CN108478610A - 一种赶黄草提取物及其应用 - Google Patents

一种赶黄草提取物及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN108478610A
CN108478610A CN201810703931.6A CN201810703931A CN108478610A CN 108478610 A CN108478610 A CN 108478610A CN 201810703931 A CN201810703931 A CN 201810703931A CN 108478610 A CN108478610 A CN 108478610A
Authority
CN
China
Prior art keywords
penthorum chinense
chinense pursh
extract
ethanol water
hhdpp
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201810703931.6A
Other languages
English (en)
Inventor
蒋凯
王照磊
金卓
梁文星
陈鑫珉
丁滨
窦晓兵
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhejiang Chinese Medicine University ZCMU
Original Assignee
Zhejiang Chinese Medicine University ZCMU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhejiang Chinese Medicine University ZCMU filed Critical Zhejiang Chinese Medicine University ZCMU
Priority to CN201810703931.6A priority Critical patent/CN108478610A/zh
Publication of CN108478610A publication Critical patent/CN108478610A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/30—Extraction of the material
    • A61K2236/33—Extraction of the material involving extraction with hydrophilic solvents, e.g. lower alcohols, esters or ketones
    • A61K2236/333—Extraction of the material involving extraction with hydrophilic solvents, e.g. lower alcohols, esters or ketones using mixed solvents, e.g. 70% EtOH
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/30—Extraction of the material
    • A61K2236/35—Extraction with lipophilic solvents, e.g. Hexane or petrol ether
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/50—Methods involving additional extraction steps
    • A61K2236/51—Concentration or drying of the extract, e.g. Lyophilisation, freeze-drying or spray-drying
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/50—Methods involving additional extraction steps
    • A61K2236/55—Liquid-liquid separation; Phase separation
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)

Abstract

