CN102010837B - 一种假单胞菌da10菌株及其获得方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种假单胞菌DA10菌株及其获得方法和应用，该菌株具有产果胶酶和半纤维素酶能力，具有亚麻脱胶活性。本发明提供菌株及培养系统能够直接用于亚麻脱胶，具有脱胶周期短，纤维分散率达100％，脱胶效率达95％，菌种不易被污染，处理成本低，纤维质量好，脱胶条件温和，抗污染能力强，耐热性能好，无环境污染等优点；与现有技术相比，本发明具有工艺简单、适合大规模工业化生产等特点，对于探索假单胞菌菌株在碱性条件下进行亚麻脱胶具有潜在的理论和实践意义。
Description
技术领域
本发明属于假单胞菌菌株及其应用领域，特别涉及一种假单胞菌DA10菌株及其获得方法和应用。
背景技术
亚麻纤维天然古朴、色彩柔和，具有独特的凉爽舒适性，是化学纤维所不具备，其它天然纤维不可比拟的，被誉为“植物纤维中的皇后”。亚麻产品具有手感滑爽、纹理自然、色调柔和、结实耐用等风格，并且具有杀毒抗菌、防紫外线、低静电、低磁场效应等天然功能，在风格与功能上独树一帜，具有“绿色保健”的特点，因此倍受消费者青睐，是国际市场上最受欢迎的纺织商品之一。
目前，生产上普遍采用传统的亚麻温水沤麻、雨露沤麻及天然水沤麻等方法，均利用天然微生物及其酶对亚麻的果胶、半纤维素和木质素等胶质进行降解，菌株混杂，难以进行有效的控制，导致脱胶时间长(温水沤麻约为4d；雨露沤麻为15-20d；天然水沤麻5-7d)、综合长麻率低、质量不稳定(束纤维强力低)和环境污染重等诸多问题，严重制约着亚麻产业的大力发展。尽管20世纪以来，微生物学得到了迅速发展，麻类作物中微生物工程技术的研究也取得了较大的进展。虽然将微生物及其产生的酶类应用于亚麻脱胶不仅可以提高纤维的产量和品质，耗能少、使用安全，可减轻对环境的污染，具有良好的前景，但是其产业化一直未能实现。因此，筛选、分离亚麻脱胶优势菌群并将其应用于亚麻脱胶以实现亚麻微生物快速脱胶非常重要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种假单胞菌DA10菌株及其获得方法和应用，本发明提供菌株及培养系统能够直接用于亚麻脱胶，具有脱胶周期短，纤维分散率达100％，脱胶效率达95％；与现有技术相比，本发明具有工艺简单、适合大规模工业化生产等特点，对于探索假单胞菌菌株在碱性条件下进行亚麻脱胶具有潜在的理论和实践意义。
本发明的一种假单胞菌DA10菌株(CGMCC No.3851)，其特征在于：该菌株具有产果胶酶和半纤维素酶能力，具有亚麻脱胶活性。
本发明的一种假单胞菌DA10菌株的获得方法，包括：
(1)从东海舟山海域取样腐烂海草，先将海草与富集培养基按1g∶20ml的比例于富集培养基中室温静置培养30天，然后取0.1ml富集培养基涂布于分离培养基，37℃静置培养1～4天，获得自野生型脱胶优势菌株；
其中，富集培养基配方为：亚麻粉5g，无菌水200ml，pH自然；分离培养基配方为：亚麻粉5g，(NH4)2SO4 5g，K2HPO4 1g，MgSO4 0.5g，KCl 0.5g，FeSO4 0.01，琼脂20g，水1000mL，用NaOH将pH调节到9；
(2)将步骤(1)中得到的菌株接种到果胶营养培养基中，28℃培养72h，带菌落形成后，加入0.2％刚果红水溶液染色4h，倒去表面剩余刚果红溶液，加入少量蒸馏水荡去薄层表面刚果红，对光即可见明显的绛红色水解圈，在菌落周围出现绛红色水解圈者即为果胶分解菌(测量果胶琼脂平板上菌周围的透明圈直径和菌落直径，水解圈与菌落直径之比大者一般有较高果胶酶活力)；
然后将果胶分解菌接种到半纤维素营养培养基中，28℃培养72h，即可见水解圈(测量水解圈和菌苔大小，并计算二者大小之比，水解圈与菌落直径之比大者一般有较高半纤维素酶活力)；
(3)通过透明圈法从上述培养基中选择出具有产果胶酶和半纤维素酶能力的菌株。所述步骤(2)中的果胶营养培养基，其组分包括：
果胶 2g
NANO3 3g
K2HPO4 0.5g
MgSO4 1g
琼脂 20g
水 1000mL
pH 自然，7.0-7.2
半纤维素营养培养基，其组分包括：
半纤维素(自制) 20g
NH4NO3 2g
K2HPO4 2g
MgSO4 0.2g
酵母膏 5g
琼脂 20g
水 1000mL
pH 7.2。
本发明的一种假单胞菌DA10菌株在亚麻脱胶中的应用，包括：
(1)假单胞菌DA10保存于牛肉膏蛋白胨培养基，37℃ 200rpm培养24h，添加冻存缓 冲液；
