CN102046166A - 治疗干眼症的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及使用β-转角模拟肽环状化合物或它们的衍生物治疗干眼症的方法。这些β-转角模拟肽环状化合物可以单独使用、与一种或多种其他的治疗干眼症的化合物、分子、或药物组合和/或联合使用。

Description

治疗干眼症的方法

相关申请

本申请要求2009年2月27日提交的美国临时申请号61/208,873以及2008年4月4日提交的美国临时申请号61/123,036的权益。以上这些申请的全部传授内容通过引用结合在此。

发明背景

干眼症，又称为干性角膜结膜炎，是泪液和眼表面的一种多因素疾病，该疾病导致的症状有不适、视觉障碍、以及具有对眼表面潜在损害的泪膜不稳定。它伴随有泪膜的渗透性增加以及眼表面的炎症(The Ocular Surface，“The Definition and Classification of Dry Eye Disease：Report of the Definition and Classification Subcommittee of the International Dry Eye Workshop(2007)，”5(2)：75-92(2007))。干眼症被认为是一种泪腺功能单位的障碍，一个泪腺功能单位的完整系统包括：泪腺、眼表面(角膜、结膜、以及睑板腺)、以及眼睑、以及连接它们的感觉和运动神经。这种泪腺功能单位以一种调节的方式控制该泪膜的主要成分并且对环境、内分泌学的、以及皮质的影响做出应答。该单位的功能是保持泪膜的完整性、角膜的透明性、以及投影到视网膜上映像的质量。对泪腺功能单位的任何部分(传入感觉神经、传出自主神经以及运动神经、以及泪液分泌腺)的疾病或损害可以使泪膜不稳定并且导致其本身表现为干眼症的眼表面疾病。

干眼症的主要类别是水液缺乏型干眼症(ADDE)以及蒸发过强型干眼症(EDE)。ADDE是由于泪腺的泪液分泌的衰竭，并且这种分类可以进一步再分为斯耶格伦综合征干眼症(由一个自身免疫过程，例如类风湿性关节炎靶向泪腺和唾液腺)和非斯耶格伦综合征干眼症(泪液功能障碍，但斯耶格伦综合征的系统性自身免疫特征除外，例如年龄相关性干眼症)。EDE归因于在正常泪液分泌功能存在下从暴露的眼表面损失了过多的水份。它的原因可以是内因性的(由于内在的疾病影响眼睑结构或动力学，例如睑板腺功能障碍)或外因性的(其中眼表面疾病的发生归因于一些外因性暴露，例如维生素A缺乏)(参见The Ocular Surface，“The Definition and Classification of Dry Eye Disease：Report of the Definition and Classification Subcommittee of the International Dry Eye Workshop(2007)，”5(2)：75-92(2007))。

干眼症是一个最常见的眼部问题，据流行率估计：在美国年龄在五十岁以上的的491万人中累及大约323万女子以及168万男子(The Ocular Surface，“The Epidemiology of Dry Eye Disease，”5(2)：93-107(2007))。对于干眼症目前的疗法是姑息性的，集中于泪滴的替换以减少症状。非处方药的人工泪液配制品是可获得的。此外，用于改进水性泪膜含量的一种非药理学方法是穿刺性填塞封闭。然而，穿刺性填塞封闭具有减少泪液产生、清除以及眼表面感觉的风险。虽然这些姑息性疗法具有短期性益处，它们在对于干眼症的长期控制治疗中的效用是有限的。RESTASIS

(环孢霉素A)是用于干眼症治疗的第一种处方产品。RESTASIS在患者(作为与干眼症疾病相关联的眼部炎症的结果，这些患者的泪液产生被抑制)中增加泪液产生。然而，对于比抗炎药物具有更宽的应用的治疗存在着一种需要。

若干临床研究已经发现局部的NGF在干眼症中提高了角膜的敏感性，并且在具有外科手术诱导的干眼症的狗的一项研究中增加了结膜杯状细胞密度的数量(Bonini，S.，et al.，“Topical Treatment with Nerve Growth Factor for Neurotrophic Keratitis，”Ophthalmology，107：1347-1352(2000))。然而，由于NGF通过神经细胞刺激神经突生长的事实，局部NGF给药的副作用之一是眼痛(Bonini，S.，et al.，“Topical Treatment with Nerve Growth Factor for Neurotrophic Keratitis，”Ophthalmology，107：1347-1352(2000))。此外，NGF具有差的药代动力学和生物利用率，并且用于制造的成本是高的。在用于干眼症治疗的替代方法的领域中存在着一种需要。

发明概述

本发明提供了一种治疗对其有需要的受试者的干眼症的方法，包括对所述受试者给予一个有效量的一种β-转角模拟肽环状化合物。在一个实施方案中，该β-转角模拟肽环状化合物包括13至17个碳原子的一个大环。在一个更具体的实施方案中，该β-转角模拟肽环状化合物是由以下结构式(I)来代表：

其中R¹和R³是独立地选自：氢、C₁至C₆的烷基、芳基、或一种在二十种蛋白氨基酸中发现的氨基酸侧链取代基，二者任一个为对映异构构型；R²和R⁴独立地是氢或C₁至C₆的烷基；或R¹和R²与它们所附接的碳原子一起形成一个环丙基、环丁基、环戊基或环己基的基团；或R³和R⁴与它们所附接的碳原子一起形成一个环丙基、环丁基、环戊基或环己基的基团；R⁵和R⁶是氢或C₁至C₆的烷基；Y是氢或一个或两个芳香族取代基；X是选自O、N、S、P、Se、C、1至6个碳原子的亚烷基、SO、SO₂或NH；n是0、1、2、3、4或5；并且连接物是一种连接基团，该连接基团通过与一种同源双功能化合物反应以有效形成式(I)的化合物的二聚体。合适的连接物基团包括，但不限于：NH₂、OH、SH、COOH、CH₃CO、CHO、以及NH-CH₂-COOH。

在本发明的另一个实施方案中，X是O、S、或NH，R¹、R³、R⁵、以及R⁶各为氢原子，且该大环具有14、15或16个环原子。

在另一个实施方案中，R¹和R³是衍生自不同的蛋白原氨基酸侧链的一种序列。

在本发明的另一个实施方案中，X是O、S、或NH。

在一个具体的实施方案中，式I的β-转角模拟肽环状化合物由下式代表：

或是其一种药学上可接受的盐。该化合物在此被称为D3。已经证明D3具有Trk调节剂活性。

在另一个具体的实施方案中，该β-转角模拟肽环状化合物是选自下组，其组成为：

以及

或任何以上化合物的一种药学上可接受的盐。这些化合物可以具有Trk调节剂的活性。

在一个实施方案中，本发明涉及一种治疗对其有需要的受试者体的干眼症的方法，该方法包括对所述受试者给予一个有效量的以下结构式(D3)代表的一种β-转角模拟肽环状化合物：

或其一种药学上可接受的盐。

在另一个实施方案中，本发明涉及一种治疗对其有需要的受试者体的干眼症的方法，该方法包括对所述受试者给予一个有效量的由式3Aa代表的一种β-转角模拟肽环状化合物：

或其一种药学上可接受的盐。

在又另一个实施方案中，本发明涉及一种治疗对其有需要的受试者的干眼症的方法，该方法包括对所述受试者给予一个有效量的由式3Ak代表的一种β-转角模拟肽环状化合物：

或其一种药学上可接受的盐。

在一个实施方案中，本发明涉及一种在对其有需要的受试者体内刺激粘蛋白分泌的方法，该方法包括对所述受试者给予一个有效量的在此描述的一种β-转角模拟肽环状化合物。

本发明进一步涉及在此描述的化合物(例如一种β-转角模拟肽环状化合物)在制造用于治疗一位需要治疗的受试者的干眼症的药物的用途。

本发明进一步涉及一种对于治疗一位需要治疗的受试者的干眼症有用的药用组合物。该药用组合物包括在此说明的一种化合物(例如β-转角模拟肽环状化合物)以及一种药学上可接受的载体。

附图简要说明

从本发明的实例实施方案的以下更具体的说明中上述内容将是清楚的，如在这些附图中展示的，其中贯穿这些不同的视图相似的参照字符是指相同的部分。这些图不必按比例绘出，而是着重展示本发明的实施方案。

在这些图和支持实验的说明中，这些化合物标识包括了前缀MIM。具有该前缀的化合物标识与没有该前缀的化合物标识是相同的。例如，化合物D3、D3、以及MIM-D3是指同一个化合物。

图1A是对于Trk调节剂化合物的的β-转角主链(编号为1、2、以及3)的代码。

图1B是对于Trk调节剂化合物主链的X-取代基(用字母A、B、C以及D标明)的代码。

图1C是对于Trk调节剂化合物的主链的二肽R¹和R²取代基的代码。

图1D展示了对于包括该主链(1、2、或3)、X-取代基(A、B、C、或D)、以及二肽氨基酸(R¹和R²)的β-转角模拟肽环状化合物全部字母代码。

图2是来自在大鼠(大鼠1-4)的结膜杯状细胞中测试神经生长因子(NGF)、氯化氨基甲酰胆碱(CCh)、化合物D3、化合物3Aa、以及化合物3Ak(在30μM(微摩尔)、10μM、1μM、以及0.3μM的剂量下)的四个实验的数据表。该表显示测量的平均值(Avg)以及标准误差(SEM)。

图3是来自大鼠(大鼠1-4)的结膜杯状细胞中的实验数据的柱状图。Y轴代表在基础上的糖缀合物分泌倍数的增加。X轴代表神经生长因子(NGF)、氯化氨基甲酰胆碱(CCh)、化合物D3、化合物3Aa、以及化合物3Ak(在30μM(微摩尔)、10μM、1μM、以及0.3μM的剂量下)。

图4是来自在大鼠(大鼠1-3)的结膜杯状细胞中的实验数据的柱状图。Y轴代表在基础以上的细胞增殖倍数的增加。X轴代表胎牛血清(FBS)、神经生长因子(NGF)1nM、化合物D3、化合物3Aa、以及化合物3Ak(在30μM(微摩尔)、10μM、1μM、以及0.3μM的剂量下)。

图5A-C显示在培养物中的杯状细胞的生长形态学。图5A显示在第九天可见的粘附细胞。图5B显示粘附至组织培养孔的单个细胞显示出鹅卵石样形态(cobblestone morphology)并且在细胞质囊泡中含有微小的半透明的液滴。图5C空心箭头显示当细胞在培养物中增殖时，观察到在这些杯状细胞的表面上形成微小的液滴，提示一种粘液样的分泌产物。图5C封闭箭头显示当这些含有液滴的细胞在培养物中生长时，这些液滴合并成为池。

图6A-C显示杯状细胞的原代培养物对高碘酸-Schiff(PAS)染色的组织化学分析。图6A显示这些细胞对PAS具有阳性反应性。图6B空心箭头显示观察到许多细胞质核周囊泡。图6B和6C封闭箭头显示这些囊泡中的一些被PAS强烈染色，表明在分泌颗粒内存在中性糖缀合物。

图7是佛波醇-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯(PMA)(0.1、1、以及10nM)、NGF(0.1、1、以及10nM)、以及化合物D3(2、10、以及50μM)对在基础上的糖缀合物分泌的倍数的增加(±sem)的影响的柱状图。Y轴代表在基础上的糖缀合物分泌的倍数的增加(±sem)。X轴代表基础、NGF(0.1、1、以及10nM)、PMA(0.1、1、以及10nM)、以及化合物D3(2、10、以及50μM)。

图8是NGF(0.01、0.1、1、以及10nM)、以及化合物D3(3、10、30、以及100μM)对杯状细胞增殖的影响的柱状图。Y轴代表在基础上的细胞增殖倍数的增加(±SD)。X轴代表FBS、NGF(0.01、0.1、1、以及10nM)、以及化合物D3(3、10、30、以及100μM)。

图9显示PMA(100nM)、NGF(1nM和10nM)、以及化合物D3(10μM和50μM)对丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)活性的影响的蛋白质印迹。

图10是PMA(100nM)、NGF(1nM和10nM)、以及化合物D3(10μM和50μM)相对于总肌动蛋白基础的MAPK激活的量化的柱状图。Y轴代表MAPK激活的倍数的增加(±sem)。X轴代表基础、PMA(100nM)、NGF(1和10nM)、以及化合物D3(10和50μM)。

图11是来自大鼠的在东莨菪碱注入后第14天的荧光素角膜染色评分(评分±sem)的柱状图，这些大鼠是：阴性对照大鼠(未治疗的；n＝6只大鼠)、具有通过系统性东莨菪碱连续十四天诱发的干眼症模型的大鼠(东莨菪碱；n＝5只大鼠)、具有在第八天用盐水局部治疗一次的干眼症模型的大鼠(东莨菪碱+盐水；n＝6只大鼠)、具有在第八天用50ug的1％化合物D3局部治疗一次的干眼症模型的大鼠(东莨菪碱+1％化合物D3；n＝7只大鼠)。