本发明公开了一种赶黄草提取物及其应用，所述赶黄草提取物按如下方法制备：赶黄草用体积浓度70％乙醇水溶液浸提、浓缩后用石油醚、乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯萃取物用体积浓度30％乙醇水溶液、体积浓度80％乙醇水溶液洗脱，收集体积浓度80％乙醇水溶液的洗脱液，减压浓缩至干，获得赶黄草提取物，其中s1、s2和s3质量含量分别为8.19±0.63％，24.86±2.02％和0.92±0.01％。通过体内外实验证明，该提取物不仅能够防治慢性酒精性肝病，预防或治疗肝脏氧化应激或脂质蓄积，还能够通过抑制肠道菌群的增殖来改善由于饮酒造成的肠道菌群紊乱。

Description

一种赶黄草提取物及其应用
(一)技术领域
本发明涉及一种赶黄草提取物及其应用。
(二)背景技术
赶黄草，学名扯根菜(Penthorum Chinese Pursh)，俗名水泽兰、水杨柳等，为虎耳草科(Saxifragaceae)扯根菜属(Penthorum)植物。作为传统苗药，赶黄草被苗疆人誉为“神仙草”，是苗族治疗肝病的常用方，食用赶黄草的水煎剂可避免摄入过量酒精引起的肝损伤，其嫩苗可食用。
近年来，通过不等剂量赶黄草对CCl4诱导的肝损伤大小鼠模型、酒精灌胃并饲喂含硫酸亚铁饲料诱导的酒精性脂肪肝大鼠模型、脂肪乳灌胃诱导的脂肪肝大鼠模型、胆管结扎诱导的大鼠梗阻性黄疸模型、α-萘异硫氰酸酯(ANIT)诱导的胆汁淤积大鼠模型、五粮春灌胃诱导的小鼠醉酒模型的干预，验证了赶黄草对肝损伤、酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪肝具有保护作用，有抗肝炎病毒和解酒作用，有利胆退黄之效。
以赶黄草为原料制备的中成药已被应用于临床，治疗包括乙肝引起的肝纤维化、长期饮酒引起的酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化等肝脏疾病。赶黄草中已鉴定的化学成分超过50种，可以大致分为黄酮类化合物、有机酸、甾体类化合物和挥发油，但还没有充足的研究阐明这些化合物与赶黄草药效的对应关系。
肠道菌群紊乱引起很多疾病，例如肠易激综合征、代谢综合征、抑郁症、癌症等。大量研究证明肠道菌群紊乱也是导致酒精性和非酒精性肝病、脂肪肝、肝纤维化乃至肝癌的重要原因之一。有研究发现赶黄草提取物具有抑菌活性，然而其中的具体活性成分并不清楚，关于其改善肠道菌群紊乱有关的研究更是史无前例。赶黄草虽作为一类保肝护肝药在临床使用，有关药物活性成分以及防病治病的理论研究却依然不足。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种赶黄草提取物及其应用，本发明方法制备的赶黄草提取物，具有抗氧化、防止脂质蓄积、调节肠道菌群、抑菌的活性。该方法制备的赶黄草可以被用于改善肠道微生态环境、防治肝脏脂质蓄积和慢性酒精性肝病。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种赶黄草提取物，所述赶黄草提取物按如下方法制备：(1)取赶黄草，加入体积浓度70％乙醇水溶液混合后冷凝回流浸提1-3小时，过滤，收集滤液和滤饼，滤液(优选多次浸提，合并多次浸提的滤液)减压浓缩至十分之一体积，获得浓缩物；所述体积浓度70％乙醇水溶液体积用量以赶黄草重量计为10-15ml/g；(2)取浓缩物用等体积石油醚萃取，取水层(即下层)加入乙酸乙酯萃取至乙酸乙酯层为无色透明，浓缩至干，获得乙酸乙酯萃取物；(3)取乙酸乙酯萃取物用体积浓度30％乙醇水溶液溶解后，加入体积浓度30％乙醇水溶液平衡的大孔树脂色谱柱中，分别用体积浓度30％乙醇水溶液和体积浓度80％乙醇水溶液洗脱，收集体积浓度80％乙醇水溶液的流出液，减压浓缩至干，获得赶黄草提取物。
进一步，所述赶黄草以赶黄草粉末形式加入，所述赶黄草粉末是将赶黄草自然风干，过80目筛，获得赶黄草粉末。
进一步，步骤(3)所述大孔树脂型号为HPD 500。
进一步，步骤(3)溶解乙酸乙酯萃取物所用体积浓度30％乙醇水溶液的体积用量以乙酸乙酯萃取物重量计为0.2～2.5ml/g，所述体积浓度30％乙醇水溶液、体积浓度80％乙醇水溶液和体积浓度95％乙醇水溶液分别洗脱1～10个柱体积(优选1个柱体积)。
本发明所述赶黄草提取物富含大环多酚乔松素苷类化合物(下文称HHDPP)，主要成分是：乔松素-7-O-[4”,6”-(S)-六羟基联苯二酰基]-β-D-葡萄糖苷(S1)、乔松素-7-O-[3”-O-没食子酰基-4”,6”-(S)-六羟基联苯二酰基]-β-D-葡萄糖苷(S2)，乔松素二氢查儿酮-7-O-[3”-O-没食子酰基-4”,6”-(S)-六羟基联苯二酰基]-β-D-葡萄糖苷(S3)，其中S1、S2和S3质量含量分别为8.19±0.63％，24.86±2.02％和0.92±0.01％。赶黄草提取物分离纯化S1、S2和S3的方法为：采用Dionex Ultimate 3000制备型HPLC，用Welch Ultimate XB-C18 10×250mm 10μm柱，由流动相由A:乙腈和B：含0.1％甲酸的蒸馏水在30分钟内流动相A的浓度由20％增至50％，将1mg/ml HHDPP(溶于20％乙腈和0.1％甲酸水溶液)中的S1，S2和S3分别在Rt＝17.5分钟、Rt＝20.5分钟和Rt＝22分钟洗脱出。根据Rt值收集洗脱物并经旋转蒸发仪干燥。
