CN102014947A - 富含亮氨酸的肽组合物和分离方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了包含分离的肽的组合物，所述分离的肽具有约12-约40重量％的亮氨酸含量。还公开了从蛋白源诸如牛乳清中分离富含亮氨酸的肽的方法和使用这些肽对人或动物提供有益效果诸如增加血流量、降低血压、增加肌肉重量、改善认知功能、改善心血管功能等的方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2008年3月26日提交的在先申请的美国临时专利申请号61/039,426的优先权权益。
发明领域
本申请涉及用于刺激蛋白合成、减少蛋白降解、产生血管舒张、增加一氧化氮产生、和减少血流量的膳食性肽组合物。更具体地，本发明涉及富含亮氨酸的肽组合物和从蛋白中分离它们的方法。
发明背景
肌肉组织损失通常作为衰老、营养不良、和分解代谢性疾病诸如烧伤、脓毒症和癌症的结果发生。膳食性蛋白补充可能是有益的，但补充必需氨基酸亮氨酸已经显示是特别有益的。例如，近年来已经显示膳食性亮氨酸抑制大鼠中肌原纤维蛋白降解和肌肉重量损失的速率。亮氨酸还刺激肌肉蛋白合成并调控参与控制mRNA翻译的各种蛋白的活性。亮氨酸可以直接或通过其代谢物，α-酮异己酸来刺激蛋白合成。亮氨酸可以独立地或通过与哺乳动物雷帕霉素靶标mTOR)的相互作用来刺激翻译。
亮氨酸是支链氨基酸之一并且是一种必需氨基酸。其是转变为乙酰辅酶A和α-酮酸的唯一氨基酸，并且其是谷氨酰胺合成的重要氮源。除了其对蛋白合成和降解的作用以外，亮氨酸还通过蛋白激酶C(PKC)刺激葡萄糖摄取，而胰岛素经蛋白激酶B调控葡萄糖摄取。
乳来源的乳清是增肌蛋白(muscle-building protein)的一个良好来源。乳清分离蛋白和乳清蛋白浓缩物用于增加蛋白的膳食补充剂中。乳清蛋白是亮氨酸的良好来源，但对于需要膳食性蛋白可以提供的增肌氨基酸的许多个体，其难以消化和/或吸收蛋白。因此找到提供这样的含有亮氨酸的氨基酸组合物的方法是很重要的，所述组合物提供更高生物利用度的形式的氨基酸以改善肌肉蛋白合成。
发明概述
本发明涉及具有约12-约40％的亮氨酸含量的肽(“富含亮氨酸的肽”)，那些肽通过包括下列步骤的方法分离自蛋白源：在一种或多种亮氨酰氨基肽酶，任选地与附加的蛋白酶组合的存在下水解蛋白以产生蛋白水解产物，使所述酶失活，以及将所述蛋白水解产物过滤以提供透过物，所述透过物含有具有约200-约4,000的分子量，包括其间的子范围，诸如，例如，约200-约1,000的分子量，或约400-约1,000的分子量的肽。任选地，可以加入通过从所述透过物去除水性流体来浓缩所述富含亮氨酸的肽的步骤。还公开了使用这些肽用于多种有益效果的方法，诸如产生血管舒张、增加一氧化氮的产生、降低血压、增加血流量、增加肌肉组织、改善创伤愈合、和改善认知功能。
本发明还涉及从蛋白源分离富含亮氨酸的肽的方法，该方法包括以下的步骤：在一种或多种亮氨酰氨基肽酶，任选地与附加的蛋白酶组合的存在下水解蛋白以产生蛋白水解产物，使所述酶失活，以及将所述蛋白水解产物过滤以提供透过物，并且浓缩含有富含亮氨酸的肽的透过物。
在各个实施方案中，蛋白可以来自动物或植物来源，包括，例如，豆科作物诸如大豆或豌豆、鱼、肉、乳、血液、蛋、谷物、面筋(wheat gluten)、玉米或其组合。在一些实施方案中，蛋白源可以是牛乳、牛乳清、乳清蛋白浓缩物和/或乳清分离蛋白。
在各个实施方案中，富含亮氨酸的肽的亮氨酸含量可以在约12-约40％范围的多种子范围内，例如，约12-约30重量％亮氨酸，约15-约20重量％亮氨酸，约15-约25重量％亮氨酸，和约20-约25重量％亮氨酸。
详述
