CN102041265A - 检测甲型h1n1病毒抗原的免疫检测试剂 - Google Patents
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Abstract
本发明提供含有甲型H1N1病毒血凝集素蛋白DNA序列的重组表达载体和由其表达的针对甲型H1N1病毒抗原的DNA疫苗，将合成的甲型H1N1流感病毒HA基因插入质粒载体构建含有甲型H1N1病毒HA基因序列的重组表达载体，提取重组质粒DNA，即获得甲型H1N1病毒DNA疫苗，用甲型H1N1病毒DNA疫苗免疫小鼠，制备单克隆抗体，本发明也提供检测甲型H1N1病毒抗原的免疫学方法和免疫检测试剂，本发明获得特异性好、亲和力高的单抗细胞株和多克隆抗体，由此制备的免疫检测试剂灵敏度好、特异性高。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地说涉及利用基因工程技术制备的DNA疫苗，及由其制备的单克隆抗体和免疫检测试剂。
背景技术
血凝素(hemagglutinin HA)是流感病毒的主要外膜蛋白，HA具有免疫原性，能使人体产生保护性抗体，但其容易变异，是流感流行的原因。制备针对流感病毒血凝素蛋白特异性单抗和多抗是流感病毒蛋白分型检测的基础，目前针对HA的抗体制备采用常规的蛋白免疫方法，其中王慧娟等【1】在昆虫杆状病毒中表达甲型H1N1的HA蛋白用于免疫抗原和筛选抗原。张祥斌等【2】(ChineseVeterinary Science 2008.38(11)：962-967)用大肠杆菌表达猪流感的HA经纯化用于免疫抗原和筛选抗原。
关于甲型H1N1的HA为目标的流感分型检测试剂盒目前还未见报道，现有的文献工作仅仅局限于抗体制备上，目前检测试剂主要存在问题在于由于ELISA试剂局限性，而临床样本(主要咽拭子)病毒含量极低，低于ELISA试剂的检测限，无法检出。如将病毒接种细胞培养可检出病毒。该试剂如配合病毒培养可大大改善对临床样本的检出。
发明内容
本发明的一个目的在于提供含有甲型H1N1病毒血凝集素蛋白DNA序列的重组表达载体和由其表达的针对甲型H1N1病毒抗原的DNA疫苗。
本发明的另一个目的在于提供一种杂交瘤细胞，以上述甲型H1N1病毒DNA疫苗免疫小鼠后制备得到。
本发明的又一个目的在于提供一种针对甲型H1N1病毒抗原的单克隆抗体，由上述杂交瘤细胞制备。
本发明的再一个目的在于提供一种免疫诊断试剂。
根据本发明的一方面，本发明提供针对甲型H1N1病毒抗原的DNA疫苗，通过将合成的甲型H1N1流感病毒A/California/04/2009HA基因(序列如SEQ IDNO.1所示)插入pCDNA3.1(+)载体多克隆位点(如附图1)构建含有甲型H1N1病毒DNA序列的重组表达载体pCDNA3.1/SF-HA载体，提取重组质粒DNA，即获得甲型H1N1病毒DNA疫苗。
根据本发明的另一方面，本发明提供针对甲型H1N1病毒抗原的单克隆和多克隆抗体，用上述甲型H1N1病毒DNA疫苗免疫小鼠，取其脾脏细胞，与SP2/0骨髓瘤细胞融合后制备杂交瘤细胞，筛选杂交瘤细胞，获得表达稳定分泌单克隆抗体，二株筛选出来具有对甲型H1N1流感病毒高特异性，且表达稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株命名为2B1和3G4，于2010年9月27日提交到中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏号为：CCTCC C201095和CCTCCC201096。培养上述2B1和3G4细胞株，制备单克隆抗体，纯化并鉴定，其分别属于IgG2a亚类和IgG1亚类。
用上述甲型H1N1病毒DNA疫苗免疫动物，例如兔，制备多克隆抗体。
根据本发明的又一方面，提供检测甲型H1N1病毒抗原的免疫学方法和免疫检测试剂，这样的检测法通常包括一个或多个能够识别和结合甲型H1N1病毒抗原的抗体，并且可以在本领域技术人员公知的各种免疫学测试法中实现，包括但不限于各种类型的放射免疫实验、酶联免疫吸附实验(ELISA)、酶联免疫荧光实验(ELIFA)等。