本发明提供一种所述赶黄草提取物在制备预防或治疗酒精性肝病药物中的应用。
本发明涉及一种所述赶黄草提取物在制备预防或治疗肝脏氧化应激或脂质蓄积药物中的应用。
本发明还提供一种所述赶黄草提取物在制备肠道菌群调节剂中的应用。
本发明涉及一种所述赶黄草提取物在制备抗菌剂中的应用，具体所述抗菌剂为大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，金黄色葡萄球菌，粪肠球菌，表皮葡萄球菌，嗜热链球菌，或鼠李糖乳杆菌。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：
本发明提供一种赶黄草提取物，富含大环多酚乔松素苷类化合物(下文称HHDPP)，主要成分是：乔松素-7-O-[4”,6”-(S)-六羟基联苯二酰基]-β-D-葡萄糖苷(S1)、乔松素-7-O-[3”-O-没食子酰基-4”,6”-(S)-六羟基联苯二酰基]-β-D-葡萄糖苷(S2)，乔松素二氢查儿酮-7-O-[3”-O-没食子酰基-4”,6”-(S)-六羟基联苯二酰基]-β-D-葡萄糖苷(S3)，其中s1、s2和s3质量含量分别为8.19±0.63％，24.86±2.02％和0.92±0.01％。通过体内外实验证明，该提取物不仅能够防治慢性酒精性肝病，预防或治疗肝脏氧化应激或脂质蓄积，还能够通过抑制肠道菌群的增殖来改善由于饮酒造成的肠道菌群紊乱。
(四)附图说明
图1：赶黄草HHDPP的HPLC分析。
图2：S1LC-MS分析图谱([M+H]+＝721)及其结构式。
图3：S2LC-MS分析图谱([M+H]+＝873)及其结构式(A)和S3LC-MS分析图谱(B)。
图4：本发明HHDPP及其中主要化合物S1和S2对慢性酒精性肝病小鼠血清中ALT含量的影响，PF-对照组，AF-模型组，HHDPP-L为HHDPP低剂量组，HHDPP-M为HHDPP中剂量组，HHDPP-H为HHDPP高剂量组，S1为S1化合物组，S2为S2化合物组。
图5：本发明HHDPP及其中主要化合物S1和S2对慢性酒精性肝病小鼠肝脏中TG含量的影响，PF为对照组，AF为模型组，HHDPP-L为HHDPP低剂量组，HHDPP-M为HHDPP中剂量组，HHDPP-H为HHDPP高剂量组，S1为S1化合物组，S2为S2化合物组。
图6：本发明HHDPP及其中主要化合物S1和S2对慢性酒精性肝病小鼠肝脏中TC含量的影响，PF为对照组，AF为模型组，HHDPP-L为HHDPP低剂量组，HHDPP-M为HHDPP中剂量组，HHDPP-H为HHDPP高剂量组，S1为S1化合物组，S2为S2化合物组。
图7：各实验组肝脏HE染色结果，a、正常对照组；b、慢性酒精性肝病模型组；c、HHDPP低剂量组；d、HHDPP中剂量组；e、S1治疗组；f、S2治疗组。
图8：不同浓度HHDPP对H2O2作用下NCTC1469细胞的LDH(乳酸脱氢酶)活性影响，UT为DMSO对照，H2O2为不添加HHDPP的对照。
图9：S1化合物，S2化合物，S3化合物对H2O2作用下NCTC1469细胞的LDH(乳酸脱氢酶)活性影响，UT为DMSO对照，H2O2为不添加HHDPP的对照。
图10：不同浓度HHDPP对OA作用的NCTC1469细胞的TG(甘油三酯)含量的影响，UT为DMSO对照，OA为不添加HHDPP的对照。
图11：HHDPP对粪便菌群体外增殖影响，A为LB培养基，B为MH培养基；注：黑色箭头表示加入不同浓度HHDPP溶液(□、×、△分别为10、2和0.4mg/ml，◇为无水乙醇对照)。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
本发明实施例中所用赶黄草按照按照《四川省中药饮片炮制规范》2015年版采集和制备，购自四川省中药饮片有限责任公司。
实施例1赶黄草提取物的制备
将赶黄草自然风干，用打粉机将赶黄草茎打成粉末并过80目筛备用。取赶黄草茎粉末300g，加入3L体积浓度70％乙醇水溶液混合后装入圆底烧瓶，连接冷凝管，使用市场上常见电热套进行加热，冷凝回流2小时，过滤，收集第一次滤液和第一次滤饼，第一次滤饼加入3L体积浓度70％乙醇水溶液再次冷凝回流2h，收集第二次滤液和第二次滤饼。合并第一次滤液和第二次滤液，使用旋转蒸发装置旋蒸浓缩至十分之一体积，加入等体积石油醚萃取，去除脂溶性部分后，向水层加入乙酸乙酯萃取，直至最后一次萃取的乙酸乙酯层为无色透明。将萃取后乙酸乙酯层溶液旋干，称重，获得赶黄草乙酸乙酯提取物8.45g。