本发明人已经发现具有约12-约40％的亮氨酸含量的肽(“富含亮氨酸的肽”)可以通过包括下列步骤的方法分离自蛋白源：在一种或多种亮氨酰氨基肽酶，任选地与附加的蛋白酶组合的存在下水解蛋白以形成蛋白水解产物，使所述酶失活，以及将所述蛋白水解产物过滤以分离富含亮氨酸的肽，并浓缩所述富含亮氨酸的肽。在一个实施方案中，该方法包括在一种或多种可用作亮氨酰氨基肽酶(亮氨酸氨基肽酶)的氨基肽酶，任选地补充以附加的蛋白酶的存在下水解蛋白以形成蛋白水解产物，使所述酶失活，使用超滤、纳米过滤或其他适当的过滤方法过滤所述蛋白水解产物，从而得到含有富含亮氨酸的肽的透过物，并使用反渗透、蒸发、或另一种通过去除来自过滤步骤的透过物的水性部分来浓缩所述肽的合适方法，来浓缩所述透过物中的富含亮氨酸的肽。本发明还提供了包含通过所述方法制备的富含亮氨酸的肽的组合物。
膳食性亮氨酸似乎具有许多有益效果，包括刺激肌肉蛋白合成和抑制肌原纤维蛋白降解和肌肉重量损失的速率。亮氨酸还增加下丘脑mTOR信号传导并减少食物摄取和体重(Cota，D.等，Science(科学)(2006)312：927-930)。亮氨酸给药增加瘦蛋白水平，且已知瘦蛋白促进脂肪组织中的脂解，但对无脂肪(lean)组织没有明显作用。增加的瘦蛋白水平导致饥饿减少、食物消耗量减少和细胞能量消耗增加。
蛋白源诸如标准乳清蛋白水解产物可以含有多达10％亮氨酸，但假定该氨基酸具有多种有益效果并且其不能在体内由其他氨基酸合成的事实，开发增加亮氨酸水平的方法以便促进其有益效果，特别是其对增加肌肉和抑制肌肉萎缩的效果已经成为了食品和营养补充剂工业的一个目标。本发明提供富含亮氨酸的氨基酸组合物，并且所述组合物可以使用本发明的方法分离自容易获得的蛋白来源。
本发明人建议使用亮氨酸氨基肽酶来加工乳清蛋白以产生生物活性/生物可利用的含有亮氨酸的肽，他们已经证明所述肽具有多种所需的作用。亮氨酸残基似乎在非常类似的蛋白之间的作用差异方面具有重要作用。例如，血管紧张肽I通过两个附加的羧基末端氨基酸-组氨酸和亮氨酸与血管紧张肽II相区别。甲硫氨酸-脑啡肽，一种神经肽，其具有许多类似于亮氨酸-脑啡肽的作用，其似乎是由肽中的氨基酸的芳族侧链所介导的。两种肽均由5个氨基酸残基组成。然而，甲硫氨酸-脑啡肽和亮氨酸-脑啡肽的不同之处是羧基末端的第五个氨基酸残基。在甲硫氨酸-脑啡肽中，其为甲硫氨酸。在亮氨酸-脑啡肽中，其为亮氨酸。两者似乎对动脉血压和血管舒张有作用，但在此区域氨基酸差异似乎较为明显，亮氨酸-脑啡肽似乎具有较强的作用(Moore，R.H.和D.Dowling，″Effects onIntravenously Administered Leu-or Met-Enkephalin on Arterial BloodPressure(静脉内施用亮氨酸-或甲硫氨酸-脑啡肽对动脉血压的作用)，″Regulatory Peptides(调节肽)(1980)1(2)：77-87)。尽管其他人已经提供了含有相当大百分比的作为游离氨基酸存在的亮氨酸的水解产物(参见，例如，Delest，V.等的美国专利号6,875,456)，但本发明提供了小肽(例如，含有相当大百分比的二肽和三肽的水解产物)，从而将亮氨酸以更高生物利用度/生物活性的形式递送。这些肽已经证明具有令人惊奇的有益结果，诸如有效抑制血管紧张肽转变酶(ACE)抑制作用、血管舒张和刺激一氧化氮的产生增加。试验证明本发明的肽提供生物可利用/生物活性的亮氨酸，补充所述肽证明与由补充亮氨酸所提供的那些相同的有益效果中的许多效果，还提供了以前没有作为补充亮氨酸的结果所描述的附加益处。
本发明的富含亮氨酸的肽组合物提供与其他氨基酸组合的亮氨酸，但提供了与其他氨基酸相比增加的亮氨酸量。例如，这些组合物可以容易地作为粉末加入至饮料制剂、加入至食品、加入至营养补充剂组合物诸如片剂、胶囊或其他制剂中，或加入至药物制剂中。附加的调味剂、碳水化合物、脂肪、蛋白质、维生素、矿物质和其他适当的食品或补充剂成分可以包含在所述组合物中。