在本发明的一个优选实施方案中，提供一种使用ELISA方法检测甲型H1N1病毒抗原的免疫检测试剂。
本发明进一步提供为以上的检测应用的试剂盒。试剂盒中包含酶联免疫所需的针对甲型H1N1病毒抗原的单克隆和多克隆抗体，试剂盒也包含与抗原或抗体结合的酶结合物和/或含报告分子的试剂，所述报告分子例如生物素结合蛋白质、例如抗生物素蛋白或链霉素抗生物素蛋白，例如酶、荧光素或放射性同位素标记物。此外，试剂盒中还包含阳性和阴性对照物以及其他必要时可以包含在其中的缓冲液、稀释剂、滤器、针、注射器和试剂盒的使用说明书。
本发明在抗体制备的基础上利用生物素-亲和素放大系统进一步研制特异性检测甲型H1N1ELISA检测试剂盒，直接用DNA疫苗做免疫原，筛选抗原用WHO提供的甲型H1N1裂解疫苗株【3】(上海生物制品所提供)。其优点在于：
1)在单抗制备上：利用核酸疫苗进行免疫，避免了用全病毒蛋白做基础免疫蛋白成分过多、过杂的缺点，大大提高了免疫效率。同时，核酸疫苗在动物真核细胞中表达也避免了用基因表达单一抗原免疫造成许多空间位点缺失的缺点。同时用全病毒甲型H1N1疫苗株【3】做筛选抗原，普通流感裂解疫苗H1N1/H3N1(购自赛诺菲巴斯德公司)做对照筛选抗原，该方法获得抗单一组分蛋白(HA)特异性好、亲和力高的单抗细胞株和多克隆抗体，这为后面免疫检测提供了质量非常好的抗体来源，对试剂盒灵敏度和特异性的提高起了关键的作用。
2)DNA免疫较常规蛋白免疫强而持久，因此用DNA免疫制备单克隆抗体和多克隆抗体可以省时省力。
3)检测方法上用生物素-亲和素放大系统，大幅度提高提高试剂的灵敏度。
附图说明
图1为pcDNA3.1(+)载体结构图。
生物材料的保藏
分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株命名为2B1和3G4，于2010年9月27日提交到中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏号为：CCTCC C201095和CCTCC C201096。
具体实施方式
以下实施例以举例的方式描述本发明，其不应视为对本发明的限制。所使用的实验材料如无特别说明，均为市售购买。
【实施例1】DNA疫苗的制备
甲型H1N1流感病毒A/California/04/2009HA基因序列如SEQ ID NO.1所示，HA序列经上海生工合成后双酶切(XhoI/ApaI)插入pCDNA3.1(+)载体多克隆位点，构建成pCDNA3.1/SF-HA载体。
质粒DNA的大量制备
按照QIAGEN公司生产的QIAGEN Plasmid Maxi Kit的步骤，提取重组质粒DNA，将所得DNA溶于TE溶液，在紫外分光光度计上测定所制备的质粒DNA的OD260值和OD280值，按照计算DNA的纯度及浓度的公式算出DNA的纯度和浓度。根据其初始浓度稀释至终浓度为1μg/μl，作电泳鉴定，其余置-20℃冰箱保存备用。
【实施例2】鼠抗H1N1病毒抗原单克隆抗体的制备
1.免疫方法和程序：
免疫途径采用股四头肌肌肉注射法，每只6-8周龄BALB/c小鼠注射DNA的量为50μg，注射后在接种位点两侧5mm加入正反各3次的电击(100V电压，电击时间为50ms)，初次免疫后3周进行加强免疫一次。
2.单抗制备：
2.1细胞融合：
2.1.1处死小鼠，无菌操作下取出脾脏，将脾脏放于5ML RPMI-1640的培养皿中(不加血清)，切成2半，然后用灭菌器材将细胞挤压出来。
2.1.2将细胞吸到1支无菌塑料管中，静置5分钟使组织块沉降下来，将细胞移入另一支无菌试管并于300XG离心10分钟。
2.1.3洗下培养中SP2/0(Ag14)细胞在同样的离心机中沉淀。
2.14将此2个沉淀悬浮在5ml RPMI-1640(不加血清)中，彼此混合并在300XG离心10分钟。
2.15轻轻敲打管子使沉淀分散，并置管于37℃水浴。