图12是来自大鼠的在东莨菪碱注入后第14天(X轴)的泪液产生评分(希尔默试验)(mm±sem)(Y轴)的柱状图，这些大鼠是：阴性对照大鼠(未治疗的；n＝6只大鼠)、具有通过系统性东莨菪碱连续十四天诱发的干眼症模型的大鼠(东莨菪碱；n＝5只大鼠)、具有在第八天用盐水局部治疗一次的干眼症模型的大鼠(东莨菪碱+盐水；n＝6只大鼠)、具有在第八天用50ug的1％化合物D3局部治疗一次的干眼症模型的大鼠(东莨菪碱+1％化合物D3；n＝7只大鼠)。

图13是在东莨菪碱注入后第14天(X轴)来自大鼠的泪液荧光素清除率评分(FU/mm±sem)(Y轴)的柱状图：这些大鼠是：阴性对照大鼠(未治疗的；n＝6只大鼠)、具有通过系统性东莨菪碱连续十四天诱发的干眼症模型的大鼠(东莨菪碱；n＝5只大鼠)、具有在第八天用盐水局部治疗一次的干眼症模型的大鼠(东莨菪碱+盐水；n＝6只大鼠)、具有在第八天用50ug的1％化合物D3局部治疗一次的干眼症模型的大鼠(东莨菪碱+1％化合物D3大鼠；n＝7)。

图14是显示在正常大鼠中局部给予化合物D3和NGF治疗之前以及之后的粘蛋白浓度的柱状图。Y轴代表粘蛋白浓度(ng/μL±sem)。X轴代表盐水和化合物D3(0.4％、1.0％、以及2.5％)以及NGF。

图15是显示在正常大鼠中局部给予化合物D3和NGF治疗后距离基线的粘蛋白浓度的变化的柱状图。Y轴代表粘蛋白浓度的变化(ng/μL±sem)。X轴代表盐水和化合物D3(0.4％、1.0％、以及2.5％)以及NGF。

图16是来自实例3的终点评价的研究设计和进度表的图表。

图17A是在用盐水、0.00053％NGF、以及2.5％，1.0％以及0.4％的化合物D3(分别对应于25mg/mL、10mg/mL、以及4mg/mL的的化合物D3)在第13天、第21天、以及第28天进行治疗的初次接受试验的大鼠和东莨菪碱注入的大鼠中的泪膜破裂时间(TBUT)(秒，平均值±sem)的柱状图。Y轴代表TBUT(秒，平均值±sem)。X轴代表用盐水、0.00053％NGF、以及2.5％、1.0％、以及0.4％的化合物D3在第13天、第21天、以及第28天进行治疗的初次接受试验的大鼠和东莨菪碱注入的大鼠。

图17B是在东莨菪碱注入后数天(X轴)用盐水、化合物D3(在0.4％、1.0％、2.5％下)、以及0.00053％NGF进行治疗的初次接受试验的大鼠和东莨菪碱注入的大鼠中的泪膜破裂时间(TBUT)(秒，平均值±sem)(Y轴)的曲线图。

图18A是在用盐水、0.00053％NGF、以及2.5％、1.0％、以及0.4％的化合物D3(分别对应于2.5mg/mL、10mg/mL、以及4mg/mL的化合物D3)在第13天、第21天、以及第28天进行治疗的初次接受试验的大鼠和东莨菪碱注入的大鼠中的角膜染色(平均值±sem)的柱状图。Y轴代表角膜染色(CS)(秒，平均值±sem)。X轴代表用盐水、0.00053％NGF、以及2.5％、1.0％、以及0.4％的化合物D3在第13天、第21天、以及第28天进行治疗的初次接受试验的大鼠和东莨菪碱注入的大鼠。

图18B是在在东莨菪碱注入后数天(X轴)用盐水、化合物D3(在0.4％、1.0％、2.5％下)、以及0.00053％NGF进行治疗的初次接受试验的大鼠和东莨菪碱注入的大鼠中的角膜染色(评分±sem)(Y轴)的曲线图。

图19A是在用盐水、0.00053％NGF、以及2.5％、1.0％、以及0.4％的化合物D3(分别对应于2.5mg/mL、10mg/mL、以及4mg/mL的化合物D3)在第12天、第19天、以及第28天进行治疗的初次接受试验的大鼠和东莨菪碱注入的大鼠中的粘蛋白产生(ng/μL±sem)的柱状图。Y轴代表粘蛋白产生(ng/μL±sem)。X轴代表用盐水、0.00053％NGF、以及2.5％、1.0％、以及0.4％的化合物D3在第13天、第21天、以及第28天进行治疗的初次接受试验的大鼠和东莨菪碱注入的大鼠。

图19B是在在东莨菪碱注入后数天(X轴)用盐水、化合物D3(在0.4％、1.0％、2.5％下)、以及0.00053％NGF进行治疗的初次接受试验的大鼠和东莨菪碱注入的大鼠中的粘蛋白产生(ng/μL±sem)(Y轴)的曲线图。

图20A-C显示化合物D3对选择的终点测量的影响的柱状图。图20A显示未治疗组、盐水组、以及用1％的化合物D3治疗的组在第28天对第13天的TBUT(秒)的变化。图20B显示对于未治疗组、盐水组、以及用1％的化合物D3治疗的组在第28天对第13天的角膜染色(评分)的变化。图20C显示对于未治疗组、盐水组、以及用1％的化合物D3治疗的组在第28天对第13天的粘蛋白产生(ng/μL)的变化。

图21A-C显示1％的化合物D3对选择的终点测量的影响的曲线图。图21A显示对于盐水组、以及用1％的化合物D3治疗的组在东茛菪碱注入(X轴)后数天TBUT(秒±sem)(Y轴)的变化。图21B显示在东茛菪碱注入后数天(X轴)盐水组、以及用1％化合物D3治疗的组在角膜染色(评分±sem)(Y轴)的变化。图21C显示在东茛菪碱注入后数天(X轴)盐水组、以及用1％化合物D3治疗的组的粘蛋白产生(ng/μL±sem)(Y轴)的变化。

图22是在东莨菪碱注入后数天(X轴)用盐水、化合物D3(在0.4％、1.0％、2.5％下)、以及0.00053％NGF进行治疗的初次接受试验的大鼠和东莨菪碱注入的大鼠中的泪液产生(mm±sem)(Y轴)的曲线图。

图23是在东莨菪碱注入后数天(X轴)用盐水、化合物D3(在0.4％、1.0％、2.5％下)、以及0.00053％NGF进行治疗的初次接受试验的大鼠和东莨菪碱注入的大鼠中的泪液荧光素清除率(Log FU/mm±sem)的曲线图。

图24是在东莨菪碱注入后数天(X轴)用盐水、化合物D3(在0.4％、1.0％、2.5％下)、以及0.00053％NGF进行治疗的初次接受试验的大鼠和东莨菪碱注入的大鼠的体重(g±sem)(Y轴)的曲线图。

发明的详细说明

本发明涉及治疗对其有需要的受试者的干眼症的多种方法，该方法包括对所述受试者给予一种β-转角模拟肽环状化合物。如在此使用的，一种“β-转角模拟肽环状化合物”是指多种环状化合物，这些环状化合物摹拟神经营养素受体配体(如NGF、NT-3、NT-4和BDNF)的β-转角区域。在一种具体的实施方案中，本发明的β-转角模拟肽环状化合物可以是一种神经营养素酪氨酸激酶(Trk)受体调节剂。在另一个具体的实施方案中，该β-转角模拟肽环状化合物可以是一种p75受体调节剂。在又另一个实施方案中，该β-转角模拟肽环状化合物可以是一种p75受体调节剂和Trk受体调节剂两者。

在一个实施方案中，该β-转角模拟肽环状化合物是由结构式(I)来代表。在一个具体的实施方案中，该β-转角模拟肽环状化合物是化合物D3或化合物D3的衍生物。

在另一个实施方案中，该β-转角模拟肽环状化合物可以是选自下组的一种化合物，该组的组成为：1Ad、3Aa、3Ak、3Ba、3Bg、3Bi、3Ca、3Ce、3Cg、3Ck、1Aa、1Ba、3Ac、以及3Ae。

虽然本发明的β-转角模拟肽环状化合物可以是一种Trk受体调节剂化合物或一种p75受体调节剂，该β-转角模拟肽环状化合物在治疗干眼症中的有效性可以依赖于其他的活性，如对调节TrkB受体或任何其他的受体(其调节在治疗干眼症中是有用的)。另外，本发明的β-转角模拟肽环状化合物在治疗干眼症中的有效性可以依赖于其他的神经营养素样活性的调节，例如像对白细胞的趋化募集的作用、对粒细胞分化的作用、对嗜中性粒细胞、肥大细胞、以及嗜酸性细胞的作用、对角膜上皮细胞增殖的作用、以及对选择性感觉神经肽、P物质、以及降钙素基因相关肽的上调。

如在此使用的，一种“Trk受体调节剂化合物”是一种TrkA受体激动剂、TrkC受体激动剂、或是一种化合物(它既是TrkA受体激动剂也是一种TrkC受体激动剂)。

如在此使用的，“调节”或“调节剂”是指激动或拮抗一种受体。

如在此使用的，一种“p75受体调节剂”是一种p75受体激动剂或拮抗剂。

神经营养因素和神经营养因素受体

神经营养因素(NTF)是在所有脊椎动物的物种中调节神经元的增殖、存活、以及分化的二聚体蛋白的一个家族。这些NTF包括神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养因素-3(NT-3)、以及神经营养因素-4(NT-4)。这些NTF结合至两个跨膜受体上：即高亲合性受体家族酪氨酸激酶(Trk)(TrkA、TrkB、以及TrkC)(K_d＝10-100pM)和p75受体(K_d＝1nM)。这些Trk家族的受体配体是十分有选择性的(如：NGF结合TrkA、BDNF结合TrkB，以及NT-3主要结合TrkC)。

神经营养因素和它们的受体已经在结膜杯状细胞(CGC)中鉴定出(Rios，J.D.，et al.，“Role of Neurotrophins and Neurotrophin Receptors in Rat Conjunctival Goblet Cell Secretion and Proliferation，Ophthalmology & Visual Science，48：1543-1551(2007))。CGC是在泪膜中大可溶性粘蛋白的原始来源。这些粘蛋白提供了一种物理性和化学性的屏障，其保护角膜和结膜免于外源药剂(细菌性的或者化学的)并且有助于一种光滑的折射表面的存在(清楚视力所必需)。

β-转角模拟肽环状化合物

在一个实施方案中，这种β-转角模拟肽环状化合物包括13至17个碳原子的一个大环。在一个更具体的实施方案中，这种β-转角模拟肽环状化合物是由以下结构式(I)来代表：

其中R¹和R³是独立地选自：氢、C₁至C₆的烷基、芳基、或一种二十种蛋白氨基酸中发现的氨基酸侧链取代基，二者任一个为对映异构构型；R²和R⁴独立地是氢或C₁至C₆的烷基；或R¹和R²与它们所附接的碳原子一起形成一个环丙基、环丁基、环戊基或环己基的基团；或R³和R⁴与它们所附接的碳原子一起形成一个环丙基、环丁基、环戊基或环己基的基团；R⁵和R⁶是氢或C₁至C₆的烷基；Y是氢或一个或两个芳香族取代基；X是选自O、N、S、P、Se、C、1至6个碳原子的亚烷基、SO、SO₂或NH；n是0、1、2、3、4或5；并且连接物是通过与一种同源双功能化合物反应而有效形成式(I)的化合物的二聚体的一种连接基团。合适的连接物基团包括，但不限于：NH₂、OH、SH、COOH、CH₃CO、CHO、以及NH-CH₂-COOH。

这二十种氨基酸侧链取代基包括：丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、天门冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸、以及酪氨酸的侧链。例如，谷氨酸的侧链是

在本发明的另一个实施方案中，X是O、S、或NH，R¹、R³、R⁵、以及R⁶各为氢原子，且大环具有14、15或16个环原子。

在另一个实施方案中，R¹和R³衍生自不同的蛋白氨基酸侧链的一个序列。

在本发明的另一个实施方案中，X是O、S、或NH。

在一个具体的实施方案中，该β-转角模拟肽环状化合物是D3(参见Maliartchouk et al.，Mol Pharmcol 57(2)：385-391，2000，通过引用将其全文结合在此，以及US 6,881,719，通过引用将其全文结合在此)、或D3的衍生物。D3的多种衍生物和式I的其他化合物预期用于本发明的这些方法中，并且包括简单的变体像生物素酰化的形式和分子，其中两个这样的单位是由二聚体连接。D3的其他衍生物和式I的其他化合物包括侧链R¹-R⁶(具有在二十种蛋白氨基酸中发现的氨基酸侧链取代基)。

蛋白质氨基酸(例如，Arg、Trp、His)的典型的侧链允许形成/设计易于产生D3的衍生物和式I的其他化合物的多种多样的结构，并且它们可以包括许多类型的官能团。

一个或多个取代基Y可以是氢或一个或两个芳香族取代基，例如，硝基、氨基、卤素、烷基(例如1-6个碳原子的烷基、优选1-4个碳原子的烷基)，以及芳基(例如苯基或萘基)。这些烷基和芳基取代基Y可以是未取代的或取代的，合适的取代基是硝基和1-6个碳原子的烷基。Y也可以用一种官能团例如生物素衍生化。基团X可以是任何亲核原子，如O、N、S、P、Se，但也可以是其它原子，如C，或者可以是典型地具有1-6个碳原子的一个亚烷基(例如亚甲基)、SO、SO₂或NH。连接点可以是相对于苯甲酰基羰基的邻位或间位。“n”的允许值是0、1、2、3、4、以及5。结合X的连接侧链是如结构(I)指示的脂肪族。

侧链烷基团R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、以及R⁶可以按许多方式变化，以增强这些化合物的生物学活性。典型地，R¹、R²、R³和R⁴是在20种蛋白质氨基酸中发现的氨基酸侧链取代基，例如，任一对映异构构型的谷氨酸、赖氨酸、乌氨酸、以及苏氨酸的侧链。若R¹取代基是氨基酸侧链，则该碳上的另一个取代基R²典型地将是氢，但也可以是甲基、乙基或苯基。可替代地，R¹和R²与它们的插入原子可以连接在一起以给出环丙烷、环丁烷、环戊烷、以及环己烷残基。R³和R⁴以与上述的R¹和R²相同的方式相关。即，它们中的一个将是一种氨基酸侧链，这两个取代基中的另一个在大多数情况下是氢，但也可以是甲基、乙基、丙基、或苯基。另外，R³和R⁴与它们的插入原子可以连接在一起以给出环丙烷、环丁烷、环戊烷、以及环己烷残基。

R⁵和R⁶有很大的变化范围，这些位置上最常见的取代基是氢或甲基。也可以设计那些取代基为对应于20种蛋白氨基酸的侧链之一，具体是甲基。

发现对生物活性特别有益的侧链是R¹和R³作为赖氨酸、谷氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、天冬酰胺、以及苏氨酸的侧链，R²、R⁴、R⁵、以及R⁶为氢。尤其选择一个或多个侧链，它对应于NGF的转角区域中的侧链

总体上，这些大环化合物具有13至16元环，其中，X取代基是O、N、S、SO或SO₂。

在另一个实施方案中，该β-转角模拟肽环状化合物是选自下组，其组成为：1Ad、3Aa、3Ak、3Ba、3Bg、3Bi、3Ca、3Ce、3Cg、3Ck、1Aa、1Ba、3Ac、以及3Ae。

在又另一个实施方案中，该β-转角模拟肽环状化合物是一种化合物，该化合物包括：一个环氨基、醚、或硫化物支架(见图1A)，具有不同的取代基(如胺、胍、或甲基磺酰胺)(见图1B)，并且R¹和R²基团包括二肽氨基酸片段(见图1C)。(还见图1D)。

在一个实施方案中，本发明涉及在一个对其有需要的受试者中刺激粘蛋白分泌的一种方法，该方法包括对所述受试者给予一个有效量的在此描述的一种β-转角模拟肽环状化合物。

本发明的化合物是以一个有效量存在的。如在此使用的，该术语“有效量”是指一种量值，当它以一个适当的给药方案给予时足以治疗(治疗学上或预防性地)这种目标失调。例如，一个有效量足以降低或者改善该被治疗的失调的严重程度、持续时间、或进展，防止该被治疗的失调的推进，引起该被治疗的失调的退化、或增强或改进另一种疗法的预防性的或治疗性的效果。

如如在此使用，“干眼症”是一种宽的概念，它旨在包括水液缺乏型干眼症、蒸发过强型干眼症、更年期相关联的干眼症、流泪不足(hypolacrimation)、泪液缺乏、干眼病、斯耶格伦综合征、干性角膜结膜炎、史蒂文斯-约翰逊综合征、眼类天疱疮、睑缘炎(blepharitis marginal)、眼睑闭合障碍和感觉神经瘫痪、过敏性结膜炎相关性干眼症、病毒性结膜炎后干眼症、白内障手术后干眼症、激光原位角膜磨镶术后慢性干眼症(LASIK)、VDT操作相关性干眼症以及隐形眼镜佩戴相关性干眼症、年龄相关性干眼症、角膜损伤、感染、赖利-戴综合征、先天性无泪症、营养失调或不足(包括维生素)、药理学副作用、眼部紧张以及眼腺和组织破坏、对烟雾、抽烟、过度干燥空气、空气播散性微粒的环境接触、自身免疫及其他免疫缺陷紊乱、以及不能眨眼的昏迷患者。另外，“干眼症”包括由干眼症所引起的疾病，如角膜结膜上皮的损害、角膜上皮疮、角膜溃疡(如角膜基质层的溃疡)以及眼部传染病。

如在此使用的，受试者是指动物，如哺乳动物，包括但不局限于：灵长类(如人类)、母牛、绵羊、山羊、马、猪、狗、猫、兔、豚鼠、大鼠、小鼠、或其他牛、羊、马、犬、猫、啮齿动物或鼠类。在一个实施方案中，该受试者是一个人。

该术语“治疗”包括治疗性处理和预防性处理(减低发展的可能性)。该术语是指降低、抑制、减弱、缩小、停止或稳定一种疾病(例如在此描述的疾病或病症)的发展或进展，减轻该疾病的严重性或改进与该疾病相关的症状。

如在此使用的，术语药学上可接受的盐是指从药学上可接受的非毒性酸(包括它们的无机酸和有机酸)制备的这些给药化合物的一种盐。此类无机酸的例子是盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硝酸、硫酸、以及磷酸。适当的有机酸可以选自，例如，脂肪族酸、芳香族酸、有机酸的羧酸和磺酸类，其中的例子是甲酸、乙酸、丙酸、琥珀酸、樟脑磺酸、柠檬酸、富马酸、葡糖酸、羟乙基磺酸、乳酸、苹果酸、黏酸、酒石酸、对-甲苯磺酸、乙醇酸、葡糖醛酸、马来酸、糠酸、谷氨酸、安息香酸、邻氨基苯甲酸、水杨酸、苯乙酸、扁桃酸、双羟萘酸(扑酸)、甲磺酸、乙磺酸、泛酸、苯磺酸(苯磺酸盐)、硬脂酸、对氨基苯磺酸、藻朊酸、半乳糖醛酸等。

本发明进一步涉及用于治疗对其有需要的受试者的干眼症的多种药用组合物。该药用组合物包括本发明的一种或多种β-转角模拟肽环状化合物以及一种药学上可接受的载体。药学上可接受的载体还可以包含惰性成份，这些惰性成份不与在这些组合物中的调节性/活性物质相互作用。可以采用多种标准药物配制技术，如那些在Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company，Easton，PA中描述的技术。用于肠胃外给药的适当的药用载体包括，例如，无菌水、生理盐水、抑菌盐水(含大约0.9％mg/ml苯甲醇的盐水)、磷酸盐缓冲盐水、Hank′s溶液、林格氏乳酸盐溶液(Ringer′s lactate)、右旋糖、乙醇、表面活性剂(如甘油)、或赋形剂。

在另外一个实施方案中，该药用组合物进一步包括一种(即、一种或多种)额外的治疗剂。适合用于在此描述的这些方法以及药用组合物中的一种额外的治疗剂可以是，但不局限于，例如：抗炎剂(如RESTASIS

(Allergan))、粘蛋白刺激剂(如Diquafasol(Inspire Pharmaceuticals)15-(S)-HETE(Alcon)、瑞巴派特(Otsuka)、以及依卡倍特(ISTA))、激素药剂、以及泪腺刺激剂(如雄激素泪液(Allergan))、以及人工泪液。

给药方式

这种组合物可以被配制成用于局部眼部施用，例如，以溶液、软膏、乳膏、洗剂、眼软膏的形式，并且最优选滴眼剂或眼凝胶，并且可以含有适当的常规添加剂，包括，例如防腐剂、辅助药品渗透的溶剂、以及软膏和乳膏中的柔润剂。这类局部配制品可以含有相容性常规载体，例如，乳膏或软膏基质，以及用于洗剂的乙醇或油醇。

可替代地，这些活性化合物可以经由脂质体而施用于眼部。此外，这些活性化合物可以经由一种泵-导管系统而灌注入泪膜。本发明的另一个实施方案涉及将该活性化合物容纳在在一种连续性或选择性释放装置内，例如，多种膜如，但不局限于在毛果芸香碱(OcusertTM)系统内采用的那些膜(Alza Corp，Palo Alto，Calif)。作为另外的一种实施方案，这些活性化合物可以被置于眼睛上的隐形眼镜包含、携带、或附接到隐形眼镜。本发明的另一个实施方案涉及包含在可以用于眼表面的一种拭子或海绵内的活性化合物。本发明的另一个实施方案涉及包含在可以用于眼表面的一种液体喷雾剂内的活性化合物。本发明的另一个实施方案涉及直接进入泪腺组织或在眼部表面上的活性化合物的一种注射剂。

当用于治疗干眼症的本发明的药用组合物用作一种眼用溶液时，它被提供为任何用于眼用溶液的剂型，例如，一种水性滴眼剂(如水性眼用溶液、水性悬浮眼用溶液、粘稠眼用溶液、以及增溶的眼用溶液)、或一种非水性眼用溶液(如非水性眼用溶液和非水性悬浮眼用溶液)。在这些剂型中，优选水性眼用溶液。

当用于治疗干眼症的本发明的药用组合物制备成一种水性眼用溶液时，只要对本发明的目的没有不利的影响，其中可以方便地包含各种通常用于水性眼用溶液的添加剂。这类添加剂的例子包括缓冲剂、等渗剂、防腐剂、增溶剂(稳定剂)、pH调整剂、增稠剂、以及螯合剂。

这些缓冲剂可以选自但不限于下组，该组包括：一种磷酸盐缓冲液、一种硼酸盐缓冲液、一种柠檬酸盐缓冲液、一种酒石酸盐缓冲液、一种醋酸盐缓冲液(例如，醋酸钠)以及一种氨基酸。

该等渗剂可以选自但不限于下组，该组包括：糖类(如山梨醇、葡萄糖、以及甘露醇)、多元醇类(如甘油、聚乙二醇、以及聚丙二醇)、以及盐类如氯化钠。

这些防腐剂可以选自但不限于下组，该组包括：苯扎氯铵、苄索氯铵、烷基对羟基苯甲酸盐(如对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸乙酯)、苯甲醇、苯乙醇、山梨酸和它的盐类、硫柳汞以及三氯叔丁醇。

这些增溶剂(稳定剂)可以选自但不限于下组，该组包括：环糊精及其衍生物、水溶性聚合物(如聚乙烯吡咯烷酮)、以及表面活性剂(如聚山梨醇酯80)(商品名：吐温80)。

这些pH调节剂可以选自但不限于下组，该组包括：盐酸、醋酸、磷酸、氢氧化钠、氢氧化钾、以及氢氧化铵。

这些增稠剂可以选自但不限于下组，该组包括：羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、以及羧甲基纤维素及其盐类。

这些螯合剂可以选自但不限于下组，该组包括：依地酸钠、柠檬酸钠、以及缩聚磷酸钠。

当用于治疗干眼症的本发明的药用组合物制备成一种眼用软膏时，必须存在一种基质化合物。该眼用软膏的基质可以选自但不限于下组，该组包括：纯化羊毛脂、VASELINE

、液体石腊和聚乙烯的复合软膏基质(plastibase)、液体石蜡、以及聚乙二醇。

可替代的，可以使用药学上可接受的压片赋形剂将本发明的组合物配制成用于口服给药，这些赋形剂包括乳糖、微晶纤维素、玉米淀粉、硬脂酸等。口服给药还可以包括配制在水、乙二醇类、油类、醇类等中的一种液体组合物。

共同给药

当本发明的这些方法包括共同给药时，共同给药是指给予第一量的β-转角模拟肽环状化合物或其一种药学上可接受的盐与第二量的至少一种药剂，这些药剂选自下组，其组成为：抗炎剂(如RESTASIS

(Allergan))、粘蛋白刺激剂(如Diquafasol(Inspire Pharmaceuticals)15-(S)-HETE(Alcon)、瑞巴派特(Otsuka)、以及依卡倍特(ISTA))、激素药剂、以及泪腺刺激剂(如雄激素泪液(Allergan))、以及人工泪液，其中该第一和第二量共同包括治疗在需要治疗的受试者的干眼症的一个有效的量。共同给药包括以一种基本上同时的方式给予共同给药的这些化合物的第一量与第二量，如在一种单一的药用组合物中或在多种药用组合物中。另外，这种共同给药还包括以任一顺序的一种序贯的方式使用每一种化合物。。当共同给药涉及分开给予该β-转角模拟肽环状化合物或其一种药学上可接受的盐的第一量以及选自下组的至少一个药剂的第二个量时，该组的组成为：抗炎剂(如RESTASIS

(Allergan))、粘蛋白刺激剂(如Diquafasol(Inspire Pharmaceuticals)15-(S)-HETE(Alcon)、瑞巴派特(Otsuka)、以及依卡倍特(ISTA))、激素药剂、以及泪腺刺激剂(如雄激素泪液(Allergan))、以及人工泪液；这些化合物在充分接近的时间内给药从而具有所希望的治疗效果。例如，导致所希望的治疗作用的每一给药之间的时间段范围可以是从数分钟到数小时，并且可以考虑每一化合物的性质如效能、溶解度、生物利用率、血浆半衰期、以及动力学曲线而确定。

剂量

一种β-转角模拟肽环状化合物的一个有效量将取决于患者的年龄、性别、以及重量、该患者目前的医疗条件以及被治疗的干眼症疾病的性质。熟练的业内人士将能根据这些及其他因素确定适当的剂量。例如，当本发明的药用组合物用作一种眼用溶液用于治疗在一个对其有需要的受试者中的干眼症时，所希望的是一种水溶液滴眼剂含有大约0.001至2.5(w/v)％，如从0.02至2.0(w/v)，例如从约0.03至1.5(w/v)％，例如从约0.05至1.0(w/v)％的一个量的本发明的一种化合物的一种活性成分。如在此使用的，重量/体积(w/v)代表在一个具体的最终体积中的溶质的具体质量(如、g/ml)。在给予本发明的这些化合物以及组合物时，可以给予每日一次或多个日剂量，如每日两次、每日三次、以及每日四次。在一种特别优选的实施方案中，可以在一至五滴的剂量给予本发明的化合物以及组合物，例如一滴、两滴、三滴、四滴、或五滴。

当本发明的药用组合物用作一种眼用软膏时，所希望的是一种眼用软膏含有大约0.001至2.5(w/v)％(如从0.02至2.0(w/v)，例如从约0.03至1.5(w/v)％，例如从约0.05至1.0(w/v)％)的一个量的本发明的一种化合物的一种活性成分，。如在此使用的，重量/重量(w/w)代表在最终重量的该溶液中的溶质的重量(如、g/g)。当给予本发明的这些化合物以及组合物时，可以给予每日一次或多个日剂量，如每日两次、每日三次、以及每日四次。

以下是本发明的多个实例实施方案的说明。

在此引证的全部专利、公开的申请以及参考文献的传授内容通过引用以其全文进行结合。

尽管本发明已经参照其实例实施方案做了具体的显示和说明，应当被本领域中的那些普通技术人员理解的是通过在在不偏离由所附的权利要求涵盖的本发明的范围下可以从中做出在形式和细节上的不同的变化。

实施例

实施例1

β-转角模拟肽环状化合物对来自大鼠结膜杯状细胞的糖缀合物分泌的影响

动物：

采集称重在250与300g之间的雄性Sprague-Dawley大鼠(n＝4)的大鼠结膜下组织。

细胞培养：

与Rios，J.D.等人描述于“Role of Neurotrophins and Neurotrophin Receptors in Rat Conjunctival Goblet Cell Secretion and Proliferation，Ophthalmology & Visual Science，48：1543-1551(2007))中的细胞培养和测定过程类似，建立了来自大鼠下结膜组织的外植体培养物。来源于这些外植体的细胞在添加有10％胎牛血清(FBS)以及青霉素(100U/mL)/链霉素(100μg/mL)的RPMI1640中于37℃下在增湿的5％CO₂气氛中生长72小时。通过将它们从平板刮除而除去污染性的非杯状细胞。在这段时间期间，杯状细胞从这些碎片迁移并且开始增殖。一周以后，用胰蛋白酶治疗这些杯状细胞并且铺板于具有添加有10％的FBS的RPMI-1640培养基的二十四孔培养平板中。

糖缀合物分泌的测量：

为了测量糖缀合物分泌，在加入神经生长因子(NGF)、卡巴胆碱(Cch)、化合物D3、化合物3Aa、以及化合物3Ak之前两小时，这些结膜杯状细胞生长至会合并且被剥夺血清两小时。以30μm(微摩尔)、10μm、1μm、以及0.3μm的浓度给予化合物D3、3Aa、以及3Ak。还包括用于溶解这些化合物的载体二甲亚砜(DMSO)。用在0.1％(v/v)的DMSO作为化合物的30μM浓度的基础对照。加入100μM(微摩尔)的胆碱能激动剂卡巴胆碱(Cch)，用于糖缀合物分泌的阳性对照。通过酶联凝集素测定(ELLA)测量分泌进入这些培养基的糖缀合物的量。收集这些培养基并且用于分析这些凝集素可检测的糖缀合物(包括粘蛋白)的量。通过使用对于大鼠结膜杯状细胞粘蛋白是特异性的凝集素UEA-I测量分泌的量。使用了生物素酰化的UEA-I凝集素和碱性磷酸酶标记的抗生蛋白链菌素，如在Rios，J.D.等人在“Role of Neurotrophins and Neurotrophin Receptors in Rat Conjunctival Goblet Cell Secretion and Proliferation，Ophthalmology & Visual Science，48：1543-1551(2007)中的描述，其全部内容通过引用结合在此。移出这些细胞并且进行超声处理，并且通过使用Bradford蛋白测定法分析该细胞均浆的蛋白质的总量。这种测定法显示在每一个孔中的蛋白质的量相等。用基础上的增加(x倍)来代表糖缀合物的分泌。

细胞增殖的测量：

使结膜杯状细胞在24孔培养平板中生长至亚会合，然后被剥夺血清二十四小时。在具有或不具有增加的浓度的化合物D3、化合物3Aa、以及化合物3Ak的添加有0.5％的BSA作为一种蛋白质源的无血清RPMI中孵育细胞二十四小时(图4)。给予浓度为30μm(微摩尔)、10μm、1μm、以及0.3μm的化合物D3、3Aa、以及3Ak。用添加有10％的FBS的RPMI作为细胞增殖研究中的阳性对照。用一种测量细胞数量的比色非放射性WST-8增殖测定法测定了CGC增殖。这个步骤使用了2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-2H-四唑单钠盐(WST-8)，它通过活的生长线粒体裂开从而形成一种深蓝色的甲臜产物，通过一种荧光ELISA酶标仪(Bio-Tek，Winooski，VT)在460nm下检测该产物。

数据展示：

将对于CGC糖缀合物分泌和增殖的数据表达为高于基础值的增加(x倍)，该基础值被标准化为1.0。例如，对于0.3μM(微摩尔)、1μM、以及10μM的剂量，CGC糖缀合物的分泌和增殖被表达为测试化合物超过未治疗细胞。对于30μM的剂量，CGC糖缀合物的分泌和增殖被表达为用测试化合物超过DMSO未治疗细胞。结果用平均值±sem来代表。

结果：

糖缀合物分泌的这些结果显示于图2和图3中。NGF在基础上以1.3±0.1倍增加了CGC糖缀合物的分泌。Cch，一种已知的杯状细胞激动剂，在基础上以1.3±0.3倍增加了CGC糖缀合物的分泌。

化合物D3增加了CGC糖缀合物的分泌并且显示出一种浓度依赖性趋势。化合物D3增加了CGC糖缀合物的分泌如下：在基础上的1.7±0.7倍(30μM)、在基础上的1.6±0.3倍(10μM)、在基础上的1.6±0.2倍(1μM)、以及在基础上的1.3±0.2倍(0.3μM)。

化合物3Aa增加了CGC糖缀合物分泌如下：在基础上的2.1±0.7倍(30μM)、在基础上的1.7±0.4倍(10μM)、在基础上的1.6±0.3倍(1μM)、以及在基础上的2.1±0.3倍(0.3μM)。与NGF和Cch相比较，化合物3Aa显示出更高的CGC糖缀合物分泌的增加。

化合物3Ak没有显示如化合物D3和3Aa一样强的作用，但的确显示出了活性。化合物3Ak的CGC糖缀合物分泌的结果如下：在基础上的1.1±0.3倍(30μM)、在基础上的1.2±0.1倍(10μM)、在基础上的1.1±0.3倍(1μM)、以及在基础上的1.4±0.3倍(0.3μM)。

细胞增殖的结果显示在图4中。在该增殖测定中，这些在任何浓度下的化合物没有一种被测试出在孵育24小时后诱导了杯状细胞的增殖。作为对照，10％的胎牛血清(FBS)在基础上以3.4±1.0倍增加了CGC增殖，并且NGF在基础上以1.6±0.3倍增加了CGC增殖。

测试的这些β-转角模拟肽环状化合物刺激了粘蛋白的分泌，并且，因此在治疗对其有需要的受试者的干眼症疾病的方法中可以是有用的。

实例2

化合物D3在大鼠结膜杯状细胞中对糖缀合物分泌、增殖以及信号转导中的作用

这项研究的目的是确定化合物D3在培养的大鼠结膜杯状细胞中对糖缀合物分泌以及增殖的效果，并且研究化合物D3的用于刺激分泌的信号转导通路。

动物：

从Charles River(Wilmington，MA)获得六至八周龄的雄性Sprague-Dawley大鼠。将动物每笼2只收容在恒定光照条件(12小时光照/12小时黑暗周期)、室温(22℃±1℃)、以及相对湿度(40％-70％)下。在这项研究中的所有规程遵照了McGill大学的动物福利政策，并且经Lady Davis研究所(LDI)动物管理与使用委员会批准。对于动物照管和使用的这些标准符合或超过在加拿大动物动物保护协会CCAC)中所定义的那些标准。

结膜组织的分离：

在安乐死前将动物在一种异氟烷99.9％ USB(Abraxis Bioscience，Richmond Hill，Ont)室中进行麻醉。通过致死量的戊巴比妥钠2mL/0.4kg或300mg/kg(Ceva Sante Animale，Libourne，法国)使动物安乐死。将结膜组织(更具体地说瞬膜和穹窿)切离并且立即放进含有3X青霉素-链霉素(300ug/mL)的Hanks平衡盐溶液中。该穹窿标识为沿着球结膜和睑结膜的交界处的褶的后部移行的带。抓住并提起穹窿的较低的鼻部分，并且将它从结膜切除。

结膜杯状细胞的培养：

从Wisent(St.Bruno，Quebec)获取RPMI-1640培养基、胎牛血清(FBS)、青霉素-链霉素、以及Hank’s平衡盐溶液。L-谷氨酰胺以及0.05％胰蛋白酶-EDTA来自于Gibco(Grand Island，NY)。组织培养瓶和培养皿来自于Corning(Lowell，MA)，并且Laboratory Tek腔室玻片来自于Nunc(Rochester，NY)。

来自外植体培养物的结膜杯状细胞的培养如前描述于Shatos，M.等人的“Isolation，Characterization，and Propagation of Rat Conjunctival Goblet Cells InVitro，”IOVS 42：1455-1464(2001)”中，其全部内容通过引用结合在此。将组织精细切碎并且将单独的碎片在0.5mL的完全RPMI-1640(添加有10％的FBS、2mM谷氨酰胺、以及100μg/mL的青霉素-链霉素)中固定在划线的6-孔培养皿上，并且在37℃下在增湿的5％ CO₂的气氛中孵育。每2天对外植体培养物重新喂料。在少数几天内，杯状细胞从这些碎片迁移并且开始增殖。在大约一周后，除去组织栓并且允许这些杯状细胞生长至会合。通过使用0.05％的胰蛋白酶-0.53mM EDTA对粘附细胞进行胰蛋白酶消化进行一次传代，并且用完全RPMI-1640培养基铺板于8-孔Laboratory Tek腔室玻片中(组织化学)或于96孔中(增殖)、24孔(分泌)、或6孔(蛋白质印迹)培养平板中。

组织化学：

将细胞固定并且治疗用于高碘酸-希夫氏(PAS)染色、并且根据制造商的说明用苏木精溶液、(Gill No.3试剂盒)(Sigma Aldrich，St.Louis，MO)进行复染色。所有步骤在室温下进行。简言之，将细胞在甲醇中固定15分钟。将载玻片在自来水中冲洗1分钟，在高碘酸溶液中染色5分钟，在蒸馏水中冲洗5次，在希夫氏(Schiff’s)试剂中浸渍15分钟，在自来水中洗涤5分钟，在苏木精溶液中染色90秒，在自来水中冲洗15-30秒，风干并且装入Vectamount中(Vector Labs，Burlingame，CA)。检查载玻片并且用一种装备有Leica DFC480照相机的Leica DM LB 2显微镜照像。

测试物品以及溶液的制备：

将Mimetogen Pharmaceuticals(Montreal，Quebec，加拿大)制造的化合物D3(盐酸盐，批号12-95)溶解于盐水中从而给出一种10mM的储备溶液。

NGF(重组的人类的)是一种在缓冲液[20mM醋酸钠、136mM氯化钠、pH 5.5]中的3.16mg/mL的溶液并且冷藏保存(2℃-8℃)。就其在纳摩尔浓度下导致PC 12细胞分化的能力而测试该溶液的生物活性。

将佛波醇-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯(PMA)(Sigma，St.Louis，MO)制备为一种10-mg/mL(16.2mM)的在DMSO中的储备溶液。

在这些实验之前，将测试物品在培养基中稀释到如在这些图中所说明的终浓度。用盐水载体对照将这些基础培养物孵育。

培养的杯状细胞的生长、形态学、以及表征

早在建立了组织栓的2天后，细胞开始从该组织长出并且持续生长以致在第9天在该组织周围可见粘附细胞(图5A)。在高倍放大下，粘附至组织培养孔的多个单细胞显示出鹅卵石样形态(cobblestone morphology)并且在细胞质囊泡中含有微小的透明液滴(图5B)。通常当细胞在培养中增殖时，观察到在这些杯状细胞的表面上形成微小的液滴，提示一种粘液样分泌产物(图5C空心箭头)。在这些含有液滴的细胞在培养中生长时，这些液滴合并成池，它在大小和数量上增加了(图5C，封闭箭头)。这些结果类似于以前发表的结果(Shatos，M.等人“Isolation，Characterization，and Propagation of Rat Conjunctival Goblet Cells In Vitro，”IOVS 42：1455-1464(2001)，其全部内容通过引用结合在此)。

确定这些细胞具有对PAS的阳性反应性，表明这些细胞与一种中性型的粘蛋白分泌产物有关(图6A)。在更高的放大率(100x)下，观察到许多细胞质核周囊泡(图6B，空心箭头)。在检查时，这些囊泡中的一些与PAS强烈染色，表明在分泌颗粒内存在中性(粉红色至红色)糖缀合物(FIG.6B and C，closed arrows)。将这些细胞用苏木精/曙红染色复染为蓝色。

终点和结果：

如以下详细论述，化合物D3增加了在结膜杯状细胞中的粘蛋白分泌，在2μM剂量下可见最大增加。另外，化合物D3在高达100μM的浓度下在第4天没有刺激杯状细胞增殖，在多个剂量之间没有差异。最后，用化合物D3对结膜杯状细胞治疗五分钟增加了丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)磷酸化。

糖缀合物分泌

为了测量细胞分泌，使杯状细胞生长至会合，然后在刺激之前耗尽血清2小时。将细胞在无血清RPMI中与化合物D3(在2、10、以及50μM)、NGF(在0.1、1、以及10nM)、以及PMA(在0.1、1、以及10nM)孵育2小时。使用一种酶联凝集素测定法(ELLA)测量杯状细胞的分泌。简言之，将细胞培养上清液的等分部分一式三份转移到一种96-孔聚苯乙烯微量滴定板(Corning Life Sciences #2592，Fisher Scientific，Nepean，Ont)。每一板上包括牛下颚粘蛋白(BSM)(Sigma，St.Louis，MO)的稀释系列作为标准(未显示标准曲线数据和显示BSM的检测是线性地在0.003μg与0.1μg之间的数据)。通过在37℃下蒸发过夜包被这些板。然后，将这些板用缓冲液[含有0.3％BSA、0.05％Tween-20的PBS]洗涤三次，然后用含有3％BSA和0.05％Tween-20的PBS在37℃下封闭1小时以用于非特异性结合。将这些孔在洗涤缓冲液中冲洗三次，然后在稀释于洗涤缓冲液中的2μg/ml的生物素酰化的UEA-1(Vector Labs，Burlingame，CA)中在37℃下孵育1小时。将这些孔在洗涤缓冲液中冲洗三次，然后在稀释于洗涤缓冲液中的1μg/mL的HRP结合的中性链亲和素(HRP-conjugated neutravidin)(Pierce，Rockford，IL)中在37℃下孵育1小时。将这些孔在洗涤缓冲液中冲洗三次之后，用TMB(Promega，Madison，WI)进行显色并且用0.5N的硫酸终止。在Benchmark Plus(Biorad)上在450nm下读取吸光率。将留存在这些培养孔中的杯状细胞刮入RIPA缓冲液中[1％ TritonX-100、20mM Tris-HCl pH 7.5、150mM NaCl、1.5mM MgCl₂、1％去氧胆酸钠、1mM EGTA、1mM EDTA、0.1％SDS、10％甘油、1mM钒酸钠、10mM氟化钠、10mM焦磷酸钠、完全不含微量EDTA的蛋白酶抑制剂(Roche Applied Science，Indianapolis，IN)]或刮入1M的Tris-缓冲液(pH 7.5)，收集并且超声处理。使用牛血清白蛋白(BSA)的稀释物系列作为标准品(BioRad，Montreal，PQ)使用Bradford蛋白测定试剂盒分析细胞均浆中的蛋白质的量。将糖缀合物的分泌标准化为均浆中的总蛋白。然后将数据代表为在基础上的增加的倍数。

为了确定化合物D3是否刺激了杯状细胞粘蛋白分泌，在化合物D3(2、10、以及50μM)、或NGF(0.1、1、以及10nM，阳性对照(Ríos，J.等人“Role of Neurotrophins and Neurotrophin Receptors in Rat Conjunctival Goblet Cell Secretion and Proliferation，”IOVS 48：1543-1551(2007)，其全部内容通过引用结合在此)、或PMA(0.1、1、以及10nM，另一个阳性对照(Dartt，D.等人“Regulation of Conjunctival Goblet Cell Secretion by Ca2+ and Protein Kinase，”C.Exp Eye Res 71：619-628(2000)，其全文通过引用结合在此)存在下将培养的传代的杯状细胞孵育2小时。使用如先前描述于Ríos，J.等人在[“Immunolocalization of Muscarinic and VIP Receptor Subtypes and Their Role in Stimulating Goblet Cell Secretion，”IOVS 40：1102-1111(1999)，其全文通过引用结合在此]中的生物素酰化的凝集素UEA-1，用ELLA确定了分泌进入该培养基的高分子量糖蛋白的量。在表1中显示了来自培养的杯状细胞(来自四只独立的大鼠)的粘蛋白分泌的原始数据。

表1：杯状细胞糖缀合物分泌的原始数据

大鼠与大鼠之间的粘蛋白分泌有很小的差异，基础分泌在2.0μg和9.9μg糖缀合物/mg蛋白之间的范围。阳性对照NGF以一种剂量依赖性方式增加了粘蛋白的分泌(在10nM下高达1.55±0.18倍)(表2)。其他阳性对照，PMA以大约1.4倍增加了粘蛋白的分泌，它不是剂量依赖性的。化合物D3增加了粘蛋白分泌；在2μM下见到最大增加(1.49±0.33倍)。这些治疗彼此没有具有统计学显著意义(P＝0.7429)。这些数据的图形展示显示在图7中。

表2：糖缀合物分泌倍数的增加

细胞增殖：

根据制造商的试验计划使用来自Biosource(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)的Alamar Blue测量细胞增殖。将来自两只大鼠的培养的杯状细胞在添加有0.5％BSA的无血清RPMI中血清饥饿24小时，然后加入FBS(10％，阳性对照)、NGF(10pM至10nM)、化合物D3(0.1至100μM)或在10μM或100μM MIM-D3存在下的NGF(10pM至10nM)，并且进一步在37℃下在增湿的5％CO₂气氛中孵育。在24小时后，添加10％ Alamar Blue 6小时并且在Benchmark Plus(Biorad)上在570nm和600nm处读取吸光率。根据制造商的说明计算Alamar Blue还原的百分比。将含有AlamarBlue的板在37℃下进一步孵育48、72、以及96小时，并且每天重读这些板。

在10％FBS的存在下测量杯状细胞增殖直到四天。用10％的FBS获得在增殖方面随着时间的统计学上有显著意义的增加(在第3天为247±2倍，P＜0.0001)。在用10％的FBS孵育三天后，由于高细胞数或孵育时间的延长使Alamar Blue的还原百分率降低。为了确定化合物D3和NGF是否刺激了杯状细胞增殖，在增加化合物D3(图8)或NGF浓度的存在下将杯状细胞在无血清培养基中孵育直到四天。直到第四天，在所有浓度下的NGF并没有增加增殖。高达100μM的浓度的化合物D3在第四天没有刺激杯状细胞增殖(未显示小于3μM的浓度)，在剂量反应之间没有差异(P＝0.1098)。用10μM或100μM的NGF与化合物D3相组合对增殖没有影响(数据未显示)。

MAPK：

使用蛋白质印迹技术检测p42/44MAPK的激活。杯状细胞在无血清RPMI中血清饥饿4-6小时，然后在37℃下加入PMA(100nM)、NGF(1nM或10nM)、或MIM-D3(10μM或50μM)5分钟。然后，将细胞在冷PBS中冲洗一次，在100μl的1xSDS-PAGE样品缓冲液[62.5mM的Tris-HCl pH 6.8、10％甘油、2％SDS、5％的β-巯基乙醇、0.02mg/mL的溴酚蓝]中刮下并且超声处理20分钟。在4℃下将这些均浆在14,900g下离心15分钟。通过SDS-PAGE(8％丙烯酰胺凝胶)将在30-μL等分部分的上清液中的蛋白质分离并且转移至硝酸纤维素膜。将这些膜在含有5％脱脂奶粉、20mM Tris-HCl(pH 8.0)、150mM NaCl、以及0.01％Tween-20的缓冲液中封闭2小时。然后在4℃下用含有5％BSA的在TBST中的直接针对磷酸化形式的MAPK1/2的一种抗体(Calbiochem，San Diego，CA)在0.1μg/mL下过夜探查这些印迹，随后在室温下在含有5％脱脂奶粉的TBST中的HRP结合的第二抗小鼠抗体(Sigma，St.Louis，MO)中孵育1小时。使用增强化学发光法(Perkin Elmer，Waltham，MA)使这些免疫反应性条带可视化。在55℃下在剥离缓冲液[62.5mMTris-HCl pH 6.8，2％ SDS，0.1M β-巯基乙醇]中剥离这些印迹30分钟，随后用含有5％脱脂奶粉的在TBST中的直接针对肌动蛋白的一种抗体(1∶5000稀释，Sigma，St.Louis，MO)再探查，并且在HRP结合的第二抗兔抗体中孵育。将这些免疫反应性条带在EPSON扫描仪上进行数字式扫描，并且使用NIH ImageJ v1.38x进行分析。将在每一样品中的磷酸化MAPK的量标准化为在该样品中的总肌动蛋白的量。

为了确定化合物D3和NGF是否经由MAPK途径的激活而诱导糖缀合物分泌，通过10μM和50μM化合物D3、1nM和10nM NGF或PMA(100nM，阳性对照)刺激来自3只独立的大鼠的培养的杯状细胞5分钟，并且通过蛋白质印迹分析测量了MAPK活性。来自3只独立的大鼠的杯状细胞培养物的一种代表性的蛋白质印迹显示在图9中，并且定量显示在图10中。对于MAPK激活的治疗具有在统计学上显著的效果(P＜0.0001)。在10μM和在50μM的化合物D3以在基础上的2.5±0.3倍以及2.2±0.5倍增加了MAPK活性，并且在1nM和在10nM的NGF以2.8±0.5倍(P＜0.05)以及1.7±0.2倍增加了MAPK活性。该阳性对照PMA在统计学上显著增加了MAPK活性6.1±0.7倍(P＜0.01)。

数据显示以及统计分析：

数据代表为在基础值(标准化到1.0)以上的增加(x倍)。数据代表为平均数±SEM。使用GraphPad Prism v4.0c(GraphPad Software Inc.，La Jolla，CA)通过单因素方差分析(one-way ANOVA)分析数据。P＜0.05被认为是统计上显著的。为了与基础对照进行比较，使用了以Dunnett’s检验进行的调整。

实例3

东茛菪碱诱导的干眼症模型(化合物D3)

这项研究的目的是使用干眼症的东茛菪碱模型来研究化合物D3的疗效。基于早先的将人工气候室(CEC)与干眼症的东茛菪碱模型进行比较的研究来选择东茛菪碱模型。

动物：

从Charles River(Wilmington，MA)获得称重在300g与350g之间的雄性Sprague-Dawley大鼠。将动物收容在恒定室温(22℃±1)、光照条件(12小时光照/12小时黑暗周期)、以及湿度(40％-60％)的动物住处中。将动物在外科手术实验和临床检查之前用异氟烷进行麻醉。

通过胆碱能阻滞诱导干眼症：

使用东茛菪碱(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)诱导了干眼症，并且在肩胛骨之间的中间背侧区域通过皮下植入充满东茛菪碱的一种渗透泵(2ML4 Alzet