本发明的肽可以用来提供这样的组合物，该组合物对人或动物在包括但不限于，心脏健康、少肌症(sarcopenia)、内皮功能、保持健康血压或降低血压、血管舒张、肌肉生长和发育、运动营养、婴儿营养、预防或治疗代谢综合征、认知功能、眼部健康、糖尿病、改善血糖生成指数(glycemicindex)、mTOR活化、伤口愈合、和皮肤护理/治疗皮肤病症的领域提供益处。
研究已经显示在运动之前和期间给药支链氨基酸(BCAA)的人类运动员在运动后的复杂认知试验中表现较好(Hassmen，P.等，Nutrition(营养)(1994)10：405-10)。当在犬中测试时，在老年犬中补充BCAA似乎在改善运动期间的认知行为表现方面特别有效(Fretwell，L.等，J.Nutr.(营养学杂志)(2006)136：2069S-2071S)。本发明的组合物提供增加的支链氨基酸(BCAA)亮氨酸水平，以及其他氨基酸，其采取可以容易地加入至片剂、胶囊、食品诸如，例如，营养棒(nutrition bar)、粉末形式的补充剂、混合饮料、和用于人和/或动物消费的其他组合物的形式。这些组合物可以对那些期望改善其认知行为表现的个体提供益处。采用本发明的肽进行的研究已经证明补充富含亮氨酸的肽促进血管舒张并增加血流量，以及增加葡萄糖递送至组织的速率。年长的个体、学生和其他个体可以从包含本发明的富含亮氨酸的肽的食品、饮料和/或补充剂中得到特殊的益处。
代谢综合征(X综合征)是一种慢性疾病，其影响美国每5个成人中的至少一个。其经常与肥胖症相关，但明确的特征是异常的血糖控制(葡萄糖不耐症(glucose intolerance)、胰岛素抗性)。富蛋白质饮食，特别是包含显著量的亮氨酸的那些，对于治疗肥胖症和治疗代谢综合征是有益的(Layman，D.K.和D.A.Walker，J.Nutr.(营养学杂志)(2006)136：319S-323S)。本发明的组合物提供了一种优秀的手段，采用该手段影响体重管理和代谢综合征所需的必需氨基酸和较高量的亮氨酸可以提供给人或动物。如果本发明的肽用作蛋白组分，则产品例如，诸如“蛋白质水”(含有乳清分离蛋白以及增甜剂和调味剂的水)可以提供附加的益处。点心、营养棒、饮料、混合饮料和其他产品也可以与富含亮氨酸的肽一起配制，从而提供用于体重管理和减少脂肪的组合物。富含亮氨酸的肽组合物可以用于通过将这些组合物加入至一种或多种食品来促进体重减轻，或可以通过将它们加入至用于在进餐时摄入的营养补充剂或营养饮料中来类似地使用。餐间点心也可以与富含亮氨酸的肽组合物一起配制以减少饥饿和食物消耗。
本发明的富含亮氨酸的肽可以加入至乳清组合物、乳清分离蛋白、乳清蛋白浓缩物、和其他蛋白源中，从而例如，改善肌肉合成、减少肌肉分解、减少饥饿和食物消耗、改善血流量和增加血管中的一氧化氮产生。这些作用可以对很大的个体群体是有益的，这些群体包括那些自愿希望增加额外的肌肉质量的个体，那些通过衰老和/或损伤、疾病(例如，脓毒症、癌症)或营养不良而正在减少肌肉质量的个体，和那些希望减少体内脂肪组织与肌肉质量的百分比的个体。
本发明的富含亮氨酸的肽组合物对正在衰老的个体或其他患有少肌症的个体是特别有益的。在衰老过程中和从约45岁开始，人的肌肉质量减少。与老年个体有关的虚弱性可能很大程度归因于这种肌肉质量的减少，并且使那些个体易于发生更多的疾病或损伤。在老年个体中一些肌肉组织的减少也可以是营养不良的结果，特别是就蛋白摄入而言，因为富含蛋白的食物对于固定收入的个体来说可能往往较为昂贵并且不太容易获得。本发明的组合物提供了营养补充剂，采用该营养补充剂解决了其中衰老或营养不良已经引起肌肉减少的个体的需求。