2.16将预热的50％聚乙二醇(PEG)和RPMI-1640(不加血清)带到准备融合的操作箱内。
2.17于1分钟内在细胞沉淀中滴加入0.8ml 50％PEG。保持37℃，立即滴加入2ml预热的RPMI-1640(无血清)，12分钟左右，然后在3分钟内加入8mlRPMI-1640。
2.18细胞在300XG离心10分钟。轻轻悬浮在所需容量的RPM-1640-20％FCS中，并接种到96孔板上。。
2.19培养板置于37℃5％CO2孵温箱内培养，24小时后，每孔加入等体积的RPMI-1640-2XHAT-20％FCS培养液。然后培养板放在孵温箱内直至出现杂交瘤细胞集落，早期杂交瘤细胞培养物。直至集落达2-3MM时需要筛选上清液中抗体的活性。经鉴定适合于进一步克隆的杂交瘤细胞，用无菌巴斯德管吸出于24孔培养板中并进一步克隆。直至形成稳定的分泌抗体的细胞株。
2.2细胞株筛选：全病毒甲型H1N1疫苗株【3】包被进行ELISA筛选，同时用普通流感裂解疫苗H1N1/H3N1(购自赛诺菲巴斯德公司)做对照筛选抗原，筛选出单抗只是特异性针对甲型H1N1病毒反应，与普通流感不反应。用这种方式我们筛选到亲和力高特异性好的两株抗甲型H1N1流感病毒抗原的单克隆抗体，分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株命名为2B1和3G4，于2010年9月27日提交到中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏号为：CCTCC C201095和CCTCC C201096。
2.3单抗制备：每株细胞扩大培养注射到降植烷处理BALB/C小鼠腹腔制备腹水，经PROTEIN-A亲和纯化，抗体纯度用SDS-PAGE鉴定，要求上样蛋白质在25KD和50KD出现清晰两条带。纯度在90％
以上。克隆编号及亚类如表1：
表1：克隆编号和对应的亚类
| 克隆号 | 亚类 |
| 2B1 | IgG2a |
| 3G4 | IgG1 |
【实施例3】兔抗H1N1病毒抗原多克隆抗体的制备
1、兔多抗制备：兔子免疫采用3月龄的家兔股四头肌肌肉注射法，注射DNA的量为100μg，注射后在接种位点两侧5mm加入正反各3次的电击(100V电压，电击时间为50ms)，初次免疫后3周进行加强免疫一次。最后一次加强后10天杀兔放血，分离血清放-20℃保存。
2、兔多抗纯化：采用盐析法粗提，再经DEAE-纤维素离子交换层析纯化。抗体纯度用SDS-PAGE鉴定，要求上样蛋白质在25KD和50KD出现清晰两条带，纯度在90％以上。
3、兔多抗生物素标记：生物素购自SIGMA公司(H1759)，严格按照生物素使用说明书，将兔抗P24多抗抗体进行生物素标记，充分透析后加入等体积甘油，-20℃保存。
【实施例4】检测H1N1病毒抗原的免疫检测试剂和方法的建立
1、单抗包被板的制备：以上两株纯化的单抗2B1、3G4进行蛋白定量，按5μg/ml浓度包被过夜，洗板封闭制成干板。
2、反应步骤如下：将待测经适当稀释H1N1阳性样品(1∶6400)加入到已包被好单克隆抗体的微孔板中，再加入生物素标记的兔抗H1N1多抗，37℃反应60分钟后洗板，加入经过适当浓度稀释的酶标链亲和素(SA-HRP)，37℃反应30分钟，再次洗板，加入TMB底物显色10分钟，加硫酸终止读数。其结果见表2：
表2
从结果看：2B1的灵敏度比3G4好。因此我们选择2B1用于检测H1N1用包被抗体。
3.该试剂最终灵敏度的确定：用2B1包被板，用纯化的H1N1疫苗株，测其蛋白含量为150微克/毫升。从1∶3200开始测其效价，结果如表3：
表3
| 稀释滴度 | 1∶3200 | 1∶6400 | 1∶12800 | 1∶25600 | 1∶51200 | 1∶10万 | 1∶20万 | 阴性 |
| OD值 | 0.83 | 0.63 | 0.31 | 0.15 | 0.15 | 0.10 | 0.08 | 0.05 |
其CUTOFF值为0.10，该试剂对H1N1疫苗株灵敏度在：
