)-2，5-diphenyl-tetrazolium bromide)【3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5.二苯四氮唑溴盐】，是一种能接受H+的黄色染料。在活细胞线粒体呼吸链中，琥珀酸脱氢酶和细胞色素C可使MTT的四氮唑环开裂，生成蓝紫色的formazan结晶。而死细胞中不含这种脱氢酶。formazan结晶的生成量与活细胞数成正比，该结晶的DMSO溶液在570nm处有最大吸收峰，所以，可通过检测formazan结晶的量来评价药物对细胞增殖的影响。
具体操作步骤如下：
(1)取对数生长期的人肝癌细胞株(HepG2)，将细胞密度用细胞培养液DMEM调至每毫升5×104个细胞，加到96孔细胞培养板中，每孔100μl。分组见表7，本发明扯根菜提取物组或9个化合物组各组均设定8个浓度梯度，分别为160、80、40、20、10、5、2.5、1.25μg/ml，每个浓度设6个平行样，同时设空白对照组，每孔加入细胞培养液DMEM100μl，于37℃、5％C02的恒温培养箱中培养12h。
(2)每孔加入浓度为5mg/ml的MTT液30μl，37℃通入5％C02的培养箱中继续培养4h。
(3)吸去上清液，每孔加入DMSO150μl，在微量振荡器上振荡15分钟，至结晶完全溶解后，酶标仪测定每孔570nm处的吸光值(OD值)。最后计算扯根菜提取物或化合物对细胞增殖的IC50。
2、实验结果
表7MTT实验受试样品对肿瘤细胞增殖的IC50
MTT实验表明，本发明扯根菜提取物或各化合物对肿瘤细胞的生长有显著抑制作用，因此具有防治肝癌的作用。
七、对高脂血症的防治作用
1、实验动物及方法：
Wister大鼠130只，体重180～230g，随机分成13组，每组10只，分组与造模方法如下：
①模型对照组：连续给予高脂饲料4周(高脂饲料配比如下：猪油10％，胆固醇2％，蔗糖10％，丙基硫氧嘧啶0.2％，猪胆盐0.5％，基础饲料77.3％。)；
②空白对照组：动物给予普通饲料4周；
③阳性对照组：连续给予高脂饲料4周；
④本发明扯根菜提取物组：连续给予高脂饲料4周；
⑤9个化合物(同上)组：各组连续给予高脂饲料4周。
造模成功后，①模型对照组：继续给予高脂饲料4周，②空白对照组：继续给予普通饲料4周，③阳性对照组：继续给予高脂饲料4周，同时给予立普妥(阿托伐他汀钙片，辉瑞制药有限公司)4周，剂量为5mg/kg，④扯根菜提取物组：继续给予高脂饲料4周，同时给予扯根菜提取物4周，剂量为750mg/kg，⑤9个化合物组：继续给予高脂饲料4周，同时分别给予化合物4周，剂量均为75mg/kg。给药后4周测定血清总胆固醇，甘油三酯含量。
统计处理：指标均以平均值±标准差表示，并以t检验进行比较。
3、实验结果结果见表8。
表8给药后4周各实验组动物血清中胆固醇、甘油三酯含量(mmol/L)
与模型对照组比较，**P＜0.01
由表8可见，造模4周后再给药4周，本发明扯根菜提取物或各化合物可明显降低血清中的胆固醇及甘油三酯含量，防治效果与阳性对照药立普妥基本一致。
综上所述，本发明提取物或化合物1～7、9、10能够明显降低小鼠急性肝损伤、酒精肝、病毒性肝炎及大鼠慢性肝纤维化等引起的AST、ALT和ALP的升高，对HepG2肿瘤细胞有显著抑制作用，并且可以降低血清中的胆固醇及甘油三酯含量，因此可用于制备防治肝炎、肝损伤、肝纤维化，肝硬化、酒精肝、肝癌和高血脂相关的疾病的药物。
Claims (2)
1.一种扯根菜提取物在制备防治肝炎、肝损伤、肝纤维化、肝硬化、酒精肝、肝癌或高血脂药物中的应用，所说扯根菜提取物的制备方法如下：
将扯根菜干燥全草切碎后，用水或不高于70％的乙醇水溶液按常规渗漉提取或浸泡提取，提取液减压浓缩至无醇味的浸膏，然后用水混悬后通过D101大孔树脂柱，依次用水、50％乙醇水溶液和95％乙醇水溶液洗脱，将收集的50％乙醇水溶液的洗脱液减压浓缩成浸膏，即为扯根菜提取物。
2.按权利要求1所述的扯根菜提取物在制备防治肝炎、肝损伤、肝纤维化、肝硬化、酒精肝、肝癌或高血脂药物中的应用，其特征在于扯根菜提取物所含化合物乔松素-7-葡萄糖苷，乔松素-7-新橙皮糖苷、槲皮素-3-鼠李糖苷、东莨菪苷和没食子酰葡萄糖苷的含量之和占扯根菜提取物的50％以上，它们的含量比依次为：1-9∶0.1-5∶1-9∶1-9∶1-9。
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