取赶黄草乙酸乙酯提取物2g用5ml体积浓度30％乙醇水溶液溶解，加入体积浓度30％乙醇水溶液平衡的大孔树脂(HPD 500)色谱柱(3×150mm)中，依次用体积浓度30％乙醇水溶液、体积浓度80％乙醇水溶液和体积浓度95％乙醇水溶液的流出液各自洗脱1个柱体积，收集体积浓度30％乙醇水溶液的流出液、体积浓度80％乙醇水溶液的流出液和体积浓度95％乙醇水溶液的流出液。通过HPLC将三个流出液经C18柱色谱分析(图1)得出，大环多酚乔松素苷类化合物集中在80％乙醇的流出液中，减压浓缩至干，即为赶黄草提取物(下文简写：HHDPP)，各步提取效率见表1。
经LC/MASS鉴定，80％乙醇水溶液的流出液中主要成分为化合物S1，S2，S3，分子量分别为720、872和874。经与文献中有关化合物分子量及二级谱比对，发现三个化合物分别是：乔松素-7-O-[4”,6”-(S)-六羟基联苯二酰基]-β-D-葡萄糖苷(S1)，乔松素-7-O-[3”-O-没食子酰基-4”,6”-(S)-六羟基联苯二酰基]-β-D-葡萄糖苷(S2)，乔松素二氢查儿酮-7-O-[3”-O-没食子酰基-4”,6”-(S)-六羟基联苯二酰基]-β-D-葡萄糖苷(S3)。
表1赶黄草提取物制备流程及提取效率
HHDPP中的S1，S2和S3可以采用Dionex Ultimate 3000制备型HPLC，用WelchUltimate XB-C18 10×250mm 10μm柱，由流动相由A:乙腈和B：含0.1％甲酸的蒸馏水在30分钟内流动相A的浓度由20％增至50％，将1mg/mL HHDPP(溶于体积终浓度20％乙腈和体积终浓度0.1％甲酸水溶液的混合液)中的S1，S2和S3分别在Rt＝17.5分钟、Rt＝20.5分钟和Rt＝22分钟洗脱出。根据Rt值收集洗脱物并经旋转蒸发仪干燥。
实施例2体内实验证明HHDPP对慢性酒精性肝病有防治作用
1材料与方法
1.1实验药物
实施例1中制备的HHDPP。
1.2实验材料
8周C57BL/6雄性小鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司。Lieber-DeCarli酒精液体饲料(代码：TP 4030B)及其对照液体饲料(代码：TP4030BC)购自南通特洛菲饲料科技有限公司。ALD检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所有限公司，TG和TC检测试剂盒购自北京普利莱基金技术有限公司。
1.3小鼠慢性酒精性肝病模型的建立
分组：将8周龄C57BL/6雄性小鼠，随机分为对照组(PF)、模型组(AF)、HHDPP高剂量组(HHDPP-H)、HHDPP中剂量组(HHDPP-M)、HHDPP低剂量组(HHDPP-L)、S1化合物组(S1)、S2化合物组(S2)。
造模：各组分别饲喂Lieber-DeCarli液体饲料，第一周不含酒精饲料适应性饲喂3天，酒精浓度5.5％喂2天，11％喂2天，第二周酒精热量提高至22％，第三周酒精热量提高至27％，第四周酒精热量提高至32％，对照组用等热量的糖代替酒精，小鼠慢性酒精性肝病模型构建成功。
给药：造模第二周开始，HHDPP高剂量组、HHDPP中剂量组和HHDPP低剂量组分别按1、2、4mg/kg体重，每天给实验动物灌胃HHDPP的生理盐水悬浊液0.2mL一次。
S1化合物组(0.15mg/kg体重，生理盐水配制)和S2化合物组(0.5mg/kg体重，生理盐水配制)，每天每只灌胃0.2mL一次。对照组和模型组灌胃0.2ml生理盐水。
1.4实验内容
在给药三周后，测定各组小鼠血清中ALT(谷丙转氨酶)含量，各组小鼠肝脏中TG(甘油三酯)和TC(总胆固醇)的含量，对比观察经HE染色的小鼠肝脏切片。
2实验结果
2.1血清及肝脏指标
模型组小鼠血清中ALT显著增加，同时肝脏中TG和TC的含量也显著升高。与模型组相比，分别灌胃低、中剂量HHDPP提取液、S1和S2的治疗组小鼠ALT均有所降低(图4)，说明药物具有保肝护肝的活性，而且S1和S2各自的效果优于HHDPP。同时，通过HHDPP和S2的灌胃能够降低治疗组小鼠肝脏中TG(图5)、TC(图6)的浓度。各实验组动物肝脏经HE染色切片观察，对比后发现低、中剂量HHDPP、S1和S2组小鼠肝脏中的脂质蓄积减少(图7)。证明本发明HHDPP及其中主要化合物S1和S2可以改善慢性酒精性肝病小鼠肝脏中脂质蓄积。蓄积的脂肪可以被HE染成红色。
2.2肠道菌群改变
通过Miseq上机测序，对比研究给药三周后对照组(PF)、模型组(AF)、HHDPP中剂量组(HHDPP-M)、HHDPP低剂量组(HHDPP-L)、小鼠肠道菌群的结构变化。结果显示，HHDPP灌胃后部分由于饮酒造成的肠道菌群多样性的降低得以恢复。其中，拟杆菌科的细菌数量恢复，过度增殖的螺杆菌科和肠杆菌科细菌受到抑制。在属水平，紫单胞菌和Mucispirillum属的细菌显著被抑制，这两个属细菌的过度增殖可能与肠癌的形成，肠黏膜受损有关。
