CN102066901A - 使用同时探测的光散射测量 - Google Patents
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Abstract
公开了一种用于测量粒子特征的方法和装置。在一个方面，探测在光和悬浮样本之间的相互作用所引起的光量，并同时获得来自不同方向的光子数。接下来可至少部分基于在来自获得步骤和探测步骤的信息之间的同步，取得粒子特征的至少一个测量结果。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2008年1月15日提交的美国临时申请No.61/011,143的优先权，该申请通过参引方式被纳入本文。
技术领域
本发明涉及对粒子特征的测量，包括对非常小的粒子的动态测量。
背景技术
基于实践和理论基础都公知的是，被小于光的波长的粒子散射的光的强度与粒子大小有很大关系。在粒子半径小于照射光波长的十分之一的瑞利散射极限中，散射强度与粒子半径的六次方成比例，并且基本与散射角无关。在这个极限以上，对角度的依赖性变得明显。为描述此范围中的散射，需要知道粒子的光学特性，并且粒子的形状也变得很重要。Gustave Mie的数学处理可以被用作预测所有这些范围内的球形粒子的散射。Dave的计算机程序是计算这些效应的一种方便的工具，并且该程序可从Bohren，C.F.和Huffman，D.R.所著的、由Wiley于1983年在纽约出版的“Absorption and Scattering of Lightby Small Particles”一书的附录获得。图1示出折射率为1.6且吸收可忽略的10nm到10微米的粒子对633nm波长的光的散射(从上面的Bohren和Huffman得到)。容易看出，对于粒子尺寸小于100nm的情况，散射角相对不重要，然而对于大粒子尺寸情况，散射图样变化，其中散射角越大，变化越大。
可用于计算具有特定粒子尺寸和折射率的球体的散射的计算机程序被包含在Bohren，C.F.和Huffman，D.R.所著的、由Wiley于1983年在纽约出版的“Absorption and Scattering of Light by SmallParticles”一书的附录中。这篇论文基于J.V.Dave于1968年出版的早期作品。上述引用的所有文件都通过参引的方式被纳入本文。
应注意到，在大约1微米时，前向-反向散射比约为104。因此，针对含有小的主导粒子和较大的物质的样本的光散射测量结果对少量的大粒子、或者甚至是对单个的大粒子是非常敏感的。这些不期望的杂质会出现在各种系统中；它们可能是主导粒子的聚集物或一些其他材料。在对生长培养基中所繁殖的病毒粒子进行研究的过程中，例如，经常出现整个生物细胞或碎片。在流动样本--例如来自尺寸排阻色谱系统(size exclusion chromatography system)的射流--的光散射中，来自流体柱本身的粒子碎片可能和感兴趣的分子物质相混合。
借助同时存在的多个探测器分析从粒子群散射的光的强度分布已被广泛使用，并且被公知为静态光散射(SLS)；当使用位于透镜的焦平面中的平面阵列探测器或等价的光学系统进行探测，使被探测的光位于前向方向的一有限角度范围内时，经常使用术语“激光衍射”。例如，英国马尔文的马尔文仪器公司(Malvern Instruments)提供了诸如Mastersizer 2000的结合前向、侧向和后向散射的混合系统。
发明内容
在本说明书和权利要求中呈现了本发明的多个方面。在一个总体方面，描述了一种在动态光散射实验中同时使用两个或更多个光子计数探测器、或至少一个光子计数和一个类似探测器的探测方案。这种方案意于在存在不可避免的较大尺寸杂质、灰尘和聚集物的情况下促进对纳米粒子、生物分子、病毒及类似物质的粒子尺寸的测量。还描述了一种应用于静态光散射的类似方案。
希望此处描述的方法在色谱实验或其他半连续过程中对流动样本的分析具有特殊价值。在将光散射应用到色谱实验的洗脱液时的主要困难在于，分离柱(separation column)易于从柱基(column matrix)释放或“脱落”粒子。这些粒子远大于色谱样本并且有可能削弱测量结果。所提出的方案意在解决这个难题。