(2)在灭菌冷却后的50mL营养肉汤培养基中，接入上述斜面培养24h的菌一环，在转速200r/min、温度40℃条件下摇瓶培养24h；
(3)将50ml摇瓶培养后培养基接种入亚麻发酵培养基5L，在转速200r/min、温度40℃条件下摇瓶培养24h得到发酵菌液；其中，亚麻发酵培养基配方为：亚麻原麻5g，KCl0.05g，磷酸氢二钾0.1g，MgSO4 0.05g，FeSO4 0.001g，(NH4)2SO4 0.5g，补水至100ml定容(5L发酵培养基等同增加各组分用量)；
将发酵菌液于4℃，8000r/min离心，取上清液即为所得酶液，然后经DNS比色法测定，酶液中果胶酶酶活力为240.62U/mL，木聚糖酶酶活力为300.58U/ml，其在pH6.5-9.0，50℃以下酶活较稳定；
(4)将灭菌后的亚麻原茎与步骤3所得发酵菌液按浴比1∶20混合，在40℃，200rpm摇床中分别脱胶1～4天，脱胶时间到时，除去脱胶液，在沸水浴中煮沸5min，用自来水冲洗数次以去除亚麻上的细菌，停止脱胶。
所述步骤(1)中的冻存缓冲液由磷酸二氢钾0.0627g，磷酸氢二钾0.0177g，柠檬酸钠0.0588g，七水合硫酸镁0.02645g，甘油10ml，加水定容至100ml制得。
本发明的一种假单胞菌DA10菌株在亚麻纱线前处理中的应用，包括：
步骤(1)～(3)与权利要求4相同；
(4)将灭菌后的亚麻纱线与步骤3所得发酵菌液按浴比1∶20混合，在40℃，200rpm摇床中分别脱胶1～4天，脱胶时间到时，除去脱胶液，在沸水浴中煮沸5min，用自来水冲洗数次以去除亚麻上的细菌，停止脱胶；其中，亚麻纱线为亚麻粗纱或亚麻二粗。
本发明的一种假单胞菌DA10菌株在亚麻织物煮练中的应用，包括：
步骤(1)～(3)与权利要求4相同；
(4)将灭菌后的亚麻织物与步骤3所得发酵菌液按浴比1∶20混合，在40℃，200rpm摇床中分别脱胶1～4天，脱胶时间到时，除去脱胶液，在沸水浴中煮沸5min，用自来水冲洗数次以去除亚麻上的细菌，停止脱胶。
该菌株除可以用于黄麻、大麻等韧皮纤维脱胶及其织物前处理外等。
根据16sR DNA测序Blast及聚类分析结果，该菌与假单胞菌Pseudomonas sp相似性为99％，结合生理生化试验结果和镜检分析，命名此菌株为假单胞菌(Pseudomonas sp)DA10菌株。
本发明所提供的具有亚麻脱胶活性的假单胞菌已于2010年5月17日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC No.3851。
本发明提供的假单胞菌菌株Pseudomonas sp DA10特征如下(附图1、图2)：
| 编号 | 大小 | 形态 | 干湿程度 | 透明度 | 颜色 | 边缘 |
| DA10 | 大 | 圆形 | 湿润 | 不透明 | 黄 | 整齐 |
| 编号 | 形状 | 革兰氏染色结果 | 革兰氏型 |
| DA10 | 短杆菌 | 红色 | G- |
提取菌株的DNA进行PCR扩增，选用细菌16S rRNA基因通用引物，正向引物BSF8/20，5’-AGAGTTTGATCCTGGCTAAG-3’(E.coli对应位置为8～27)，反向引物BSR1541/20，5’-AAGGAGGTGATCCAGCCG-3’(E.coli对应位置为1541～1522)；进而测得菌株16S rRNA全序列，如下：
GGGCGCGCAGTGATTCGAGCTCGGTACCGTAATACGACTCACTATAGGGCGACATATGATCGATGATATCCCATGGGCGGCCGCCTGCAGACCAGGTCTGGTTACCTTGTTACGACTTCACCCCAGTCATCGGCCACACCGTGGCAAGCGCCCTCCCGAAGGTTAAGCCACCTGCTTCTGGTGCAACAAACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCAGCAATGCTGATCTGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGGAGTCGAGTTGCAGACCCCAATCCGGACTGAGATAGGGTTTCTGGGATTGGCTTACCGTCGCCGGCTTGCAGCCCTCTGTCCCTACCATTGTAGTACGTGTGTAGCCCTGGCCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCGGTCTCCTTAGAGTTCCCACCATTACGTGCTGGCAACTAAGGACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTGTTCGAGTTCCCGAAGGCACCAATCCATCTCTGGAAAGTTCTCGACATGTCAAGGCCAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAAACCACATACTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGCGAACTTAACGCGTTAGCTTCGATACTGCGTGCCAAATTGCACCCAACATCCAGTTCGCATCGTTTAGGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAACCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGTGCCTCAGTGTCAGT GTTGGTCCAGGTAGCTGCCTTCGCCATGGATGTTCCTCCTGATCTCTACGCATTTCACTGCTACACCAGGAATTCCGCTACCCTCTACCACACTCTAGTCGCCCAGTATCCACTGCAGTTCCCAGGTTGAGCCCAGGGCTTTCACAACGGACTTAAACGACCACCTACGCACGCTTTACGCCCAGTAATTCCGAGTAACGCTTGCACCCTTCGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGAAGTTAGCCGGTGCTTATTCTTTGGGTACCGTCATCCCAACCGGGTATTAGCCAGCTGGATTTCTTTCCCAACAAAAGGGCTTTACAACCCGAAGGCCTTCTTCACCCACGCGGTATGGCTGGATCAGGCTTGCGCCCATTGTCCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGACCGTGTCTCAGTTCCAGTGTGGCTGATCATCCTCTCAGACCAGCTACGGATCGTCGCCTTGGTGGGCCTTTACCCCGCCAACTAGCTAATCCGACATCGGCTCATTCAATCGCGCAAGGCCCGAAGGTCCCCTGCTTTCACCCGTAGGTCGTATGCGGTATTAGCGTAAGTTTCCCTACGTTATCCCCCACGAAAAAGTAGATTCCGATGTATTCCTCACCCGTCCGCCACTCGCCACCCAGAGAGCAAGCTCTCCTGTGCTGCCGTTCGACTTGCATGTGTTAGGCCTACCGCCAGCGTTCACTCTGAGCCAGGATCAAACTCT。
有益效果
(1)本发明提供菌株及培养系统，经检测可同时高产果胶酶和半纤维素酶，能够直接用于亚麻脱胶，具有脱胶周期短，纤维分散率达100％，对亚麻脱胶效果良好，脱胶效率达95％，菌种不易被污染，处理成本低，纤维质量好，脱胶条件温和，抗污染能力强，耐热性能好，无环境污染等优点；
(2)本发明具有工艺简单、适合大规模工业化生产等特点。利用该体系进行亚麻脱胶具有脱胶时间短，亚麻纤维分散率达到100％，脱胶率达到90％以上，精干麻质量好。
附图说明
图1为荚膜染色照片(油镜)；
图2为电镜照片；
图3为发酵实例照片。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
亚麻脱胶菌种的筛选获得
(1)从东海舟山海域取样腐烂海草，先将海草与富集培养基按1g∶20ml的比例于富集培养基中室温静置培养30天，然后取0.1ml富集培养基涂布于分离培养基，37℃静置培养1～4天，获得自野生型脱胶优势菌株；
其中，富集培养基配方为：亚麻粉5g，无菌水200ml，pH自然；分离培养基配方为：亚麻粉5g，(NH4)2SO4 5g，K2HPO4 1g，MgSO4 0.5g，KCl 0.5g，FeSO4 0.01，琼脂20g，水1000mL，用NaOH将pH调节到9；
(2)将步骤(1)中得到的菌株挑4环接种到果胶营养培养基中(培养皿直径10cm)，28℃培养72h，带菌落形成后，加入0.2％刚果红水溶液染色4h，倒去表面剩余刚果红溶液，加入少量蒸馏水荡去薄层表面刚果红，对光即可见明显的绛红色水解圈，在菌落周围出现绛红色水解圈者即为果胶分解菌(测量果胶琼脂平板上菌周围的透明圈直径和菌落直径，水解圈与菌落直径之比大者一般有较高果胶酶活力)；