健身包括营养补充和运动的组合以增加肌肉质量。本发明的组合物理想地适合于健身营养补充剂。富含亮氨酸的组合物刺激肌肉合成，同时通常减少过量进食的需要和脂肪组织增加。此外，膳食性亮氨酸补充已经显示能显著地改善耐力行为表现(endurance performance)(Crowe，M.J.等，Eur. J.Appl.Physiol.(欧洲应用生理学杂志)(2006)97(6)：664-72)。
除了其许多其他的有益作用以外，亮氨酸已经证明具有心脏保护作用。例如，亮氨酸保护心肌免受心肌缺血，并且一些研究者认为其也是一种抗心律失常因子(Gabrys，J.等，(2002)Pharmacology Reviews and Communications(药理学综述和通讯)12：101-108)。本发明的肽已经显示用作有效的血管紧张肽转变酶(ACE)抑制剂。例如，欧洲专利号1794189B1(De Slegte，J等)提出迄今为止证明具有最高效力的ACE-抑制性肽是含有相当大百分比的脯氨酸残基的那些。那些发明人讨论了一些公司诸如Calpis和Valio的产品，这些产品提供了每个三肽具有两个脯氨酸残基的三肽。报告了他们自己的肽制剂针对ACE抑制的结果(其表示为IC50值，即，减少ACE活性50％所需的肽或水解产物的浓度)，他们指出他们的水解产物产生的IC50(表示为μg/ml)为7.2。然而，本发明的富含亮氨酸的肽具有的已确定的IC50值为约4.0μg/ml至约9.6μgrams/ml，用于大规模生产批次的规格的ACE-抑制值为4.0-4.7。
本发明的肽还已经证明了在产生血管舒张、增加血流量和增加血管中一氧化氮(NO)的产生方面的效力(见实施例1)。这种作用组合清楚地证明了本发明的肽对心血管系统的正向作用，并且因此举例说明了本发明的肽作为心脏保护性组合物和用于改善血管功能、增加血流量、降低血压、增加耐力等的组合物的益处。本发明的组合物可以作为用于在具有或易于发生升高的血压水平的个体中维持健康血压水平和降低血压的膳食补充剂和/或药物组合物来提供或消费。所述组合物可以特别有益于患有糖尿病的个体，例如，可能具有或易于发生高血压的个体和还可能需要增加到达组织的血流量以便减少组织损害，尤其在四肢中的个体。
已经确定补充亮氨酸对于烧伤、创伤和脓毒症患者比一般性补充BCAA更为有益(DeBandt，J.和L Cynober，J.Nutr.(营养学杂志)(2006)136：308S-313S)。此外，亮氨酸对皮肤伤口和肌肉中的蛋白质有合成作用，条件是获得足够的额外的氨基酸。当与单独补充亮氨酸比较时，补充亮氨酸与补充蛋白相结合对伤口愈合提供更大的益处(Zhang，X.等，J.Nutr.(营养学杂志)(2004)134：3313-8)。本发明的组合物提供具有增加的亮氨酸含量的肽，并且因此是用于对具有烧伤或其他皮肤伤口、肌肉损伤、创伤、脓毒症、或其中通过提供亮氨酸与肽或蛋白的组合而可以增加亮氨酸的有益作用的其他病症的患者施用的优异的食品、药物或营养组合物。这些组合物可以口服形式、经静脉内方式，或通过注射提供。富含亮氨酸的肽组合物还可以经口服或局部使用以增加肤色和柔软性，并且促进整体的皮肤健康。
富含亮氨酸的肽还可以对血压调节和血管紧张肽转变酶(ACE)的抑制提供益处。对于需要更好地管理血压并增加到达组织的血流量的个体，本发明的富含亮氨酸的肽可以作为食品补充剂诸如片剂、胶囊、粉末和可以容易在进餐时或餐间自行施用的其他制剂在食品、饮料和混合饮料中被消耗。通过增加血流量和促进血管舒张和一氧化氮的产生，本发明的组合物可以通过增加微循环，促进内皮健康，并改善向组织的营养素递送来提供益处。这些作用在患有糖尿病、外周动脉疾病、和影响循环的其他疾病的个体，以及老年人，运动员，从手术、创伤性损伤、烧伤、慢性伤口和其中增加的血流量和营养素递送可以促进健康改善的其他病症恢复的个体中可以是特别重要的。