；CedarLane，Burlington，Ontario)将东茛菪碱持续而全身性地递送至这些动物。用2-3个创缘夹将该创伤闭合。在手术后并且再次在第二天用卡布洛芬(0.5mg/100g)(一种非甾体抗炎药以及在啮齿动物中有效的长效的镇痛剂)皮下注射这些动物。在外科手术泵植入之前以及全部临床终点测试之前，将动物在一种异氟烷99.9％USP(Abraxis Bioscience，Richmond Hill，Ontario)室中麻醉。将东茛菪碱以12.5mg/天递送，并且出于技术原因在第14天评估数据。

在盐水(0.9％)中制备氢溴酸东茛菪碱(Sigma-Aldrich，St.Louis MO)的0.175g/mL的无菌溶液并且通过一种0.22μm的注射器末端过滤器(Millex-GC，Millipore Corp.，Bedford，MA)过滤。根据制造商的说明将多个2ML4 Alzet

泵充满2mL的0.175g/mL的东茛菪碱溶液。

治疗组：

测试的大鼠眼的组如下：

·1组：对照大鼠(n＝12只眼，来自6只大鼠)。

·2组：通过连续的东茛菪碱全身给药诱导出具有干眼症的大鼠(n＝12只眼，来自6只大鼠)，并且在第十四天进行了荧光素染色的测量。

·3组：通过连续的东茛菪碱全身给药诱导出具有干眼症的大鼠(n＝14只眼，来自7只大鼠)，并且在第八天用盐水局部治疗一次。

·4组：通过连续的东茛菪碱全身给药诱导出具有干眼症的大鼠(n＝14只眼，来自7只大鼠)，并且在第八天用5μl 1％(10mg/mL)的化合物D3滴注进行局部治疗一次。

干眼症的临床终点和结果：

如以下的详细论述，在第八天用局部的1％化合物D3治疗的组在角膜荧光素染色方面具有显著降低(p＜0.0001)，与在第十四天盐水治疗的对照相比较，具有1.1±0.1的平均评分，但是与未治疗的或东茛菪碱治疗的对照相比较，对水性泪液产生以及水性泪液更新(在第十三天测量)没有影响。

没有大鼠死亡，但是有两只大鼠发病(一个在2组并且一个在3组)，其中由于咀嚼而再打开了切割伤位置并且暴露了这些泵。对于这两只动物的临床体征数据被除外。从第二天向前在所有东茛菪碱治疗的动物(2-4组)中观察到了温和至严重的眼部刺激。大多数东茛菪碱治疗的动物眼显示出结膜充血、肿胀、以及结膜血性溢液。结膜充血和血性溢液通常消退了。然而，结膜肿胀延续贯穿该研究。在这些动物的给药期间甚至在麻醉下观察到了眼部刺激。

预治疗平均体重大约是350g，并且在组间没有统计上的差异(P＝0.3999)。到第14天在未治疗的对照组(1组)中平均体重增加至大约420g。在这三组接受东茛菪碱的组(2-4组)中平均体重增加至大约375g。从第7天开始持续经过第14天，治疗的体重降低具有统计学显著效果(P＝0.0042)。

角膜染色：

通过角膜的荧光素浸渍评价角膜干燥的临床体征。将在无菌盐水中配制的一滴1％荧光素钠(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)溶液滴注入麻醉动物的结膜囊中。此后，在荧光素滴注之后三分钟使用具有蓝钴滤光片的一种便携式裂隙灯检眼镜(Reichert Opthalmic Instruments，Depew，NY)在蓝光下观察角膜。对于各动物，以一种盲法记录眼表面的点状荧光阳性区域。这种测试的评分等级为从0到4，其中0＝没有染色，1≤25％表面染色，2＝25％-50％表面染色，3＝50％-75％表面染色，并且4≥75％表面染色。

如图11所示，对照组(初次接受试验)显示出几乎完全不存在角膜荧光素染色，具有0.8±0.1的平均评分(评分±SD)。该未治疗的干眼症组(仅用东茛菪碱)显示出一个显著程度的点状弥漫的角膜荧光素染色，在东茛菪碱泵植入后第十四天具有2.3±0.3的平均评分。在东茛菪碱泵植入后第八天用局部的盐水治疗的组在第十四天也显示出显著程度的点状弥漫的角膜荧光素染色，与未治疗的干眼症组相似，具有2.9±0.3的平均评分。在第八天用局部的1％化合物D3治疗的组的角膜荧光素染色具有显著降低(p＜0.0001)，与在第十四天盐水治疗的对照相比较具有1.1±0.1的平均评分。此外，在第十四天，在用局部的1％化合物D3治疗的组中的平均值(1.1±0.1)是与1组(未治疗的对照，0.8±0.1，p＞0.05)没有统计学差异的。

希尔默试验：

在用异氟烷轻度镇静的动物上用Zone-Quick标准化酚红棉线(FCI Ophthalmics，Marshfield Hills，MA)测量泪液产生。将这些棉线插入侧下方眼角并且原位留置三十秒。使用提供有精确度为1mm的纹线的尺子按毫米测量了该棉线的染色润湿部分的长度。如在以下章节中所描述，希尔默试验常规地与泪液荧光素清除率相组合。

在基线上，所有组的平均预治疗希尔默评分为13.7±4.2mm(P＝0.6943)。六天后，东茛菪碱治疗的动物具有比未治疗的对照更低的希尔默试验评分(即较少的泪液)(9.2±2.5mm相比于16.0±5.4mm，P＜0.0001)，与干眼症诱导对应。在第八天用盐水(3组)或1％化合物D3(4组)的单一局部剂量，随后为一个5天的无治疗期间。在第十三天，接受东茛菪碱的这些组与未治疗的对照(1组)相比较具有统计学显著的较低的希尔默试验评分(P＜0.0001)，在给药组之间没有统计学显著差异(图12)。与未治疗的或东茛菪碱治疗的对照相比，在第八天的1％化合物D3的单一局部滴注对水性泪液产生(如在第十三天测量的，五天后)没有影响。

泪液荧光素清除率：

评价了泪液荧光素清除率，正如描述的用于人体(Afonso，AA.等人，“Correlation of Tear Fluorescein Clearance and Schirmer Test Scores with Ocular Irritation Symptoms，”Ophthalmology 106：803-810(1999)，其全部内容通过引用结合在此)以及改进的用于大鼠(Chen，W.等人，“Keratoconjunctivitis Sicca Modifies Epithelial Stem Cell Proliferation Kinetics in Conjunctiva，”Comea 26：1101-1106(2007)，其全部内容通过引用结合在此)的方法。用异氟烷使动物轻度镇静并且将两微升的1％荧光素钠(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)溶液(在无菌的盐水中)施加到下结膜囊。在两分钟之内唤醒这些动物。十五分钟后，再次镇静这些动物并且用一种酚红棉线收集荧光素染色的泪液液体(正如用于希尔默试验)。将这些线立即密封在1.5mL的聚丙烯Eppendorf管避光保存直到荧光光度分析(fluorophotometric analysis)。按mm计的棉线润湿的长度确定了收集的泪液液体的体积。

随后，加入100μl的磷酸盐缓冲盐水(PBS)，将这些管在12,000rpm下旋转五分钟，并且将液体转移至一种96-孔聚苯乙烯微量滴定板上(Coming Life Sciences #2592，Fisher Scientific，Nepean，Ont.)。在每一板上制备一种标准孔，它包含放置在含有2μl的1％荧光素钠溶液的100μl的PBS中的一种酚红棉线。对该标准孔设置增益后使用一种荧光微板阅读仪(FLUOstar OPTIMA，BMG Labtech，德国)立即测量荧光。由这些荧光单位(FU)除以润湿棉线的毫米数计算出泪液中的荧光素的浓度(FU/mm)。

通过荧光素清除率测量水性泪液更新。在基线，平均荧光素清除率值是606±496FU/mm(P＝0.8920)。在数字上，在随后的第六天和第十三天的检查中，接受东茛菪碱的这些组具有比1组(未治疗的对照)更高的值(即较少的泪液更新)。这种差异在第13天是统计学显著的(0.0304)，但在第6天不是统计学显著的(P＝0.1117)(图13)。与未治疗的或东茛菪碱治疗的对照相比，在第八天的1％化合物D3的单一局部滴注对水性泪液更新[正如在第十三天(五天后)测量]没有影响。

统计分析：

用平均值和标准偏差(SD)来表征各研究组的数据。使用GraphPad Prism 4.0c(GraphPad Software Inc.，La Jolla，CA)对在每一观测的治疗组的体重和眼部体征进行单因素方差分析(ANOVA)。当由检查日分层时，当该治疗组是统计学显著时(p≤0.05，双侧)，进行了成对比较。为了与未治疗的对照(1组或A组)进行比较，使用了以Dunnett’s检验的调整。对于多重比较无须做修正。没有显示组间的P值，并且没有显示在各对平均值(报告P值为＞0.05、＜0.05、＜0.01或＜0.001)之间的差异。

实例4

化合物D3的局部滴注后在初次接受试验的大鼠中的泪液粘蛋白产生

进行了化合物D3的局部滴注在初次接受试验的大鼠中刺激粘蛋白产生的剂量范围研究。将三十只雄性sprague dawley大鼠分成五组，每组六只大鼠，用盐水、0.4％的化合物D3、1.0％的化合物D3、2.5％的化合物D3、以及0.00053％的NGF进行双侧治疗，每小时一次连续六小时。一旦麻醉，使用一种校准的微量移液器使每一动物接受5μl的测试物品的局部滴注(进入双眼的下结膜囊)。

在治疗之前将来自双眼的泪液洗涤物合并并且收集，随后每六小时滴注盐水、化合物D3、以及NGF。通过酶联凝集素测定法(ELLA)对泪液洗涤物的粘蛋白浓度进行评价。

用平均值和标准偏差(SD)来表征这些数据。粘蛋白浓度的差值是从多组大鼠中从治疗的值减去基线值而计算出的。使用配对t检验评价两组之间从基线的连续的粘蛋白变化。使用方差分析分析在两个治疗组以上之间的粘蛋白变化。将在治疗组之间的中位数粘蛋白变化对使用Wilcoxon秩和检验的零的理论中位数进行比较。具有P＜0.05的双侧检验被认为是统计学显著的。使用GraphPad Prism 4.0C(GraphPad Software Inc.，La Jolla，CA)进行统计分析。

这些结果证明：治疗后组间差异不是统计学显著的(p＝0.1430)。当在治疗组与基线之间做配对比较时，在用2.5％化合物D3治疗的动物的粘蛋白浓度有统计学显著的增加(图14)(从3.0±1.9ng/μL至7.0±4.5ng/μL，p＝0.0413)，但其他组没有(p＝0.1799至0.8454)。另外，组间差异不是统计学显著的(p＝0.0818)。当将组间差异对零的理论中位数进行比较时，在用2.5％的化合物D3治疗的组中有统计学显著的增加(4.0±3.5ng/μL，p＝0.0312)，但其他组没有(p＝0.1562至1.1250)。在数字上，在用化合物D3治疗的所有组中的粘蛋白浓度的平均数变化的增加是剂量依赖性的(图15)。

实例5

东茛菪碱诱导的大鼠干眼症模型(化合物D3和神经生长因子)

动物：

从Charles River(Wilmington，MA)获得称重在360g与470g之间的雄性Sprague-Dawley大鼠(六至八周龄)。将动物收容在恒定室温(22℃±1℃)、光照条件(12小时光照/12小时黑暗周期)、以及相对湿度(32％-61％)下的动物住处中。在外科手术泵植入以及所有临床终点测试之前，将动物在一种异氟烷99.9％USP(Abraxis Bioscience，Richmond Hill，Ontario)室中麻醉。

通过胆碱能阻断对干眼症的诱导：

使用氢溴酸东茛菪碱(Sigma-Aldrich，St.Louis，Missouri)诱导了干眼症，并且在肩胛骨之间的中间背侧区域通过皮下植入充满东茛菪碱的一种渗透泵(2ML4 Alzet

；CedarLane，Burlington，Ontario)将东茛菪碱持续而全身性地递送至这些动物。以12.5mg/天将东茛菪碱递送二十八天时间，其经由渗透泵转换为30.0±1.5mg/kg。

在盐水中制备一种0.175g/mL的氢溴酸东莨菪碱(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)的无菌溶液。经由一种0.22μm的注射器末端过滤器(Millex-GC，Millipore Corp，Bedford，MA)过滤该溶液，并且冷藏保存过夜。根据制造商的说明书将2mL的东茛菪碱溶液充入多个Alzet

渗透泵(型号2ML 4，批号10187-08，CedarLane Laboratories，Burlington，Ontario)。在这些泵的填充和操作期间使用无菌技术。