实施例3细胞水平验证本发明能够预防肝脏氧化应激和脂质蓄积
1材料与方法
1.1实验药物
实施例1中制备的HHDPP，用DMSO溶解配制成20mg/mL的HHDPP母液。S1、S2和S3分别用DMSO溶解配制成5mg/mL母液。DMSO(即UT)为对照。
1.2实验材料
NCTC1469细胞购自上海细胞所。DMEM高糖培养液、马血清和LDH检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所有限公司，TG检测试剂盒购自北京普利莱基金技术有限公司。
1.3实验内容
用含体积浓度10％马血清的DMEM高糖培养液培养NCTC1469细胞至细胞状态良好，按2.0×105cell/孔浓度接入24孔板中，37℃，5％CO2细胞培养箱中培养24h。
证明HHDPP预防肝脏氧化应激的研究中以H2O2处理的NCTC1469细胞为模型，分别验证不同浓度HHDPP、S1、S2、S3的DMSO溶液对氧化应激的预防保护作用。该研究中空白对照(UT)以等量的无菌蒸馏水和DMSO代替H2O2及药物处理细胞，模型对照(图8和9中H2O2)以DMSO代替药物处理细胞。HHDPP的药物浓度分别为12.5、25、50、100μg/mL(图8)。S1的药物浓度分别2.5、5、10、20μg/mL，S2的药物浓度分别为7.5、15、30、60μg/mL，S3的药物浓度分别为1.25、2.5、5、10μg/mL(图9)。加药后2h向除UT以外的实验孔加入终浓度0.5mMH2O2，继续培养14-16h，使用试剂盒测定培养液中LDH(乳酸脱氢酶)活性，根据细胞培养液中乳酸脱氢酶浓度的变化评价药物的抗氧化活性。
证明HHDPP预防肝脏脂质蓄积的研究中以OA(棕榈酸)处理的NCTC1469细胞为模型，分别验证不同浓度HHDPP(18.25、37.5、50、75、150μg/mL)的DMSO溶液对细胞脂质蓄积的预防作用(图10)。该研究中空白对照(UT)以等量的无菌蒸馏水和DMSO代替OA及药物处理细胞，模型对照(图10中OA)以DMSO代替药物处理细胞。加入药物2h后向除UT以外的实验孔加入0.5mM OA(油酸)，继续培养14-16h。收集细胞测定胞内TG(甘油三酯)含量。以细胞内TG含量的变化评价药物的预防脂质蓄积活性。2.实验结果
25-100μg/mL的HHDPP能够保护NCTC1469细胞免受H2O2的氧化杀伤，其中50μg/mL的药物浓度抗氧化活性最强(图8)。本发明中重要成分均有抗氧化活性，其中2.5-10μg/mLS1，15-60μg/mL S2和2.5-10μg/mL S3能够保护NCTC1469细胞免受H2O2的氧化杀伤(图9)，表现在上述处理能够降低由于加入H2O2造成的细胞LDH浓度升高。另外，细胞实验也证明18.25-150μg/mL的HHDPP能够抑制油酸造成的NCTC1469细胞内甘油三酯蓄积，其中50-75μg/mL浓度防治效果最强(图10)。
实施例4药敏实验证明HHDPP广谱抗菌活性以及对临床MRSA金黄色葡萄球菌增殖的抑制活性
1材料与方法
1.1实验药物
实施例1中制备的HHDPP，用70％乙醇水溶液溶解配制10mg/mL的HHDPP溶液。
1.2实验材料
临床分离的MRSA金黄色葡萄球菌由宁波第二人民医院提供。其它标准菌株金黄色葡萄球菌ATCC29223，鼠李糖乳杆菌ATCC53103，大肠杆菌ATCC35218，粪肠球菌ATCC292120购自美国典型培养物保藏中心。枯草芽孢杆菌CMCC1.1470购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。MRH培养基购自海博生物技术有限公司(青岛)。
1.3实验内容
将金黄色葡萄球菌ATCC29223、大肠杆菌ATCC35218、粪肠球菌ATCC292120、枯草芽孢杆菌CMCC1.1470接入灭菌后的LB琼脂培养基，鼠李糖乳杆菌ATCC53103接种MRH培养基，分别倾注于无菌平皿中，待培养基冷却后形成厚度约为4mm的平板。将直径6mm的无菌滤纸片浸泡在浓度为5mg/ml的HHDPP溶液中。取滤纸片，在超净台中风干后紧贴于同一平板上，每个菌种做三个重复，静止10min后倒置于恒温培养箱中37℃培养约24h后。使用十字交叉法测量抑菌圈直径，并记录数据。以70％乙醇为阴性对照。
2.实验结果
70％乙醇未见抑菌圈，而HHDPP贴片周围可见明显抑菌圈，直径约在8.1-11.2mm之间。测量到的抑菌圈直径详见表2。
表2：HHDPP抑菌圈直径(mm)
实施例5粪便菌群体外培养实验证明HHDPP广谱抗菌活性
1材料与方法
1.1实验药物
实施例1中制备的HHDPP，用无水乙醇溶解分别配制浓度为8、40和200mg/mL的HHDPP溶液。
1.2实验材料
实施例2中收集的模型组小鼠粪便。LB培养基和MRH培养基购自海博生物技术有限公司(青岛)。
