CN113057972A - 赶黄草有效部位及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了赶黄草有效部位（EPC）及其制备方法和用途，所述赶黄草有效部位在制备治疗和/或预防脑缺血/再灌注损伤药物中的应用。本发明首次采用EPC作为抗脑缺血/再灌注损伤的药物，经过药效实验验证，制备得到的药物能抗脑缺血/再灌注损伤。本发明材料为药食同源的赶黄草提取物，具有无毒、治疗效果好的优势。

Description

赶黄草有效部位及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及药学/中药学领域，具体涉及赶黄草有效部位及其制备方法和应用，尤其是赶黄草有效部位在抗脑缺血/再灌注损伤中的应用。
背景技术
缺血性脑卒中具有发病率高、致残率高、死亡率高、复发率高和并发症多等特点，是一类常见的严重威胁着人类生命健康和生活质量的疑难性疾病。继发性脑缺血/再灌注损伤(cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI)是脑卒中后高致残率和高病死率的重要原因之一。因此，如何降低脑细胞缺血/再灌注损伤已成为脑卒中治疗的焦点和难点。脑缺血/再灌注损伤有氧化应激、炎症反应、兴奋性氨基酸的过度释放等众多病理机制参与其中，是一个复杂的病理过程。目前临床用药由于治疗窗窄、并发症频发等缺点，迫切需要寻找疗效好、副作用少的防治CIRI的药物。
在中枢神经系统中星形胶质细胞是最主要的组成部分，数量约为神经元的5倍。星形胶质细胞在缺血性损伤恢复过程中发挥重要的作用，其可通过支持、保护和营养作用，减缓兴奋性氨基酸、自由基等带给神经元的伤害，可能是脑缺血性损伤疾病中重要的潜在调节靶点，寻找对星形胶质细胞具有保护的药物在是发现抗脑缺血致脑细胞损伤药物的重要途径。
民族药在治疗心脑血管等复杂疑难疾病方面相对于单一化学成分药物有其独到之处，是创新药物发现的重要途径。作为我国六大民族药之一的苗药，其传统医药门类比较齐全，许多祖传秘方、单方、验方的长期使用与优化，其疗效在民间得到了比较充分的确证，是发现创新药物的宝库。
赶黄草为虎耳草科植物扯根菜Penthorum chinense Pursh.的干燥地上部分，始载于明代《救荒本草》，在苗族民间历来作为药食两用植物，有上千年的用药史，被誉为“神仙草”。赶黄草性温，味甘，无毒，具有清热解毒、活血散瘀、利水消肿、退黄、平肝的功效，是苗族治疗肝脏疾病的传统药物，目前临床应用也局限于肝脏疾病。
迄今为止未有该药物用于抗脑缺血再灌注损伤研究的报道。
发明内容
发明目的：为了解决上述技术问题，本发明的目的在于提供了赶黄草有效部位(EPC)及其制备方法和其药物新用途。
本发明通过体外培养星形胶质细胞的方法，建立氧糖剥夺再灌注(oxygen-glucose deprivation/reperfusion，OGD/R)致星形胶质细胞损伤模型，体外模拟脑缺血/再灌注损伤的发病过程，观察EPC对星形胶质细胞损伤的保护作用及机制。结果显示：EPC对正常培养的星形胶质细胞无毒并可增强氧糖剥夺再灌注星形胶质细胞存活率。进一步的研究发现EPC能上调氧糖剥夺再灌注星形胶质细胞中Nrf2、HO-1的蛋白表达，下调氧糖剥夺再灌注星形胶质细胞中p-ERK1/2、p-p38、p-JNK1/2的蛋白表达，但对氧糖剥夺再灌注星形胶质细胞中ERK1/2、p38、JNK1/2的蛋白表达无明显影响。以上结果提示：EPC通过激活Nrf2/HO-1通路、抑制MAPK通路发挥对氧糖剥夺再灌注星形胶质细胞的保护作用。综上所述EPC具有开发成抗脑缺血/再灌注损伤药物的重要价值。
技术方案：本发明提供了赶黄草有效部位，所述赶黄草有效部位为通过乙醇提取后经过大孔树脂分离然后收集50％乙醇洗脱的流份。
本发明内容还包括所述的赶黄草有效部位的制备方法，包括以下步骤：
1)取赶黄草药材，粉碎成颗粒状；
2)将颗粒状赶黄草药材用乙醇进行热回流提取得到提取液；
3)收集提取液，过滤，减压回收溶剂，烘干后得浸膏；
4)将浸膏用水和少量乙醇(体积比9∶1)溶解，经D101大孔树脂柱色谱分离，依次用水、15％、30％、50％、75％、100％乙醇洗脱，收集50％乙醇洗脱的流份，减压回收溶剂，得赶黄草有效部位。
本发明内容还包括所述的赶黄草有效部位在制备治疗和/或预防脑缺血/再灌注损伤药物中的应用。
其中，所述赶黄草有效部位在制备增强氧糖剥夺再灌注星形胶质细胞存活率的药物中的应用。
其中，所述赶黄草有效部位在制备上调氧糖剥夺再灌注星形胶质细胞中Nrf2、HO-1蛋白表达的药物中的应用。
其中，所述赶黄草有效部位在制备下调氧糖剥夺再灌注星形胶质细胞中p-ERK1/2、p-p38、p-JNK1/2蛋白表达的药物中的应用。
其中，所述药物为单组份或复方制剂。
其中，所述药物的剂型为包含但不仅限于片剂、胶囊、控释片、口服液、糖浆、滴丸、注射液剂型或冻干粉针剂型。
有益效果：本发明首次采用EPC作为抗脑缺血/再灌注损伤的药物，经过药效实验验证，EPC(5、10、20μg.mL-1)能增加氧糖剥夺再灌注星形胶质细胞存活率约22.86～29.26％；EPC能激活Nrf2/HO-1通路，使氧糖剥夺再灌注星形胶质细胞中Nrf2蛋白水平上调约27.86～33.85％，HO-1蛋白水平上调约30.35～38.22％；EPC能抑制MAPK通路，使氧糖剥夺再灌注星形胶质细胞中p-ERK1/2蛋白水平下调约21.13～34.61％，p-p38蛋白水平下调约25.54～30.82％，p-JNK1/2蛋白水平下调约27.16～51.42％。因此，采用EPC制备得到的药物能抗脑缺血/再灌注损伤。本发明材料为药食同源民族药来源的赶黄草提取物，具有无毒、治疗效果好的优势。
附图说明
图1、不同浓度的EPC对正常星形胶质细胞以及氧糖剥夺再灌注后星形胶质细胞活力的影响；图1A为不同浓度的EPC对正常星形胶质细胞活力的影响；图1B为不同浓度的EPC对氧糖剥夺再灌注星形胶质细胞活力的影响；
图2、不同浓度的EPC对氧糖剥夺再灌注后星形胶质细胞中Nrf2和HO-1蛋白表达的影响；图2A为Nrf2和HO-1 Western Blot条带图，图2B为Nrf2和HO-1蛋白表达变化分析图；
图3、不同浓度的EPC对氧糖剥夺再灌注后星形胶质细胞中MAPK通路相关蛋白表达的影响；图3A为ERK1/2、p-ERK1/2、JNK1/2、p-JNK1/2、p38、p-p38Western Blot条带图，图3B为p-ERK1/2/ERK1/2、p-JNK1/2/JNK1/2、p-p38/p38蛋白表达变化分析图。
具体实施方式
实验材料和仪器：
实验材料：DMEM高/低糖培养基：美国Gibco公司；青链霉素混合液：北京索莱宝公司；胎牛血清：美国Gibco公司；完全培养基为DMEM高糖培养基∶胎牛血清∶青-链霉素按9∶1∶0.1的比例配制所得；进行氧糖剥夺时用DMEM低糖培养基∶胎牛血清∶青-链霉素按9∶1∶0.1的比例配制的培养液；0.01M PBS缓冲液(pH 7.2-7.4，北京索莱宝公司)；细胞滤器(FALCON公司，100μM，型号：352360)；一抗为兔抗大鼠Nrf2，HO-1、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK1/2、p-JNK1/2、p38和p-p38，二抗为羊抗兔IgG抗体；SD大鼠购自扬州大学比较医学中心；
实验仪器：CO2培养箱(thermoFisher)；三气培养箱(thermoFisher)
实施例1赶黄草有效部位(EPC)的制备
EPC的制备：取一定量的赶黄草药材，粉碎成颗粒状(粒径小于2mm)。将颗粒状赶黄草药材用95％乙醇于85℃热回流提取(固液质量比为1∶3.5)，每次2h，共五次。收集提取液，过滤，减压回收溶剂，40℃烘干后得浸膏。将浸膏用水和少量乙醇(体积比为9∶1)溶解，经D101大孔树脂柱色谱分离，依次用水、15％、30％、50％、75％、100％乙醇洗脱，收集50％乙醇洗脱的流份，减压回收溶剂，得赶黄草有效部位。
实施例2 OGD/R损伤后星形胶质细胞的获得
在无菌的条件下，取出生24h之内的SD大鼠的大脑皮质，剪碎后用0.25％的胰蛋白酶于37℃下消化10min，随后用含10％胎牛血清的高糖培养基终止消化，500g离心10min，弃去上清，再加入20ml高糖培养基重新打散制成细胞悬液，用涡旋振荡仪以最高速度3000转/分钟涡旋1min，以杀死神经元，随后300g离心10min，弃去上清，再重复3次。待最后一次离心结束，将细胞悬液滤过100μm的细胞滤器，将细胞悬液铺于适当的容器中，放置于5％CO2、95％空气的37℃培养箱内培养14d后传代在相应的培养皿上继续培养4d。
待细胞长满至70～80％，可以进行氧糖剥夺再灌注处理。用PBS洗涤细胞2次，更换不含葡萄糖的无糖培养基，然后置于94％N2，1％O2，5％CO2的三气培养箱中，37℃缺氧培养6h。在缺氧完成后，将无糖培养基再次更换为含10％胎牛血清的高糖培养基，并放回正常氧培养箱中继续培养24h。实验中的空白对照组始终保持在正常氧培养箱中并在高糖培养基中培养。药物组为细胞给予缺氧，同时给与EPC(5、10、20μg.mL-1)。
获得的OGD/R损伤后星形胶质细胞进行后续实施例3～5的实验研究。
实施例3 EPC对正常星形胶质细胞以及OGD/R损伤后星形胶质细胞活力的影响
为了研究EPC对正常星形胶质细胞以及OGD/R损伤后星形胶质细胞活力的影响，将原代星形胶质细胞以1×104个细胞/孔的密度接种到96孔板中，使用MTT测定法测定细胞的存活率；EPC浓度分别为5、20和80μg.mL-1，阴性对照为含0.1％DMSO的完全培养液。结果发现，EPC能增强正常星形胶质细胞的存活率，EPC在浓度为5、20、80μg.mL-1时细胞存活率分别为112±4.82％，113±3.97％，141±9.74％，在80μg.mL-1时有统计学意义(图1A)；实施例2获得的经氧糖剥夺再灌注的星形胶质细胞存活率为56.41±3.33％，而用浓度为5，10，20，40，80μg.mL-1EPC处理后星形胶质细胞的存活率为66.12±4.09％，63.79±3.60％，64.98±3.55％，51.97±1.58％，44.74±2.20％(图1B)。EPC在5，10和20μg.mL-1浓度下能显著提高OGD/R损伤后星形胶质细胞的存活率，表现出对星形胶质细胞的神经保护作用。而实施例1中水、15％、30％、75％、100％乙醇洗脱部位都没有表现出提高OGD/R损伤后星形胶质细胞的存活率的作用。实验以含0.1％DMSO的完全培养液阴性对照，白藜芦醇为阳性对照(处理后星形胶质细胞的存活率为76.36±7.01％)。
实施例4 EPC对OGD/R损伤后星形胶质细胞中Nrf2蛋白和HO-1蛋白表达水平的影响
细胞培养方法同实施例2，EPC作用浓度为5，10和20μg.mL-1。细胞处理后，弃去培养基，用预冷的PBS洗涤细胞2次；向培养皿中加入700uL的PBS，用细胞刮将细胞刮下，使用移液器将细胞悬液转入离心管中，800g，离心5min；弃去上清液，加入200μL现配现用的蛋白裂解液(含PMSF 2μL、蛋白酶抑制剂4uL)，使用超声涡旋机破碎细胞；放置于冰上裂解约30min，每隔5min在涡旋仪上振荡30s，待细胞充分裂解后，12500rpm，4℃离心10min，收集上清液转移至新的离心管中，放置于-80℃冰箱中保存备用。二喹啉甲酸(Bicinchoninicacid，BCA)法测定蛋白浓度。并按样品：上样缓冲液3∶1加入上样缓冲液，于95℃煮沸约5min，冻存于-20℃备用。然后进行电泳，转模。待转膜结束后，将PVDF膜放入含5％脱脂奶粉的TBST封闭液中，室温封闭2h；一抗(Nrf2，HO-1)用封闭液稀释至适当浓度，于4℃孵育过夜；回收一抗，用TBST洗涤PVDF膜3次，每次10min；二抗用封闭液稀释至适当浓度，于室温孵育1-2h；用TBST洗涤PVDF膜3次，每次10min；将高灵敏度化学发光检测试剂盒中的A、B两试剂等体积混合，滴加至PVDF膜中约5min后，凝胶成像仪成像并记录。
从图2可以看出，Nrf2可以在应激条件下被激活，然后转移到细胞核内启动血红素加氧酶1(HO-1)的转录激活。用EPC(5、10、20μg.mL-1)处理，促进Nrf2和HO-1蛋白表达水平增加(Nrf2由1.35±0.07分别上升至1.81±0.12，1.73±0.08和1.76±0.11；HO-1由1.42±0.08分别上升至1.85±0.1，1.89±0.15和1.96±0.17)，说明EPC处理可以激活Nrf2/HO-1通路。
实施例5 EPC对OGD/R损伤后星形胶质细胞中MAPK通路相关蛋白表达水平的影响
利用Western Blot检测EPC对细胞内ERK1/2、p-ERK1/2、JNK1/2、p-JNK1/2、p38、p-p38蛋白表达水平的影响(图3)。实验方法同实施例4，所用一抗为ERK1/2、p-ERK1/2、JNK1/2、p-JNK1/2、p38和p-p38。用EPC(5、10、20μg.mL-1)处理能抑制p-ERK1/2/ERK1/2、p-JNK1/2/JNK1/2、p-p38/p38蛋白表达水平(p-ERK1/2/ERK1/2由1.77±0.11分别下降至1.39±0.13，1.25±0.09和1.16±0.08；p-JNK1/2/JNK1/2由2.61±0.3分别下降至1.9±0.59，1.36±0.24和1.27±0.32；p-p38/p38由1.97±0.16分别下降至1.46±0.39，1.4±0.12和1.36±0.14)，说明EPC处理可以抑制MAPK通路。

Claims (8)

1.赶黄草有效部位，其特征在于，所述赶黄草有效部位为通过乙醇提取后经过大孔树脂分离然后收集50%乙醇洗脱的流份。
2.权利要求1所述的赶黄草有效部位的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）取赶黄草药材，粉碎成颗粒状；
2）将颗粒状赶黄草药材用乙醇进行热回流提取得到提取液；
3）收集提取液，过滤，减压回收溶剂，烘干后得浸膏；
4）将浸膏用水和乙醇溶解，经D101大孔树脂柱色谱分离，依次用水、15%、30%、50%、75%、100% 乙醇洗脱，收集50%乙醇洗脱的流份，减压回收溶剂，得赶黄草有效部位。
3.权利要求1所述的赶黄草有效部位在制备治疗和/或预防脑缺血/再灌注损伤药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述赶黄草有效部位在制备增强氧糖剥夺再灌注星形胶质细胞存活率的药物中的应用。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述赶黄草有效部位在制备上调氧糖剥夺再灌注星形胶质细胞中Nrf2、HO-1蛋白表达的药物中的应用。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述赶黄草有效部位在制备下调氧糖剥夺再灌注星形胶质细胞中p-ERK1/2、p-p38、p-JNK1/2蛋白表达的药物中的应用。
7.根据权利要求3~6任一项所述的应用，其特征在于，所述药物为单组份或复方制剂。
8.根据权利要求3~6任一项所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为包含片剂、胶囊、控释片、口服液、糖浆、滴丸、注射液剂型或冻干粉针剂型中的一种。
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