然后将果胶分解菌挑4环接种到半纤维素营养培养基中(培养皿直径10cm)，28℃培养72h，即可见水解圈(测量水解圈和菌苔大小，并计算二者大小之比，水解圈与菌落直径之比大者一般有较高半纤维素酶活力)；
果胶营养培养基，其组分包括：
果胶 2g
NANO3 3g
K2HPO4 0.5g
MgSO4 1g
琼脂 20g
水 1000mL
pH 自然，7.0-7.2。
半纤维素营养培养基，其组分包括：
半纤维素(自制) 20g
NH4NO3 2g
K2HPO4 2g
MgSO4 0.2g
酵母膏 5g
琼脂 20g
(3)通过透明圈法从上述培养基中选择出具有产果胶酶和半纤维素酶能力的菌株。
实施例2
为了使该菌株能够保持稳定的高产特性，斜面保藏培养基使用牛肉膏蛋白胨培养基，培养基原料及制备方法为：牛肉膏0.5g，蛋白胨1g，氯化钠0.5g(pH7.4-7.6)，加水至100ml定容，37℃ 200rpm培养过夜，添加冻存缓冲液100ml；其中，冻存缓冲液由磷酸二氢钾0.0627g，磷酸氢二钾0.0177g，柠檬酸钠0.0588g，七水合硫酸镁0.02645g，甘油10ml，加水定容至100ml制得；将营养肉汤培养基(牛肉膏0.3g，蛋白胨1g，氯化钠0.5g，加水至100ml定容，pH7.4-7.6)分装于250mL容器中，每个容器中50mL，封口包扎后，于121℃灭菌20min；冷却后接入斜面培养24h的菌一环，在转速200r/min、温度40℃条件下摇瓶培养24h。
本发明所使用的发酵培养基为亚麻原麻5g，KCl 0.05g，磷酸氢二钾0.1g，MgSO4 0.05g，FeSO4 0.001g，(NH4)2SO4 0.5g；将50ml摇瓶培养后接种入发酵培养基5L，在转速200r/min、温度40℃条件下摇瓶培养24h得到发酵菌液；再经高速冷冻离心机在4℃，8000r/min条件下离心菌液，取上清液即为所得脱胶酶液。
脱胶酶液的酶活测定
为了测定复合脱胶酶液的有效成分，分别测定了果胶酶和木聚糖酶酶活。其中采用DNS比色法测定果胶酶活，酶活测定底物分别为0.25％的果胶，1％木聚糖(均用pH8的磷酸缓存液配制)。
酶活性测定方法如下：
(1)取25ml比色管，先加底物1.8ml，再取经8000rpm，4℃离心15min后的发酵液上清液0.2ml，加塞摇匀，50℃水浴保温30min，取出；
(2)加1.5mlDNS显色液并摇匀，立即置沸水中显色5min，取出流水冷却。加蒸馏水稀释至刻度，摇匀；
(3)用灭活处理过的酶液作对照，用UNICO VU2100型分光光度计分别在520nm和540nm波长下，测定果胶酶活力，木聚糖酶。
酶液中果胶酶酶活力为240.62U/mL，木聚糖酶酶活力为300.58U/ml，其在pH6.5-9.0， 50℃以下酶活较稳定。
实施例3
亚麻脱胶工艺如下：
将5g亚麻原茎置入250ml三角瓶，以亚麻原茎与发酵菌液按浴比1∶20分装于三角瓶中，装液量为100ml，在40℃，200rpm摇床中分别脱胶1天、2天和4天；脱胶时间到时，除去脱胶液，在沸水浴中煮沸5min，用自来水冲洗数次以去除亚麻上的细菌，停止脱胶。
通过对脱胶亚麻观察发现，1天后亚麻纤维有明显分散，发酵液颜色变深变浑浊；脱胶2天后原本成束的亚麻完全分散成纤维状，发酵液明显变稠；脱胶4天后亚麻脱胶率达到90％以上。
实施例4
亚麻脱胶工艺如下：
将5g灭菌后的亚麻纱线(亚麻粗纱或亚麻二粗)置入250ml三角瓶，以亚麻原茎与发酵菌液按浴比1∶20分装于三角瓶中，装液量为100ml，在40℃，200rpm摇床中分别脱胶1天、2天和4天；脱胶时间到时，除去脱胶液，在沸水浴中煮沸5min，用自来水冲洗数次以去除亚麻上的细菌，停止脱胶。
通过对脱胶亚麻观察发现，1天后亚麻纤维有明显分散，发酵液颜色变深变浑浊；脱胶2天后原本成束的亚麻完全分散成纤维状，发酵液明显变稠；脱胶4天后亚麻脱胶率达到90％以上。
实施例5
亚麻脱胶工艺如下：
将5g灭菌后的亚麻织物置入250ml三角瓶，以亚麻原茎与发酵菌液按浴比1∶20分装于三角瓶中，装液量为100ml，在40℃，200rpm摇床中分别脱胶1天、2天和4天；脱胶时间到时，除去脱胶液，在沸水浴中煮沸5min，用自来水冲洗数次以去除亚麻上的细菌，停止脱胶。
通过对脱胶亚麻观察发现，1天后亚麻织物白度、柔软度显著改善，刺痒感显著减低。
Claims (1)