1.3实验内容
将实施例2中收集的实施例2中模型组小鼠粪便分别以终浓度10μg/ml分别接入LB培养基和MRH培养基，装入厌氧管中，留有2cm空间，盖紧塞子。放入37℃摇床中培养，模拟肠道缺氧环境。培养3小时后取样监测OD值，加入1/20体积HHDPP溶液使HHDPP终浓度分别为0.4、2、10mg/ml，充分混匀培养半小时监测OD值。之后在6.5小时，8.5小时分别监测各个培养物的OD值。以加入无水乙醇的粪便培养物为阴性对照。
2.实验结果
见图11，加入不同终浓度的HHDPP后，LB培养物的OD值降幅较大，而MRH的培养物似乎没有受到很大的影响，然而6小时后再观察，与加入无水乙醇对照的培养物相比，加入HHDPP的培养物均未有明显增殖，且含HHDPP终浓度为10mg/ml的培养物OD降至0。说明HHDPP溶液在低浓度(0.4-2mg/ml)下能够抑制粪便中细菌的增殖，高浓度时能够杀死粪便中的细菌。

Claims (10)

1.一种赶黄草提取物，其特征在于所述赶黄草提取物按如下方法制备：(1)取赶黄草，加入体积浓度70％乙醇水溶液混合后冷凝回流浸提1-3小时，过滤，收集滤液和滤饼，滤液减压浓缩至十分之一体积，获得浓缩物；(2)取浓缩物用等体积石油醚萃取，取水层加入乙酸乙酯萃取至乙酸乙酯层为无色透明，浓缩至干，获得乙酸乙酯萃取物；(3)取乙酸乙酯萃取物用体积浓度30％乙醇水溶液溶解后，加入体积浓度30％乙醇水溶液平衡的大孔树脂色谱柱中，分别用体积浓度30％乙醇水溶液和体积浓度80％乙醇水溶液洗脱，收集体积浓度80％乙醇水溶液的流出液，减压浓缩至干，即为赶黄草提取物。
2.如权利要求1所述赶黄草提取物，其特征在于所述赶黄草以赶黄草粉末形式加入，所述赶黄草粉末是将赶黄草自然风干，过80目筛，获得赶黄草粉末。
3.如权利要求1所述赶黄草提取物，其特征在于步骤(1)所述体积浓度70％乙醇水溶液体积用量以赶黄草重量计为10-15ml/g。
4.如权利要求1所述赶黄草提取物，其特征在于步骤(3)所述大孔树脂的型号为HPD500。
5.如权利要求1所述赶黄草提取物，其特征在于步骤(3)溶解乙酸乙酯萃取物所用体积浓度30％乙醇水溶液的体积用量以乙酸乙酯萃取物重量计为0.2～2.5ml/g，所述体积浓度30％乙醇水溶液和体积浓度80％乙醇水溶液分别洗脱1～10个柱体积。
6.一种权利要求1所述赶黄草提取物在制备预防或治疗酒精性肝病药物中的应用。
7.一种权利要求1所述赶黄草提取物在制备预防或治疗肝脏氧化应激或脂质蓄积药物中的应用。
8.一种权利要求1所述赶黄草提取物在制备肠道菌群调节剂中的应用。
9.一种权利要求1所述赶黄草提取物在制备抗菌剂中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于所述抗菌剂为大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，金黄色葡萄球菌，粪肠球菌，表皮葡萄球菌，嗜热链球菌或鼠李糖乳杆菌。
CN201810703931.6A 2018-06-30 2018-06-30 一种赶黄草提取物及其应用 Pending CN108478610A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810703931.6A CN108478610A (zh) 2018-06-30 2018-06-30 一种赶黄草提取物及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810703931.6A CN108478610A (zh) 2018-06-30 2018-06-30 一种赶黄草提取物及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108478610A true CN108478610A (zh) 2018-09-04

Family

ID=63343237

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810703931.6A Pending CN108478610A (zh) 2018-06-30 2018-06-30 一种赶黄草提取物及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108478610A (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113057972A (zh) * 2020-04-15 2021-07-02 扬州大学 赶黄草有效部位及其制备方法和应用
CN114848691A (zh) * 2022-04-28 2022-08-05 四川大学 赶黄草乙酸乙酯提取物在制备防治糖尿病的药物中的用途