本发明会在用生物分子、细胞和病毒的尺寸和质量进行表征方面尤其有用。蛋白聚集物的探测已经变成一个重要事项，因为蛋白聚集物的存在对蛋白基药物的治疗上的使用有很大影响。根据本发明的系统也应能够改进聚集物比例的定量并且允许对基蛋白有更准确的测量。通过光散射对病毒粒子的测量常受到生长培养基中存在的杂质的限制。类似的小细胞如淋巴细胞的样本常伴随有一些较大的细胞或者其光散射将来自目标细胞的信号淹没的其他材料。
又一个应用领域是用于研究纳米粒子的分散，纳米粒子常包含大的聚集物，给出对这些大聚集物的探测可以产生对主导粒子的改进的测量结果。
在又一个总体方面，本发明的特征在于一个粒子测量仪器，该粒子测量仪器包括光源，其具有输出光束路径；样本池，其位于光源的输出光束路径中；以及至少一个光子计数探测器，其位于所述光束路径外以获得沿第一散射角散射的光。一个附加探测器位于光束路径外，以获得沿第二散射角散射的光，该第二散射角不同于第一散射角；以及响应于所述光子计数探测器和所述附加探测器这两者的同时探测逻辑电路。该同时探测逻辑电路具有粒子特征测量结果输出，以及一个探测器间同步逻辑电路，该同步逻辑电路可操作用于至少部分基于来自光子计数探测器的信息和来自附加探测器的信息之间的同步来取得粒子特征测量结果输出。
在优选的实施方案中，光子计数探测器可以与光源相同位于样本池的同一边、并位于光束路径外，以获得反向散射的光，附加探测器相对于光源位于样本池的相对侧，以获得前向散射的光。附加探测器也可以是光子计数探测器。光源可以是相干可见光源。光源可以是窄带可见光源。同时探测逻辑电路可以包括动态光散射探测逻辑电路。同时探测逻辑电路可以实时运行以允许来自附加探测器的信息选通来自光子计数探测器的信息。同时探测逻辑电路可以在获得来自光子计数探测器和附加探测器的数据之后，对从光子计数探测器获得的数据和从附加探测器获得的数据进行后处理。同时探测逻辑电路可以包括数据信号处理逻辑电路。同时探测逻辑电路可以是交互式的。同时探测逻辑电路可操作用于在存在有较大杂质粒子情况下确定粒子尺寸。同时探测逻辑电路可操作用于在存在有较大杂质粒子情况下确定粒子相对量。附加探测器可以处于偏离光源的光轴大约5-30度的位置。附加探测器可以处于偏离光源的光轴大约30-90度的位置。光子计数探测器可以处于偏离光源的光轴大约7度的位置。该仪器可进一步包括第二光子计数探测器，所述同时探测器进一步响应于该第二光子计数探测器。第二光子计数探测器可以处于偏离在样本池处的光源的光轴大约90度的位置。该仪器的粒子探测范围可覆盖直径小于100nm的粒子。该仪器的粒子探测范围可覆盖直径小于10nm的粒子。同时探测逻辑电路可以包括交叉相关逻辑电路，该交叉相关逻辑电路运行以至少部分基于来自光子计数探测器的信息和来自附加探测器的信息之间的交叉相关取得粒子特征测量结果输出。当光子计数探测器和附加探测器的输出之间的交叉相关超过预定的阈值时，交叉相关逻辑电路可以选通来自光子计数探测器的信息。
在又一总体方面，本发明的特征是一种测量粒子特征的方法，其包括在悬浮的样本上照射光，获得由样本散射光引起的光子数，在获得光子数的步骤的同时，探测由光和样本之间相互作用所引起的光量，其中，所述探测步骤对来自于以下方向的至少一些光进行探测：所述方向不同于获得光子数的方向，并且至少部分基于来自光子计数探测器的信息和来自附加探测器的信息之间的同步，取得粒子特征的至少一种测量。在优选的实施方案中，照射光的步骤可将光照射到悬浮的生物分子，如蛋白质上。
附图说明
图1是得自上面的Bohren和Huffman的现有技术中的散射与尺寸和角度的函数关系图；
图2是根据本发明的一示例多探测器光散射装置的光学结构图；
图3是根据本发明的多探测器光散射装置的一示例同步图，如图1中所示的；
图4是对图3所用的同一数据组所做的示例性的互相关图；
图5是对轻微聚集的溶菌酶样本所获得的示例性的尺寸和强度的关系曲线图；以及
图6是对低浓度的溶菌酶样本所获得的示例性的尺寸和强度的关系曲线图。
具体实施方案