1.一种假单胞菌（Pseudomonas sp）DA10菌株，其保藏号为CGMCC No.3851，其特征在于：该菌株具有产果胶酶和半纤维素酶能力，具有亚麻脱胶活性；其16S rRNA序列，如下：GGGCGCGCAGTGATTCGAGCTCGGTACCGTAATACGACTCACTATAGGGCGACATATGATCGATGATATCCCATGGGCGGCCGCCTGCAGACCAGGTCTGGTTACCTTGTTACGACTTCACCCCAGTCATCGGCCACACCGTGGCAAGCGCCCTCCCGAAGGTTAAGCCACCTGCTTCTGGTGCAACAAACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCAGCAATGCTGATCTGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGGAGTCGAGTTGCAGACCCCAATCCGGACTGAGATAGGGTTTCTGGGATTGGCTTACCGTCGCCGGCTTGCAGCCCTCTGTCCCTACCATTGTAGTACGTGTGTAGCCCTGGCCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCGGTCTCCTTAGAGTTCCCACCATTACGTGCTGGCAACTAAGGACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTGTTCGAGTTCCCGAAGGCACCAATCCATCTCTGGAAAGTTCTCGACATGTCAAGGCCAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAAACCACATACTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGCGAACTTAACGCGTTAGCTTCGATACTGCGTGCCAAATTGCACCCAACATCCAGTTCGCATCGTTTAGGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAACCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGTGCCTCAGTGTCAGTGTTGGTCCAGGTAGCTGCCTTCGCCATGGATGTTCCTCCTGATCTCTACGCATTTCACTGCTACACCAGGAATTCCGCTACCCTCTACCACACTCTAGTCGCCCAGTATCCACTGCAGTTCCCAGGTTGAGCCCAGGGCTTTCACAACGGACTTAAACGACCACCTACGCACGCTTTACGCCCAGTAATTCCGAGTAACGCTTGCACCCTTCGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGAAGTTAGCCGGTGCTTATTCTTTGGGTACCGTCATCCCAACCGGGTATTAGCCAGCTGGATTTCTTTCCCAACAAAAGGGCTTTACAACCCGAAGGCCTTCTTCACCCACGCGGTATGGCTGGATCAGGCTTGCGCCCATTGTCCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGACCGTGTCTCAGTTCCAGTGTGGCTGATCATCCTCTCAGACCAGCTACGGATCGTCGCCTTGGTGGGCCTTTACCCCGCCAACTAGCTAATCCGACATCGGCTCATTCAATCGCGCAAGGCCCGAAGGTCCCCTGCTTTCACCCGTAGGTCGTATGCGGTATTAGCGTAAGTTTCCCTACGTTATCCCCCACGAAAAAGTAGATTCCGATGTATTCCTCACCCGTCCGCCACTCGCCACCCAGAGAGCAAGCTCTCCTGTGCTGCCGTTCGACTTGCATGTGTTAGGCCTACCGCCAGCGTTCACTCTGAGCCAGGATCAAACTCT。
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Granted publication date: 20121107 Termination date: 20160813 |