CN116474009A (zh) * 2023-03-29 2023-07-25 天津中医药大学 赶黄草提取物及其活性单体化合物在制备抗癌药物中的应用以及制备方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101829165A (zh) * 2010-05-07 2010-09-15 张蕊 赶黄草用于酒精性肝病茶剂的制备方法
CN102093459A (zh) * 2011-01-10 2011-06-15 中国人民解放军第二军医大学 一种扯根菜提取物及其制备方法和用途
CN103641871A (zh) * 2013-11-26 2014-03-19 中国人民解放军第二军医大学 大环多酚化合物及其制备与在制药中的应用
KR101534616B1 (ko) * 2013-11-22 2015-07-09 충남대학교산학협력단 낙지다리 추출물을 유효성분으로 포함하는 항인플루엔자용 조성물
CN105125601A (zh) * 2015-10-13 2015-12-09 四川古蔺肝苏药业有限公司 一种赶黄草的提取物及其制备方法和用途
CN105193833A (zh) * 2015-10-13 2015-12-30 四川古蔺肝苏药业有限公司 赶黄草单体在制备肝保护药物中的用途

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101829165A (zh) * 2010-05-07 2010-09-15 张蕊 赶黄草用于酒精性肝病茶剂的制备方法
CN102093459A (zh) * 2011-01-10 2011-06-15 中国人民解放军第二军医大学 一种扯根菜提取物及其制备方法和用途
KR101534616B1 (ko) * 2013-11-22 2015-07-09 충남대학교산학협력단 낙지다리 추출물을 유효성분으로 포함하는 항인플루엔자용 조성물
CN103641871A (zh) * 2013-11-26 2014-03-19 中国人民解放军第二军医大学 大环多酚化合物及其制备与在制药中的应用
CN105125601A (zh) * 2015-10-13 2015-12-09 四川古蔺肝苏药业有限公司 一种赶黄草的提取物及其制备方法和用途
CN105193833A (zh) * 2015-10-13 2015-12-30 四川古蔺肝苏药业有限公司 赶黄草单体在制备肝保护药物中的用途

Non-Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CANESSO, M.C.C，等: "Comparing the effects of acute alcohol consumption in germ-free and conventional mice: The role of the gut microbiota", 《BMC MICROBIOL》 *
ECE A. MUTLU，等: "Colonic microbiome is altered in alcoholism", 《AM J PHYSIOL GASTROINTEST LIVER PHYSIOL》 *
GENTA KAKIYAMA，等: "Colonic inflammation and secondary bile acids in alcoholic cirrhosis", 《AM J PHYSIOL GASTROINTEST LIVER PHYSIOL》 *
QUN LU，等: "Isolation and Identification of Compounds from Penthorum chinense Pursh with Antioxidant and Antihepatocarcinoma Properties", 《AGRICULTURAL AND FOOD CHEMISTRY》 *
刘新文，等: "《临床普通外科诊疗指南》", 31 July 2015, 西安交通大学出版社 *
唐勇，等: "赶黄草乙醇提取物对大鼠酒精性脂肪肝的作用", 《中成药》 *
孙宝林，等: "《人体微生物与健康》", 30 June 2017, 中国科学技术大学出版社 *
张潇，等: "赶黄草黄酮类化学成分研究", 《中草药》 *
樊代明: "《整合医学 理论与实践2》", 31 May 2017, 世界图书出版社 *
陈德淑，等: "445种中草药的抑菌试验报告", 《贵阳中医学院学报》 *
雷娇，等: "赶黄草不同溶剂提取物抑菌活性的初步探讨", 《亚太传统医药》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113057972A (zh) * 2020-04-15 2021-07-02 扬州大学 赶黄草有效部位及其制备方法和应用