参照图2，现在将更详细地讨论本发明的示例实施方案。在这个实施方案中，激光束经过样本池。光子计数探测器PD1优选位于样本池后面，并在激光器的光路之外，例如经过光纤接收来自样本池的反向散射。附加探测器PD2--其可以是光子计数探测器或者不是光子计数探测器--优选位于样本池的前面并在激光器光路之外，并例如通过光纤接收来自样本池的前向散射。也可以提供一个或多个进一步可选的光子计数探测器(如PD3)，例如以便通过另一个光纤来监测侧向散射。在一个实施方案中，PD1在PD1和PD2光纤光学获取之间简单地切换，以获得反向散射和侧向散射。
优选的是放置光子计数探测器以获取反向散射的光，因为光子计数探测器在该位置将接收少量来自聚集物的信号，但光子计数探测器也可被放置在激光束的路径之外的任何位置。附加探测器可以覆盖任意角度范围，只要该角度不同于、优选地小于所述光子计数探测器。附加探测器甚至也可被实施为积分球，其中所有角度都可被覆盖到以产生最大灵敏度。
在一个实施方案中，图2中所示的角度如下：
角A 7度有效探测(173度--反向散射)
角B 5-30度(一般)--前向散射
角C 90度--侧向散射
PD1-PDN可以电连接到一信号处理器，如数字信号处理器(DSP)集成电路或用于后处理的个人计算机。重叠的光学装置被用在从英国马尔文的马尔文仪器公司获取的Zetasizer Nano装置上。如所示的使用透镜的反向散射光学器件也被用在Zetasizer Nano中，并且得到专利权保护(也被描述为“NIBS”-非侵入性反向散射)。
附加探测器PD2的输出可被用于选通一个或多个光子计数探测器。当附加探测器的输出上升到预定阈值之上，表明杂质粒子正在传送激光束时，系统就使光子计数探测器停止工作。当附加探测器水平低于阈值时，光子计数可以重新开始。选通可被实时执行，或者可作为后处理操作被执行。也可以应用其他类型的后处理操作，例如数字信号处理方法，并且这些后处理可以以专用的方式或以交互作用的方式被应用。选通/后处理功能可以使用专用的硬件、在通用处理器上运行的软件、或二者的结合来实施。
需要注意到，波动信号实际被向下解析成单个光子到达次数，并且如PD1所观察到的，该波动信号对于低散射样本可能是稀疏的。随着前向散射被加强(通过散射物理学)，以及潜在地通过使用比相关处理中PD1可以使用的接收角更大的接收角，PD2中的信号更快地达到统计显著性。
对于小于100nm的粒子，散射变得非常弱，并且和角度无关。在这个尺寸范围内，以及对于小于6微米的较大粒子，粒子尺寸可以通过动态光散射确定，其中，强度的波动可使用光子计数探测器来记录。这些波动由正在进行布朗运动的粒子引起，该布朗运动可通过计算信号的相关函数来表征。这要求信号在远远短于由所述运动引起的特征驰豫时间的时间段内被采样，并要求一快速且灵敏的探测器，如光电倍增管(PMT)或最近的雪崩光电二极管(APD)。一般的基本采样时间是50纳秒，以在如Malvern Zetasizer Nano的现代仪器中测量可能小至0.6nm直径的最小物质的分布。例如对8个连续采样的信号波动进行记录，然后使成对增加，并以50ns的采样时间对进一步的8个“信道”的信号波动进行记录，然后以100ns对8个进一步的“信道”的信号波动进行记录，以此类推超过24级，使得最后的采样时间大于0.4秒。这个所谓的对数相关处理能够表征更宽的动态范围尺寸。
由于相关处理通常使用所记录的每一个采样，令人头疼的来自大杂质的散射将被附带到信号中，并且当该问题已经发生时，该来自大杂质的散射不易于被除去。在173度反向散射中测量的10nm粒子的散射中的一般计数速率可以是大约每秒105个，或者每10微秒1个。大部分采样时间为基本的50ns，并且在大部分情况下，在相关器(correlator)的前8段的总计形式是空的，并且为了恢复信号，几百万的采样被总计。单个1微米的灰尘粒子可以散射大约15次之多，并且100nm尺寸的聚集物或杂质散射150次之多，即便是计数速率中的这些增加也不足以使信号能够通过当即数据的检测而被过滤。10nm粒子在25摄氏度的水中扩散的驰豫(相干)时间为29.3微秒(假设照射波长为633nm，散射角为173度)。常要计算在至少10个相干时间上的相关性，使得数据可以在比如300微秒内被成批收集。在这个时间内，人们希望探测30个光子。这个探测的精确度被泊松计数统计限制在20％。因为对于纯样本情况，可预计，3倍标准偏差波动在大约16％内，通过排除一批给出超过比如45个光子的数据--由于可能会存在灰尘粒子--我们可以显著地降低数据收集率。