在手术后并且第二天再次用卡洛芬(0.5mg/100g)(一种非甾体抗炎药以及在啮齿动物中有效的长效的镇痛剂)皮下注入这些动物。将动物在第1天泵植入之前称重，然后每周一次进行4周。据报告这种给药方案在大鼠中诱导了干眼症(Viau S等人的“Time course of ocular surface and lacrimal gland changes in a new scopolamine-induced dry eye model，”Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol.，246：857-867(2008)，通过引用将其全部内容结合在此)。

治疗组：

如表3和图16所见，测试的大鼠眼的组如下：

·对照大鼠(n＝10只眼，来自5只大鼠)没有植入泵，并且贯穿该研究中未治疗(在此还将这个组称为“G1”)。

·通过连续的东茛菪碱全身给药诱导出具有干眼症的大鼠(n＝10只眼，来自5只大鼠)，并且在第五天开始每日用5μL盐水局部治疗持续经过第二十一天(在此还将这个组称为“G2”)。

·通过连续的东茛菪碱全身给药诱导出具有干眼症的大鼠(n＝10只眼，来自5只大鼠)，并且在第五天开始每日用5μL化合物D3的0.4％(4mg/mL)的溶液局部治疗持续经过第二十一天(在此还将这个组称为“G3”)。

·通过连续的东茛菪碱全身给药诱导出具有干眼症的大鼠(n＝10只眼，来自5只大鼠)，并且在第五天开始每日用5μL化合物D3的1.0％(10mg/mL)的溶液局部治疗持续经过第二十一天(在此还将这个组称为“G4”)。

·通过连续的东茛菪碱全身给药诱导出具有干眼症的大鼠(n＝10只眼，来自5只大鼠)，并且在第五天开始每日用5μL化合物D3的2.5％(25mg/mL)的溶液局部治疗持续经过第二十一天(在此还将这个组称为“G5”)。

·通过连续的东茛菪碱全身给药诱导出具有干眼症的大鼠(n＝10只眼，来自5只大鼠)，并且在第五天开始每日用5μL NGF的0.00053％(0.00526mg/mL)的溶液局部治疗持续经过第二十一天(在此还将这个组称为“G6”)。

每日治疗G2-G6持续十七天(直至并且包括第二十一天)。其后终止治疗，但是该研究继续一周。在治疗期间，在一种异氟烷容器中麻醉每一动物。一旦入睡，使用一种校准的微量移液器使每一动物接受5μl的测试物品的局部滴注(进入双眼的下结膜囊)。若还测试一种临床终点，将测试物品在测试结束时局部滴注。

表3.-治疗组

给药溶液的制备：

使用由Mimetogen Pharmaceuticals设计的一种配制品[是大约pH 7(通过EMD Chemicals的pH指示剂条确定)的缓冲盐水]制备化合物D3。三种局部给药溶液制备如下：

·使用溶解在845μL的无菌的milliQ水中的4.0mg的化合物制备一种0.4％的局部给药溶液。使用pH指示剂条用6.5μL的1.0N NaOH(VWR)将该溶液调节至大约pH 7，并且通过加入148.5μL的无菌的1.0M的NaCl使其等渗(0.9％NaCl)。

·使用溶解在845μL的无菌的milliQ水中的10.0mg的化合物制备一种1.0％的局部给药溶液。用20μL的1.0N NaOH将该溶液调节至大约pH 7，并且通过加入135μL的无菌的1.0M NaCl使其等渗。

·使用溶解在845μL的无菌的milliQ水中的25.0mg的化合物制备一种2.5％(最大溶解度)的溶液。用20μL的1.0N NaOH将该溶液调节至大约pH 7。通过加入135μL的无菌的1.0M NaCl将该溶液使其等渗。将所有溶液超声处理5分钟。将所有化合物D3溶液冷藏保存(2℃-8℃)用于持续该研究。

通过在600μL的无菌的0.9％氯化钠注射液、USP(批号63-922-FW EXP 20100301)中稀释1μL的3.16mg/mL储备溶液来制备0.00053％NGF的局部给药溶液。每周制成一种新稀释的给药溶液，并且冷藏保存(2℃-8℃)。据报告这种浓度的NGF具有疗效：i)在切除第三个眼睑泪腺以后发展了干眼症的狗中(Coassin M，Lambiase A，Costa N等，Efficacy of topical nerve growth factor treatment in dogs affected by dry eye.Graefe′s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology 2005；243：151-155，通过引用将其全文结合在此)；以及ii)在屈光性角膜切除术(PRK)以后发展了角膜神经损伤的兔中(Esquenazi S，Bazan HEP，Bui V等，Topical Combination of NGF and DHA Increases Rabbit Corneal Nerve Regeneration after Photorefractive Keratectomy.Investigative Ophthalmology & Visual Science 2005；46：3121-3127，通过引用将其全部内容结合在此)。

使用了无菌的0.9％氯化钠注射液、USP(批号63-922-FW EXP 20100301)的局部给药溶液。将该盐水溶液在室温下保存。

干眼症的临床终点和结果：

如以下详细论述，在七天恢复期之后，对化合物D3的0.4％、1.0％、或2.5％的剂量的作用的评价显示：与未治疗的对照相比较，化合物D3的1％的剂量的增加了泪膜破裂时间(TBUT)、增加了粘蛋白产生、并且几乎完全恢复了角膜染色，但对于泪液产生(希尔默试验)、蛋白质测定、或荧光素清除率，与对照相比较没有显示任何统计学显著的差异。

泪膜破裂时间：

在第13天(在每日治疗8天以后)、第21天(在每日治疗16天以后)、以及第28天(在治疗停止7天以后)测试泪膜破裂时间。通过将10μL的荧光素钠溶液(0.2％在无菌盐水中)滴注进入麻醉动物的上结膜囊中评价TBUT。使眼睑手动眨眼以用泪膜分布该荧光素。在一种便携式裂隙灯检眼镜(Reichert Ophthalmic Instruments，Depew，NY)的钴蓝光下，眼部保持开放并且记录了直到在角膜前泪膜(Precorneal tear film)中出现一个或多个黑条的时间。对于每一只眼，用新鲜荧光素溶液作出最少重复三次的读数。

相比于在任何接受东茛菪碱的组中，在1组(未治疗的对照)中的泪膜破裂时间是最高的(表4和图17A、图17B)。在所有观察的治疗具有统计学显著的效果(分别地p＜0.0001、0.0349、以及＜0.0001)。在治疗期间(第13天)，接受东茛菪碱的所有组在统计学上显著不同于1组(p＜0.0001至0.0012)。当对5组(7.0±2.3秒，2.5％化合物D3)与4组(3.9±1.2秒，1.0％化合物D3)进一步做配对比较时，可见统计学显著的差异(p＝0.0160)。在治疗期间(第21天)，除4组和5组之外(1.0％和2.5％化合物D3)，所有接受东茛菪碱的组在统计学上显著不同于1组(p＝0.0167至0.0289)。在第28天，所有接受东茛菪碱的组在统计学上显著不同于1组(p＜0.0001至0.0054)。当对4组(6.4±1.2秒，1.0％化合物D3)与3组(4.3±0.8秒，0.4％化合物D3，p＝0.0204)、以及6组(4.2±0.8秒，NGF，p＝0.0165)进一步做配对比较时，可见统计学显著的差异。在七天恢复期后，与未治疗的对照相比较，化合物D3的1％的剂量增加了TBUT。相反，在七天恢复期后，化合物D3的0.4％与2.5％的剂量的TBUT没有差异。更高的剂量可能已经使在杯状细胞上的NGF受体不敏感，导致它们抵抗化合物D3的激动剂活性。该较低的剂量可能正是次优的。

虽然对于TBUT没有基线值，与未治疗的对照组以及盐水组相比的化合物D3的1％剂量的效果可以通过评价在第28天与第13天相比TBUT的变化而理解。与未治疗的以及盐水对照组相比较，化合物D3的1％剂量在统计学上显著地改进了TBUT(p＝0.0001)(FIG.20A)。另外，图21A展示了随着时间的推移与第13天相比较的在该盐水对照组和用化合物D3的1％剂量治疗的组中的TBUT的终点测量数据。

表4-泪膜破裂时间数据

除在第13天对于G3和G4之外，在每一观察中^an＝5

^bn＝3

^cn＝4

⁵组代码：

1)初次接受试验的；

2)东莨菪碱+盐水；

3)东莨菪碱+0.4％化合物D3；

4)东莨菪碱+1.0％化合物D3；

5)东莨菪碱+2.5％化合物D3；

6)东莨菪碱+0.00053％NGF

角膜染色：

在TBUT评估后立即通过角膜的荧光素染色评价角膜干燥的临床体征，并且在第13天(在每日治疗8天以后)、第21天(在每日治疗16天以后)、以及第28天(在治疗停止7天以后)进行测试。将一滴在无菌的盐水中配制的0.2％荧光素钠溶液滴注入麻醉的动物的上结膜囊中。此后在荧光素滴注之后两到三分钟使用具有蓝钴滤光片的一种便携式裂隙灯检眼镜(Reichert Ophthalmic Instruments，Depew，New York)在蓝光下观察角膜。对于每一动物，以一种蒙面的方式(masked fashion)记录角膜的点状荧光素染色区域。这种测试评分的等级是从0到4，其中0是等于未染色、1是小于25％的表面染色、2是25％-50％的表面染色、3是50％-75％的表面染色，并且4是大于75％的表面染色。

在数字上，接受东茛菪碱的这些组具有比1组(未治疗的对照)更高的值(即更多的损害)(表5和图18A-B)。在第13天和28天，组间差异是统计学显著的(p＜0.0001)，但在第21天不是(P＝0.0682)。在第13天，接受东茛菪碱的每一组是统计学上显著不同于1组的(p＜0.0001至0.0003)，但除5组(在统计学上显著不同于4组(p＝0.0352))之外，接受东茛菪碱的各组彼此无统计学上的显著差异(p＞0.0677)。在第28天，2、3、5、以及6组是统计学上显著不同于1组的(p＜0.0001至0.0007)。在4组(1％化合物D3)中的平均值1.3±0.3，其对于1组(未治疗的对照，0.9±0.7，p＝0.5136)是没有统计学上的显著差异的。同样在这一检查，4组与2、3、5、以及6组中所见的更高的值是有统计学上的显著差异的(p＜0.0001至0.0047)。在七天恢复期后，与未治疗的对照相比较，化合物D3的1％的剂量几乎完全恢复了角膜染色。相反，在七天恢复期后，对于化合物D3的0.4％与2.5％剂量，角膜染色没有差异。该更高的剂量可能已经使在杯状细胞上的NGF受体不敏感，导致它们抵抗化合物D3的激动剂活性。该较低的剂量可能正是次优的。

虽然对于角膜染色没有基线值，与未治疗的对照组以及盐水组相比的化合物D3的1％剂量的效果可以通过评价在第28天与第13天相比角膜染色的变化而理解。与未治疗的以及盐水对照组相比较，化合物D3的1％剂量在统计学上显著地改进了角膜染色(p＜0.0001)(图20B)。另外，图21B展示了随着时间的推移与第13天相比较的在盐水对照组和用化合物D3的1％剂量治疗的组中的角膜染色的终点测量数据。

表5-角膜染色数据

^a评分：0至4

在每个观察^bn＝5

⁶组代码：

1)初次接受试验的；

2)东莨菪碱+盐水；

3)东莨菪碱+0.4％化合物D3；

4)东莨菪碱+1.0％化合物D3；

5)东莨菪碱+2.5％化合物D3；

6)东莨菪碱+0.00053％NGF

注意到在所有检查的组之间在TBUT值与角膜染色评分之间的一种显著的负相关：TBUT值随着角膜染色评分的增加而降低(斯皮尔曼r＝-0.7606，p＜0.0001，n＝87XY对)。

粘蛋白产生的测定：

在将5μL无菌的盐水滴注进入已麻醉的动物的下结膜囊中后，在第12天(在每日治疗7天以后)、第19天(在每日治疗14天以后)、以及第28天(在停止治疗7天以后)，从所有六组大鼠收集泪液洗涤物。使这些眼睑轻轻眨眼以使泪膜与该盐水混合。用一种5μL体积的玻璃毛细管(Drummond Scientific Co，Broomhall，Pennsylvania)通过毛细管作用从在外眦中的泪液弯月面收集稀释的泪液液体。常规地收集大约4-5μl。在极干的眼中，在收集之前滴注入盐水的第二个5μl的等分部分。