CN113057972B (zh) * 2020-04-15 2022-06-03 扬州大学 赶黄草有效部位及其制备方法和应用
CN114848691A (zh) * 2022-04-28 2022-08-05 四川大学 赶黄草乙酸乙酯提取物在制备防治糖尿病的药物中的用途
CN116474009A (zh) * 2023-03-29 2023-07-25 天津中医药大学 赶黄草提取物及其活性单体化合物在制备抗癌药物中的应用以及制备方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Feng et al. Bear bile: dilemma of traditional medicinal use and animal protection
Zhang et al. Extraction of bio-active components from Rhodiola sachalinensis under ultrahigh hydrostatic pressure
Han et al. Antibacterial and anti-inflammatory activity of traditional Chinese herb pairs, Angelica sinensis and Sophora flavescens
CN101411745B (zh) 一种抗菌丹参酮提取物、其制备方法、用途及其产品
Pan et al. Regulatory effect of Grifola frondosa extract rich in polysaccharides and organic acids on glycolipid metabolism and gut microbiota in rats
CN101185692B (zh) 一种胆木提取物及其制剂与用途
CN108478610A (zh) 一种赶黄草提取物及其应用
CN102138966A (zh) 藏茵陈提取物及其制备方法、药物组合物和用途
CN103130865A (zh) 苦参碱、氧化苦参碱甘草次酸复盐及其制备方法、用途
CN103655929B (zh) 一种具有护肝作用药物组合物及其制备方法
CN102988529B (zh) 樱桃核中总酚酸的制备方法及新用途
Guo et al. Chemical composition, biological activities, and quality standards of hawthorn leaves used in traditional Chinese medicine: a comprehensive review
Kalko et al. A screening study of hepatoprotective activity of liquid extract from common tansy Tanacetum vulgare L. herb in the setting of subchronic hepatitis in rats
CN105287709A (zh) 一种具有降尿酸作用的山核桃叶提取物总黄酮及其制备方法及用途
CN104306492A (zh) 一种有抗菌及增效抗菌活性的药物及其制备方法与应用
TWI438001B (zh) 用於治療糖尿病之植物萃取物及其製備方法
CN105311085A (zh) 忍冬藤或其基源植物忍冬的叶或花提取物及其制备方法和应用
CN112022892B (zh) 蓟属植物的有机提取物的应用
CN113116867B (zh) 一种预防和/或治疗流感的组合物
CN101209271B (zh) 一种抗幽门螺杆菌的药物组合物
Vermaak et al. The effect of simulated gastrointestinal conditions on the antimicrobial activity and chemical composition of indigenous South African plant extracts
CN103432214B (zh) 头花蓼有效组分的制备方法与用途
WO2013138964A1 (zh) 异瑞香新素化合物在制备抗糖尿病药物中的应用
CN103110890B (zh) 协日嘎四味有效部位及其制备方法、质量检测方法和应用
CN102058640A (zh) 一种具有抗菌活性的当归地上部分有效部位及其制备方法和其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20180904

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication