CN105125601A - 一种赶黄草的提取物及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种赶黄草提取物，其HPLC指纹图谱的特征如下：包含4个特征峰，其中，1号峰的保留时间为10.4±0.25min，峰面积为1682000±8000；2号峰的保留时间为12.5±0.25min，峰面积为36750±700；3号峰的保留时间为13.0±0.25min，峰面积为2461000±3000；4号峰的保留时间为14.9±0.25min，峰面积为1831000±5000。本发明赶黄草提取对肝缺血再灌注肝损伤及化学性肝损伤的疗效优良，临床应用前景良好。
Description
技术领域
本发明涉及一种赶黄草提取及其制备方法和用途。
背景技术
常见的肝损伤包括缺血再灌注肝损伤和化学性肝损伤。其中缺血再灌注损伤(ischemiareperfusioninjury,IRI)是外科临床最常见的问题之一。各种原因造成组织器官血液灌流量减少时发生缺血性损伤，而恢复血液灌流后，细胞功能代谢及结构破坏反而加重，出现缺血再灌注损伤。在肝移植技术日趋成熟的今天，移植肝经受缺血损伤后，随着血液的开放，又会经历再灌注损伤二次打击，这一过程在临床上因损伤程度不同可有多种表现(从无症状、轻度肝功能异常到肝功能衰竭等)，但愈来愈多的研究显示，缺血再灌注损伤是导致肝切除后肝功能衰竭和肝移植后移植物早期非免疫性失活的重要原因，同时还可以增加移植器官随后发生急性和慢性排斥反应的机会，引起晚期的免疫性失活(灯盏花素预适应对大鼠肢体缺血再灌注肝损伤的保护作用，实用医学杂志，2013，9(4)，543-545)。
化学性肝损伤是指由化学性肝毒物质所诱导的肝损伤，包括酒精、环境中的化学毒物及某些药物等。肝脏作为人体的重要解毒器官，具有肝动脉和肝静脉双重血液供应。化学性肝毒物质可通过胃肠道门静脉或体循环进入肝脏进行转化，因此肝脏容易受到化学性肝毒物质的损害，进一步可引起肝脏不同程度的肝细胞坏死、脂肪变形、肝硬化和肝癌(葡萄籽原花青素减轻小鼠急性化学性肝损伤，基础医学与临床，2012，32(10)，1198-1201)。CCl4诱导的化学性肝损伤动物模型被广泛用于化学性肝损伤保护药物和保健食品的研发(沙棘籽油对四氯化碳肝损伤的保护作用研究，中国预防医学杂志，2010，11(5)，513-516)。CCl4进入机体后，能被肝脏内的肝微粒体色素P450激活，产生三氯甲基自由基(·CC1，)和氯自由基(·C1)，这些自由基攻击肝细胞膜的多不饱和脂肪酸(polyunsaturatedfattyacid，PUFA)引发脂质过氧化，导致细胞膜通透性强，严重的则使肝细胞变性坏死，胞浆内转氨酶渗出(Mechanismofcarbontetrachlorideinducedhepatotoxicity,ZNaturforschC,2011,56(728):649-659；Biochemicalandcellularmechanismsoftoxicliverinjury,SeminLiverDis，2002；22(2)：137-13)。
随着肝缺血再灌注损伤机制的逐步明确，各种预防及治疗措施日益增多，但大部分都在实验阶段。1、缺血预处理(ischemicpreconditioning，IPC)：Murry等发现缺血预处理能够增加够心脏对缺血的耐受性以来，IPC的保护作用在很多器官中都得到了证实。2、减轻肝脏缺血再损伤的药物：如抗氧化剂、黏附分子拮抗剂、PAF拮抗剂、细胞因子活性抑制剂、蛋白酶抑制剂以及FK506、Cyclosporine等等(肝缺血再灌注损伤，医学临床研究，2005，22(3)，397-400)。而对于化学性肝损伤治疗主要包括：联苯双酯、辅酶A，肌酐等西药(糖肝康对CC1d肝损伤模型肝功能影响机制研究，中华全科医学，2012，10(12)，1829-1830；D-阿洛糖对急性化学性肝损伤小鼠的保护作用研究，中国医疗前沿，2013,8(24)，7-8)。
赶黄草(PenthorumchinensePursh)又名扯根菜、水泽兰、山珍珠等，据《天宝本草》、《救荒本草》等记载，赶黄草具有通络活血、祛瘀除湿、活血散瘀等作用。文献报道赶黄草具有防治肝炎、肝保护的药理活性，但至今尚未见赶黄草关于防治缺血再灌注肝损伤及化学性肝损伤活性成分的报道。另外，目前临床使用的赶黄草成方制剂“肝苏颗粒”系列产品，由于生产工艺仍为传统的水提醇沉，活性成分未能充分的富集，临床多用于肝病的辅助治疗，因此需要进一步的提高。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种新的保肝效果更佳的赶黄草提取物及其制备方法和用途。
本发明赶黄草提取物：其HPLC指纹图谱的特征如下：包含4个特征峰，其中，
1号峰的保留时间为10.4±0.25min，峰面积为1682000±8000；
2号峰的保留时间为12.5±0.25min，峰面积为36750±700；
3号峰的保留时间为13.0±0.25min，峰面积为2461000±3000；
4号峰的保留时间为14.9±0.25min，峰面积为1831000±5000。
HPLC指纹图谱的色谱条件如下：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶作填充剂；
检测波长：280nm；
流动相：A相为乙腈，B相为0.2％甲酸水溶液，按如下程序进行梯度洗脱：采用梯度洗脱，洗脱程序如下：从0分钟开始至20分钟，流动相A由35％变为65％，从20分钟开始至25分钟，流动相A由65％变为80％，从25分钟开始至35分钟，流动相A由80％变为35％。
优选地，所述提取物的HPLC指纹图谱如图2所示。
优选地，所述提取物采用如下方法制备：
(1)取赶黄草药材，粉碎，用30～95％乙醇提取，减压浓缩，得粗提取浸膏；
(2)往步骤(1)所得浸膏中加入1～2倍体积的水，过滤或者离心，所得滤液或者上清液通过HPD-400、D-101或AB-8大孔树脂柱，上样体积是柱体积的1/2-2/3，依次用水、10％乙醇、30％乙醇、50％乙醇和95％乙醇洗脱，洗脱液为柱体积的5-7倍，分别得到水、10％乙醇、20％乙醇、30％乙醇、50％乙醇和95％乙醇洗脱液，取95％乙醇洗脱液，浓缩，干燥，即得。
步骤(1)中，所述提取是热回流提取或者浸润提取。
优选地，所述热回流提取的方法如下：用30-95％的乙醇热回流提取两次，每次提取时间为2小时，每次加入的乙醇的量为原药材重量的8-15倍V/W，合并提取液。
优选地，所述浸润提取的方法如下：用原药材重量10-15倍体积(V/W)的40-60％乙醇浸润24小时后渗漉提取，收集20-25倍体积的渗漉液。
本发明赶黄草提取物的制备方法，它包括如下步骤：
(1)取赶黄草药材，粉碎，用30～95％乙醇提取，减压浓缩，得粗提取浸膏；
(2)往步骤(1)所得浸膏中加入1～2倍体积的水，过滤或者离心，所得滤液或者上清液通过HPD-400、D-101、AB-8大孔树脂柱，上样体积是柱体积的1/2-2/3，依次用水、10％乙醇、30％乙醇、50％乙醇和95％乙醇洗脱，洗脱液为柱体积的5-7倍，分别得到水、10％乙醇、20％乙醇、30％乙醇、50％乙醇和95％乙醇洗脱液，取95％乙醇洗脱液，浓缩，干燥，即得。
步骤(1)中，所述提取是热回流提取或者浸润提取。
优选地，所述热回流提取的方法如下：用30-95％的乙醇热回流提取两次，每次提取时间为2小时，每次加入的乙醇的量为原药材重量的8-15倍V/W，合并提取液。
优选地，所述浸润提取的方法如下：用原药材重量10-15倍体积(V/W)的40-60％乙醇浸润24小时后渗漉提取，收集20-25倍体积的渗漉液。
本发明还提供了前述赶黄草提取物在制备肝保护药物中的用途。
其中，所述药物是预防和/或治疗肝损伤的药物。
其中，所述药物是预防和/或治疗肝缺血再灌注肝损伤及化学性肝损伤的药物。
本发明还提供了一种保肝药物，它是前述赶黄草提取物为活性成分，加上药学上可接受的辅料或者辅助性载体制备而成的制剂。
优选地，所述剂型为经胃肠道给药剂型。
进一步优选地，所述经胃肠道给药剂型为颗粒剂、散剂、片剂、丸剂、胶囊剂、茶剂、酒剂或口服液
综上，本发明赶黄草大环多酚提取物具有保肝作用，能够预防和治疗肝损伤，对肝缺血再灌注损伤、急性肝损伤和慢性肝损伤有确切疗效，而且效果优于阳性药物肝苏颗粒，可以替代肝苏颗粒使用，具有良好的临床应用前景。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1本发明实施例1-5制备的赶黄草大环多酚提取物的HPLC图谱。S1：实施例1；S2：实施例2；S3：实施例3；S4：实施例4；S5：实施例5。
图2本发明赶黄草大环多酚提取物的指纹图谱。
图3赶黄草大环多酚提取物在大鼠缺血再灌注肝损伤保护中对ALB的升高作用纵坐标ALB表达量，单位(g/l)，*P<0.05与模型组相比。A:正常对照组；B：模型组；C:预处理给药组；D：术后给药组；E:预处理肝苏颗粒组；F:术后给药肝苏颗粒组。
图4赶黄草大环多酚提取物在大鼠缺血再灌注肝损伤保护中对ALT的降低作用纵坐标ALT表达量，单位(u/l)，*P<0.05与模型组相比。A:正常对照组；B：模型组；C:预处理给药组；D：术后给药组；E:预处理肝苏颗粒组；F:术后给药肝苏颗粒组。
图5赶黄草大环多酚提取物在大鼠缺血缺血再灌注肝损伤保护中对AST的降低作用纵坐标AST表达量，单位(u/l)，*P<0.05与模型组相比。A:正常对照组；B：模型组；C:预处理给药组；D：术后给药组；E:预处理肝苏颗粒组；F:术后给药肝苏颗粒组。
图6赶黄草大环多酚提取物在缺血再灌注肝损伤保护中HE染色结果。A:正常对照组；B：模型组；C：术后给药组；D：预处理给药组；E:预处理肝苏颗粒组；F:术后给药肝苏颗粒组。
图7赶黄草大环多酚提取物在大鼠缺血再灌注肝损伤保护中对MDA的降低作用纵坐标MDA含量，单位(nmol/mg·prot)，*P<0.05与模型组相比。A:正常对照组；B：模型组；C：术后给药组；D：预处理给药组；E:预处理肝苏颗粒组；F:术后给药肝苏颗粒组。
图8赶黄草大环多酚提取物在CCl4诱导的大鼠急性肝损伤保护保护中HE染色结果。A:正常对照组；B：模型组；C:甘草酸二铵组；D：提取物高剂量组；E：提取物低剂量组；F:肝苏颗粒组。
图9赶黄草大环多酚提取物在CCl4诱导的大鼠慢性肝损伤保护中对ALT的降低作用纵坐标ALT表达量，单位(IU/l)，△△P<0.01与正常组相比，*P<0.05与模型组相比A:正常对照组；B：模型组；C:秋水仙碱组；D：肝苏颗粒组E：提取物高剂量组；F：提取物中剂量组；G：提取物低剂量组。
图10赶黄草大环多酚提取物在CCl4诱导的大鼠慢性肝损伤保护中对SOD的升高作用纵坐标SOD含量，单位(U/mg·prot)，△△P<0.01与正常组相比，*P<0.05与模型组相比A:正常对照组；B：模型组；C:秋水仙碱组；D：肝苏颗粒组E：提取物高剂量组；F：提取物中剂量组；G：提取物低剂量组。
图11赶黄草大环多酚提取物在CCl4诱导的大鼠慢性肝损伤保护中HE染色结果。A:正常对照组；B：模型组；C:秋水仙碱组；D：肝苏颗粒组E：提取物高剂量组；F：提取物中剂量组；G：提取物低剂量组。
图12赶黄草大环多酚提取物在CCl4诱导的大鼠慢性肝损伤保护中Masson染色结果。A:正常对照组；B：模型组；C:秋水仙碱组；D：肝苏颗粒组E：提取物高剂量组；F：提取物中剂量组；G：提取物低剂量组。
图13赶黄草大环多酚提取物在CCl4诱导的大鼠慢性肝损伤保护中超微结构电镜观察结果。A:正常对照组；B：模型组；C:秋水仙碱组；D：肝苏颗粒组E：提取物高剂量组；F：提取物中剂量组；G：提取物低剂量组。
具体实施方式
实施例1制备本发明赶黄草大环多酚提取物
赶黄草药材粉碎，过二号筛，95％乙醇热回流提取两次，每次提取时间为2小时，每次加入原药材重量8倍体积的95％乙醇V/W，合并提取液，减压浓缩至无醇味得粗提物浸膏(相对密度为1.12～1.18)，得率为9.7％；
将上述赶黄草浸膏加2倍体积的水混悬后过滤，滤液通过HPD-400大孔树脂柱，上样体积是大孔树脂柱体积的2/3，依次用水、10％乙醇、30％乙醇、50％乙醇和95％乙醇洗脱，洗脱液为柱体积的7倍，分别得到水、10％乙醇、20％乙醇、30％乙醇、50％乙醇和95％乙醇洗脱液，合并95％乙醇洗脱液至无醇味，干燥后即为赶黄草大环多酚提取物，其中95％乙醇得率为0.9％。
实施例2制备本发明赶黄草大环多酚提取物
赶黄草药材粉碎，过二号筛，60％乙醇热回流提取两次，每次提取时间为2小时，每次加入原药材重量10倍体积的60％乙醇V/W，合并提取液，减压浓缩至无醇味得粗提物浸膏(相对密度为1.12～1.18)，得率为11.2％；
将上述赶黄草浸膏加2倍体积的水混悬后过滤，滤液通过HPD-400大孔树脂柱，上样体积是大孔树脂柱体积的2/3，依次用水、10％乙醇、30％乙醇、50％乙醇和95％乙醇洗脱，洗脱液为柱体积的7倍，分别得到水、10％乙醇、20％乙醇、30％乙醇、50％乙醇和95％乙醇洗脱液，合并95％乙醇洗脱液至无醇味，干燥后即为赶黄草大环多酚提取物，其中95％乙醇得率为1.2％。
实施例3制备本发明赶黄草大环多酚提取物
赶黄草粉碎，过二号筛，加30％乙醇热回流提取3次，每次提取时间为3小时，每次加原料重量15倍体积的水V/W，合并提取液，减压浓缩至无醇味得粗提物浸膏(相对密度为1.12～1.18)；得率为14.7％；
将上述赶黄草浸膏加1倍体积的水混悬后离心(5000r/min,20min)，上清液通过HPD-400大孔树脂柱，上样体积是大孔树脂柱体积的1/2，依次用水、10％乙醇、30％乙醇、50％乙醇和95％乙醇洗脱，洗脱液为柱体积的5倍，分别得到水、10％乙醇、20％乙醇、30％乙醇、50％乙醇和95％乙醇洗脱液，合并95％乙醇洗脱液至无醇味，干燥后即为赶黄草大环多酚提取物，其中95％乙醇得率为1.4％。
实施例4制备本发明赶黄草大环多酚提取物
赶黄草粉碎，过二号筛，加入原药材重量10倍体积(V/W)60％乙醇浸润24小时后渗漉提取，收集20倍体积的渗漉液，减压浓缩至无醇味得粗提物浸膏(相对密度为1.12～1.18)；得率为11.7％；
将上述赶黄草浸膏加1倍体积的水混悬后过滤，通过HPD-400大孔树脂柱，上样体积是大孔树脂柱体积的1/2，依次用水、10％乙醇、30％乙醇、50％乙醇和95％乙醇洗脱，洗脱液为柱体积的6倍，分别得到水、10％乙醇、20％乙醇、30％乙醇、50％乙醇和95％乙醇洗脱液，合并95％乙醇洗脱液至无醇味，干燥后即为赶黄草大环多酚提取物，其中95％乙醇得率为1.1％。
实施例5制备本发明赶黄草大环多酚提取物
赶黄草粉碎，过二号筛，加入原药材重量15倍体积(V/W)40％乙醇浸润24小时后渗漉提取，收集25倍体积的渗漉液，减压浓缩至无醇味得粗提物浸膏(相对密度为1.12～1.18)；得率为10.3％；
将上述赶黄草浸膏加1倍体积的水混悬后过滤，通过HPD-400大孔树脂柱，上样体积是大孔树脂柱体积的1/2，依次用水、10％乙醇、30％乙醇、50％乙醇和95％乙醇洗脱，洗脱液为柱体积的6倍，分别得到水、10％乙醇、20％乙醇、30％乙醇、50％乙醇和95％乙醇洗脱液，合并95％乙醇洗脱液至无醇味，干燥后即为赶黄草大环多酚提取物，其中95％乙醇得率为0.9％。
实施例6赶黄草大环多酚提取物HPLC分析
分别取实施例1-5制得的赶黄草大环多酚提取物5mg，加入60％甲醇溶解定容至10ml，采用HPLC液相分析，其液相条件如下：
色谱柱：AgilentZorbaxSB-C18(4.6×250mm，5μm)；流动相:采用梯度洗脱，A相为乙腈，B相为0.2％甲酸水溶液；流速：1ml/min；运行时间：35min(后10min为起始溶剂平衡时间)；检测波长：280nm；柱温：30℃；进样量：10μl；梯度洗脱程序见表1：
表1流动相梯度洗脱条件
洗脱程序为：从0分钟开始至20分钟，流动相A由35％变为65％，从20分钟开始至25分钟，流动相A由65％变为80％，从25分钟开始至35分钟，流动相A由80％变为35％。
实施例1-5制得的赶黄草大环多酚提取物的HPLC检测结果如图1所示，其中的主要成分1、2、3、4的峰面积如下表2所示，实验结果说明5种提取方法得到的赶黄草大环多酚提取物成分没有差异，图2所示的HPLC检测结果即为本发明赶黄草大环多酚提取物的指纹图谱。
表2大环多酚提取物各组分的保留时间及含量
经过研究发现，成分1-4均为多酚类化合物，因此，本发明提取物中多酚类化合物含量为50-67％，故称赶黄草大环多酚提取物。
以下用实验例的方式说明本发明的有益效果：
实验例1本发明赶黄草大环多酚提取物体内防治缺血再灌注肝损伤实验
1材料与方法
1.1试验药物
赶黄草大环多酚提取物(实施例1制备的本发明赶黄草大环多酚提取物)
肝苏颗粒(批号131127)，四川古蔺肝苏药业有限公司。
1.2实验材料
SD大鼠(上海斯莱克实验动物有限公司，动物合格证号：SYXK(沪)2013-0005；体重：250g左右；性别：雄性；每组6只)；MDA、T-SOD试剂盒
1.3大鼠肝脏缺血再灌注损伤模型的建立：
将大鼠用10％的水合氯醛进行麻醉，约一分钟后大鼠昏迷，将大鼠固定于操作台上，腹部喷洒75％酒精进行消毒，用剪刀小心剪开大鼠腹部表皮，再沿腹中线剪开内皮至胸腔，使肝脏完全暴露，创口约4cm，用两个用生理盐水浸润过的棉签小心翻开大鼠肝脏右叶，找到右叶下肝动脉，并用动脉夹夹住肝动脉至右叶分叉上方，使除去右叶之外的75％肝脏处于缺血状态，发现右叶依然呈鲜红色，其他缺血部分肝脏呈暗红色。用湿润的棉球覆盖于大鼠腹部，打开计时器，调整至45min。
45min后取出动脉夹，缝合大鼠并保持大鼠体温，记录时间，三小时后将大鼠再次麻醉，打开大鼠腹部，找到下腔静脉，用纱布擦干净周围组织，用剪刀剪断下腔静脉取血(取血前向离心管内加入约2ml肝素并摇晃瓶身，防止凝血)，取血完毕后用剪刀小心剪下大鼠肝脏，生理盐水冲洗后分成四部分，缺血与不缺血部分各剪成两块，一块放入-80℃冰箱用于各项指标的检测，另一块浸泡于4％多聚甲醛，用于蜡块包埋，以便于之后的免疫组化等试验。
1.4实验分组及给药剂量
将大鼠分为六组，每组6只，分别为：正常对照组、假手术组、预处理给药组，术后给药组，预处理肝苏颗粒组，术后给药肝苏颗粒组。
预处理及术后给药组给药浓度均为75mg/kg；给药方式为灌胃，每天灌胃一次。
1.5缺血再灌注各项指标的检测：
1.5.1肝功能检测
将取出的大鼠血液离心，取上层血清，进行肝功能的检测。
1.5.2HE染色
将多聚甲醛固定的大鼠肝脏组织进行蜡块包埋，制成组织切片进行HE染色。
1.5.3缺血再灌注各项指标(MDA)试剂盒检测。
2实验结果
2.1肝功能检测结果
随着肝损伤加重，ALB值应降低，AST和ALT值应升高，所以模型组与正常组相比，ALB值下降，AST与ALT值上升。预处理给药组和术后给药组能够使ALB值升高，AST和ALT值降低(*p<0.05)。各项检测指标的变化见表3、图3-5。
表3.大环多酚提取物对大鼠缺血再灌注肝损伤模型肝功能的影响
注：*p<0.05，**p<0.01vs模型组.
2.2HE染色结果
从HE染色结果来看，模型组织形态最不规则，组织损伤最严重，而预处理组与正常组组织形态最接近，说明其损伤程度较小。组织形态变化见图6。
2.3MDA检测结果
随着肝损伤加重，MDA表达量上升，所以模型组与正常组相比MDA表达量上升。预处理给药组和术后给药组能够使MDA表达量降低，且预处理组比术后给药组效果更好(**p<0.01,*p<0.05)。各项检测指标的变化见表4，图7。
表4.大环多酚提取物对大鼠缺血再灌注肝损伤MDA的影响
注：*p<0.05，**p<0.01vs模型组.
3.实验结论
从实验结果可以看出，与模型组相比，本发明赶黄草大环多酚提取物的预处理和术后给药物组的ALB值升高，AST和ALT值降低，肝损伤程度小，降低MDA表达量，说明本发明赶黄草大环多酚提取物能够预防和治疗肝缺血再灌注损伤。
同时，与阳性药物肝苏颗粒相比，采用本发明提取物，在给药量大幅度降低的情况下，治疗效果反而更优，可以替代肝苏颗粒使用，具有良好的临床应用前景。
实验结果说明，本发明赶黄草大环多酚提取物可以治疗和预防肝缺血再灌注损伤，疗效优良。
实验例2赶黄草大环多酚提取物体内防治CCl4诱导急性肝损伤实验
1材料与方法
1.1试验药物
赶黄草大环多酚提取物(实施例1制备的本发明赶黄草大环多酚提取物)
肝苏颗粒(批号131127)，四川古蔺肝苏药业有限公司。
1.2实验材料
健康成年SD大鼠，雄性，SPF级，体重l60～170g，购自北京维通利华实验动物有限公司，许可证号SCXK(京)2012-0001，饲养于上海中医药大学实验动物中心，设施许可证号：SYXK(沪)2009-0069；
四氯化碳，化学纯，批号20140325；橄榄油，化学纯，批号F20110402，均购自国药集团；丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、总胆红素(TBil)、白蛋白(Alb)购自上海科华生物。
1.3CCl4诱导急性肝损伤模型的建立：
CCl4诱导的急性肝损伤模型染毒5次，即第1，4，7，10，13天上午9点。首次造模除正常组外，其余各组均皮下注射100％CCl43ml/kg大鼠体重；此后50％CCl4橄榄油溶液2ml/kg大鼠体重。正常组大鼠皮下注射相同容积的橄榄油溶液。
1.4实验分组及给药剂量
动物分组：Wistar大鼠52只，按照完全随机分组的原则，分为正常组8只，模型组10只，肝苏颗粒组8只，赶黄草大环多酚提取物低剂量组、高剂量组各9只，阳性对照甘草酸二铵组8只。
给药剂量：首次造模6h后开始给药，每天1次，连续给药14天。赶黄草大环多酚提取物低剂量组、高剂量组分别给予提取部位30mg/kg与90mg/kg；阳性对照给予肝苏颗粒3g/kg、甘草酸二铵胶囊75mg/kg(临床使用：甘草酸二铵胶囊：3粒/次，每天3次。上述各药物均以0.5％的羧甲基纤维钠溶解，正常组及模型组分别灌胃等量的0.5％羧甲基纤维钠。
1.5各项指标的检测：
血清肝功能：实验第14天晚禁食，第15天早晨9点杀鼠，腹主动脉取血，分离血清，测定：(1)丙氨酸氨基转移酶(ALT)；(2)天门冬氨酸氨基转移酶(AST)；(3)总胆红素(TBil)；(4)白蛋白(Alb)，检测方法均参照试剂盒说明书。
肝组织病理学观察：实验第15天杀检时肉眼大体观察记录，并取肝右叶相同部位组织常规10％用中性福尔马林液固定，石蜡包埋。作HE染色，光镜下观察肝脏组织病理病变。
2.实验结果：
赶黄草大环多酚提取物防治急性肝损伤的作用，见表5，图8。
表5大环多酚提取物对大鼠四氯化碳急性肝损伤模型肝功能的影响
注：*p<0.05，**p<0.001vs正常组，#p<0.05，##p<0.001vs模型组.
3.实验结论
从实验结果可以看出，与模型组相比，本发明赶黄草大环多酚提取物的高剂量组的ALB值升高，ALT、AST、T.Bil值降低，肝损伤程度小，说明本发明赶黄草大环多酚提取物能够治疗CCl4诱导的急性肝损伤。
同时，与阳性药物肝苏颗粒相比，采用本发明提取物，在给药量大幅度降低的情况下，治疗效果反而更优，可以替代肝苏颗粒使用，具有良好的临床应用前景。
实验结果说明，本发明赶黄草大环多酚提取物可以治疗急性肝损伤，疗效优良。
实验例3赶黄草大环多酚提取物体内防治CCl4诱导慢性肝损伤实验
1材料与方法
1.1试验药物
赶黄草大环多酚提取物(实施例1制备的本发明赶黄草大环多酚提取物)
肝苏颗粒(批号131127)，四川古蔺肝苏药业有限公司。
1.2实验材料
健康成年SD大鼠，雄性，SPF级，体重180～200g，购于上海市西普尔-必凯实验动物有限公司，实验动物质量合格证号：
SCXK(沪)2008-0016.MDA、T-SOD试剂盒
1.3CCl4诱导慢性肝损伤模型的建立：
除正常对照组大鼠外，其余大鼠腹腔注射40％CCl43ml/kg(用橄榄油配置成混悬液)，连续注射4周，每隔3天注射1次。药物干预组大鼠自造模开始灌胃给药，连续4周。于实验结束末，动物禁食24h，10％水合氯醛麻醉、腹主动脉采血，制备血清。
1.4实验分组及给药剂量
动物分组：大鼠于动物房适应性常规饲养l周后，开始进行实验。实验大鼠分为10组，随机分为正常对照组、模型组、秋水仙碱组、部位低、中、高剂量组，肝苏颗粒组。
给药剂量：秋水仙碱0.5mg；赶黄草大环多酚提取物低剂量10mg/kg、赶黄草大环多酚提取物中剂量30mg/kg、赶黄草大环多酚提取物高剂量90mg/kg。正常对照组和模型组给予等体积的0.5％CMC-Na溶液；所有药物均采用灌胃方式给药，给药体积为10ml/kg。
1.5各项指标的检测：
1、ALT、SOD的检测
取大鼠血清，离心后用自动生化仪检测血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、超氧化物歧化酶(SOD)。
2、病理学观察
取肝脏相同部位肝左叶组织，一部分切成2cm×2cm大小组织块，经10％中性甲醛溶液固定、石蜡包埋、切片，进行HE染色和masson染色。
3、超微结构电镜观察
取肝脏组织，切成1.5mm3大小组织，经4％戊二醛，1％饿酸固定，梯度丙酮脱水，618环氧树脂包埋，LKB超薄切片机切片，日立H-600透射电镜观察。
2实验结果
2.1ALT、SOD的检测
随着肝损伤加重，ALT值应升高，SOD值应降低，所以模型组与正常对照组相比，SOD值下降，ALT值上升。提取物中高剂量组能够使SOD升高，ALT值降低(**p<0.01，*p<0.05vs模型组；ΔΔp<0.01vs正常对照组)。各项检测指标的变化见表6、图9-10。
表6.大环多酚提取物对大鼠四氯化碳慢性肝损伤模型肝功能的影响
注：ΔΔp<0.01vs正常组，#p<0.05，##p<0.01vs模型组.
2.2病理学观察结果
HE染色结果显示，正常对照组肝细胞未见变性和坏死，肝内未见纤维组织增生，小叶结构清晰，肝组织正常。模型组大鼠肝脏组织可见肝组织损伤严重，肝小叶结构破坏，肝细胞空泡化、脂肪样变，伴有炎细胞浸润等病理性改变。阳性药物秋水仙碱及部位中高剂量组。结果见图11。
Masson染色，肝组织胶原蛋白经Masson染色、光镜下呈蓝色。Masson染色结果显示，正常对照组大鼠肝组织胶原较少，仅见中央静脉周围；模型组大鼠肝组织可见大量相互交联的胶原纤维；阳性药物秋水仙碱及赶黄草大环多酚提取物中高剂量组大鼠肝组织内胶原含量明显减少，仅在门管区、中央静脉及小叶间有分布胶原蛋白。结果见图12。
2.3超微结构电镜观察结果
正常对照组肝细胞结构正常，部分有脂滴，细胞之间有极少量的胶原。模型组正常肝细胞结构消失，肝细胞核变形，内质网扩张，有的肝细胞内大量空泡，细胞凋亡，肝细胞间成束的胶原，成纤维细胞增多。阳性药物秋水仙碱及赶黄草大环多酚提取物部位中高剂量组明显改善肝纤维化超微结构变化程度，肝组织超微结构介于模型与正常对照之间。结果详见图13。
3.实验结论
赶黄草大环多酚提取物能够防治CCl4诱导的肝损伤，从各项指标来看对肝脏的保护，赶黄草大环多酚提取物中高剂量组大鼠的治疗效果很显著，大大降低了肝损伤大鼠血清中ALT的含量以及升高SOD的含量；HE染色和Masson染色结果提示赶黄草大环多酚提取物能够明显保护肝损伤；从超微结构电镜观察结果可以看出，赶黄草大环多酚提取物部位中高剂量组明显改善肝纤维化超微结构变化程度。因此赶黄草大环多酚提取物对肝损伤具有防治作用。
从实验结果可以看出，与模型组相比，本发明赶黄草大环多酚提取物的高剂量组的SOD值升高，ALT值降低，肝损伤程度小，说明本发明赶黄草大环多酚提取物能够治疗CCl4诱导的慢性肝损伤。
同时，与阳性药物肝苏颗粒相比，采用本发明提取物，在给药量大幅度降低的情况下，治疗效果反而更优，可以替代肝苏颗粒使用，具有良好的临床应用前景。
综上，本发明赶黄草大环多酚提取物具有保肝作用，能够预防和治疗肝损伤，对肝缺血再灌注损伤、急性肝损伤和慢性肝损伤有确切疗效，而且在用量减小的情况下效果反而优于阳性药物肝苏颗粒，可以替代肝苏颗粒使用，可以替代肝苏颗粒使用，具有良好的临床应用前景。
Claims (17)
1.一种赶黄草提取物，其特征在于：其HPLC指纹图谱的特征如下：包含4个特征峰，其中，