多种有益作用与一氧化氮的产生有关。NO松弛平滑肌并且抑制血管炎症，抑制沿血管排列的内皮细胞释放炎性物质。NO抑制平滑肌细胞迁移和增殖并减少血小板粘附和聚集。这些作用在易于形成动脉粥样硬化和易于中风、自体免疫病等的那些患者中是特别有益的。NO似乎部分地通过抑制Weibel-Palade小体的胞吐作用来调节血管炎症，所述Weibel-Palade小体的胞吐作用例如可以通过凝血酶、组胺、血纤蛋白、补体、白三烯和ATP来触发(Matsushita，K.等，Cell(细胞)(2003)115：139-150)。本发明的富含亮氨酸的肽已经显示在体内能增加一氧化氮的产生和血管舒张。本发明的组合物因此可以通过预防动脉粥样硬化病灶的形成，减少血管炎症，减少血小板粘附和聚集等来提供益处。本发明的组合物因此可以提供补充剂，所述补充剂在加强心血管系统，减少循环系统中的炎症，预防血管中斑块的形成，和通常在血管内提供更加“心脏-健康”的环境方面提供显著的益处。
所述方法可以用来从包括含有亮氨酸的蛋白的任何来源分离富含亮氨酸的肽。所述来源可以包括，但不限于，面筋、玉米/谷物分离蛋白、卵蛋白、大豆和其他豆类蛋白(例如，豌豆)、鱼、肉、血液/血液蛋白、和乳蛋白。富含亮氨酸的肽的一种特别有价值的来源是乳来源的乳清，诸如，例如，牛乳-来源的乳清、乳清分离蛋白和/或乳清蛋白浓缩物。乳清分离蛋白通常具有至少约90重量％的蛋白含量，而乳清蛋白浓缩物可以具有至少约35重量％-约80重量％的蛋白。
用于本发明的方法的酶来源可以容易地由本领域技术人员来鉴定。例如，亮氨酰氨基肽酶(亮氨酸氨基肽酶)是外肽酶，其水解邻近游离氨基的肽键，并且最迅速地与含亮氨酸的肽和蛋白反应。
使用过滤，分子选择性地跨膜通过或运送，并且当使用压力梯度时此方法可以更为有效。在分离富含亮氨酸的肽时过滤是特别有效的。基于分子量和其他特性过滤分子的方法是本领域技术人员所公知的，并且包括例如，通常膜过滤、超滤和纳米过滤。就此而言，分离的富含亮氨酸的肽通常包含在透过物内，所述透过物固体含量非常低。然后透过物可以通过去除液体(水性流体)被浓缩以增加组合物中的固体百分比。这可以通过本领域那些技术人员已知的方式来完成，所述方式包括但不限于诸如蒸发和反渗透的方法。
在整个本公开内容中，当使用术语“包含”时，其意在该术语也可以用“由......组成”和/或“基本上由......组成”来代替。本发明可以进一步通过下面的非限制性实施例来说明：
实施例
实施例1-亮氨酸肽的产生
使用高蛋白、低脂肪、低乳糖液体乳清分离蛋白产品作为初始底物。此产品以17％的固体水平泵入至反应罐中。温度升高至45℃，并用氢氧化钠将pH调节至7.3。然后以0.35％的固体水平加入蛋白酶和氨基肽酶(例如，亮氨酸氨基肽酶)的掺合物。使水解进行6小时，每小时调节pH，从而将pH保持在7.3。然后通过将溶液加热至65℃来使酶灭活。
使用过滤来进行分级分离，将水解产物通过滤器以保留分子量大于20,000的分子。来自过滤系统的透过物含有亮氨酸肽，其具有约52％的在小于1,000的分子量范围内的肽；41％的在1,000-4,000的分子量范围内的肽；和6％的在4,000-20,000的分子量范围内的肽。这些肽使用反渗透进一步浓缩。然后将最终产物干燥和包装。
本发明的肽的6个制剂(批次)的分析显示在表1中，其中批次06-187、批次06-257和批次06-259是小规模批次，并且批次07-041、批次07-046和07-055是大规模生产批次。每个批次的水解程度显示在最下面的一行中，在这些试验中产生所需的肽的水解的范围为约30％-约50％。ACE抑制显示为产生50％ACE抑制所需的肽的量。
表1
实施例
实施例2-增加的血流量，血管舒张，NO产生的刺激
对个体提供2周的每日补充本发明的肽产品或安慰剂。在首个2周补充期结束和血管测试的第一天后，间隔1-2周，之后所述个体开始第二个2周补充期，每个个体消耗二中择一的补充剂。在试验期间中四个单独的时刻评价个体，并且告之个体禁食12小时，以及避免酒精、咖啡因和运动24小时，并且在每次评价前的夜晚摄入36盎司水和在受访的早上摄入另外12-16盎司水，以确保每人均被充分地水化。