单个1微米粒子--其具有相似于10倍群体的光学特性--贡献了2.7k cps的有效计数速率，所以，在300微秒的时间段内仅可期望0.81个光子。然而，在12度角处来自相同的单个粒子的散射大约更加强烈720倍，因此，假设在相似的光效率和探测器灵敏度情况下，大约可预期600个光子。
阈值可以基于探测的光强度进行设置，因为较小的粒子在所述时间段内仍将平均贡献30个光子。可以设置(比如)100个光子的阈值。当超出该阈值时，人们可以将173度角处收集的一批光子从相关处理中排除。一种更复杂的处理可以存储两个角度处的所有的光子到达信息，并且在前向角度数据表明灰尘不存在时，在任意长度的时间段内处理反向散射数据。以这种方法，可以避免固定长度的成批数据并且相关处理会更有效。
理想的过滤方法将依赖于具体的实验布置；在流动系统中，灰尘粒子的停留时间主要依赖于流速。在凝胶色谱柱(SEC column)的动态光散射测量中，一般的容积流速是大约0.5ml/分。在横截面为2×2mm的一般流体池中，线性流速会是2mm/秒。因为激光束直径大约50微米，任何单个粒子的停留时间是25ms；了解这些使能够得到一个合适的监视范围来有效地在前向散射信号中定位灰尘事件。1微米粒子在25度水中的扩散常数大约是每秒5um^2；因此对于这样一种侵入粒子，需要数十秒来将其从一组散射实验中去除，并且对于相关处理，需要采用更长的时间。
在图3中，反向散射探测器中的计数速率被标为通道0，而前向散射探测器中的计数速率被标为通道1。数据由观察分散在水中的30nm样本以及还存在的一些具有微米尺寸的聚集物的探测器获取。前向探测器对杂质的较大灵敏度由信号中的较大向上波动示出，其中最大计数速率与基线水平的比率达到大约10∶1，而反向探测器中的同一比率是大约1.3∶1。人们还可以看到，在许多情况下(但不是所有情况)前向探测器中的计数速率“尖峰”和反向探测器中的较小“尖峰”在一条直线上；然而，前向探测器中的较大波动可以从基线清晰分辨，并使得反向散射探测器中的所述数据被去除。这使得能够通过排除以下区域而改进对反向散射信号的处理：在那些区域处，聚集物贡献于信号，但是单单反向通道还不能清楚探测到所述聚集物对信号的贡献。
图4中，示出了实际使用中的处理方案。所述曲线图是“x相关”性和颗粒尺寸，“x相关”性是两个探测器中的计数速率之间的交叉相关函数的变量，粒子尺寸(Z平均)仅从反向散射探测器中的光子数据得出。所述数据来自图3中的相同数据集：应注意到，在7.5秒附近，在交叉相关中有一个尖峰，其与平均尺寸上的突然的跳跃对齐，并且通过在尖峰期间去除下面的光子数据，可搜集到经过改善的粒子尺寸信息。也应注意到，该“尖峰”覆盖大约120ms，在此期间反向散射探测器计数了大约40000个事件。较小的尖峰出现在大约5.4秒和6秒处。
图解中使用的交叉相关函数是
C(T)＝G(T)*H(T+t)/(<G>*<H>)
其中G是通道0中的计数，H是通道1中的计数。如果事件应被及时转移，例如，如果探测器被设置成观察流动样本的不同区域，则可以引入延迟时间“t”。在所呈现的情况中，探测器被用来观察样本的相同区域，t被设置成0。
由V形符(“<”，“>”)表示的平均，是在实验时间段的时间窗内进行的，该函数在计数速率的每一个采样处被计算，在所呈现的数据中对计数速率的采样是50ms。也可以使用其他时间段如1ms，只要采样时间段代表由反向散射探测器处理的扩散信号的多个相干时间。因为来自每个探测器的所有光子事件都被实时存储，它们可以为不同目的而在不同的时间间隔上被处理。
图5示出了对轻微聚集的溶菌酶样本所获得的粒子尺寸与强度的示例曲线图。在这个曲线图中，由存在的聚集物所引起的第二浓度峰值清晰可见。在图6中，对低浓度的溶菌酶样本获得了类似的曲线图，第二峰值看不见，并且主峰较窄。这两个曲线图都说明了当聚集物的影响减轻时粒子特征诸如粒子尺寸的探测是怎样改进的。
本发明现已结合其许多特定的实施方案被描述。然而，预期落入本发明范围内的许多修改现在对于本领域的技术人员应该是清晰的。尽管目前考虑了在可见波长范围内的测量，例如，应该也可在近红外或甚至紫外光波长执行测量。因此，本发明的范围仅限于所附权利要求的范围。除此之外，权利要求的陈述顺序不应被理解为限制了权利要求中的任何特定术语的范围。
Claims (23)
1.一种粒子测量仪器，包括：