通过酶联凝集素测定法(ELLA)测定在稀释的泪液洗涤物中的粘蛋白糖蛋白的浓度。将含有3μg总蛋白的一个样品在碳酸盐缓冲液(pH 9.2)中稀释至100μL，并且转移到一个96-孔聚苯乙烯微量滴定板上(Corning Life Sciences #2592，Fisher Scientific，Nepean，Ontario)。每一板上包括牛下颚粘蛋白(Sigma，St.Louis，Missouri)的稀释系列作为标准品。这些板通过在37℃下蒸发过夜来包被。之后，用洗涤缓冲液[含有0.3％BSA、0.05％Tween-20的PBS]将这些板洗涤三次，然后用包含3％BSA和0.05％吐温-20的PBS在37℃下封闭一小时用于非特异性结合。在洗涤缓冲液中将这些孔冲洗三次，然后在37℃下与在洗涤缓冲液中稀释的2μg/ml生物素酰化的UEA-1(Vector Labs，Burlingame，CA)孵育一小时。在洗涤缓冲液中将这些孔冲洗三次，然后在37℃下与在洗涤缓冲液中稀释的1μg/ml HRP-结合的中性链亲和素(Pierce，Rockford，Illinois)孵育一小时。这些孔在洗涤缓冲液中冲洗三次后，用TMB(Promega，Madison，Wisconsin)进行显色并且用0.5N硫酸终止。在泪液洗涤物中的粘蛋白的浓度被计算为粘蛋白ng除以泪液洗涤物(按μL计给出3μg总蛋白)的体积。

在每一观察测量了粘蛋白产生并且组间差异不是统计学显著的(p＝0.1066至0.7844)(表6以及图19A-B)。在数字上，与1组相比较(未治疗的对照，分别为2.9、6.8、以及1.5ng/μL)，在任何治疗组中的这些观察的每一次的最高平均值(3.3、9.1、以及6.8ng/μL)见于4组(化合物D3的1％剂量)。这种差异在第28天是统计学显著的(0.0312)，但在其他天不是(P＝0.6992至0.9973)。在七天恢复期后，通过化合物D3的1％剂量在粘蛋白产生的统计学显著的增加可能已经改进了泪膜的质量和稳定性。相反，七天恢复期后，对于化合物D3的0.4％与2.5％剂量的粘蛋白产生没有差异。该更高的剂量可能已经使在杯状细胞上的NGF受体不敏感，导致它们抵抗化合物D3的激动剂活性。该较低的剂量可能正是次优的。

虽然对于粘蛋白产生没有基线值，与未治疗的对照组以及盐水组相比的化合物D3的1％剂量的效果可以通过评价在第28天与第12天相比粘蛋白产生的变化而理解。与未治疗的组以及盐水对照组相比较，化合物D3的1％剂量在统计学上显著地增加了粘蛋白的产生(p＝0.0013)(图20C)。另外，图21C展示了随着时间的推移与第12天相比在盐水对照组和用化合物D3的1％剂量治疗的组中对于粘蛋白产生的终点测量数据。

表6-泪液洗涤物中的粘蛋白产生

在每个观察^an＝5

⁷组代码：

1)初次接受试验的；

2)东莨菪碱+盐水；

3)东莨菪碱+0.4％化合物D3；

4)东莨菪碱+1.0％化合物D3；

5)东莨菪碱+2.5％化合物D3；

6)东莨菪碱+0.00053％NGF

希尔默试验：

在干眼症诱导后第5、7、14、20、以及29天使用希尔默试验监测泪液产生。在用异氟烷轻度镇静的动物上用Zone-Quick标准化酚红棉线(FCI Ophthalmics，Marshfield Hills，Massachusetts)测量泪液产生。将这些棉线插入眼角的侧下方并且原位留置三十秒。使用提供有精确度为1mm的纹线的尺子按毫米测量了该棉线的染色润湿部分的长度。

对于30只大鼠(60只眼)手术前的希尔默泪液试验的平均值是11.9±3.8mm(p＝0.7228)。2天后，东茛菪碱治疗的动物具有比未治疗的对照更低的希尔默试验评分(即较少的泪液)(9.6±3.2mm对15.2±5.4mm，p＝0.1671)，并且将动物分配成组(表7)。在第5天，与未治疗的对照(17.7±4.4mm)相比，治疗的动物具一个8.5±2.2mm的平均希尔默试验评分，并且这种差异是统计学显著的(p＜0.0001)，与干眼症诱导相对应。在随后的检查中，与未治疗的对照(G1)相比，接受东茛菪碱的这些组具有统计学显著的较低的希尔默评分(p＜0.0001至0.0541，在第14天的界线)，在接受东茛菪碱的这些组间没有统计学显著的差异(表8和图22)。

表7-组分配

在每个观察^an＝5

²组代码：

1)初次接受试验的；

2)东莨菪碱+盐水；

3)东莨菪碱+0.4％化合物D3；

4)东莨菪碱+1.0％化合物D3；

5)东莨菪碱+2.5％化合物D3；

6)东莨菪碱+0.00053％NGF

表8-希尔默试验数据

在每个观察^an＝5

³组代码：

1)初次接受试验的；

2)东莨菪碱+盐水；

3)东莨菪碱+0.4％化合物D3；

4)东莨菪碱+1.0％化合物D3；

5)东莨菪碱+2.5％化合物D3；

6)东莨菪碱+0.00053％NGF

泪液荧光素清除率：

在干眼症诱导后第5、7、14、以及20天使用荧光素清除率试验测量泪液液体更新。评价了泪液荧光素清除率，正如描述的用于人体(Alfonso，AA.等人，“Correlation of Tear Fluorescein Clearance and Schirmer Test Scores with Ocular Irritation Symptoms，”Ophthalmology 106：803-810(1999)，以其全文通过引用结合在此)以及改进的用于大鼠(Chen，W.等人，“Keratoconjunctivitis Sicca Modifies Epithelial Stem Cell Proliferation Kinetics in Conjunctiva，”Cornea 26：1101-1106(2007)，以其全文通过引用结合在此)的方法。用异氟烷使动物轻度镇静并且将两微升的1％荧光素钠(Sigma-Aldrich，St.Louis，Missouri)溶液(在无菌的盐水中)施加到下结膜囊中。在两分钟之内唤醒这些动物。在十五分钟后，将这些动物再次镇静并且用一种酚红棉线收集荧光素染色的泪液液体(如对于希尔默试验所说明)。将这些棉线立即密封在1.5mL的聚丙烯Eppendorf管避光保存直到荧光光度分析。通过以mm计的棉线润湿长度测定收集的泪液液体的体积。之后，加入100μl的磷酸盐缓冲盐水(PBS)，将这些管在12,000rpm下旋转五分钟，并且将液体转移至一种96-孔聚苯乙烯微量滴定板上(Corning Life Sciences #2592，Fisher Scientific，Nepean，Ontario)。在每一板上制备一种标准孔，它包含放置入含有2μl的1％荧光素钠溶液的100μl的PBS中的一种酚红棉线。对该标准孔设置增益后使用一种荧光微板阅读仪(FLUOstar OPTIMA，BMG Labtech，德国)立即测量荧光。由这些荧光单位除以润湿棉线的毫米数计算出泪液中的荧光素的浓度(FU/mm)。

在基线，平均荧光素清除率值是387±427FU/mm(P＝0.7506)。在数字上，在随后的检查中，接受东茛菪碱的这些组具有比1组(未治疗的对照)更高的值(即较少的泪液更新)。这种差异在第7天是统计学显著的(0.0378)，但在其他天不是(P＝0.1242至0.4472)。在接受东茛菪碱的这些组间没有统计学显著的差异(表9和图23)。

表9-泪液荧光素清除率数据

在每个观察^an＝5

⁴组代码：

1)初次接受试验的；

2)东莨菪碱+盐水；

3)东莨菪碱+0.4％化合物D3；

4)东莨菪碱+1.0％化合物D3；

5)东莨菪碱+2.5％化合物D3；

6)东莨菪碱+0.00053％NGF

注意到在所有检查的组之间的泪液荧光素清除率值与希尔默测试值之间的一种显著的负相关。泪液荧光素浓度随着水性泪液产生的减少而增加(斯皮尔曼r＝-0.3306，p＜0.0001，n＝180XY对)。

东茛菪碱在大鼠中的作用：

没有动物死亡。从2天向前在所有东茛菪碱治疗的动物(G2-6)中观察到了温和至严重的眼部刺激。大多数东茛菪碱治疗的动物眼显示出结膜充血、肿胀、以及结膜血性溢液。结膜充血与结膜血性溢液通常在第二天消退，但是结膜肿胀延续贯穿该研究。预治疗平均体重大约是400g，并且在组间没有统计上的差异(P＝0.3927)(表10)。贯穿该研究这些未治疗的对照组(G1)中的平均体重增加至大约575g。在接受东茛菪碱的五个组中(G2-G6)，平均体重增加到大约425g至450g。从第14天开始持续经过第28天，治疗的体重降低具有统计学显著效果(p＜0.0001至0.0426)(图24)。

表10-体重

在每个观察^an＝5只大鼠

¹组代码：

1)初次接受试验的；

2)东莨菪碱+盐水；

3)东莨菪碱+0.4％化合物D3；

4)东莨菪碱+1.0％化合物D3；

5)东莨菪碱+2.5％化合物D3；

6)东莨菪碱+0.00053％NGF

统计分析

在应用时，将每只大鼠的眼部数据平均，并且因此实验动物变成待分析的单位(n＝5)。平均值和标准偏差(SD)被用来表征对于每一研究组的数据。对于体重和眼部体征(具有治疗组、检查天数、以及治疗组检查天数的因素)进行了双因素方差分析(PROC GLM)(PC-SAS，version 9.1.，SAS Institute，Cary NC)。当由检查日分层时，当该治疗组是统计学显著时(p≤0.05，双侧)，进行了成对比较。为了与未治疗的对照(1组)进行比较，使用了以Dunnett’s调整的LSMEANS。为了在组间进行比较，使用了LSMEANS。组间p值显示在数据表中，并且对所有的成对比较的推论p值进行了评定(数据未包括)。使用GraphPad Prism 4.0c(GraphPad Software Inc.，La Jolla，CA)使用斯皮尔曼等级相关系数评价在不同的终点测量之间的相关性。

进行了一种后验效能的计算。Whitley，E.and Ball，J.，″Statistics Review 4：Sample Size Calculations，″Critical Care，6：335-341(2002)，通过引用将其全文结合在此。该研究具有80％的效能(β)(具有α＝0.05，双侧)以检出小至54g的体重、4.9mm的希尔默评分、830FU/mm的荧光素清除率、2.8秒的TBUT、0.9分的角膜染色、以及4.5ng/μL的粘蛋白的差异。

Claims (12)

1.一种治疗对其有需要的受试者的干眼症的方法，该方法包括对所述受试者给予一个有效量的一种β-转角模拟肽环状化合物。

2.如权利要求1所述的方法，其中该β-转角模拟肽环状化合物包括一个13至17个碳原子的大环。

3.如权利要求2所述的方法，其中所述β-转角模拟肽环状化合物是由结构式(I)来代表：

其中R¹和R³是独立地选自：氢、C₁至C₆的烷基、芳基、或在二十种蛋白氨基酸中发现的氨基酸侧链取代基；R²和R⁴独立地是氢或烷基；或R¹和R²与它们所附接的碳原子一起形成一个环丙基、环丁基、环戊基或环己基的基团；或R³和R⁴与它们所附接的碳原子一起形成一个环丙基、环丁基、环戊基或环己基的基团；R⁵和R⁶是氢或C₁至C₆烷基；Y是氢或一个或两个芳香族取代基；X是选自O、N、S、P、Se、C、1至6个碳原子的亚烷基、SO、SO₂或NH；n是0、1、2、3、4或5；并且连接物选自下组，其组成为：NH₂、OH、SH、COOH、CH₃CO、CHO、以及NH-CH₂-COOH。

4.如权利要求3所述的方法，其中，X是O、S、或NH，R¹、R³、R⁵、以及R⁶各自为氢原子，并且该大环具有14、15或16个环原子。

5.如权利要求3所述的方法，其中，R¹和R³衍生自不同的氨基酸侧链的一个序列。

6.如权如利要求5所述的方法，其中，X是O、S、或NH。

7.如权利要求1所述的方法，其中所述β-转角模拟肽环状化合物是由式D3来代表：

或是其一种药学上可接受的盐

8.如权利要求1所述的方法，其中所述β-转角模拟肽环状化合物是选自下组，其组成为：

以及

或其一种药学上可接受的盐。

9.一种治疗对其有需要的受试者的干眼症的方法，该方法包括对所述受试者给予一个有效量的由式D3代表的一种β-转角模拟肽环状化合物：

或其一种药学上可接受的盐。

10.一种治疗对其有需要的受试者的干眼症的方法，该方法包括对所述受试者给予一个有效量的由式3Aa代表的一种β-转角模拟肽环状化合物：

或其一种药学上可接受的盐。

11.一种治疗对其有需要的受试者的干眼症的方法，该方法包括对所述受试者给予一个有效量的由式3Ak代表的一种β-转角模拟肽环状化合物：

或其一种药学上可接受的盐。

12.一种刺激在对其有需要的受试者体内的粘蛋白分泌的方法，该方法包括对所述受试者给予一个有效量的一种β-转角模拟肽环状化合物。

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