肽产品由Glanbia Nutritionals，Twin Falls，ID生产。预先称量5g的单剂量并置于带有人造甜味剂的独立包装中。向参与研究的个体提供2周的供应量，并且指示其每天摄入混合在300mL水中的一个包装。
在血管测试的早上，个体摄入混合在水中的含有5g肽产品或安慰剂的一个包装。测定血流介导的舒张(FMD和前臂血流量(FBF)的空腹测量值。在摄入测试饮料之前容许在FMD和FBF测量之间恢复15分钟。在这些基线测量之后，受试者摄入混合在300mL水和人造甜味剂中的5g单剂量的肽产品或安慰剂。
间歇地进行摄入后FMD和FBF测量。在摄入后15、30、45、60、90和120分钟时获取血样。在整个测试期间受试者以舒适的体位休息。为了确保测试试验期间的标准化，受试者被告之在研究期间保持他们当前的体力活动水平，并且在每次血管测试访问前一天重复他们在先前记录的膳食记录中的膳食摄入物。在摄入测试饮料之前(PRE)和之后30、60和90min时使用用于进行高频超声波扫描成像的标准化步骤评价血流介导的舒张(FMD)。该技术引起一氧化氮的释放，导致血管舒张，其可以定量为血管舒缩功能指数。所有测试在安静的温控室内在处于仰卧位10分钟后进行。测血压袖带置于右上臂用于闭塞。贴附ECG导联以监测操作期间的心率。在肘前皱纹上方对肱动脉成像，并且放置换能器从而在纵轴上对肱动脉成像，清晰地对前后血管壁显影。当获得动脉的前后壁的清晰图像时，通过立体定向夹固定该换能器，并且在数据采集期间使该位置保持恒定。记录基线肱动脉直径持续30次心跳。在臂上采集图像的位置处做标记。使用快速袖带充气机(Hokanson E20，Bellevue，WA，USA)将袖带充气至200mmHg持续5min，从而闭塞肱动脉，然后松开。然后在闭塞后连续地评价动脉直径持续300次心跳。使用Acuson 13.0-MHz线阵式换能器和Aspen心脏超声系统(Acuson Corp，Elmwood Park，NJ)获得肱动脉的图像。
使用MIA软件(Medical Imaging Applications(医学成像应用)，Iowa City，IA，USA)进行图像分析。对于基线，使用取自30帧的平均直径。对于闭塞后记录300帧。通过将观察到的峰直径之前的5帧和相同标记之后的5帧的血管直径进行平均来计算峰闭塞后直径。计算肱动脉FMD并且表示为基线直径的百分比。
使用静脉闭塞应变容积描记术(strain gauge plethysmography)在同一右臂中测量前臂血流量。将环绕右前臂的最大直径的校准的填充以铟/镓的硅橡胶应变计连接至体积描记器(EC6，Hokanson，Inc.，Bellevue，WA，USA)。在通过在每个15秒周期期间由快速袖带充气机(Hokanson E20，Bellevue，WA，USA)将上臂袖带充气至50mmHg持续7秒阻断静脉回流后，测量前臂体积的增加，从而确定静息前臂血流量(R-FBF)。在安静时(at rest)(PRE)和摄入测试饮料之后20、50、80和110分钟时进行该测量。在每次流量评估之前和期间通过将腕部袖带充气至220mmHg持续1min来排除手部循环。使用专用软件(无创性血管程序3(NIVP3)，Hokanson，Bellevue，WA，USA)来评估前臂血流量，该软件确定前臂体积变化的斜率并且以每分钟的体积变化百分比来记录血流量(％/min)。将四次体积描记测量值平均以获得R-FBF值。为了确定反应性充血诱导的前臂血流量(RHFBF)，将右上臂上的测血压袖带充气至200mmHg的压力持续5分钟。在松开闭塞后，如上所述确定FBF。在安静(PRE)时和摄入测试饮料后120min时进行该测量。