1号峰的保留时间为10.4±0.25min，峰面积为1682000±8000；
2号峰的保留时间为12.5±0.25min，峰面积为36750±700；
3号峰的保留时间为13.0±0.25min，峰面积为2461000±3000；
4号峰的保留时间为14.9±0.25min，峰面积为1831000±5000；
HPLC指纹图谱的色谱条件如下：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶作填充剂；
检测波长：280nm；
流动相：A相为乙腈，B相为0.2％甲酸水溶液，按如下程序进行梯度洗脱：采用梯度洗脱，洗脱程序如下：从0分钟开始至20分钟，流动相A由35％变为65％，从20分钟开始至25分钟，流动相A由65％变为80％，从25分钟开始至35分钟，流动相A由80％变为35％。
2.根据权利要求1所述的提取物，其特征在于：所述提取物的HPLC指纹图谱如图2所示。
3.根据权利要求1所述的赶黄草提取物，其特征在于：它是采用如下方法制备：
(1)取赶黄草药材，粉碎，用30～95％乙醇提取，减压浓缩，得粗提取浸膏；
(2)往步骤(1)所得浸膏中加入1～2倍体积的水，过滤或者离心，所得滤液或者上清液通过HPD-400、D-101或AB-8大孔树脂柱，上样体积是柱体积的1/2-2/3，依次用水、10％乙醇、30％乙醇、50％乙醇和95％乙醇洗脱，洗脱液为柱体积的5-7倍，分别得到水、10％乙醇、20％乙醇、30％乙醇、50％乙醇和95％乙醇洗脱液，取95％乙醇洗脱液，浓缩，干燥，即得。
4.根据权利要求3所述的提取物，其特征在于：步骤(1)中，所述提取是热回流提取或者浸润提取。
5.根据权利要求4所述的提取物，其特征在于：所述热回流提取的方法如下：用30-95％的乙醇热回流提取两次，每次提取时间为2小时，每次加入的乙醇的量为原药材重量的8-15倍V/W，合并提取液。
6.根据权利要求4所述的提取物，其特征在于：所述浸润提取的方法如下：用原药材重量10-15倍V/W的40-60％乙醇浸润24小时后渗漉提取，收集20-25倍体积的渗漉液。
7.一种赶黄草提取物的制备方法，其特征在于：它包括如下步骤：
(1)取赶黄草药材，粉碎，用30～95％乙醇提取，减压浓缩，得粗提取浸膏；
(2)往步骤(1)所得浸膏中加入1～2倍体积的水，过滤或者离心，所得滤液或者上清液通过HPD-400、D-101或AB-8大孔树脂柱，上样体积是柱体积的1/2-2/3(，依次用水、10％乙醇、30％乙醇、50％乙醇和95％乙醇洗脱，洗脱液为柱体积的5-7倍，分别得到水、10％乙醇、20％乙醇、30％乙醇、50％乙醇和95％乙醇洗脱液，取95％乙醇洗脱液，浓缩，干燥，即得。
8.根据权利要求7所述的提取物，其特征在于：步骤(1)中，所述提取是热回流提取或者浸润提取。
9.根据权利要求8所述的提取物，其特征在于：所述热回流提取的方法如下：用30-95％的乙醇热回流提取两次，每次提取时间为2小时，每次加入的乙醇的量为原药材重量的8-15倍V/W，合并提取液。
10.根据权利要求8所述的提取物，其特征在于：所述浸润提取的方法如下：用原药材重量10-15倍体积(V/W)的40-60％乙醇浸润24小时后渗漉提取，收集20-25倍体积的渗漉液。
11.权利要求1-6任意一项所述赶黄草提取物在制备肝保护药物中的用途。
12.根据权利要求11所述的用途，其特征在于：所述药物是预防和/或治疗肝损伤的药物。
13.根据权利要求12所述的用途，其特征在于：所述药物是预防和/或治疗肝缺血再灌注肝损伤及化学性肝损伤的药物。
14.根据权利要求13所述的用途，其特征在于：所述化学性肝损伤是急性肝损伤或者慢性肝损伤。
15.一种保肝药物，其特征在于：它是权利要求1-6任意一项所述赶黄草提取物为活性成分，加上药学上可接受的辅料或者辅助性载体制备而成的制剂。
16.根据权利要求15所述的药物组合物，其特征在于：所述剂型为经胃肠道给药剂型。
17.根据权利要求16所述的药物组合物，其特征在于：所述经胃肠道给药剂型为颗粒剂、散剂、片剂、丸剂、胶囊剂、茶剂、酒剂或口服液。
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