光源，其具有输出光束路径，
样本池，其位于所述光源的所述输出光束路径中，
至少一个光子计数探测器，其位于所述光束路径外，以获取沿第一散射角散射的光，
附加探测器，其位于光束路径外，以获得沿不同于第一散射角的第二散射角散射的光，和
响应于所述光子计数探测器和所述附加探测器这两者的同时探测逻辑电路，其具有粒子特征测量结果输出，其中同时探测逻辑电路包括探测器间同步逻辑电路，其可操作用于至少部分基于来自所述光子计数探测器的信息和来自所述附加探测器的信息之间的同步来得到所述粒子特征测量结果输出。
1a.根据权利要求1所述的仪器，其中，光子计数探测器与光源位于样本池的同一侧，并位于光束路径外以获得反向散射光，并且其中，附加探测器相对于光源位于样本池的相对侧，以获得前向散射光。
2.根据权利要求1所述的仪器，其中，附加探测器也是光子计数探测器。
3.根据权利要求1所述的仪器，其中，光源是相干可见光源。
4.根据权利要求1所述的仪器，其中，光源是窄带可见光源。
5.根据权利要求1所述的仪器，其中，同时探测逻辑电路包括动态光散射探测逻辑电路。
6.根据权利要求1所述的仪器，其中，同时探测逻辑电路实时运行，以允许来自附加探测器的信息选通来自光子计数探测器的信息。
7.根据权利要求1所述的仪器，其中，同时探测逻辑电路可操作用于在从光子计数探测器和附加探测器获得数据之后，对从光子计数探测器获得的数据和从附加探测器获得的数据进行后处理。
8.根据权利要求7所述的仪器，其中，同时探测逻辑电路包括数字信号处理逻辑电路。
9.根据权利要求7所述的仪器，其中，同时探测逻辑电路是交互式的。
10.根据权利要求1所述的仪器，其中，同时探测逻辑电路可操作用于在存在有较大杂质粒子情况下确定粒子尺寸。
11.根据权利要求1所述的仪器，其中，同时探测逻辑电路可操作用于在存在有较大杂质粒子情况下确定粒子相对量。
12.根据权利要求1所述的仪器，其中，附加探测器处于偏离光源的光轴大约5-30度的位置。
12a.根据权利要求1所述的仪器，其中，附加探测器处于偏离光源的光轴大约30-90度的位置。
13.根据权利要求1所述的仪器，其中，光子计数探测器处于偏离光源的光轴大约7度的位置。
14.根据权利要求1所述的仪器，进一步包括第二光子计数探测器，并且其中，同时探测器进一步响应于该第二光子计数探测器。
15.根据权利要求14所述的仪器，其中，第二光子计数探测器处于偏离样本池处的光源的光轴大约90度的位置。
16.根据权利要求1所述的仪器，其中，仪器的粒子探测范围覆盖直径小于100nm的粒子。
17.根据权利要求1所述的仪器，其中，仪器的粒子探测范围覆盖直径小于10nm的粒子。
18.根据权利要求1所述的仪器，其中，同时探测逻辑电路包括交叉相关逻辑电路，其可操作用于至少部分基于来自光子计数探测器的信息和来自附加探测器的信息之间的交叉相关来取得粒子特征测量结果输出。
19.根据权利要求18所述的仪器，其中，当光子计数探测器和附加探测器之间的交叉相关超过预定阈值时，交叉相关逻辑电路选通来自光子计数探测器的信息。
20.一种测量粒子特征的方法，包括：
在悬浮样本上照射光，
获得由样本散射光所引起的光子数，
在获得光子数的步骤的同时，探测由光和样本之间相互作用所引起的光量，其中，所述探测步骤对来自于以下方向的至少一些光进行探测：所述方向不同于获得光子数的方向，并且
至少部分基于来自所述获得步骤的信息和来自所述探测步骤的信息之间的同步，取得关于粒子特征的至少一个测量结果。
21.根据权利要求20所述的方法，其中，照射光的步骤是在悬浮的生物分子上照射光。
22.根据权利要求21所述的方法，其中，照射光的步骤是在悬浮的蛋白质上照射光。
23.一种粒子测量仪器，包括：
用于在悬浮样本上照射光的装置，
用于获得由样本散射光引起的光子数的装置，
用于在获得光子数的步骤的同时，探测来自光和样本之间相互作用所引起的光量的装置，其中，所述探测步骤对来自于以下方向的至少一些光进行探测：所述方向不同于获得光子数的方向，以及
用于至少部分基于来自用于获得的装置的信息和来自用于探测的装置的信息之间的同步、取得关于粒子特征的至少一个测量结果的装置。
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