在受试者处于仰卧位安静地休息10分钟后从左臂静脉获取血样。使用YSI葡萄糖/乳酸盐分析仪(YSI 2300 STAT，Yellow Springs，OH)和市售的EKISA[Diagnostic Systems Laboratory(诊断系统实验室)(DSL)，Webster，TX]一式两份地分别分析血清葡萄糖和胰岛素浓度(CV＝7.0％)，并且用其计算胰岛素抗性指数。
在研究期间体重保持稳定，并且在肽补充2周后收缩血压/舒张血压没有显著的变化。然而，结果证明由于摄入了本发明的肽产品，导致血管直径、血流量、一氧化氮水平增加。
实施例3-ACE抑制测定
ACE抑制测定法以前已经由Cushman和Cheung(Cushman，D.W.和Cheung，H.S.，Biochem.Pharmacol.(生物化学和药理学)(1971)20：1637)描述。简言之，通过将21.475mg Hip-His-Leu(″HHL，″Sigma(西格玛)，St.Louis，密苏里州)溶解在8ml磷酸盐缓冲盐水中制备底物，体积调节至10ml，最终pH调节至8.3。使用缓冲液作为稀释剂制备肽组合物的10％w/w溶液。通过将0.1单位的ACE(兔肺，Sigma Chemical(西格玛化学)，St.Louis，密苏里州)用缓冲液稀释来制备血管紧张肽转变酶母液。为了进行测定，将10微升样品置于含有200μl HHL和70μl缓冲液的小玻璃管中。将管置于37℃水浴中，并且保持3分钟。将管从水浴中取出，并且向每管中加入20μl血管紧张肽转变酶。将管涡旋并放回至水浴中保持30分钟。然后从水浴中取出管，并加入250μl HCl以终止反应。使用玻璃吸管向各管中加入乙酸乙酯(1.5ml)，并将各管再次涡旋。将小管单独地置于50ml塑料管中，在2000rpm下离心2分钟。从离心机中取出各管，取出时小心地不扰动醚层。移除醚层(1ml)并置于10ml小烧杯中，然后置于热处，在约100℃下蒸发。向每个蒸发的样品中加入1ml超纯水。在228nm处读取吸光度，不含抑制剂的反应混合物用作对照。
Claims (32)
1.一种包含分离的肽的肽组合物，所述分离的肽具有约12重量％-约40重量％的亮氨酸含量和约200-约4,000的分子量。
2.如权利要求1所述的肽组合物，其中所述分离的肽的亮氨酸含量为约12重量％-约30重量％。
3.如权利要求1所述的肽组合物，其中所述分离的肽的亮氨酸含量为约15重量％-约20重量％。
4.如权利要求1所述的肽组合物，其中所述分离的肽的亮氨酸含量为约15重量％-约30重量％。
5.如权利要求1所述的肽组合物，其中所述分离的肽的亮氨酸含量为约20重量％-约30重量％。
6.如权利要求1所述的肽组合物，其中所述分离的肽的分子量为约200-1,000。
7.如权利要求1所述的肽组合物，其中所述分离的肽的分子量为约400-1,000。
8.如权利要求1所述的肽组合物，其中所述蛋白源选自由豆科作物、鱼、肉、乳、蛋、谷物、面筋、玉米及其组合组成的组。
9.如权利要求1所述的肽组合物，其中所述蛋白源选自由牛乳、牛乳清、乳清蛋白浓缩物、乳清分离蛋白及其组合组成的组。
10.一种肽组合物，其包含具有约12重量％-约40重量％的亮氨酸含量和约200-约4,000的分子量的肽，所述肽通过包括下列步骤的方法分离自蛋白源：
a)在至少一种亮氨酰氨基肽酶的存在下水解蛋白以形成蛋白水解产物；
b)使所述氨基肽酶失活；以及
c)将所述蛋白水解产物过滤以产生含有富含亮氨酸的肽的透过物。
11.如权利要求10所述的肽组合物，其中所述方法包括通过从所述透过物去除水性流体来浓缩所述肽的附加步骤。
12.如权利要求10所述的肽组合物，其中所述蛋白源选自由豆科作物、鱼、肉、乳、血液、蛋、谷物、面筋、玉米及其组合组成的组。
13.如权利要求10所述的肽组合物，其中所述蛋白源选自由牛乳、牛乳清、乳清蛋白浓缩物、乳清分离蛋白及其组合组成的组。
14.一种从蛋白源分离富含亮氨酸的肽的方法，所述方法包括以下的步骤：