150微克/毫升/51200＝0.0029微克/毫升＝2.9纳克/毫升
4、试剂特异性考核：
取季节流感疫苗株H1N1、H3N1(购自赛诺菲巴斯德公司)、禽流感H5N1\H7N1\H9N2(购自哈尔滨兽医研究所)用该试剂盒检测全部为阴性。
【实施例5】检测试剂盒
试剂盒组份(规格)：96份样品
操作方法
1、加样：将预包被板条固定于板架上。每孔加入生物素标记物(抗H1N1多抗)25ul。每次试验设阴性对照2孔、阳性对照2孔，然后分别加入阴、阳性对照75ul；设空白对照1孔；其余孔加待测样品75ul。
2、温育：振荡混匀，置37℃温育60分钟。
3、洗涤：弃去孔内液体，将稀释后的洗液注满各孔，静置30-60秒，弃去孔内洗液，扣干。重复洗5次。
4、加酶：空白对照孔不加酶，其余孔加入亲和素酶结合物100ul。
5、温育：置37℃温育30分钟。
6、洗涤：弃去孔内酶标记物，重复洗5次(同操作步骤3)。
7、显色：每孔加入底物缓冲液50ul(1滴)，再加入底物液50ul(1滴)，振荡混匀，置37℃温育10分钟。
8、终止：每孔加入终止液50ul(2M硫酸)(1滴)，轻拍混匀。在单波长450nm或双波长450nm/630nm下，用空白孔校零，再读取各孔OD值。
结果判定
1、临界值(C.O.)计算：
临界值(C.O.)＝2.1×阴性对照平均OD值
备注：阴性对照平均OD值小于0.05按0.05计算，大于0.05按实际值计算。
2、结果判断：
样品OD值≥临界值(C.O.)为H1N1抗原阳性；
样品OD值＜临界值(C.O.)为H1N1抗原阴性。
注意事项
实验准备
从冷藏环境中取出的试剂盒应平衡至室温后方可打开使用。
未使用完的预包被板条应置于有干燥剂的封口袋中密封保存。
若20倍浓缩洗液出现结晶，请置于37℃至溶解后再使用。
不同批号的试剂组份不可混用。
本试剂盒应按含有传染性材料对待。
实验操作
试剂使用前应充分摇匀。
洗涤时各孔均需加满洗液，以防止孔口有游离酶标记物未被洗净。
结果判读请在反应终止后15分钟内完成。
以上对本发明的详细描述并不限制本发明，本领域技术人员可以对本发明作出各种改变和变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明的权利要求所限定的范围。
注解：
【1】LETTERS IN BIOTECHNOLOGY Vol.21No.1Jan；2010
【2】Chinese Veterinary Science 2008.38(11)：962-967
【3】A/reassortant/NYMC X-179A(Califomia/07/2009x NYMC X-157)
Claims (10)
1.一种重组表达载体，含有如SEQ ID NO.1所示的甲型H1N1流感病毒血凝集素蛋白基因。
2.权利要求1所述的重组表达载体，其中将如SEQ ID NO.1所示的甲型H1N1流感病毒血凝集素蛋白基因插入pCDNA3.1(+)载体的多克隆位点而构建。
3.针对甲型H1N1流感病毒抗原的DNA疫苗，由权利要求1所述的重组表达载体产生。
4.杂交瘤细胞，由权利要求3所述的DNA疫苗免疫小鼠制备，其保藏号为CCTCC C201095。
5.针对甲型H1N1流感病毒抗原的单克隆抗体，由权利要求4所述的杂交瘤细胞制备。
6.针对甲型H1N1流感病毒抗原的多克隆抗体，由权利要求3所述的DNA疫苗免疫动物制备。
7.一种免疫检测试剂，包含权利要求5所述的针对甲型H1N1流感病毒抗原的单克隆抗体。
8.权利要求7所述的免疫检测试剂，其进一步包含权利要求6所述的针对甲型H1N1流感病毒抗原的多克隆抗体。
9.一种试剂盒，包含权利要求7所述的免疫检测试剂。
10.检测样本中甲型H1N1流感病毒抗原的方法，包括将待测样本与权利要求7所述的免疫检测试剂接触，根据检测结果判断样本中是否存在甲型H1N1流感病毒抗原的步骤。
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