a)在至少一种亮氨酰氨基肽酶的存在下水解蛋白以形成蛋白水解产物；
b)使所述氨基肽酶失活；以及
c)将所述蛋白水解产物过滤以产生含有富含亮氨酸的肽的透过物。
15.如权利要求14所述的方法，还包括通过从所述透过物去除水性流体来浓缩所述肽的步骤。
16.如权利要求14所述的方法，其中所述蛋白源选自由豆科作物、鱼、肉、乳、血液、蛋、谷物、面筋、玉米及其组合组成的组。
17.如权利要求14所述的方法，其中进行所述过滤步骤以在所述透过物中收集具有约200-约4,000的分子量的富含亮氨酸的肽。
18.如权利要求14所述的方法，其中进行所述过滤步骤以收集具有约200-约1,000的分子量的富含亮氨酸的肽。
19.如权利要求14所述的方法，其中进行所述过滤步骤以收集具有约400-约1,000的分子量的富含亮氨酸的肽。
20.如权利要求14所述的方法，其中所述蛋白源选自由牛乳、牛乳清、乳清蛋白浓缩物、乳清分离蛋白及其组合组成的组。
21.如权利要求14所述的方法，其中所述肽的亮氨酸含量为约12-约30重量％的亮氨酸。
22.如权利要求14所述的方法，其中所述肽的亮氨酸含量为约15-约25重量％的亮氨酸。
23.如权利要求14所述的方法，其中所述肽的亮氨酸含量为约20-约25重量％的亮氨酸。
24.一种增加受试者血管中一氧化氮的产生的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的富含亮氨酸的肽组合物，所述组合物包含具有约12-约40重量％的亮氨酸含量的肽。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述富含亮氨酸的肽通过包括下列步骤的方法分离自蛋白源：
a)在至少一种亮氨酰氨基肽酶的存在下水解蛋白以形成蛋白水解产物；
b)使所述氨基肽酶失活；以及
c)将所述蛋白水解产物过滤以产生含有富含亮氨酸的肽的透过物。
26.如权利要求24所述的方法，其中所述分离富含亮氨酸的肽的方法还包括通过从所述透过物去除水性流体来浓缩所述肽的步骤。
27.一种在受试者血管中产生血管舒张的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的富含亮氨酸的肽组合物，所述组合物包含具有约12-约40重量％的亮氨酸含量的肽。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述富含亮氨酸的肽通过包括下列步骤的方法分离自蛋白源：
a)在至少一种亮氨酰氨基肽酶的存在下水解蛋白以形成蛋白水解产物；
b)使所述氨基肽酶失活；以及
c)将所述蛋白水解产物过滤以产生含有富含亮氨酸的肽的透过物。
29.如权利要求27所述的方法，其中所述分离富含亮氨酸的肽的方法还包括通过从所述透过物去除水性流体来浓缩所述肽的步骤。
30.一种增加受试者血管中的血流量的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的富含亮氨酸的肽组合物，所述组合物包含具有约12-约40重量％的亮氨酸含量的肽。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述富含亮氨酸的肽通过包括下列步骤的方法分离自蛋白源：
a)在至少一种亮氨酰氨基肽酶的存在下水解蛋白以形成蛋白水解产物；
b)使所述氨基肽酶失活；以及
c)将所述蛋白水解产物过滤以产生含有富含亮氨酸的肽的透过物。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述分离富含亮氨酸的肽的方法还包括通过从所述透过物去除水性流体来浓缩所述肽的步骤。
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